專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從甲醛固定組織或甲醛固定石蠟包埋組織中提取總蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，是一種從甲醛固定的， 或甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織中快速高效提取總蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
醫(yī)院病理?yè)醢钢斜４媪舜罅康募兹┕潭ǖ?，或甲醛固定石蠟包?FFPE)組織切 片樣本，這些樣本絕大多數(shù)已經(jīng)保存了幾十年，甚至上百年，石蠟包埋組織是病理分子生物 學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要材料。由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞的表達(dá)譜研究并不能夠真實(shí)反映體 內(nèi)細(xì)胞的真實(shí)狀況，研究其正常細(xì)胞和疾病相關(guān)的細(xì)胞，特別是癌細(xì)胞中表達(dá)譜差異，對(duì)于 判斷癌化的進(jìn)展，癌癥的類(lèi)型的判定，以方便于診斷和治療有重要的意義，因此從甲醛固定 的，或甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織切片樣本中提取DNA，mRNA，MicroRNA，SnoRNA，全蛋白 等等加以研究是一個(gè)重要的基礎(chǔ)性工作，而合適的提取試劑和提取方法是關(guān)系到所提取的 核酸或蛋白質(zhì)樣品能否反映FFPE切片樣本中真實(shí)數(shù)量和方便，快捷，安全地進(jìn)行下游的重 要環(huán)節(jié)。早先人們主要從從甲醛固定的，或甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織切片樣本提取的 是 DNA(Goelz 1985，Dubeau 1986)，而后 Erlander (2003)等從 FFPE 組織切片樣本中提取 RNA和mRNA用于表達(dá)譜研究。可是對(duì)于FFPE組織切片樣本的表達(dá)譜研究研究的重要方面_全蛋白的提取，由于 蛋白質(zhì)被甲醛固定，所以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部以及蛋白質(zhì)分子之間存在著交鏈，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分 子的可溶性較差和蛋白質(zhì)的抗原表位，特別是蛋白質(zhì)立體表位被嚴(yán)重破壞，用常規(guī)的試劑 對(duì)脫蠟后的石蠟包埋組織內(nèi)的蛋白質(zhì)抽提時(shí)，全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)會(huì)嚴(yán)重?cái)嗔褳槎嚯暮涂乖砦?的恢復(fù)程度較差，所以國(guó)內(nèi)外對(duì)石蠟包埋組織內(nèi)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的提取報(bào)道較少。Ikeda(1998) 使用有機(jī)溶劑對(duì)含有2% SDS的RIPA裂解液，通過(guò)加熱，提取淀粉樣蛋白質(zhì)，可是Shan-Rong Shi (2006)在使用Ikeda的方法，用同樣的裂解液對(duì)同樣類(lèi)型的新鮮組織樣本對(duì)全蛋白質(zhì) 提取時(shí)，通過(guò)比較新鮮和石蠟包埋組織切片的SDS-PAGE的圖譜發(fā)現(xiàn)，部分含量較少的蛋白 在石蠟包埋組織的western blot檢測(cè)信號(hào)較弱甚至無(wú)法檢測(cè)到，并且50-10Kda區(qū)域，蛋白 質(zhì)條帶呈現(xiàn)出涂抹狀，說(shuō)明蛋白質(zhì)的提取效率較低，全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)嚴(yán)重?cái)嗔?。Okaka(2005) 使用高溫脫臘，再通過(guò)溫育含有尿素，2% SDS和巰基乙醇的溶液提取蛋白，但是石蠟不能 夠被完全去除干凈，提取的蛋白也被尿素在高溫下修飾，同時(shí)高濃度的SDS對(duì)下游操作， 特別是蛋白的MS(質(zhì)譜分析)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。Shan-Rong Shi (2006)使用了一種含有 20mMTris-HCl, pH 9.0,2% SDS的溶液對(duì)脫臘的組織切片蛋白質(zhì)高溫提取時(shí)，蛋白質(zhì)的產(chǎn) 量有所提高，但是SDS不容易去除，會(huì)對(duì)抗原表位的恢復(fù)和MS分析產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從甲醛固定的，或甲醛固定石蠟包埋(Formalin-Fixed， Paraffin-Embeded Tissue FFPE)的組織中快速高效提取全蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的基本程序包括以下步驟1)將甲醛固定的組織用不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑在兩種不同的溫度條件 下溫育以釋放被交鏈的蛋白質(zhì)；或者，將甲醛固定石蠟包埋的組織先用脫蠟試劑去蠟后，再用不含有去污劑的蛋 白質(zhì)抽提試劑在兩種不同的溫度條件下溫育以釋放被交鏈的蛋白質(zhì)；2)離心并分離上清，上清加入蛋白質(zhì)沉淀試劑后分離并洗滌沉淀，再將沉淀采用 合適的試劑溶解獲得甲醛固定的組織或甲醛固定石蠟包埋的組織的全蛋白質(zhì)提取液。 