專利名稱：含單鏈dna結(jié)合蛋白的融合蛋白及其表達(dá)和純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)，更具體地說，本發(fā)明涉及含單鏈DNA結(jié) 合蛋白(single-stranded DNA binding protein, SSB)的融合蛋白的表達(dá)與純化方法。
背景技術(shù)：
目前大量生物的基因組序列已經(jīng)得到，隨著DNA重組技術(shù)的進(jìn)步，基因的克隆及 在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)這些基因已經(jīng)成為一項簡單的技術(shù)。而對蛋白質(zhì)功能的生化闡明 需要得到高純度的蛋白質(zhì)。 有很多種方法能將蛋白質(zhì)從生物樣品中的其它組分中分離純化出來。這些方法包 括利用它們的電荷不同進(jìn)行分離的離子交換層析，利用分子大小進(jìn)行分離的排阻層析，以 及親和層析。親和層析是利用一個蛋白和特定分子之間的專一作用而衍生出來的純化方 法，如抗體與抗原之間的專一性結(jié)合，因而它具有更高的特異性，比其它純化方法更有效。 相互配對的一個部分可以作為目的蛋白的"標(biāo)簽"，而另一個作為親和配基。可以通過重組， 使該"標(biāo)簽"以融合蛋白的形式表達(dá)。然后，帶標(biāo)簽的融合蛋白與它的配基通過親和作用力 得到純化。如有需要，可通過專一性切割去除標(biāo)簽得到原來的蛋白。然而，已知的親和層析 存在諸如純化效率不高，所需時間長，花費大，以及洗脫條件特殊等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種簡單高效并能經(jīng)濟(jì)地表達(dá)和純化 重組蛋白的方法和體系。 本發(fā)明的一個目的是提供一類質(zhì)粒表達(dá)載體，該質(zhì)粒包含啟動子和一段編碼融合 蛋白的多核苷酸序列；其中編碼融合蛋白的多核苷酸序列與啟動子恰當(dāng)?shù)剡B接，因此融合 蛋白的轉(zhuǎn)錄受該啟動子控制；該融合蛋白包含一個單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和一個直接或 間接融合在SSB的C端或N端的目的蛋白或多肽；該融合蛋白能夠與單鏈DNA結(jié)合。
本發(fā)明的一個方面是提供了一種純化目的蛋白的方法。具體地說，該方法包括將 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，其中該表達(dá)載體包含啟動子和與之恰當(dāng)連接的多核苷酸序列，該 多核苷酸序列編碼一個由SSB與目的蛋白組成的融合蛋白，目的蛋白直接或間接地連接在 SSB的C端或N端，使得該融合蛋白可以與單鏈DNA相結(jié)合；在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞， 使融合蛋白表達(dá)；裂解宿主細(xì)胞得到細(xì)胞裂解液；將細(xì)胞裂解液與固定了單鏈DNA的介質(zhì) 接觸，使融合蛋白結(jié)合到該介質(zhì)的單鏈DNA上；清洗介質(zhì)以除去雜質(zhì)；再將結(jié)合的融合蛋白 從介質(zhì)上洗脫下來；這樣，目的蛋白就以融合蛋白的形式得到表達(dá)和純化。
本發(fā)明的另一方面是提供一種融合蛋白，它包括SSB和直接或間接地連接于SSB 的C端或N端的目的蛋白或多肽，其中該融合蛋白能夠與單鏈DNA結(jié)合；因此該融合蛋白可 以通過固定了單鏈DNA的介質(zhì)進(jìn)行純化。 本發(fā)明在表達(dá)及純化蛋白質(zhì)上具有明顯的優(yōu)點。首先，該融合蛋白是可溶的，并可 在生理條件下直接用單鏈DNA纖維素進(jìn)行親和純化。第二，在單鏈DNA纖維素一步層析中，前面提到的融合蛋白同細(xì)胞裂解液中其它蛋白和雜質(zhì)的分離效率很高，明顯優(yōu)于其它親和 層析，如鎳-瓊脂糖親和層析。第三，僅通過提高鹽(KCl或NaCl)濃度的辦法，就可以從單 鏈DNA纖維素中洗脫下該融合蛋白，這使得從單鏈DNA纖維素回收前面提到的融合蛋白非 常簡單并且高效。 本發(fā)明的目的及優(yōu)點可以從下面的有詳細(xì)描述的幾個實施例中得到很好的體現(xiàn)， 這些實施例附有相關(guān)的圖表。


圖lA是一系列pSSB-B表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，包括pSSB-Bl的圖示表征。這一系列質(zhì) 粒適用于細(xì)菌宿主。同時還給出了 pSSB-B、pSSB-B2、pSSB-B3和pSSB_B4質(zhì)粒的專一蛋白 酶酶切位點。另外，在pSSB-B3和pSSB-B4質(zhì)粒中，SSB的N端還附加了一個六組氨酸的標(biāo) 簽。 圖IB是一系列pSSB-Y表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，包括pSSB-Yl的圖示表征。這一系列質(zhì) 粒適用于裂殖酵母宿主。同時還給出了 pSSB-Bl、pSSB-B2、pSSB-B3和pSSB-B4質(zhì)粒的專一 蛋白酶酶切位點。此外，還標(biāo)明了 pSSB-Yl或pSSB-Y2表達(dá)載體中的六組氨酸的標(biāo)簽，SSB， 腸激酶或凝血酶切割位點，以及多克隆位點。 圖1C是一系列pSSB-I表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，包括pSSB-Il的圖示表征。這一系列質(zhì) 粒適用于昆蟲細(xì)胞宿主。同時還給出了 pSSB-Il、pSSB-I2、pSSB-I3和pSSB-I4質(zhì)粒的專一 蛋白酶酶切位點。在pSSB-13和pSSB-I4表達(dá)載體中，SSB的N端還有一個六組氨酸的標(biāo) 簽。 圖ID是一系列pSSB-H表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，包括pSSB-Hl的圖示表征。這一系列質(zhì) 粒適用于人細(xì)胞宿主。同時還給出了 pSSB-Il、pSSB-I2、pSSB-I3和pSSB-I4質(zhì)粒的專一蛋 白酶酶切位點，在pSSB-H3和pSSB-H4表達(dá)載體中，SSB的N端還有一個六組氨酸的標(biāo)簽。
