專利名稱：一種編碼雞Ⅱ型膠原蛋白的全長多核苷酸序列及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種包含如SEQ ID NO 1所示編碼全長雞II型膠原蛋白的多核苷酸 序列之核酸分子，或其具有相同生物學功能的片段；及其所編碼的雞II型膠原蛋白。本發(fā) 明還涉及一種制備所述雞II型膠原蛋白的方法，以及由本發(fā)明所述方法制備的雞II型膠 原蛋白用于制備治療和/或預防類風濕性關節(jié)炎的藥物的用途。本發(fā)明特別涉及一種用于 預防和/或治療骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎(RA)的藥物組合物，以及食品或飲料組合物或 食品添加劑組合物，其中含有本發(fā)明方法制備的所述雞II型膠原蛋白。本發(fā)明還涉及所述 核酸分子用于基因治療的用途。
背景技術：
類風濕性關節(jié)炎是嚴重影響人類健康的常見病、多發(fā)病，由于迄今為止對其病因 及其發(fā)病機制不甚了解，因此控制炎癥、緩解癥狀、維持關節(jié)功能仍是目前RA治療的主要 手段，遠未達到控制關節(jié)損傷的目標。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，對RA研究取得 了巨大進展，尤其是隨著對其發(fā)病機制認識的不斷深入，新的治療方法和策略也相應產(chǎn)生。1993 年，美國科學家首次在《科學》(Trentham DE, Dynesius-Trentham RA, Orav EJ，et al. Science, 1993，261 :1727-1730)報道了他們用天然雞 II 型膠原蛋白(雞 CCII) 治療RA患者獲得巨大成功的研究結果，立刻引起全世界對這一療法的高度重視。目前美 國、英國、法國等發(fā)達國家正在進行雞II型膠原蛋白治療RA的II-III期臨床實驗研究。從 已發(fā)表的研究結果綜合分析可以得出如下基本結論口服耐受的確為RA的治療開辟了一 條能標本兼治極具前景的新途徑、新策略和新療法(Trentham DE,Dynesius-Trentham RA, OravEJ,et al.，Science,1993，261 :1727_1730，)。目前，在雞II型膠原蛋白還未完成II-III期臨床實驗之前，歐美發(fā)達國家制藥公 司紛紛將雞II型膠原蛋白制成食品添加劑，以避開冗長煩瑣的藥物審批。然而，縱觀目前 國際上探索口服免疫耐受治療RA所用的均是天然雞II型膠原蛋白，其最大的缺陷就在于 1)不同公司生產(chǎn)制備的天然雞II型膠原蛋白質(zhì)量不同，即便是同一公司所生產(chǎn)的不同批 號的雞II型膠原蛋白產(chǎn)品質(zhì)量也會不同。從而也就難以確保療效的一致性、連續(xù)性。2)天 然雞II型膠原蛋白提取和制備所需人力物力甚大。本發(fā)明人提出了解決上述問題的新思路即采用基因工程方法重組生產(chǎn)雞II型 膠原蛋白。為此，提出克隆其編碼基因，即CC0L2A1基因，并實現(xiàn)高效表達，重組生產(chǎn)雞II 型膠原蛋白的設想。本發(fā)明就是基于發(fā)明人首次克隆成功編碼雞II型膠原蛋白的全長多 核苷酸序列_CC0L2AlcDNA而完成的。發(fā)明概述本發(fā)明一個方面涉及一種如SEQ ID NO 1所示包含編碼全長雞II型膠原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物學功能的片段。本發(fā)明又一方面涉及由本發(fā)明所述核酸分子編碼的雞II型膠原蛋白，或其具有 相同生物學活性的片段。本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明所述編碼雞II型膠原蛋白的核酸分子或其具有 相同生物學功能的片段的重組表達載體。