較佳的，所述甲醛固定的組織或甲醛固定石蠟包埋的組織均為組織切片。步驟1中，所述脫蠟試劑包括可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑和與石蠟不相溶的有機(jī)溶 劑。所述的可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑可以選自甲苯，二甲苯，D-檸檬烯，正戊烷，正己 烷，正庚烷和正辛烷等無(wú)極性有機(jī)溶劑。所述的與石蠟不相溶的有機(jī)溶劑可以選自乙醇，甲醇，異丙醇和正丁醇等弱極性 有機(jī)溶劑。所述將甲醛固定石蠟包埋的組織用脫蠟試劑去蠟的方法具體為將石蠟包埋組織 先用可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑處理3-5分鐘，而后再在前述處理液中加入與石蠟不相溶的 有機(jī)溶劑處理5-60秒，再將處理后的組織洗滌并分離。所述可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑與與石蠟不相溶的有機(jī)溶劑的體積比為 5 1-20 1，優(yōu)選 5 1-10 1。本發(fā)明所述的脫蠟試劑，不同于常規(guī)的二甲苯/乙醇方法，傳統(tǒng)的二甲苯/乙醇方 法對(duì)10-15 μ m厚石蠟包埋組織切片需要兩次10分鐘的脫臘過(guò)程，和分別用100%、96%、 70%的乙醇水化，兩次10分鐘的過(guò)程，這樣需要的時(shí)間通常在1個(gè)多小時(shí)，而本發(fā)明所提供 的脫蠟試劑只需要短短幾分鐘就可以實(shí)現(xiàn)石蠟的完全去除。所述的不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑由還原試劑，變性試劑和緩沖液組成。 所述的還原試劑選自巰基乙醇，DTT, TCEP等，合適的濃度在5-500mM，最合適的濃度在 20-200mM,所述的變性試劑選自尿素，硫尿，鹽酸胍，異硫氰酸胍，高氯酸鈉，碘化鈉等，合適 的濃度在1-9M，最合適的濃度在3-7M。所述的緩沖液組成選自HEPES，MOPS, TRIS，PIPES, MES, Glycine-NaOH, citrate等緩沖液體系，合適的濃度在lO-lOOOmM，最合適的濃度在 20-200mM。緩沖體系的pH2_10，最合適的濃度在pH5_9。優(yōu)選的，不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑的配方如下20-200mMTris-HCl，pH3_9， TCEP 20-200mM，異硫氰酸胍 3-7M。所述不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑中還可以加Aprotinin，E-64，Leupeptin, PMSF等一種或幾種蛋白酶抑制試劑或者它們的混合物。步驟1中用不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑在兩種不同的溫度條件下溫育，是可 以可逆甲醛對(duì)蛋白質(zhì)的交鏈作用，并且解鏈蛋白質(zhì)分子內(nèi)部以及蛋白質(zhì)分子之間存在著交 鏈，以方便蛋白質(zhì)完全溶解并且釋放到蛋白質(zhì)抽提試劑中。而采用不含有去污試的蛋白質(zhì) 提取試劑，保護(hù)了絕大多的蛋白，尤其是癌癥或腫瘤蛋白標(biāo)記物的抗原表位的構(gòu)象。所述在兩種不同的溫度條件下溫育方法具體為先在30-120°C下溫育10-60分 鐘，優(yōu)選60-120°C ；而后在30-100°C下溫育1_5小時(shí)，優(yōu)選30_80°C。實(shí)施例具體列舉的為先在100°C下溫育20分鐘，而后在60°C下溫育2小時(shí)。步驟2中所采用的蛋白質(zhì)沉淀試劑可以包括三氯乙酸，DOC(脫氧膽酸鈉)，乙醇，丙酮，硫酸氨，PEG8000(聚乙二醇8000)，乙醚，二乙醚等，也可以是以上幾種成分按照一定 的質(zhì)量或體積比組成的混合物。優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)沉淀試劑為二乙醚與乙醇的混合物，二乙醚與乙醇的體積 比為1/3-4/1 ；或者所述蛋白質(zhì)沉淀試劑為乙醚與乙醇的混合物，乙醚與乙醇的體積比為 1/2-2/1。所述蛋白質(zhì)沉淀試劑可以將釋放的幾乎全部蛋白質(zhì)或多肽完全沉淀出來(lái)，在去除 上清的同時(shí)，減少了糖，脂肪，鹽的污染。本發(fā)明所敘述的合適的溶解試劑是根據(jù)下游的實(shí)驗(yàn)(Western blot, ELIS，MS, 2D 電泳)要求所直接加的溶解緩沖液,可以是laemmli sample buffer, IEFsample buffer, 2D sample buffer，基質(zhì)緩沖液等；或者也可以預(yù)先用加入少量的micrococcal nuclease, benzonase等消化，消除DNA，RNA殘留，減少粘性，再加入前述溶解緩沖液。