圖2顯示了融合蛋白6His-SSB-Sapl，6His-Sapl和6His-GST-Sapl在大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中過表達(dá)的表達(dá)水平。從可溶性組分電泳道上可以看到，這三 種融合蛋白在細(xì)胞裂解液中都是可溶的。圖中還給出了沒有表達(dá)融合蛋白的負(fù)對照組。所 有數(shù)據(jù)中的麗是分子量(molecular weight)的縮寫。kDa是kilo-Dalton的縮寫。
圖3A給出了融合蛋白6His-SSB-S即l經(jīng)過單鏈DNA纖維素親和層析純化的結(jié)果。 取全細(xì)胞提取液進(jìn)行單鏈DNA纖維素親和層析。不結(jié)合的蛋白及其它雜質(zhì)直接從單鏈DNA 纖維素柱中流出。結(jié)合的6His-SSB-S即l在鹽濃度約0. 4MKC1時從單鏈DNA纖維素上洗脫 下來。 圖3B顯示的是經(jīng)單鏈DNA纖維素親和層析純化的6His-SSB-S即l能夠很好地與 鎳-瓊脂糖結(jié)合，并在咪唑(imidazole)濃度250mM時洗脫下來。此結(jié)果表明，若需要， 6His-SSB-S即l可以用鎳柱進(jìn)一步純化。 圖4是細(xì)胞裂解液中的融合蛋白SSB-Fenl用單鏈DNA纖維素柱進(jìn)行純化的結(jié) 果Fenl是人細(xì)胞里的一種DNA片段內(nèi)切酶1 (human fl即endo皿cleasel)。融合蛋白 SSB-Fenl在E. coli細(xì)胞中過表達(dá)。含有SSB-Fenl的細(xì)胞裂解液進(jìn)行ssDNA纖維素親和層 析。結(jié)合的SSB-Fenl在鹽濃度約0. 4M KC1時洗脫下來。 圖5是細(xì)胞裂解液中的6His-GST-S即l用還原型谷胱甘肽(glutathione)-s印harose 4B進(jìn)行純化的結(jié)果。融合蛋白6His-GST-S即l在E.coli細(xì)胞 中過表達(dá)。包含6His-GST-S即l的細(xì)胞裂解液用還原型谷胱甘肽-S印harose4B進(jìn)行親和 層析。當(dāng)柱子用不含還原型谷胱甘肽的緩沖液充分洗滌后，結(jié)合的GST-S即1首先用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫殘留于柱的GST-S即1用0. 5% SDS才從還原型谷胱甘肽-S印harose 4B上進(jìn)一步洗脫下來。 圖6是細(xì)胞裂解液中的6His-S即l用鎳-瓊脂糖親和層析純化的結(jié)果。6His-S即l 在E. coli細(xì)胞中過表達(dá)。含6His-S即l的細(xì)胞裂解液過鎳柱，并用含20mM咪唑的緩沖液 洗幾個柱體積，以除去不結(jié)合的蛋白及其它雜質(zhì)。結(jié)合的6His-S即l用250mM咪唑洗脫下來。 圖7是從人細(xì)胞裂解液中純化SSB-S即1的結(jié)果。SSB-S即1在人細(xì)胞中過表達(dá)。 含SSB-S即1的人細(xì)胞裂解液進(jìn)行單鏈DNA纖維素親和層析。通過分步梯度洗脫的辦法，大 部分結(jié)合的SSB-Sapl在鹽濃度0. 2至1. 0M KC1時被洗脫下來。圖7_9中的SSB-Sapl條 帶標(biāo)明了該蛋白在SDS-PAGE膠中的位置。 圖8是從昆蟲細(xì)胞裂解液中純化SSB-S即1的結(jié)果。SSB-S即1在昆蟲細(xì)胞中過 表達(dá)。含SSB-S即1的昆蟲細(xì)胞裂解液進(jìn)行單鏈DNA纖維素柱親和層析。大部分結(jié)合的 SSB-Sapl在鹽濃度0. 2至1. 0M KC1時被洗脫下來。 圖9是從裂殖酵母細(xì)胞裂解液中純化SSB-S即1的結(jié)果。SSB-S即1在裂殖酵母細(xì) 胞中過表達(dá)。含SSB-S即1的酵母細(xì)胞裂解液進(jìn)行單鏈DNA纖維素親和層析。大部分結(jié)合 的SSB-Sapl在鹽濃度0. 2至1. 0M KC1時被洗脫下來。 圖10是6His-SSB-S即l用凝血酶切割，并用鎳_瓊脂糖層析除去6His-SSB的結(jié) 果。
具體實施例方式
下面結(jié)合一些具體細(xì)節(jié)進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明，以使本發(fā)明更容易被理解。應(yīng) 理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的 具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進(jìn)行。 本文中涉及到的文獻(xiàn)引用，直接顯示于本文中，這樣，能更好地明示本發(fā)明中所用 的技術(shù)。 本發(fā)明在操作中將用到分子生物學(xué)(包括DNA重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物 學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)已為人們熟知，若如無例外，將不再特別指出。 這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已經(jīng)有很好的描述，如Molecular Cloning :ALaboratory Ma皿al，第二 片反(Sambrook et al. ，1989) ;Current Protocols in MolecularBiology(F. M. Ausubel et al. ， eds. ， 1987)。 本發(fā)明的一個方面，提供了一類表達(dá)載體，這類載體能在原核生物(如大腸桿菌) 和真核細(xì)胞(如酵母，昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)融合蛋白。"融合蛋白"是一個由多 肽鏈相互連接形成的嵌合分子。不同的多肽鏈可以直接相連，也可以通過一個或多個多肽 連接片段相互連接嵌合分子中所指的"連接片段"可以是任何能連接嵌合分子組成成分的 分子。當(dāng)嵌合分子為融合蛋白時，連接片段可以是包含于融合蛋白中的一段多肽。
