專利名稱：文昌魚糖類模式識別分子Bjfcn1基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文昌魚糖類模式識別分子Bjfcnl基因及其編碼的蛋白PBjf。nl，以及該 蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文昌魚(Branchiostoma Japonicum)屬于脊索動物門(Chordate)，頭索動物亞門 (Cephalochordate)，是現(xiàn)存和脊椎動物親緣關(guān)系最近的無脊椎動物，近年來，對文昌魚免 疫系統(tǒng)的研究引起了廣泛的重視，其中發(fā)現(xiàn)了不少具有重要意義的免疫基因。纖維膠凝蛋白(Ficolin)最初作為一種轉(zhuǎn)化生長因子-β 1 (TGF-β 1)，是從豬 的子宮內(nèi)膜中分離得到的。它是近年來所發(fā)現(xiàn)的天然免疫中一種重要的“一線防御”分 子，也是繼膠原凝素(Collectin)之后的又一種重要的糖類模式識別分子，與膠凝素超 家族中的典型代表甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)在結(jié)構(gòu)和功能上相類似，均具有凝集素活 性。Ficolin含有膠原樣結(jié)構(gòu)域(Collagen-like Domain, CLR)和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域 (Fibrinogen-like Domain, FBG)，而FBG是病原微生物表面寡聚糖樣結(jié)構(gòu)的結(jié)合部位。研 究表明，F(xiàn)icolin家族中的某些成員與病原微生物表面相應(yīng)的糖基配體結(jié)合后，通過補體活 化的凝集素途徑和調(diào)理吞噬作用在天然免疫中發(fā)揮著免疫效應(yīng)。迄今，已在人類中發(fā)現(xiàn)了 3種Ficolin分子，分別是L-ficolin、H-ficolin和 M-ficolin。前兩者主要存在于血清中，后者則為表達于肺和單核細胞膜表面。L-ficolin 每條肽鏈的相對分子量為35kD，包括4個功能區(qū)，即含13個氨基酸的N末端區(qū)；帶有 Gly-Xaa-Yaa三聚體重復(fù)序列(Gly為甘氨酸，Xaa和Yaa為任意氨基酸)的膠原樣區(qū)；一 個由9個氨基酸組成的頸區(qū)及長達209個氨基酸的C末端區(qū)。C末端區(qū)與MBL的糖類識別 區(qū)(Carbohydrate-recognition Domain, CRD)十分相像，其獨立卷曲而形成球形的FBG區(qū)。 3種Ficolin都能結(jié)合GlcNAC，但L-ficolin對甘露糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖無明顯的親和 性。與Ficolin結(jié)合的糖類配體都是病原微生物表面常見的結(jié)構(gòu)成份，主要是脂多糖(LPS) 和甘露糖樣結(jié)構(gòu)。近期又有研究稱，L-ficolin對A型Hmi流感病毒感染小鼠有一定保護 作用，揭示L-ficolin可作為抗流感病毒的新型候選制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的文昌魚糖類模式識別分子Bjfcnl基因及其 編碼的糖類模式識別蛋白PB#。nl。本發(fā)明的另一個目的在于提供文昌魚糖類模式識別蛋白Pwfml的表達方法。本發(fā)明的再一個目的在于提供該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過兼并引物擴增和RACE全長擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到文 昌魚糖類模式識別分子Bjfcnl基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。由文昌魚糖類模式識別分子Bjfcnl基因編碼的糖類模式識別蛋白PBjf。nl，其氨基 酸序列如序列表中<400>2序列所示。該蛋白的等電點為5. 62，分子量為45. 926KDa。
文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl是通過重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl，在大腸桿 菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達的，具體包括以下步驟1)重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl的構(gòu)建；2)將重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)；3)對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21 (DE3)進行培養(yǎng)；4)文昌魚糖類模式識別蛋白PB@nl的提取和純化。