本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)步驟可設(shè)計(jì)如下1.取兩塊大約10-15um厚，IOOmm2石蠟包埋組織切片到1. 5ml的干凈離心管中， 加入Iml正辛烷，高速渦懸震蕩30秒，室溫靜置5分鐘，期間偶爾顛倒離心管數(shù)次。2.加入IOOul甲醇，渦懸震蕩10秒，再10000RPM離心2分鐘，移去上下層的液體。3.用500ul的雙蒸水清洗脫蠟的組織兩次，盡量吸去液體，保留組織塊沉淀。4.加入100 μ 1不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，蓋上蓋子，渦懸震蕩數(shù)秒。5.在電熱消解儀或水浴鍋中100°C加熱20分鐘，短暫離心一下，再用組織研磨棒 將組織切片磨碎。6.在電熱消解儀或水浴鍋中60°C加熱2小時(shí)，期間大約每20分鐘取出，震蕩一次。7. 4°C，12000RPM離心15分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml的干凈離心管中。8.加入Iml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘。9. 40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清保留沉淀。10.加入0.5ml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘.4°C， 12000RPM離心15分鐘，去除上清，保留沉淀.在通風(fēng)櫥中將試管倒置在濾紙上，讓殘余的液 體揮發(fā)干凈。11.將固體沉淀溶解于合適的緩沖液中，再4°C，12000RPM離心5分鐘，收集上清， 用于 SDS-PAGE，Western blot 等實(shí)驗(yàn)。所述步驟11中的固體沉淀可以根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)的要求，溶解直接或間接于 laemmlisample buffer, IEF sample buffer, 2D sample buffer，基質(zhì)緩沖液等；或者也可 以預(yù)先用加入少量的micrococcal nuclease, benzonase等消化，消除DNA，RNA殘留，減少 粘性，再加入 IEF sample buffer, 2D sample buffer 等。本發(fā)明實(shí)施過(guò)程中需要的注意事項(xiàng)1.為提高石蠟包埋組織中蛋白質(zhì)的回收效率，必須盡量減少在切片制作過(guò)程中甲 醛固定時(shí)間，同時(shí)在石蠟包埋前徹底脫水，甲醛固定的時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取，回收效率越低。2.盡量取用從石蠟包埋組織塊中切取薄片，或沒(méi)有封閉到載玻片的沒(méi)有經(jīng)過(guò)蘇木 精等染色的切片。3.材料越新鮮或甲醛固定時(shí)間越短，蛋白質(zhì)的回收效率越高。4.提取試劑中含有刺激性的化合物，操作時(shí)要戴好乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛 和衣服，防止吸入口鼻，沾染皮膚眼睛后，立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)生的 幫 助。5.對(duì)于甲醛浸泡的組織樣本，每次可以取5-10mg的組織樣本，用雙蒸水洗滌離心 收集后后，直接從步驟4開(kāi)始操作。6.本方法所提取的蛋白質(zhì)只能夠用于體外實(shí)驗(yàn)，不能夠用于臨床、治療和動(dòng)物體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)等，由此產(chǎn)生的后果，概不承擔(dān)責(zé)任。及時(shí)將石蠟包埋組織中全蛋白質(zhì)提取出來(lái)，進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)譜研究，以方便了 解疾病，特別是癌癥的發(fā)生，發(fā)展，愈后情況有十分重要的意義。本方法通過(guò)特殊的快速脫 蠟試劑和蛋白質(zhì)抽提試劑，在兩種不同的溫度條件下溫育，可以將被交鏈的蛋白質(zhì)釋放出 來(lái)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的離心步驟，上清中含有的蛋白經(jīng)過(guò)沉淀洗滌和合適的試劑溶解后，最大限度 地保持了蛋白質(zhì)的完整性和抗原表位的正確構(gòu)象，尤其適用于從甲醛固定的，或甲醛固定 石蠟包埋的病理組織切片中快速高效提取全蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法制備的組織全蛋白質(zhì)提 取液可以用于WesternBlot，ELISA，2D電泳，蛋白質(zhì)芯片分析，MS分析等生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)分 析，是目前最快速，安全，方便的石蠟包埋組織全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)提取方式，為病理組織切片下 游的Western blot，ELISA等免役實(shí)驗(yàn)，MS(質(zhì)譜分析)和以疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床診斷提 供了一種快速，安全，方便的途徑。