專利名稱：一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體為一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，尤其 是從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取高純度片狀蟲草素晶體的方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草(北蟲草)，又名蛹蟲草(Cordyc印s militaris)，屬子囊菌亞門、麥角 菌科、蟲草屬，是一種珍貴的藥用菌。近年來，由于天然冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis)需 求不斷增長，有限的資源日益枯竭，目前尚未人工規(guī)模化栽培。于是人們開始培育生產(chǎn)周期 短，與天然冬蟲夏草有相似醫(yī)療保健功效的北冬蟲夏草滿足消費(fèi)需求，替代天然冬蟲夏草 的不足，為人工規(guī)?；嘤谋倍x夏草的發(fā)展提供了廣闊的市場和良好的發(fā)展機(jī)遇。人工培育的北冬蟲夏草培養(yǎng)基中含有蟲草素、蟲草多糖等生理活性成份，從殘余 培養(yǎng)基中提取蟲草素、蟲草多糖等保健食品或醫(yī)藥中間體，將能變廢為寶，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效
■、Λ
frff. ο蟲草素是天然冬蟲夏草、人工培育北冬蟲夏草中重要的生理活性成份。蟲草素 (cordycepin)是由腺嘌呤和脫氧戊糖組成，也稱3'-脫氧腺苷(3' -deoxyadenosine)。大量的藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，蟲草素具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自 由基、減肥、提高性功能等作用，表現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景。目前高含量的蟲草素市場價 格昂貴，因此，制備高純度的蟲草素具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和廣闊的市場前景。據(jù)國內(nèi)外所有公開報(bào)道的蟲草素分離純化專利文獻(xiàn)，未從報(bào)道過高純度片狀蟲草 素晶體的制備方法。報(bào)道過的專利文獻(xiàn)中，蟲草素的分離純化工藝比較復(fù)雜，需經(jīng)過不同的 樹脂處理或須借助昂貴的高效液相制備色譜技術(shù)設(shè)備，生產(chǎn)成本高，難于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè) 生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘 基提取高純度片狀蟲草素晶體。一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，是利用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基 殘基中的蟲草素進(jìn)行提取，同時使提取液流經(jīng)大孔樹脂后再次對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘 基進(jìn)行循環(huán)提取和吸附；再將吸附在大孔樹脂上的蟲草素洗脫下來，洗脫液濃縮、結(jié)晶和再 結(jié)晶后得到高純度片狀蟲草素晶體。具體步驟包括
(1)將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內(nèi)，用提取劑對北冬蟲夏草固體培 養(yǎng)基殘基進(jìn)行提??；提取劑流出后用大孔樹脂進(jìn)行吸附，然后流回裝有北冬蟲夏草固體培 養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提??；提取時間為10 20hr ；北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 1 20L 0. 3
0.5L，優(yōu)選為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L ；提取劑為水；
(2)用洗脫劑洗脫大孔樹脂，得到洗脫液；洗脫速度為0.5 2BV/hr ； 北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為Ikg :1 2L ；
洗脫劑為10 50%體積濃度的乙醇水溶液；
(3)取洗脫液濃縮和結(jié)晶，分離固體得到蟲草素粗品；
(4)將蟲草素粗品洗滌和重結(jié)晶，得到高純度片狀蟲草素晶體。步驟(1)中，將粉碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。步驟(1)中，裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔 樹脂的吸附柱的底部入水口，吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基 的容器底部的入水口，提取液的流動方向?yàn)槿萜鞯撞咳胨凇萜魃喜砍鏊凇?附柱底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。步驟(1)中，所用的大孔樹脂為非極性大孔樹脂；可選用H-20型、H-Ol型或H_10 型大孔樹脂，優(yōu)選為H-20型大孔樹脂。步驟(3)中先將洗脫液濃縮至比重為1.05 1. 1，再在0 30°C下結(jié)晶，優(yōu)選的 結(jié)晶溫度為0 4°C。步驟(3)中，用離心或真空抽濾的方法分離固體。步驟(4)中，用75% 99%體積濃度的乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。將步驟(4)重結(jié)晶得到的產(chǎn)品洗滌干燥，用75% 99%體積濃度的乙醇水溶液洗 滌，80 100°C下加熱烘干，或-50 -10°C下低溫冷凍干燥。本發(fā)明的方法，采用大孔吸附樹脂作為分離介質(zhì)，以水、乙醇做為溶劑，在常溫下 連續(xù)動態(tài)地進(jìn)行提取和吸附分離，實(shí)現(xiàn)從北冬蟲夏草培養(yǎng)基中分離制備出高純度片狀蟲草 素晶體，變廢為寶；克服現(xiàn)有蟲草素提取、分離純化技術(shù)的不足，工藝簡單，實(shí)現(xiàn)連續(xù)提取、 分離，所用樹脂不需經(jīng)過酸堿再生可以重復(fù)使用，設(shè)備投資和生產(chǎn)運(yùn)行成本低，環(huán)保，片狀 蟲草素晶體HPLC純度99. 9%以上，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例1高純度片狀蟲草素晶體的HPLC檢測圖譜。