所述的表達載體pETSUMO-Bjfcnl 是以 SUM0(Small Ubiquitin-Iike Modifier) 蛋白為分子融合伴體，該系統(tǒng)使重組蛋白在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達。本發(fā)明所選擇的文昌魚屬于中國青島文昌魚(Branchiostoma japonic·)，采自 山東省青島市沙子口水域。本發(fā)明通過兼并引物擴增從文昌魚的cDNA—鏈中克隆得到了部分目標(biāo)片段， 并對該片段進行了擴增，得到了目標(biāo)基因序列的全長克隆，命名為Bjfcnl，其DNA序列如 序列表中<400>1序列所示。該基因編碼422個氨基酸，其氨基酸序列如序列表<400>2 序列所示，含有24個氨基酸的信號肽，去除信號肽的成熟蛋白等電點為5. 62，分子量為 43.418KDa。本發(fā)明通過設(shè)計一對引物，將Bjfcnl基因的成熟蛋白編碼序列克隆到原核融合 表達載體pETSUMO上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pETSUMO-Bjfcnl并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。 此重組表達載體以T7為啟動子，SUMO為分子融合伴體，能幫助重組蛋白正確折疊，以可溶 的形式表達，其C端有6XHis結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。該重組 蛋白編碼518個氨基酸，等電點為6. 21，分子量為57. 625KDa。通過對培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)時間 和溫度等條件的摸索和優(yōu)化，重組蛋白PBjf。nl的表達量較高，大部分處于可溶狀態(tài)。本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組蛋白PBjf。nl的純化條件，表達產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng) Ni-NTAAgarose親和色譜層析，得到純度較高的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明的表達質(zhì)粒復(fù)制方法參照SBjbrook(SBjbrook，et al. 1989，Molecular doing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)方法，通過CaCl2 的方法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化Ε. coli.DH5a或BL21(DE3)菌株，用含氨芐青霉素(lOOyg/mL)的2XYT培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn) 化菌株，用Omega公司試劑盒提取質(zhì)粒。本發(fā)明的文昌魚糖類模式識別蛋白PB#。nl初步驗證，能較為廣泛結(jié)合細菌表面的 多糖，并且有明顯的細菌結(jié)合、細菌凝集作用，可開發(fā)為天然的抑菌活性物質(zhì)以及制備治療 感染性疾病的藥物。


圖1為本發(fā)明所述的文昌魚糖類模式識別蛋白 f。nl與其它物種Ficolin家 族成員蛋白的序列比較結(jié)果。其中，Hm表示人類；Mm表示小鼠；Xe表示爪蟾；As表示海 鞘。用于進化分析的序列包括以下這些Hm_FCN_l(NP_001994) ；Hm_FCN_2 (NP_004099)； Hm_FCN_3 (NP_003656) ；Mm_FCN_A(NP_032021) ；Mm_FCN_B(NP_034320) ；Xe_ FCN_1(NP_001082604) ；Xe_FCN_3(NP_001079138) ；Xe_FCN_4(NP_001079139) ；As_ FCN_1(BAB60704) ；As_FCN_3(BAB60706) ；As_FCN_l(BAB60707)。圖2為擴增得到的Bjfcnl基因全長片段。其中，1表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；
42表示PCR擴增得到的產(chǎn)物。圖3為Bjfcnl基因的重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl的構(gòu)建流程圖。圖4為構(gòu)建重組表達載體時，Bjfcnl基因用限制性酶HindIII、Xh0 I酶切后的電 泳圖。其中，1表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) ；2表示酶切后的Bjfcnl基因片段。圖5為構(gòu)建重組表達載體時，pETSUMO載體用限制性酶Hindlll、Xho I酶切后的 電泳圖。其中，1表示酶切前的pETSUMO質(zhì)粒；2、3表示酶切后的pETSUMO質(zhì)粒。圖6為文昌魚糖類模式識別蛋白 f。nl經(jīng)誘導(dǎo)表達后的蛋白電泳圖。其中，1表示 未經(jīng)誘導(dǎo)的PBjf。