具體實(shí)施方法以下結(jié)合幾個(gè)實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍實(shí)施例11.取兩塊大約10-15um厚，IOOmm2石蠟包埋腎癌組織切片到1. 5ml的干凈離心管 中，加入Iml正辛烷，高速渦懸震蕩30秒，室溫靜置5分鐘，期間偶爾顛倒離心管數(shù)次。2.加入IOOul甲醇，渦懸震蕩10秒，再10000RPM離心2分鐘，移去上下層的液體。3.用500ul的雙蒸水清洗脫蠟的組織兩次，盡量吸去液體，保留組織塊沉淀。4.加入100 μ 1不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(20mM Tris-HCl, ρ H 9， DTT200mM,鹽酸胍7M)，蓋上蓋子，渦懸震蕩數(shù)秒。5.在電熱消解儀或水浴鍋中100°C加熱20分鐘，短暫離心一下，再用組織研磨棒 將組織切片磨碎。6.在電熱消解儀或水浴鍋中60°C加熱2小時(shí)，期間大約每20分鐘取出，震蕩一次。7. 4°C，12000RPM離心15分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml的干凈離心管中。8.加入Iml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘。9. 40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清保留沉淀。
10.加入0.5ml的沉淀試劑(二乙醚與乙醇的混合物，二乙醚與乙醇體積比為 1/3)。渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘.4°C，12000RPM離心15分鐘，去除上 清，保留沉淀.在通風(fēng)櫥中將試管倒置在濾紙上，讓殘余的液體揮發(fā)干凈。11.將固體沉淀溶解于laemmli sample buffer中，95度加熱5分鐘，再4°C， 12000RPM離心5分鐘，收集上清，用于Western blot。將新鮮的腎癌組織IOmg按照實(shí)驗(yàn)4-11步驟操作后，比較新鮮的與石蠟包埋的腎 癌組織的Western blot免疫印跡發(fā)現(xiàn)，β actin的免疫印跡的色彩程度沒(méi)有明顯差異.
實(shí)施例21.取5-10mg甲醛固定12小時(shí)的存在于固定液中的腎癌組織。2.用500ul的雙蒸水清洗組織兩次，盡量吸去液體，保留組織塊沉淀。3.加入100μ 1不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(20mM HEPES, ρ H 3，TCEP 200mM,異硫氰酸胍3M)，蓋上蓋子，渦懸震蕩數(shù)秒。4.在電熱消解儀或水浴鍋中100°C加熱20分鐘，短暫離心一下，再用組織研磨棒 將組織切片磨碎。5.在電熱消解儀或水浴鍋中60°C加熱2小時(shí)，期間大約每20分鐘取出，震蕩一次。6. 4°C，12000RPM離心15分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml的干凈離心管中。7.加入Iml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘。8. 40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清保留沉淀。9.加入0. 5ml的沉淀試劑(乙醚與乙醇的混合物，乙醚與乙醇的體積比為2/1)。 渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘.40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清，保留 沉淀.在通風(fēng)櫥中將試管倒置在濾紙上，讓殘余的液體揮發(fā)干凈。10.將固體沉淀溶解于laemmli sample buffer中，95度加熱5分鐘，再4°C， 12000RPM離心5分鐘，收集上清，用于SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)。將新鮮的腎癌組織IOmg按照實(shí)驗(yàn)3-10步驟操作后，比較新鮮的與石蠟包埋腎癌 組織的SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，除了 10-50Kda區(qū)間石蠟包埋腎癌組織的蛋白質(zhì)條帶有點(diǎn)涂抹 夕卜，其他沒(méi)有顯著差異。實(shí)施例31.取兩塊大約1015um厚，IOOmm2石蠟包埋腎癌組織切片到1. 5ml的干凈離心管 中，加入Iml正戊烷，高速渦懸震蕩30秒，室溫靜置5分鐘，期間偶爾顛倒離心管數(shù)次。2.加入IOOul乙二醇，渦懸震蕩10秒，再10000RPM離心2分鐘，移去上下層的液體。3.用500ul的雙蒸水清洗脫蠟的組織兩次，盡量吸去液體，保留組織塊沉淀。