融合蛋白包含一個單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)。這里提到的SSB指任何可以結(jié)合單鏈DNA的蛋白或多肽鏈；所以，當(dāng)目的蛋白或多肽鏈融合在SSB的C端或N端時，融合蛋白 可以通過SSB結(jié)合到單鏈DNA上得到純化當(dāng)單鏈DNA被固定到一個介質(zhì)上， 一種有效的親 和層析純化體系就被建立起來了，它可以被用來純化含SSB的融合蛋白；這樣，目的蛋白可 以很容易地被表達(dá)和純化。 適合本發(fā)明的SSB可以是來自于任何有機(jī)體的作為基因組功能的一部分正常表 達(dá)的天然蛋白。例如，T7噬菌體表達(dá)了一個分子量為25.6kDa的單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB) (Dunn jj， Studier FW(1983)Complete nucleotide sequence ofbacteriophage T7 DNA and the location of T7 genetic elements. J Mol Biol. 166(4) :477-535)。在生理條 件下，該蛋白以同源二聚體形式存在，是一個可溶性很高的蛋白。該蛋白能特異地結(jié)合單鏈 DNA，親和性高，且無序列特異性。在鹽濃度1. 0M時，T7SSB與單鏈DNA分離。用于融合蛋 白的SSB也可以是天然SSB蛋白的一個片段或變異或經(jīng)過改變的SSB。還可以從人工序列 庫篩選具有單鏈DNA結(jié)合能力的蛋白，如噬菌體展示，得到合適的單鏈DNA結(jié)合蛋白。當(dāng)篩 選到的SSB更小時，它有可能優(yōu)于天然蛋白，因為不需要再將SSB從融合蛋白中除去。在很 多情況下，當(dāng)SSB融合蛋白具有正常的生物活性和生物功能時，可能沒有必要除去SSB。
在特定實施例中，融合蛋白包含一段置于SSB和目的蛋白之間并可切割的連接序 列，以便用化學(xué)方法或酶解除去融合蛋白中的SSB。顯然，可切割序列可以根據(jù)使用者的意 愿，置于融合蛋白的任何位置。在表達(dá)載體中，可切割序列包含一段編碼一個特定氨基酸或 幾個氨基酸的序列，在這些氨基酸的C端可以進(jìn)行化學(xué)切割或酶解。 可用于切割的化學(xué)試劑有溴化氰(cyanogen bromide) ， BNPS-skatole (2_ (2-nitr ophenylsulfenyl)_3_bromo_3'_methylindolinium)禾口羥胺(hydroxyl咖ine)等。溴化氰 在甲硫氨酸殘基的C端進(jìn)行切割。BNPS-skatole在色氨酸殘基的C端進(jìn)行切割。羥胺在天 冬酰胺-z的C端進(jìn)行切割，Z可以是甘氨酸，亮氨酸或丙氨酸。 可用于切割的酶有胰蛋白酶(trypsin),木瓜蛋白酶(papain),胃蛋白酶 (p印sin)，血纖維蛋白溶酶(plasmin)，凝血酶(thrombin)，腸激酶(enterokinase)等。每 一個都對識別的特定氨基酸序列進(jìn)行切割。例如腸激酶，識別氨基酸序列-(天冬氨酸) n_賴氨酸-(n為2至4的整數(shù))。 在特定實施例中，融合蛋白包含一個或多個其它的純化標(biāo)簽。例如，六個組氨 酸殘基融合到SSB的N端或C端，這樣純化含六個組氨酸殘基和SSB的融合蛋白時，可 以將鎳-瓊脂糖和固定了單鏈DNA的介質(zhì)結(jié)合起來。純化后，SSB和六組氨酸殘基部 分可以用化學(xué)方法或酶解除去。事實上，任何純化標(biāo)簽在這里都是適用的，包括myc標(biāo) 簽，HA標(biāo)簽，F(xiàn)lag-p印tide， KT3印itope， alpha-tubulin epitope, T7gene 10protein p印tide標(biāo)簽，GST(glutathione_S_transferase) ，str印標(biāo)簽，牛胰蛋白酶抑制劑(bovine pancreatictrypsin inhibitor, BPTI)禾口麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein, MBP)。 表達(dá)載體由核苷酸構(gòu)成，通過重組或合成得到，含有能在宿主中有效表達(dá)基因或 cDNA的元件，這些序列與宿主是相容的。重組表達(dá)載體包括一個或多個調(diào)控序列，這些序 列恰當(dāng)?shù)嘏c編碼核苷酸序列相連，使核苷酸能夠轉(zhuǎn)錄為mRNA，并翻譯得到目標(biāo)蛋白。這里， "調(diào)控序列"是一種籠統(tǒng)的說法，它包含啟動子，增強(qiáng)子或其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸 化信號)。這些調(diào)控序列為該領(lǐng)域里的人所熟知。(例如，Goeddel (1990)Gene ExpressionTechnology :Meth. Enzymol. 185， Academic Press, San Diego， Calif.)