nl菌體總蛋白；2表示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的PBjf。nl菌體總蛋白；3表示誘導(dǎo)菌超聲 沉淀總蛋白；4表示誘導(dǎo)菌超聲上清總蛋白；M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖7為文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl經(jīng)Ni柱純化后的蛋白電泳圖。其中，1表 示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2表示純化的文昌魚糖類模式識別蛋白PB@nl。圖8表示文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl的紅細胞凝集活性實驗。圖9表示文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl與細菌結(jié)合及凝集實驗。
具體實施例方式下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明。實施例1 文昌魚總RNA的提取和Bjfcnl部分片段的擴增取文昌魚全魚，采用Trizol試劑法提取總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白 質(zhì)，獲得文昌魚總RNA。取1 μ g總RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTraAce-α-TM(code No. FSK-100)說明書操作，進行逆轉(zhuǎn)錄 合成第一鏈。取2μ1 cDNA —鏈產(chǎn)物，以根據(jù)其他ficolin家族基因設(shè)計的兼并 弓I 物 5 ‘ PCR Primer 5 ‘ -ACAGCCAGTGGAGTCTACCCACTTG-3 ‘和 3 ‘ PCR Primer 5' -TCAGGGAGTAATACCAGCCTTTCCA-3‘為引物，進行PCR擴增 Bjfcnl 的部分片段 582bp。將 擴增得到的目標(biāo)片段連接到pGEX T easy vector (promega)后，轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑選 重組克隆測序。Blast同源分析表明，獲得的這個片段含有FBG結(jié)構(gòu)域，屬于Ficolin家族 成員。實施例2 =RACE擴增Bjfcnl基因5'和3'末端按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit進行RNA的去磷酸化RACE、脫帽反應(yīng)、 RNA oligo的連接及mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA—鏈，采用Takara的LA Taq聚合 酶，按照GeneRacerTM Kit的反應(yīng)體系進行PCR擴增。其中，根據(jù)實施例1擴增得到的 Bjfcnl部分片段，設(shè)計進行5' RACE擴增的基因特異的外套引物為5' -gene-specific primer 5 ‘ -TCATCCCAGTCCATCAGGTCAAAC-3 ‘，內(nèi)巢引物為 5 ‘ -nested primer 5 ‘ -TGTTCCCGAAGCCCTGTTTGTAC-3 ‘ ；3 ‘ RACE擴增的基因特異的外套引物為 5 ‘ -gene-specific primer 5 ‘ -GGAGGAGTACAAACAGGGCTTCG-3 ‘；內(nèi)巢引物為 5' -nested primer -ACGAGAACATCCACCTCCTGACTG-3‘。將擴增得到的目標(biāo)片段連接 到pGEX T easy vector (promega)后，轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑選重組克隆測序，并與實施 例1得到的目標(biāo)片段進行拼接，得到Bjfcnl基因的全長序列，長度為2583bp，編碼422個氨 基酸的BjFCNl蛋白。實施例3 =Bjfcnl全長序列的擴增及序列分析
根據(jù)實施例2拼接得到的Bjfcnl序列，設(shè)計引物 5' -TGCGTCCAAGAAGCTGTTCCCA-3‘和 5' -TGATTTTGTGGATAACTGGGTGTGA-3‘，采用 Takara 的LA Taq聚合酶擴增Bjfcnl的ORF框基因，擴增得到的1405bp片段的電泳圖譜如圖2所 示。將擴增得到的目標(biāo)片段連接到PGEX T easy vector (promega)后，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿 菌，挑選重組克隆測序。Blast同源分析表明，獲得了 Bjfcnl基因的全長序列。實施例4 重組Bjfcnl表達質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)Bjfcnl基因的兩端序列合成一對引物，其中，上游引物含HindIII切割位點， 下游引物含Xho I切割位點。