本發(fā)明又一方面涉及一種由上述重組表達載體轉化的宿主細胞，其能夠表達雞II 型膠原蛋白，或其具有相同生物學活性的片段。本發(fā)明再一方面涉及一種制備所述雞II型膠原蛋白的方法，其中包括1).用本發(fā)明所述重組表達載體轉化合適的宿主細胞；2).在合適的培養(yǎng)基中及適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細胞；3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及了本發(fā)明所述雞II型膠原蛋白用于制備治療和/或預防類風濕性 關節(jié)炎的藥物的用途。本發(fā)明特別涉及了一種用于預防和/或治療骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎的藥物組 合物，其中包含治療有效量的由本發(fā)明所述方法制備的雞II型膠原蛋白，和任選的，藥學 可接受的載體。本發(fā)明還包括食品或飲料組合物，其特征在于包含一定量的由本發(fā)明所述方法制 備的雞II型膠原蛋白。本發(fā)明也包括一種食品添加劑組合物，其中包含一定量的由本發(fā)明所述方法制備 的雞II型膠原蛋白。本發(fā)明還包括了本發(fā)明所述核酸分子或其片段用于基因治療的用途。發(fā)明詳述口服耐受是自九十年代國際上興起治療自身免疫病的特異性免疫療法之一，也是 近年來免疫學研究領域中最活躍、最富有成效的領域之一。它是指口服某種蛋白質(zhì)抗原，隨 后再用該抗原進行胃腸外免疫，引起機體對該抗原產(chǎn)生全身性低免疫應答狀態(tài)?，F(xiàn)已知介 導口服耐受的主要機制包括自身細胞抑制、克隆無能、克隆清除以及旁觀者抑制，這還遠不 是其機制的全部。其中決定因素是抗原的用量、種類來源、性質(zhì)、抗原遞呈處理的過程以及 宿主的遺傳背景和發(fā)育程度。從已發(fā)表的研究結果綜合分析可以得出如下基本結論1). 口服耐受的確為RA的 治療開辟了一條能標本兼治極具前景的新途徑、新策略和新療法；2). 口服耐受雞II型膠 原蛋白的確對相當一部分RA患者療效十分顯著；3).雞II型膠原蛋白的療效要遠好與其 它物種來源的II型膠原蛋白，因其富含大量的硫酸軟骨素A和粘蛋白(proteoglycans)，而 粘蛋白中硫酸葡糖胺含量最高，它們有著強有力的抗炎作用和軟骨修復作用；尤其是來源 于6-8周齡雛雞胸骨的雞II型膠原蛋白其含量最高；4).此外，雞II型膠原蛋白中還含有 抗氧化作用的粘蛋白，又稱之為軟骨基質(zhì)糖蛋白(CMGP)，它能有效地減少氧化作用對軟骨 細胞的損傷；5).雞II型膠原蛋白能有效防止蛋白酶對關節(jié)軟骨的消化破壞，重新編程已 被破壞的軟骨細胞和細胞因子，從而明顯減少炎癥的發(fā)生；6).雞II型膠原蛋白能促進軟 骨細胞及粘蛋白的合成，增加關節(jié)滑液及透明質(zhì)酸的分泌；7).雞II型膠原蛋白是強有力 的抗炎劑和疼痛緩解劑；8).雞II型膠原蛋白治療十分安全無任何毒副作用，這是目前任
4何其它治療RA藥物所不能比擬的。目前，口服II型膠原蛋白誘導機體產(chǎn)生免疫耐受已成為有效治療類風濕關節(jié)炎 極為重要的新策略。為了提供大量、優(yōu)質(zhì)雞II型膠原蛋白用于上述治療，本發(fā)明人摒棄傳 統(tǒng)的從天然來源中提取、純化的方法，采用基因工程方法重組生產(chǎn)雞II型膠原蛋白。為此，本發(fā)明人提出克隆CC0L2A1基因并高效表達重組生產(chǎn)CCII的設想，同時還 可深化對CC0L2A1基因的全面認識與了解。因為迄今為止，國際上雖已成功地克隆了人、 犬、鼠C0L2A1基因及并進行了染色體上的定位，但對于具有如此重大藥用價值、治療價值 和經(jīng)濟價值的CC0L2A1基因尚未有克隆成功的報道。