具體實(shí)施例方式用滾軸式不銹鋼刀片粉碎機(jī)對塊狀的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基的殘基進(jìn)行粉碎，主 軸轉(zhuǎn)速為400 600r/min，篩網(wǎng)孔徑為10 20mm，得到北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒。蟲草素含量的測定方法(高效液相色譜法)如下
(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制準(zhǔn)確稱取2. 5毫克蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，用純凈水加熱溶解后定容 到10毫升，冷卻至室溫備用。(2)色譜條件 C18色譜柱(150mm*4. 6mm)；流動相為甲醇水=15 85 ；流速
1.Oml/min ；柱溫 40°C ；檢測波長 258nm。(3)樣品含量測定 準(zhǔn)確稱取2. 5毫克樣品，用純凈水加熱溶解后定容到10毫 升，冷卻至室溫，搖勻，溶解液過0. 22 W m濾膜過濾，L進(jìn)樣，通過樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積來計(jì)算蟲草素的含量。實(shí)施例1
取24. 89公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將桶蓋緊。用隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入，不銹鋼桶上端出來的水提液從下 端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中，不銹鋼柱上端的流出液繼 續(xù)用隔膜泵泵入不銹鋼桶底端，進(jìn)行水循環(huán)提取，同時吸附；隔膜泵開啟時間即提取時間為 16h。提取后以30升30% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，洗脫大孔樹脂柱，流速為lBV/h ； 收集洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為1. 07時停止?jié)饪s。將濃縮液在0 4°C下結(jié)晶，用真空抽濾法將晶體分離出，水洗并熱風(fēng)烘箱干燥得 20. 6克白色蟲草素粗品。取10克上述白色蟲草素粗品溶于85% (V/V)乙醇水溶液中進(jìn)行重結(jié)晶；真空抽濾 分離重結(jié)晶產(chǎn)物，用85%體積濃度乙醇溶液洗滌，80 100°C烘干，得到6. 6克白色的高純 度片狀蟲草素晶體，HPLC檢測純度大于99.9%，如圖1所示。實(shí)施例2
將24. 32公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將桶蓋緊。用隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入，不銹鋼桶上端出來的水提液從下 端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中，不銹鋼柱上端的流出液繼續(xù) 用高壓隔膜泵泵入不銹鋼桶底端，進(jìn)行水循環(huán)提取，隔膜泵開啟時間即提取時間為16h。用30升20% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔樹脂 的不銹鋼柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h ；收集洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重 為1.06時停止?jié)饪s。將濃縮液在0 4°C下結(jié)晶，用真空抽濾法將晶體分離出，水洗并熱風(fēng)烘箱干燥得 19. 7克白色蟲草素粗品。取10克上述白色蟲草素粗品溶于85% (V/V)乙醇水溶液中進(jìn)行重結(jié)晶；真空抽濾 分離重結(jié)晶產(chǎn)物，用85%體積濃度乙醇溶液洗滌，-30°C冷凍干燥，得5. 9克白色的高純度片 狀蟲草素晶體，HPLC檢測純度大于99. 9%。實(shí)施例3
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管 中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將PVC管蓋緊。用蠕動泵將2500ml飲用水從PVC管底端泵入，PVC管上端出來的水提液從下端流 入裝有100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ2.5Χ50(:πι)中，玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動 泵泵入PVC管底端，進(jìn)行水循環(huán)提?。蝗鋭颖瞄_啟時間即提取時間為16小時。用400ml 30% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用蠕動泵將洗脫劑泵入裝有大孔樹脂 的玻璃柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h ；收集洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為 1.05時停止?jié)饪s。將濃縮液在0 4°C下結(jié)晶，用真空抽濾法將晶體分離出，水洗并熱風(fēng)烘箱干燥得
51.8克白色蟲草素粗品。取1克上述白色蟲草素粗品溶于85% (V/V)乙醇水溶液中進(jìn)行重結(jié)晶；真空抽濾 分離重結(jié)晶產(chǎn)物，用85%體積濃度乙醇溶液洗滌，-20°C冷凍干燥，得0.61克白色的高純度 片狀蟲草素晶體，HPLC檢測純度大于99. 9%。實(shí)施例4