在特定實施例中，表達(dá)載體是一系列構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體(pSSB)，保證SSB融合 蛋白可以在廣泛的宿主細(xì)胞中表達(dá)pSSB-Bl-B4用于細(xì)菌中的表達(dá)，pSSB-Yl-Y2用于酵母 中的表達(dá)，pSSB-11-14用于昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，pSSB-Ml-M4用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)(圖1)。 在插入編碼目的蛋白的DNA序列之前，一個典型表達(dá)載體包含1)啟動子區(qū)域；2) —個5' 非編碼序列；3)蛋白編碼區(qū)；4) 一個3'非編碼序列；5)轉(zhuǎn)錄終止位點。蛋白編碼區(qū)的構(gòu)建 保證目的蛋白序列能容易地插入并形成融合蛋白。例如，蛋白翻譯區(qū)包含一個來自噬菌體 T7的編碼SSB的DNA片段，即699bp的T7基因2. 5的DNA序列。在特定實施例中，專一的 蛋白酶(如凝血酶或腸激酶)識別位點插到SSB的C端或N端附近多克隆位點也設(shè)計在這 些蛋白酶酶切位點的下游或上游，編碼目的蛋白或多肽的DNA序列可以由此插入此外，其 它純化標(biāo)簽也可以包含在"蛋白編碼區(qū)"中。更佳的，目的多肽可以與組成型啟動子或可誘 導(dǎo)的/組織特異性啟動子恰當(dāng)?shù)剡B接。 在特定實施例子中，表達(dá)載體可以來自科斯質(zhì)粒(cosmids)或病毒。例如可以 用復(fù)制缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)，腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相關(guān)的病毒 (adeno-associated viruses)。表達(dá)載體的另一個例子是酵母人工染色體(YAC)，包含一 個中心粒和兩個端粒，使YAC可以作為小的線性染色體得到復(fù)制。大量已經(jīng)商業(yè)化的恰當(dāng) 的表達(dá)體系可以通過改進(jìn)，使它適用本專利的載體。這里闡述的表達(dá)體系包含(但不局限 于)桿狀病毒(baculovirus)表達(dá)載體。 如上所述，表達(dá)載體克隆，構(gòu)建和擴(kuò)增的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。因此，SSB融合蛋白 的表達(dá)載體可以用常規(guī)的步驟構(gòu)建；為了不使本發(fā)明變得費解，這里就不再提供進(jìn)一步的 細(xì)節(jié)。 本發(fā)明的另一方面，提供了一個以融合蛋白形式對目的蛋白進(jìn)行純化的方法，該 融合蛋白利用SSB作為標(biāo)簽。根據(jù)DNA在細(xì)胞中以雙鏈形式存在的特性，大量的蛋白能夠 以不同的親和力與雙鏈DNA結(jié)合，但是能與單鏈DNA結(jié)合的蛋白極少。SSB是在進(jìn)化過程中 選擇并保留下來，在DNA復(fù)制階段，它在DNA復(fù)制叉處結(jié)合并保護(hù)單鏈DNA的蛋白。簡單來 說，將前面描述的SSB融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒引入相容的宿主細(xì)胞中；在合適條件下培養(yǎng)宿 主細(xì)胞使融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；裂解細(xì)胞得到細(xì)胞裂解液；將細(xì)胞裂解液與固定了 單鏈DNA的親和介質(zhì)接觸；洗去雜質(zhì)；洗脫得到融合蛋白。 這里用到的術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括可以轉(zhuǎn)化并表達(dá)SSB融合蛋白的重組表達(dá)載體 的任何細(xì)胞或細(xì)胞系。合適的宿主細(xì)胞包括(但不局限于)海藻細(xì)胞，細(xì)菌(如大腸桿菌)， 酵母細(xì)胞(如出芽酵母，裂殖酵母)，真菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，無脊椎動物細(xì)胞(如SF9昆蟲細(xì) 胞等)，以及脊椎動物細(xì)胞，包括哺乳動物細(xì)胞。例如，表達(dá)體系包括在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿 狀病毒載體。 一個用細(xì)胞提取物的體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系也可被用于生產(chǎn)SSB融合蛋白。
編碼SSB融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒可以通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入宿主細(xì) 胞。本發(fā)明包含所有可以將核酸引入宿主細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)。 本發(fā)明的親和介質(zhì)包含固定化的單鏈DNA，作為結(jié)合SSB融合蛋白中SSB的配 基。配基與介質(zhì)通過共價或非共價形式結(jié)合。介質(zhì)包括固體(solids)，凝膠(gels)， 槳體(pastes)，膜(membranes)或者槳料(slurries)等。