上游引物(Pl):5，-CCC AAGCTT cATGCGGGACCAGCAGATGGCTTTC-3，保護堿基 HindIII Bjfcnl基因序列下游引物(P2):5，-ccg CTCGAG TTGTGGCCTGATTTTCATAG-3，保護堿基 Xho I Bjfcnl基因序列以含有Bjfcnl基因的pGEX質(zhì)粒為模板，PU P2為引物，進行PCR擴增，得到特異 擴增的單一條帶，產(chǎn)物大小在1211bp左右。將所獲得的PCR擴增產(chǎn)物克隆到原核融合表達 載體pETSUMO上，得到重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl (其構(gòu)建過程如圖3所示)。重組表達 載體pETSUMO-Bjfcnl中的外源基因經(jīng)測序鑒定正確。實施例5 文昌魚糖類模式識別蛋白PB@nl的表達將重組表達載體pETSUMO-BjFCNl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳?解上清液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達產(chǎn)物帶，分子量與 用軟件DNA T00LS6. O預(yù)測的理論值產(chǎn)生部分誤差，蛋白電泳得到PBjf。nl的分子量為64KDa。 對培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)濃度、溫度等條件的摸索得出，基因工程菌的培養(yǎng)條件為將單菌落接種 于30ml含有100mg/L氨芐青霉素抗性2 X YT液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)過夜；取過 夜培養(yǎng)物按1 100的比例接種于含有氨卞青霉素的2XYT培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng) 至0D600 = 0. 6，加入終濃度為0. 2mM的IPTG，18°C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜后，離心，收集菌 體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明在該培養(yǎng)條件下，重組蛋白PBjf。nl的表達量占菌體總蛋白 的50%以上，處于可溶狀態(tài)。實施例6 文昌魚糖類模式識別蛋白PB@nl的純化將總菌體用TBS溶液(50mM Tris. Cl,150mM NaCl，pH7. 5)進行洗滌，再用適量的 TBS溶液懸浮，超聲處理后，裂解上清液進行親和色譜層析純化，通過SDS-PAGE分析重組蛋 白的表達和層析的結(jié)果。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出重組蛋白PBjf。nl能被Ni-NTAAgarose 親和柱吸附，用IOOmM咪唑洗柱時，能把目標(biāo)蛋白PB#。nl洗脫下來。收集得到目標(biāo)蛋白的洗 脫峰后，經(jīng)凝膠柱除去蛋白中的咪唑，并用蛋白超濾柱(Millipore)進行濃縮，得到成份單 一且濃度較高的文昌魚糖類模式識別蛋白PB#。nl (如圖7所示)。實施例7 文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl的紅細胞凝集活性分析取鼠新鮮血液，2000rpm離心IOmin除去血漿，加10倍體積的TBS溶液充分洗滌， 然后IOOOrpm離心3min，去上清，重復(fù)三次，最后經(jīng)2500rpm離心3min，配成2% (V/V)的紅 細胞懸浮液?；盍y定在96孔V型血凝板中進行，先在各孔中加入的2% (V/V)的TBS紅 細胞懸浮液，再往其中加重組蛋白PBjf。nl樣品，以及不同濃度的Ca2+、EDTA蛋白溶液，同時以 SUMO單體蛋白為陰性對照。溫和混勻，在室溫下放置1 2h，肉眼觀察。加入SUMO的紅細
6胞不發(fā)生凝集則在管底沉積，而加入重組蛋白PBjf。nl和Ca2+的孔中則發(fā)生了凝集，紅細胞之 間形成一似網(wǎng)絡(luò)擴散的紅斑塊(如圖8所示)。實施例8 文昌魚糖類模式識別蛋白PBjf。nl的細菌結(jié)合及凝集活性分析各菌體細胞用TBS-Ca2+緩沖液(TBS緩沖液中加入IOmM CaCl2)調(diào)節(jié)0D600濃度 至2. 0，與適量重組蛋白PBjf。nl混勻，并在4°C搖床中孵育過夜。之后，各菌體用TBS-Ca2+緩 沖液洗滌非特異結(jié)合蛋白，再各加入30μ1 SDS-PAGE樣品緩沖液，于100°C煮樣15min。最 后通過SDS-PAGE和Western Blot進行檢測(如圖9A所示)。重組蛋白PBjf。nl與各菌體均 有明顯的結(jié)合作用。各菌體細胞用TBS緩沖液調(diào)節(jié)0D600濃度至3. 0，然后與50 μ 1的FITC混勻，于室 溫暗室中熒光標(biāo)記1小時，之后用TBS-Ca2+緩沖液洗滌4次。各標(biāo)記混合物加入適量含有 Ca2+的重組蛋白PBjf。nl，以SUMO單體蛋白為陰性對照，于室溫下孵育1小時。最后用熒光顯 微鏡進行鏡檢(如圖9B所示)。重組蛋白PBjf。nl能明顯凝集大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌以 及金黃色葡萄球菌。