4.加入100 μ 1不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(20mM Mops, ρ H 10，巰基乙醇 20mM，尿素9Μ)蓋上蓋子，渦懸震蕩數(shù)秒。5.在電熱消解儀或水浴鍋中100°C加熱20分鐘，短暫離心一下，再用組織研磨棒 將組織切片磨碎。6.在電熱消解儀或水浴鍋中60°C加熱2小時(shí)，期間大約每20分鐘取出，震蕩一次。7. 4°C，12000RPM離心15分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml的干凈離心管中。8.加入Iml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘。9. 40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清保留沉淀。10.加入0. 5ml的沉淀試劑(二乙醚與乙醇的混合物，二乙醚與乙醇的體積比為4/1)。渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘.4°C，12000RPM離心15分鐘，去除上 清，保留沉淀.在通風(fēng)櫥中將試管倒置在濾紙上，讓殘余的液體揮發(fā)干凈。11.將固體沉淀溶解于IOOul終濃度lu/ul的benzonase緩沖液中消化，再用沉淀 試劑沉淀后，再溶解于2D sample buffer中，進(jìn)行2D電泳。將新鮮的腎癌組織IOmg按照實(shí)驗(yàn)4-11步驟操作后，比較新鮮的與石蠟包埋腎癌 組織的2D電泳發(fā)現(xiàn)，除了 benzonase所特有的條帶外，其它蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)差異并不顯著。實(shí)施例41.取兩塊大約10-15um厚，IOOmm2石蠟包埋腎癌組織切片到1. 5ml的干凈離心管 中，加入Iml正辛烷，高速渦懸震蕩30秒，室溫靜置5分鐘，期間偶爾顛倒離心管數(shù)次。2.加入IOOul乙二醇，渦懸震蕩10秒，再10000RPM離心2分鐘，移去上下層的液體。3.用500ul的雙蒸水清洗脫蠟的組織兩次，盡量吸去液體，保留組織塊沉淀。4.加入100 μ 1不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(20mMTris-HCl，p H9,TCEP20mM, 鹽酸胍7M)蓋上蓋子，渦懸震蕩數(shù)秒。5.在電熱消解儀或水浴鍋中100°C加熱20分鐘，短暫離心一下，再用組織研磨棒 將組織切片磨碎。6.在電熱消解儀或水浴鍋中60°C加熱2小時(shí)，期間大約每20分鐘取出，震蕩一次。7. 4°C，12000RPM離心15分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml的干凈離心管中。8.加入Iml的沉淀試劑，渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘。9. 40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清保留沉淀。10.加入0. 5ml的沉淀試劑(乙醚與乙醇的混合物，乙醚與乙醇的體積比為1/2)。 渦懸震蕩10秒，在4°C的環(huán)境中保持10分鐘.40C，12000RPM離心15分鐘，去除上清，保留 沉淀.在通風(fēng)櫥中將試管倒置在濾紙上，讓殘余的液體揮發(fā)干凈。11.將固體沉淀溶解于IOOul終濃度lu/ul的benzonase緩沖液中消化，再用沉淀 試劑沉淀后，再溶解于2D sample buffer中，進(jìn)行2D電泳，而后將β-actin和Cytokeratin 的蛋白質(zhì)點(diǎn)取出，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后用來(lái)做MS分析。將新鮮的腎癌組織IOmg按照實(shí)驗(yàn)4-11步驟操作后，比較新鮮的與石蠟包埋腎癌 組織的MS發(fā)現(xiàn)，β -actin和Cytokeratin的MS沒(méi)有明顯的差異。
權(quán)利要求
一種從甲醛固定組織或甲醛固定石蠟包埋組織中提取總蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟1)將甲醛固定的組織用不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑在兩種不同的溫度條件下溫育以釋放被交鏈的蛋白質(zhì)；或者，將甲醛固定石蠟包埋的組織先用脫蠟試劑去蠟后，再用不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑在兩種不同的溫度條件下溫育以釋放被交鏈的蛋白質(zhì)；2)離心并分離上清，上清加入蛋白質(zhì)沉淀試劑后分離并洗滌沉淀，再將沉淀采用合適的溶解試劑溶解獲得甲醛固定的組織或甲醛固定石蠟包埋的組織的總蛋白質(zhì)提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醛固定的組織或甲醛固定石蠟包埋 的組織均為組織切片。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，所述脫蠟試劑包括可以溶解石蠟 的有機(jī)溶劑和與石蠟不相溶的有機(jī)溶劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，將甲醛固定石蠟包埋的組織用脫 蠟試劑去蠟的方法為將石蠟包埋組織先用可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑處理3-5分鐘，而后 再在前述處理液中加入與石蠟不相溶的有機(jī)溶劑處理5-60秒，再將處理后的組織洗滌并 分離。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑與與石蠟不 相溶的有機(jī)溶劑的體積比為5 1-20 1。