合適的基質(zhì)材料包括(但不 局限于)玻璃(glass)，珠子(beads),孔徑可控玻璃(controlled pore glass)，磁珠(magnetic beads)，各種膜或各種剛性多聚樹脂如聚苯乙烯(polystyrene)，聚苯乙烯乳 劑(polystyrene/latex)，以及其它天然或人工合成的有機(jī)或無機(jī)多聚體。具體來說，多 聚體包括聚乙烯，聚丙烯(polypropylene)，聚4-甲基丁烯(poly(4-methylbutene))， 聚苯乙烯(polystyrene)，聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)，聚對苯二甲酸乙二 酉旨(poly (ethylene ter印hthalate))，人造纖維(rayon)，尼龍(nylon)，聚縮丁醛乙 烯(poly(vinyl butyrate))，聚偏(二)弗乙烯(polyvinylidene difluoride， PVDF)， 硅酮(silicones)，聚甲醛(polyformaldehyde)，纖維素(cellulose)，纖維素乙酸酯 (cellulose acetate)和硝化纖維。也可使用其它材料如紙、玻璃、礦物、陶瓷、金屬、非 金屬、塑料、半導(dǎo)體材料或水泥。另外，也可以用能形成膠體的物質(zhì)，包括蛋白(如白明膠 gelatins)，月旨多糖(lipopolysaccharides)，娃酸鹽(silicates)，瓊月旨糖(agarose)禾口聚 丙烯酰胺(polyacrylamides)等。多聚體能形成幾種水相，包括(但不局限于)右旋糖苷 (dextrans)，聚亞烷基二醇(polyalkylene glycols)以及如磷脂(phospholipids)長鏈烷 基銨鹽(long chain alkyl ammonium salts)等合適的表面活性劑。 首選的基質(zhì)材料包括樹脂，例如合成樹脂(如交聯(lián)聚苯乙烯 (cross-linkedpolystyrene) ， 二乙烯基苯(divinyl benzene)等)，交聯(lián)多聚糖(如纖維 素，右旋糖苷(s印hadex)，瓊脂糖，s印harose)等。在特定實施例中，基質(zhì)材料包括能與SSB 形成共價鍵的活性基團(tuán)。例如，基質(zhì)材料包含乙二醛活化的瓊脂糖，包含巰基活性基團(tuán)的材 料，或溴化氰活化的基質(zhì)材料。SSB也可通過交聯(lián)試劑與瓊脂糖樹脂連接。這些試劑被精通 這些技術(shù)的人所熟知，包括碳二亞胺(carbodiimides)，順丁烯二酰亞胺(maleimides)，琥 珀酰亞胺(succinimides，)，還原性二硫鍵。 本發(fā)明的親和介質(zhì)可以采用任何通常的形式。例如，親和介質(zhì)可以裝成柱，微型 柱，毛細(xì)管，微毛細(xì)管或電泳毛細(xì)微管(c即illary electrophoresis tube)。又如，親和介 質(zhì)可以在多相溶液中懸浮于某一相。在這種情況下，親和介質(zhì)就起了將帶標(biāo)簽的分子從多 相體系中分隔到特定的相的作用。這樣的多相純化體系對于大體積或高通量的情況非常適 用。 在特定實施例中，親和介質(zhì)是纖維素。單鏈DNA通過共價或非共價的方式固定到 纖維素上。當(dāng)單鏈DNA通過非共價的方式連接到纖維素上時，結(jié)合的單鏈DNA從纖維素的 泄露或釋放被控制到最小。單鏈DNA不需要特定序列。若使用雙鏈DNA (如鮭魚精子DNA) 時，首先將其變性得到單鏈DNA，然后固定到纖維素上，得到單鏈DNA親和介質(zhì)。
在特定實施例中，包含SSB融合蛋白的全細(xì)胞裂解液用單鏈DNA纖維素層析柱進(jìn) 行層析。SSB融合蛋白通過SSB結(jié)合到被固定化的單鏈DNA上，其它蛋白和雜質(zhì)直接流出柱。 結(jié)合的SSB融合蛋白只要通過提高鹽(KC1或NaCl)濃度就可以洗脫下來。本發(fā)明的蛋白 純化過程能天然有效地將外來蛋白或多肽以SSB融合蛋白的形式從細(xì)胞雜質(zhì)中分離純化。
在特定實施例中，每毫升膨脹的單鏈DNA纖維素親和介質(zhì)至少能夠結(jié)合12mg融合 蛋白。在E. coli中過表達(dá)SSB融合蛋白，每升細(xì)胞培養(yǎng)物可以得到3至30mg蛋白，不同的 目的蛋白在E.coli中過表達(dá)的量是不同的。單鏈DNA纖維素親和介質(zhì)在純化同一蛋白質(zhì) 時可以使用多次，或用1.5M NaCl洗后回收。另外，單鏈DNA纖維素親和介質(zhì)是以干燥的固 體狀態(tài)保存的，因此可以無限期保存，而不丟失結(jié)合能力及從雜質(zhì)中分離SSB融合蛋白的 能力。
本發(fā)明的另一方面，提供了一類SSB融合蛋白，融合蛋白包含SSB和直接或間接融 合的目的蛋白。SSB融合蛋白可以進(jìn)一步包含一個或多個其它親和純化標(biāo)簽，以及用來除去 SSB和其它親和標(biāo)簽的連接片段。SSB融合蛋白可以用表達(dá)載體表達(dá)，用單鏈DNA固定化的 介質(zhì)進(jìn)行純化，或結(jié)合其它上面提到過的鎳_瓊脂糖等親和介質(zhì)進(jìn)行共同純化。
若融合蛋白的SSB部分不干擾特定的生化反應(yīng)，目的蛋白或多肽仍具抗原性和生 物功能活性，則本發(fā)明中的融合蛋白可以直接用于隨后的生化反應(yīng)?；蛘?，融合蛋白可以通 過切割除去SSB部分，得到純的目的蛋白或多肽。如果需要得到這樣的目的蛋白或多肽，可 在融合蛋白中的SSB和目的蛋白之間引入可切割的連接片段。 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于闡述本發(fā)明的一 些原理及應(yīng)用，而不用于限制本發(fā)明的范圍。 實施例1 :表達(dá)質(zhì)粒載體pSSB-Bl， B2， B3和B4的構(gòu)建與表達(dá)