權(quán)利要求
通過兼并引物擴增和RACE全長擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到的文昌魚糖類模式識別分子Bjfcn1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.由權(quán)利要求1所述的文昌魚糖類模式識別分子Bjfcnl基因編碼的糖類模式識別蛋 白PB@nl，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.權(quán)利要求2所述的糖類模式識別蛋白Pwfml的表達方法，其特征在于通過重組表達 載體pETSUMO-Bjfcnl，在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達方法，包括以下步驟1)重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl的構(gòu)建；2)將重組表達載體pETSUMO-Bjfcnl轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)；3)對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)進行培養(yǎng)；4)糖類模式識別蛋白PBjf。nl的提取和純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達方法，其特征在于，在步驟1)中所述的重組表達載體 pETSUMO-Bjfcnl的構(gòu)建包括以下步驟a)依據(jù)權(quán)利要求1所述的Bjfcnl基因的兩端序列合成一對引物，其中，上游引物Pl為 5，-cccAAGCTTcATGCGGGACCAGCAGATGGCTTTC-3，，含有 HindIII 切割位點；下游引物 P2 為 5 ，-ccgCTCGAGTTGTGGCCTGATTTTCATAG-3，，含有 Xho I 切割位點；b)以含有Bjfcnl基因的pGEMT easy vector質(zhì)粒為模板，以P1、P2為引物，進行PCR 擴增；c)將PCR擴增產(chǎn)物克隆到原核融合表達載體pETSUMO上，得到重組表達載體 pETSUMO-Bjfcnlο
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達方法，其特征在于，步驟3)的培養(yǎng)條件為將單菌落接 種于30ml含有l(wèi)OOmg/L氨芐青霉素抗性2 X YT液體培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)過夜；取 過夜培養(yǎng)物按1 100的比例接種于含有氨卞青霉素的2XYT培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培 養(yǎng)至0D600 = 0. 6，加入終濃度為0. 2mM的IPTG，18°C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜后離心收集菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達方法，其特征在于在步驟4)中，將總菌體用Tris緩沖 液洗滌后，再懸浮，超聲處理后，高速離心，裂解上清液經(jīng)Ni-NTA Agarose親和色譜層析純 化，收集目標(biāo)蛋白的洗脫峰。
8.權(quán)利要求2所述的糖類模式識別蛋白PBif。nl在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及文昌魚糖類模式識別分子Bjfcn1基因及其編碼的蛋白PBjfcn1，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過兼并引物擴增和RACE全長擴增的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到Bjfcn1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的蛋白PBjfcn1的氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本發(fā)明的糖類模式識別蛋白初步驗證能較為廣泛結(jié)合細菌表面的多糖，并且有明顯的細菌結(jié)合、細菌凝集作用，可發(fā)展為天然的抑菌活性物質(zhì)以及制備治療感染性疾病的藥物。
文檔編號C07K14/435GK101914546SQ201010234908
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者余英才, 元少春, 徐安龍, 李銳, 王昕 , 董美玲, 黃慧清, 黃盛豐 申請人:中山大學(xué)