6.如權(quán)利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的可以溶解石蠟的有機(jī)溶劑選 自甲苯，二甲苯，D-檸檬烯，正戊烷，正己烷，正庚烷和正辛烷；所述的與石蠟不相溶的有機(jī) 溶劑選自乙醇，甲醇，異丙醇和正丁醇。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，所述的不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽 提試劑由還原試劑、變性試劑和緩沖液組成。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的還原試劑選自巰基乙醇，DTT和TCEP， 在蛋白質(zhì)抽提試劑中的濃度為5-500mM;所述的變性試劑選自尿素，硫尿，鹽酸胍，異硫氰 酸胍，高氯酸鈉和碘化鈉，在蛋白質(zhì)抽提試劑中的濃度為1-9M;所述的緩沖液選自HEPES， MOPS,TRIS,PIPES,MES,Glycine NaOH和Citrate緩沖液體系，在蛋白質(zhì)抽提試劑中的濃度 為lO-lOOOmM，緩沖體系的pH為2-10。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的還原試劑在蛋白質(zhì)抽提試劑中的 濃度為20-200mM ；所述的變性試劑在蛋白質(zhì)抽提試劑中的濃度為3-7M ；所述的緩沖液為 20-200mM pH 5-9的緩沖體系。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述不含有去污劑的蛋白質(zhì)抽提試劑含有 如下組分pH3-9 的 20-200mM Tris-HCl ；TCEP 20-200mM ；異硫氰酸胍3-7M。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，在兩種不同的溫度條件下溫育的 方法為先在30-120°C下溫育10-60分鐘；而后在30-100°C下溫育1_5小時(shí)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在兩種不同的溫度條件下溫育的方法為先在60-120°C下溫育20-60分鐘；而后在30_80°C下溫育1_5小時(shí)。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中，所述蛋白質(zhì)沉淀試劑選自三氯乙 酸，DOC,乙醇，丙酮，硫酸氨，PEG8000,乙醚和二乙醚中的一種或多種的混合。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)沉淀試劑為二乙醚與乙醇的 混合物，二乙醚與乙醇的體積比為1/3-4/1 ；或者所述蛋白質(zhì)沉淀試劑為乙醚與乙醇的混 合物，乙醚與乙醇的體積比為1/2-2/1。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中，所述的合適的溶解試劑選自 laemmli sample buffer、IEF sample buffer、2D sample buffer 或基質(zhì)緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從甲醛固定組織或甲醛固定石蠟包埋組織中提取總蛋白質(zhì)的方法，主要包括以下幾個(gè)步驟采用快速石蠟脫臘試劑將石蠟包埋組織中的石蠟徹底去除干凈，再在雙蒸水洗滌過(guò)的組織薄片中加入蛋白質(zhì)提取試劑，經(jīng)過(guò)兩種不同溫度的溫育過(guò)程，將被甲醛交鏈的幾乎全部蛋白質(zhì)或多肽解鏈并完全釋放出來(lái)，再經(jīng)過(guò)快速蛋白質(zhì)沉淀試劑，將釋放的全部蛋白質(zhì)或多肽完全沉淀出來(lái)。本發(fā)明的方法制備的組織全蛋白質(zhì)提取液可以用于生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)分析，為病理組織切片下游的Western blot，ELISA等免役實(shí)驗(yàn)，MS(質(zhì)譜分析)和以疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床診斷提供了一種快速，安全，方便的途徑。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101985461SQ20101028667
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者李瑞峰, 荀恒杰 申請(qǐng)人:生工生物工程(上海)有限公司