設(shè)計引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從噬菌體T7基因組DNA中得到編碼T7SSB 的DNA片段，插入到表達(dá)載體pET28a的Ncol和BamHl位點，得到表達(dá)載體pSSB-Bl。在 pSSB-Bl載體中，可被腸激酶識別的連接片段位于SSB標(biāo)簽和BamHl位點之間。表達(dá)質(zhì)粒載 體pSSB-B2， B3和B4用相似方法構(gòu)建。在這四種質(zhì)粒中，SSB以及腸激酶或凝血酶的切割 位點位于pET28a載體的Ncol和BamHI位點之間。另外，在載體pSSB-B3和pSSB-B4中，六 組氨酸標(biāo)簽恰好置于SSB的N端。物理圖譜和多克隆位點見圖1A。這一系列質(zhì)粒載體用來 在E. coli中表達(dá)帶SSB或者6His-SSB標(biāo)簽的融合蛋白。
實施例2 :表達(dá)質(zhì)粒載體pSSB-Yl和Y2的構(gòu)建 設(shè)計引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從噬菌體T7基因組DNA中得到編碼T7SSB的 DNA片段，插入到表達(dá)載體pSLF1072的Xhol和Notl位點，得到表達(dá)載體pSSB-Yl和Y2。在 pSSB-Yl中，腸激酶的切割位點位于SSB標(biāo)簽和Notl位點之間；在pSSB-Y2中，凝血酶的切 割位點位于SSB和Notl位點之間。另外，在載體pSSB-Yl和pSSB-Y2中，六組氨酸標(biāo)簽恰 好置于SSB的N端。物理圖譜和多克隆位點見圖1B。這一系列質(zhì)粒載體用來在酵母中表達(dá) 帶SSB或者6His-SSB標(biāo)簽的融合蛋白。 實施例3 :在E. coli中融合蛋白6His-SSB-Sapl和SSB-Fenl的過表達(dá)及用單鏈 DNA纖維素層析純化 S即l是DNA復(fù)制起始相關(guān)的必需蛋白，在裂殖酵母中大量存在，分子量約為 30kDa。通過PCR反應(yīng)從裂殖酵母基因組DNA中擴(kuò)增得到s即l基因的DNA片段，插入到 pSSB-B4載體的BamHI和HindIII位點。編碼融合蛋白6His-SSB-Sapl的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E. coli BL21(DE3)pLysS細(xì)胞中，得到單克隆。單克隆接到50mL含20 y g/ml卡那霉素的LB
培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。過夜的菌液以i : 50到i : 100的比例接到新鮮培養(yǎng)基中，在37t:培
養(yǎng)至0D59。= 0. 3。然后力口 IPTG到0. lmM，誘導(dǎo)3. 5小時。然后離心得到細(xì)胞，用含0. 4M KC1的緩沖液A(50mM Tris-HCl， pH 7. 4， 5mM醋酸鎂，5mM DTT， lmM EDTA， lmMEGTA， 0. 04% NP-40，10X甘油)懸浮。超聲破碎細(xì)胞，37，000g離心30分鐘。全細(xì)胞提取物，以及隨后 的細(xì)胞裂解液的沉淀和上清用SDS-PAGE檢驗。圖2結(jié)果表明l)6His-SSB-S即l融合蛋白 在細(xì)胞蛋白總量中大約占25X;2)6His-SSB-S即l融合蛋白非?？扇埽虼穗x心后絕大部分 在上清組分中。由于S即l是DNA結(jié)合蛋白，用含0. 4M KC1的緩沖液A保證S即l從染色質(zhì) DNA上分離開來。
用緩沖液A將含6His-SSB-S即l的上清組分的鹽濃度調(diào)到0. 2M，再進(jìn)行單鏈DNA 纖維素層析。用含0.2M KC1的緩沖液A洗去不結(jié)合的蛋白和其它雜質(zhì)。然后，結(jié)合的融合 蛋白6His-SSB-S即l在鹽濃度0. 4M KC1時洗脫下來。如圖3A所示，單鏈DNA纖維素層析 一步純化后，根據(jù)密度測定法(densitometry) ，6His-SSB-Sapl的純度達(dá)到 96%。
為了檢測融合蛋白6His-SSB-S即l是否能通過融合蛋白N端的六組氨酸殘基與 鎳_瓊脂糖結(jié)合，通過單鏈DNA纖維素親和層析純化的6His-SSB-S即l進(jìn)行鎳-瓊脂糖層 析。如圖3B所示，6His-SSB-S即l能夠很好地與鎳柱結(jié)合，在咪唑250mM濃度時洗脫下來。 這表明，帶6His-SSB標(biāo)簽的融合蛋白可以用兩種不同特性的層析柱進(jìn)行純化。 一種是單鏈 DNA纖維素柱，另一種是鎳_瓊脂糖柱。通過單鏈DNA纖維素柱與鎳-瓊脂糖柱的結(jié)合，即 使是低含量的6His-SSB融合蛋白，一般也能達(dá)到很高的純度，用于后面的生化分析。
用相似的方法，在pSSB-Bl載體的SacI和HindIII位點插入人fenl基因。融合 蛋白SSB-Fenl在E. coli BL21 (DE3)pLysS細(xì)胞中過表達(dá)。和融合蛋白6His-SSB-Sapl — 樣，SSB-Fenl在含0. 1M KC1的緩沖液A中也是可溶的。如圖4所示，SSB-Fenl能與單鏈 DNA纖維素結(jié)合，并在鹽濃度0.4M KC1時洗脫下來。同樣的，經(jīng)過單鏈DNA纖維素層析一步 純化，根據(jù)密度測定法(densitometry) ， SSB-Fenl的純度可達(dá)到 96%。
