專(zhuān)利名稱(chēng):檸條中一個(gè)新的抗旱耐寒基因CaDHN1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
檸條中一個(gè)新的抗旱耐寒基因CaDHNl,涉及一種植物脫水素及其編碼基因,其功 能是提高植物的抗旱耐寒性能,屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù):
各種非生物脅迫包括干旱、鹽漬、低溫等非生物逆境脅迫,是制約農(nóng)作物、林草和 蔬菜等生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。我國(guó)的干旱、半干旱耕地共計(jì)5. 7億畝,占全國(guó)耕地面積的 38%,我國(guó)每年因缺水造成糧食減產(chǎn)700-800億公斤。培育和推廣抗逆植物品種是提高其 產(chǎn)量與質(zhì)量,保證國(guó)家糧食安全和改善生態(tài)環(huán)境的最有效途徑。雖然利用植物自身抗病基 因和一些抗逆相關(guān)基因,在抗逆育種方面取得了一些進(jìn)展。但目前可利用的抗逆相關(guān)基因 資源有限,并且存在著抗逆品種不理想等問(wèn)題,難以滿(mǎn)足目前生產(chǎn)與生態(tài)改良的需求。近 年來(lái),有關(guān)植物抗逆反應(yīng)機(jī)制特別是相關(guān)反應(yīng)途徑研究的進(jìn)展以及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā) 展,為運(yùn)用基因工程手段提高植物抗病性與抗逆性展示出誘人的前景。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展了一系列應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物逆境脅迫的反應(yīng) 機(jī)制,以保證其生長(zhǎng)發(fā)育。大量研究結(jié)果表明,植物能通過(guò)基因感知和識(shí)別逆境脅迫信 號(hào),然后啟動(dòng)級(jí)聯(lián)式的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),進(jìn)而誘導(dǎo)一系列下游的具有功能的抗逆基因表 達(dá)。生物體的細(xì)胞能夠?qū)ν饨绛h(huán)境條件的變化做出相應(yīng)的反應(yīng),植物的這種耐旱機(jī)制 與脅迫條件下植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)引起植物體內(nèi)理化性質(zhì)變化密切相關(guān),其中 LEAdateembryogenesis abundant protein)基因是一類(lèi)重要的抗旱基因]。認(rèn)為在種子 成熟以及抗逆生理過(guò)程中具有重要作用,所以近年來(lái)關(guān)于脫水素的研究發(fā)展很快,特別是 逆境下脫水素對(duì)植物的保護(hù)作用引起了人們廣泛的關(guān)注。脫水素基因的表達(dá)受到諸多因素 的影響,與植物所處的環(huán)境以及其自身的生理狀況有密切的關(guān)系。在不同的條件下表達(dá)的 脫水素行使各自特定的功能,減小逆境和脫水過(guò)程對(duì)植物組織的傷害。脫水素K片段形成 的雙親性a螺旋能使脫水素與部分變性蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)相結(jié)合,起到了類(lèi)似于分子伴侶 的作用,阻止蛋白質(zhì)的進(jìn)一步變性,對(duì)蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用。低溫、干旱等逆境往往會(huì)破壞 植物細(xì)胞自由基代謝的平衡,增加活性氧自由基的產(chǎn)生,進(jìn)而引發(fā)或加劇膜脂的過(guò)氧化,造 成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。有證據(jù)表明,脫水素能夠清除植物細(xì)胞中的活性氧自由基,從而減輕 植物所受的傷害。關(guān)于脫水素的作用機(jī)理、基因表達(dá)的調(diào)控等方面的研究將為其在實(shí)際生 產(chǎn)中的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù),將脫水素應(yīng)用于提高作物的抗逆能力, 減小災(zāi)害對(duì)農(nóng)業(yè)的影響等方面具有廣闊的前景。已有報(bào)道證明,含有柑橘脫水素基因的轉(zhuǎn) 基因煙草植株抵抗低溫的能力明顯高于一般植株。檸條是能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的 干旱沙漠地區(qū)生長(zhǎng)的灌木建群樹(shù)種,在我國(guó)“三北”地區(qū)廣泛分布。作為天然的抗逆性極強(qiáng) 的典型植物,檸條的抗逆性已引起國(guó)際學(xué)術(shù)界的重視。研究、開(kāi)發(fā)和利用檸條抗逆性基因資 源,對(duì)于深入植物抗逆性機(jī)理以及定向培育抗逆植物新品種具有重要的價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檸條中的一種與抗性相關(guān)的脫水素及其編碼基因,該基因首 次在檸條中克隆,該基因的表達(dá)受干旱、寒冷誘導(dǎo)在抗寒和抗旱反應(yīng)中具有調(diào)控作用。本發(fā)明的名稱(chēng)即又為檸條脫水素。本發(fā)明所提供的脫水素來(lái)源于檸條,是LEA蛋 白家族中的一個(gè),是具有與序列表3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì),或者是將序列表3氨基酸殘 基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與序列表中的氨基酸殘 基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)序列,表中氨基酸殘基序列是由243個(gè)氨基酸殘基 組成的蛋白質(zhì),分子量約26. 84KD,等電點(diǎn)6. 7?;蛉L(zhǎng)1165bp,開(kāi)放閱讀框從106位到 837位計(jì)731bp,擁有序列1所示的全長(zhǎng)DNA序列和序列2所示的完整讀碼框。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于(1)首次從檸條中克隆了脫水素基因;