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管 中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將PVC管蓋緊。用蠕動泵將2500ml飲用水從PVC管底端泵入，PVC管上端出來的水提液從下端流 入裝有100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ2.5Χ50(:πι)中，玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動 泵泵入PVC管底端，進(jìn)行水循環(huán)提??；蠕動泵開啟時間即提取時間為16小時。用400ml 10% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用蠕動泵將洗脫劑泵入裝有大孔樹脂 的玻璃柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h ；收集洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為 1.09時停止?jié)饪s。將濃縮液在0 4°C下結(jié)晶，用真空抽濾法將晶體分離出，水洗并熱風(fēng)烘箱干燥得 2.1克白色蟲草素粗品。取1克上述白色蟲草素粗品溶于85% (V/V)乙醇水溶液中進(jìn)行重結(jié)晶；真空抽濾 分離重結(jié)晶產(chǎn)物，用85%體積濃度乙醇溶液洗滌，80 100°C烘干，得0. 67克白色的高純度 片狀蟲草素晶體，HPLC檢測純度大于99. 9%。
權(quán)利要求
一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內(nèi)，用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提??；提取劑流出后用大孔樹脂進(jìn)行吸附，然后流回裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提??；提取時間為10～20hr；所述的大孔樹脂為非極性大孔樹脂；北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為1kg1～20L0.3～0.5L；提取劑為水；(2) 用洗脫劑洗脫大孔樹脂，得到洗脫液；洗脫速度為0.5～2BV/hr；北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為1kg1～2L；洗脫劑為10～50%體積濃度的乙醇水溶液；(3) 取洗脫液濃縮和結(jié)晶，分離固體得到蟲草素粗品；(4) 將蟲草素粗品洗滌和重結(jié)晶，得到高純度片狀蟲草素晶體。
2.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，將粉 碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。
3.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，裝有 北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔樹脂的吸附柱的底部入水 口，吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器底部的入水口，提 取液的流動方向?yàn)槿萜鞯撞咳胨凇萜魃喜砍鏊凇街撞咳胨凇?柱上部出水口——容器底部入水口。
4.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述 北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L。
5.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所用 的非極性大孔樹脂為H-20型、H-Ol型或H-IO型大孔樹脂。
6.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中先將洗 脫液濃縮至比重為1. 05 1. 1，再在0 30°C下結(jié)晶。
7.權(quán)利要求1或6所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中結(jié) 晶溫度為0 4°C。
8.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，用離 心或真空抽濾的方法分離固體。
9.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，用 75% 99%體積濃度的乙醇水溶液為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。
10.權(quán)利要求1所述高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，其特征在于，將步驟(4)重結(jié) 晶得到的產(chǎn)品洗滌干燥，用75% 99%體積濃度的乙醇水溶液洗滌，80 100°C下加熱烘 干，或-50 -10°C下低溫冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度片狀蟲草素晶體的制備方法，是利用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中的蟲草素進(jìn)行提取，同時使提取液流經(jīng)大孔樹脂后再次對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行循環(huán)提取和吸附；再將吸附在大孔樹脂上的蟲草素洗脫下來，洗脫液濃縮、結(jié)晶和再結(jié)晶后得到高純度片狀蟲草素晶體。本方法獲得的產(chǎn)品HPLC純度99.9％以上，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H19/16GK101928316SQ20101023513
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者唐亮, 唐永范 申請人:上海國寶企業(yè)發(fā)展中心;上海國寶生物工程研究所