為了比較SSB-， GST-和6His-三種融合蛋白分別與單鏈DNA纖維素，還原型谷胱 甘肽-S印harose 4B和鎳-瓊脂糖的純化效率在pET-28a的Nhel和EcoRI位點插入編碼 GST-Sapl的DNA片段GST-Sapl ;在pET-28a的Nhel和BamHI位點插入編碼Sapl的DNA片段 Sapl。得到的兩種融合蛋白6His-GST-S即和6His-Sapl都能在E. coli BL21 (DE3)pLysS細(xì) 胞中高表達(dá)，并達(dá)到細(xì)胞總蛋白的 25 % 。在細(xì)胞提取液中，6His-GST-S即1和6His-S即1 在鹽濃度0. 4M KC1時都是可溶的。用緩沖液A將含6His-GST-S即l或6His-S即l的細(xì)胞 提取液調(diào)整到鹽濃度0. 2M，然后分別進(jìn)行還原型谷胱甘肽-S印harose 4B或鎳-瓊脂糖層 析。柱子用含0.2M KC1的緩沖液A洗去不結(jié)合的蛋白和其它雜質(zhì)。純化6His-S即l時，柱 子用含O. 2M KCl和20mM咪唑的溶液A洗。結(jié)合的6His-GST-Sapl先用10mM還原型谷胱甘 肽洗脫，殘留的6His-GST-S即l用0. 5% SDS洗脫。如圖5所示，GST-Sapl的純度在用lOmM 還原型谷胱甘肽和0. 5% SDS洗脫時，純度分別達(dá)到了 20%和 70%。圖6的結(jié)果表明， 6His-Sapl在咪唑濃度250mM時洗脫下來，純度達(dá)到了 70%。如圖3A所示，單鏈DNA纖 維素層析純化后，6His-SSB-S即l融合蛋白的純度達(dá)到了 96%。如圖2所示，E. coli細(xì) 胞中6His-SSB-Sapl，6His-GST-Sapl和His-Sapl的表達(dá)水平大致相當(dāng)，但在單鏈DNA纖維 素，還原型谷胱甘肽-S印harose 4B層析和鎳_瓊脂糖親和層析后，這三種融合蛋白明顯達(dá) 到了不同的純度，其中6His-SSB-S即l純度最高。 實施例4 :人細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和裂殖酵母細(xì)胞中SSB-S即1的過表達(dá)及用單鏈DNA 纖維素親和柱層析純化 重組質(zhì)粒用常規(guī)步驟構(gòu)建，這些質(zhì)粒分別在人細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和裂殖酵母細(xì)胞中 過表達(dá)SSB-S即1融合蛋白。得到包含SSB-S即1的細(xì)胞提取物再過單鏈DNA纖維素柱。圖 7，8和9的結(jié)果顯示，SSB-S即1的表達(dá)量在上述三種表達(dá)體系的全細(xì)胞蛋白中的比例小于 或約等于1 % 。在人細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞中過表達(dá)的SSB-S即1都是可溶的，能結(jié)合單 鏈DNA，在鹽濃度0. 2至1. 0M KC1時洗脫下來。通過單鏈DNA纖維素層析，在人細(xì)胞、昆蟲 細(xì)胞或酵母細(xì)胞中過表達(dá)的SSB-Sapl純度分別達(dá)到了 70%， 80%和 90%。
實施例5 :SSB融合蛋白中SSB的切除 100 ii g 6His-SSB-S即l蛋白加1單位的凝血酶在含0. 1M KC1和2. 5mM CaCl2的 緩沖液A中室溫溫育2到5小時。如圖10所示，6His-SSB-S即l融合蛋白能被凝血酶充分 酶解，6His-SSB通過鎳-瓊脂糖層析除去。 類似的，十?dāng)?shù)種SSB融合蛋白在大腸桿菌，酵母，昆蟲或人細(xì)胞中過量表達(dá)。無論 目的蛋白或多肽來自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，這些SSB融合蛋白都具有很好的可溶性。過量 表達(dá)的SSB融合蛋白進(jìn)行單鏈DNA纖維素層析，都能較好地與單鏈DNA纖維素結(jié)合，表明目 的蛋白或多肽上融合的SSB保持了結(jié)合單鏈DNA的能力，目的蛋白或多肽不會在空間上阻 礙SSB與單鏈DNA的結(jié)合，從而保證了 SSB融合蛋白在進(jìn)行單鏈DNA纖維素親和層析時可 以與其它雜質(zhì)很好地分開。 在設(shè)計表達(dá)質(zhì)粒載體時，所有SSB融合蛋白的SSB和目的蛋白之間插入了一個酶 切割位點。由于這個切割位點，可以得到不含SSB的目的蛋白或多肽。所有純化得到的SSB 融合蛋白是凝血酶或腸激酶等進(jìn)行專一性切割的好底物。更佳的，選擇的蛋白酶不會對SSB 或目的蛋白本身進(jìn)行切割。切割后，SSB可以用單鏈DNA纖維素除去，如果六組氨酸殘基融 合在SSB的N端，還可以用鎳-瓊脂糖除去。 由于融合蛋白結(jié)合了表達(dá)量高，可溶性好，純化效率高，以及酶切位點專一的特 點，pSSB載體將是一個表達(dá)和純化目的蛋白和多肽的強(qiáng)大體系。 本發(fā)明用實施例進(jìn)行了描述，應(yīng)理解，這些實施例僅用于闡述目的，而不用于限制 本發(fā)明范圍。熟知本發(fā)明包含的技術(shù)的人應(yīng)該很容易將本發(fā)明擴(kuò)展于其它實施例。應(yīng)當(dāng)認(rèn) 為，這些替代實施例也屬于本發(fā)明的范圍。相應(yīng)地，本發(fā)明的范圍將在所附權(quán)力要求書中定 義并進(jìn)一步描述。 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì) 和范圍。
權(quán)利要求