(2)經(jīng)過(guò)BLAST,該轉(zhuǎn)錄因子與豌豆脫水素的氨基酸相似性34%,該蛋白含有2個(gè) Y結(jié)構(gòu)域和一個(gè)K結(jié)構(gòu)域,富含組氨酸和甘氨酸,是一個(gè)新脫水素基因。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、擰條葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建檸條植株栽培培養(yǎng)缽中,于溫室內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)60天,進(jìn)行干旱處理,至全株出現(xiàn)萎 蔫取幼嫩葉片于液氮中速凍、研磨,TRIzole抽提總RNA,溶于水中。經(jīng)mRNA純化試劑盒處 理得到mRNA。取mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),然后再合成第二鏈。均一化后與pDNR-LIB載體 連接(具體步驟詳見(jiàn) Creator SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech Cat. No. 634903)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。涂板得到單克隆,分別保藏。實(shí)施例2、cDNA文庫(kù)的隨機(jī)EST測(cè)序從文庫(kù)中隨機(jī)選取3000個(gè)單克隆進(jìn)行5’端 EST測(cè)序,將測(cè)序成功的序列進(jìn)行BLAST,選擇與經(jīng)驗(yàn)證抗旱相關(guān)基因相似的EST。實(shí)施例3選擇經(jīng)BLAST與脫水素相似的EST,將它們對(duì)應(yīng)的克隆測(cè)通,得到候選抗 逆基因的全長(zhǎng)DNA序列。如不能得到全長(zhǎng)序列,則以該EST設(shè)計(jì)引物,通過(guò)5’或3’RACE得 到全長(zhǎng)序列。實(shí)例4脫水素基因的干旱誘導(dǎo)表達(dá)的定量分析取干旱處理的檸條葉片提取RNA, 同時(shí)提取正常生長(zhǎng)的葉片提取RNA為對(duì)照,分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)本發(fā)明的序列2設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物引物 1 為5,CTCAACTTCCCTAAACTCCG 3,;引物 2 為 5,TCAGCCAAGCCTTCACAA 3,該引物對(duì)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為237bp的核苷酸片段,以SYBR GREENI作為熒光染料,用Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析,采用2_Δα法發(fā)現(xiàn)干旱誘 導(dǎo)下本發(fā)明所涉及的基因的表達(dá)比對(duì)照提高5倍以上,足以證明其在抗旱中可發(fā)揮重要作 用。序列1 :Ca DHNl基因的全長(zhǎng)CGGCCGGGGACTCACAACCGCATTAATTTTAGCAAGCAAGTTCTTACAAACTAAACCAACAACACCTTGCCATTTTCTCCTTTGTGCGCATTCTGTTTCGTTGCAATGGCACAATATCGGCAGGGTGGTCAATACAGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATATTGACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAATACGGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCGGTTCATCAATATGGTGATCAAATGCGCAGGACCAATGAGTACGACAACCCTGT
GTTGATAAGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAATTGACCAACATGGCAGCCCACTTCGTCAATACGGTGATCAAATGCGCAAGACCGATGAGTATGGAAACTCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAAGGTCACGGTCATGGTCATAGTCATGGTCATGGTCATCGTCATCGTCATGGTCATGGATCTGATCATCAGGGCACTGGTTATGGAACCCACACCGGTGGTGCCACAGGTTATGGTGGAACCACGTACACCGGTGGAGACACTGGTTATGGAACCACTACTGGAGAAGGAACAGGCATGGGGTATGGAAGAACTACTGGGGGCACAGAAGCAGGTTATGTTGGAACCGCAGGGCAACAGTACTATGGAACCACCGCTGGGGGTACTGGTCATCATGAACAATGTCATGGTGGGTATGGTTGTGAACAATATGAGAAGAGAGGGATCATGGATAAGATCAAGGATAAACTTCGTGAAAGATACTAAGATATTTATAATCGATGCATATATTCATTCATGCATATCGATAATAAATATGTATTGGTGTCTTTTTAAGCTTTTGAATAATTTGCTACATACTTTTAAATATGTAGTGGTGTCTTTTGCGACTAGTTTTAAGAAACTGTTTTCGCAACTTGTTCTGGAATCAGGCATATCATCGTTCGTGGGTTTCAACTTTCAATGTTTCTTATTATTTGACTTGAAATTTGCAATTTTGACTTTCAATGATCTTGGAATTGTTCCTCAGATAAAAAAAAAAGAAAAAAAGAATATAAAAAAAAATAAAAAAAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA序列2基因的編碼區(qū)ATGGCACAATATCGGCAGGGTGGTCAATACAGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATATTGACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAATACGGTGATCAAATGCGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCGGTTCATCAATATGGTGATCAAATGCGCAGGACCAATGAGTACGACAACCCTGTGTTGATAAGCAGGACCGATGAGTATGGAAACCCTGTGAGCCAAATTGACCAACATGGCAGCCCACTTCGTCAATACGGTGATCAAATGCGCAAGACCGATGAGTATGGAAACTCTGTGAGCCAAGTTAACCAATATGGCAACCCAGTTCATCAAGGTCACGGTCATGGTCATAGTCATGGTCATGGTCATCGTCATCGTCATGGTCATGGATCTGATCATCAGGGCACTGGTTATGGAACCCACACCGGTGGTGCCACAGGTTATGGTGGAACCACGTACACCGGTGGAGACACTGGTTATGGAACCACTACTGGAGAAGGAACAGGCATGGGGTATGGAAGAACTACTGGGGGCACAGAAGCAGGTTATGTTGGAACCGCAGGGCAACAGTACTATGGAACCACCGCTGGGGGTACTGGTCATCATGAACAATGTCATGGTGGGTATGGTTGTGAACAATATGAGAAGAGAGGGATCATGGATAAGATCAAGGATAAACTTCGTGAAAGATACTAA序列3脫水素的氨基酸序列MAQYRQGGQYSDQMRRTDEYIDQYGNPVHQY⑶QMRRTDEYGNPVSQVNQYGNPVHQYiiDQMRRTNEYDNPVLISRTDEYGNPVSQIDQHGSPLRQY⑶QMRKTDEYGNSVSQVNQYGNPVHQGHGHGHSHGHGHRHRHGHGSDHQGTGYGTHTGGATGYGGTTYTGGDTGYGTTTGEGTGMGYGRTTGGTE
AGYVGTAGQQYYGTTAGGTGHHEQCHGGYGCEQYEKRGIMDKIKDKLRERY.
權(quán)利要求
檸條脫水素,它具有與序列表中序列3的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代,缺失或添加且具有與序列3的氨基酸殘基序列相同活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.檸條脫水素的編碼基因,序列表中序列1的DNA序列,包括該基因的全部序列及部分 序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
3.序列表中序列2的DNA序列是基因的讀碼框,是權(quán)利要求的重點(diǎn)。
4.將序列表中序列1限定的DNA序列作適當(dāng)突變或偏愛(ài)密碼子改造后的基因,編碼相 同功能蛋白質(zhì),亦在本專(zhuān)利權(quán)利要求之內(nèi)。
5.權(quán)利要求2所述的基因,其開(kāi)放閱讀框是自5’端第106到第837位堿基。
6.含有權(quán)利要求3所述的基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3所述的基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求2所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檸條(Caragana korshinskii)脫水素及其基因。該脫水素由243個(gè)氨基酸殘基組成,具有兩個(gè)Y結(jié)構(gòu)區(qū)和一個(gè)K結(jié)構(gòu)區(qū),同其它脫水素不同的是本發(fā)明所涉及的脫水素富含組氨酸(H)和甘氨酸(G)。其基因全長(zhǎng)1165bp,從5′端106到837位是一個(gè)731bp開(kāi)放閱讀框,在植物受到干旱和冷脅迫下強(qiáng)烈表達(dá),使植物細(xì)胞減輕受害,提高抗旱、耐寒能力,是植物耐旱機(jī)制的關(guān)鍵元件。該基因與豌豆脫水素基因的氨基酸序列相似性為34%,是一個(gè)新基因,如構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體,并將此耐旱基因?qū)敫黝?lèi)植物中,將可以提高植物的抗旱耐寒性能。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101817874SQ20091025037
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者喬慧蕾, 孫國(guó)琴, 李曉東, 白晨, 郭九峰 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院