一系列表達(dá)載體，其特征在于，它包含啟動子和編碼融合蛋白的核苷酸序列；其中表達(dá)融合蛋白的核苷酸序列與啟動子連接，使編碼融合蛋白的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受啟動子的控制；其中融合蛋白包含一個單鏈DNA結(jié)合蛋白以及直接或間接融合于該單鏈DNA結(jié)合蛋白的C端或N端的目的蛋白或多肽鏈；該融合蛋白能夠結(jié)合單鏈DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白是T7噬菌體 的單鏈DNA結(jié)合蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白來自于噬菌 體、細(xì)菌、古細(xì)菌、嗜熱菌、病毒、酵母或多細(xì)胞生物的真核細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述單鏈DNA結(jié)合蛋白來自于編碼具 有單鏈DNA結(jié)合能力的多肽鏈的人造多核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述融合蛋白包含一個或多個純化 標(biāo)簽，所述純化標(biāo)簽包括多組氨酸殘基或谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述目的蛋白或多肽鏈通過一個可 切割的片段與單鏈DNA結(jié)合蛋白連接。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述可切割片段能被位點專一性蛋 白酶切割。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述可切割片段能被腸激酶、凝血 酶、凝血因子Xa或凝乳酶等切割。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，包括如下質(zhì)粒表達(dá)載體pSSB-Bl、 pSSB-B2、 pSSB-B3、 pSSB-B4、 pSSB-Yl、 pSSB-Y2、 pSSB-Il、 pSSB-工2、 pSSB-工3、 pSSB-工4、 pSSB-Hl、 pSSB-H2、 pSSB-H3或pSSB-H4等。
10. —種純化目的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，其中表達(dá)載體包括啟動子和與之恰當(dāng)連接的編碼融合蛋白 的多核苷酸序列，該融合蛋白包括單鏈DNA結(jié)合蛋白以及直接或間接融合于單鏈DNA結(jié)合 蛋白的N-端或C-端的目的蛋白或多肽鏈，該融合蛋白具有結(jié)合單鏈DNA的能力；培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使融合蛋白表達(dá)；裂解宿主細(xì)胞得到細(xì)胞裂解液；細(xì)胞裂解液與固定了單鏈DNA的介質(zhì)接觸，使融合蛋白結(jié)合到該介質(zhì)的單鏈DNA上； 洗介質(zhì)除去雜質(zhì)； 將介質(zhì)上的融合蛋白洗脫下來；這樣目的蛋白就以融合蛋白的形式得到表達(dá)及純化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求io所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白通過一個可切割的片段與單鏈DNA結(jié)合蛋白融合；
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述可切割片段能被位點專一性蛋白 酶切割。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述可切割片段能被腸激酶、凝血酶、 凝血因子Xa或凝乳酶等切割。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母細(xì)胞、 昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體是pSSB-Bl、 pSSB-B2、 pSSB-B3、 pSSB-B4、 pSSB-Yl、 pSSB-Y2、 pSSB-Il、 pSSB-工2、 pSSB-工3、 pSSB-工4、 pSSB-Hl、 pSSB-H2、 pSSB-H3或pSSB-H4等質(zhì)粒表達(dá)載體。
16. —種融合蛋白，其特征在于，它包含單鏈DNA結(jié)合蛋白以及直接或間接融合于單鏈 DNA結(jié)合蛋白C端或N端的目的蛋白或多肽，所述融合蛋白具有與單鏈DNA結(jié)合的能力。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，它包含一個位于單鏈DNA結(jié)合蛋白 和目的蛋白之間的可切割片段，所述可切割片段上有切割位點，能分割開單鏈DNA結(jié)合蛋 白和目的蛋白。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的融合蛋白，其特征在于，所述可切割片段可以被位點專一 性蛋白酶切割。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，所述可切割片段能被腸激酶、凝血 酶、凝血因子Xa或凝乳酶等切割。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，它連接或內(nèi)置了純化標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類表達(dá)載體，該載體包含啟動子和編碼融合蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供一類融合蛋白，包含單鏈DNA結(jié)合蛋白以及直接或間接融合于單鏈DNA結(jié)合蛋白C端或N端的目的蛋白或多肽，該融合蛋白能與單鏈DNA結(jié)合。本發(fā)明還提供了一類純化蛋白的方法，通過與單鏈DNA相結(jié)合的親和層析，使得該融合蛋白得到高效純化。
文檔編號C07K19/00GK101709306SQ20091026034
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者華余, 孔道春, 孫靜亞, 胡家志 申請人:孔道春;華余;胡家志;孫靜亞