亦即，有關CC0L2A1全長cDNA與基因 組DNA的克隆、CC0L2A1在染色體上的定位、CC0L2A1在各組織中的構成性表達、CC0L2A1相 關生物信息學以及重組CC0L2A1的表達研究在國際上還是一個空白。由于編碼雞II型膠原蛋白的cDNA基因序列較長，而目前對其功能區(qū)的cDNA序列 所知甚微，因此獲得編碼雞II型膠原蛋白三螺旋區(qū)的CDNA無疑是非常重要。由于II型膠 原具有復雜的二級結構，高重復序列，高GC含量(平均GC含量大于70 %，個別區(qū)域GC含量 高達 80% ) (Nah DH, Upholt WB.，J Biol Chem, 1991,26634 :23446_23452)，因此，直接進 行PCR非常困難。為此，我們首先采用Goldkey軟件對已知的編碼雞II型膠原蛋白3’原肽區(qū)cDNA 序列進行酶切位點分析，嘗試采用限制性內(nèi)切酶不完全消化cDNA，再用消化后的cDNA進行 C端原肽區(qū)的PCR擴增的策略獲得成功。鑒于編碼雞II型膠原蛋白的cDNA基因序列較長， 我們將cDNA分成五部分分別進行PCR擴增，并使各擴增片斷彼此之間重疊至少50bp，便于 最后采用SOE-PCR策略將各cDNA片段進行首尾連接。針對編碼雞II型膠原蛋白膠原基因 中的高GC含量，在PCR擴增中應選用適宜擴增高GC含量且保證性強的Tag酶。最終本發(fā)明人獲得了長度為4837bp的CC0L2A1全長cDNA，它包括4260bp開放閱 讀框和520bp的3，非翻譯區(qū)。將其插入pGEM-T載體進行序列測定證實，該cDNA序列為 CC0L2A1所特有的迄今未曾報道過的基因序列。序列測定結果登錄于GenBank(AY046949)。已有的研究表明，雞II型膠原蛋白基因組DNA具有復雜的結構。鑒于國際上迄 今為止對于CC0L2A1基因組DNA尚無任何詳細研究資料加以闡述這一事實，我們在成功地 克隆了編碼CC0L2A1全長cDNA的基礎上，隨后又對CC0L2A1基因組DNA進行了克隆分析。 由于CC0L2A1基因組DNA具有含高量GC、重復序列多、引物非特異結合部位太多等復雜的 結構，最初我們通過PCR對雞外周血細胞(EDTA抗凝)中提取的DNA進行擴增，僅能獲得 CC0L2A13’端5494bp的片段，而對3’端以外的基因組序列，無論如何調(diào)整模板、引物及PCR 擴增條件，均未能獲得該目的基因。隨后，又對從雞基因組DNA文庫中篩選到的陽性克隆進 行測序，但也因高GC含量及PolyT結構限制了測序反應的進行，使測序信號中斷。為此，我們采取了利用已知的外顯子序列，設計多個測序引物，才使CC0L2A1基因 組DNA的測序得以完成。最終我們獲得長度為12003bp的CC0L2A1基因組DNA序列，其中包 含45個外顯子和44個內(nèi)含子。經(jīng)查新檢索證實，該基因組DNA序列為CC0L2A1基因組所 特有的國際上未曾報道過的。相關基因序列亦已遞交GenBank，Accession No為AF452711。通過對CC0L2A1基因組DNA序列的分析不難看出，與雞I型膠原和III型膠原相 比，CC0L2A1基因的內(nèi)含子與外顯子明顯的較小，這與Upholt等曾報道的相同(Ausar SF, Beltramo DM, Castagna LF, et al.，Rhematol Int.，2001，20 138-144) ；II 型膠原(CII)在進化上高度保守，不同種屬的II型膠原蛋白其氨基酸同源性均高于92%，甚至達99%。 因此，我們認為造成CC0L2A1基因緊湊的原因并非內(nèi)含子數(shù)量上的減少，而是由于內(nèi)含子 平均長度較小所致。為了更好地認識和掌握CC0L2A1基因生物信息學的相關內(nèi)容，深入了解CC0L2A1 基因的進化特征，本研究利用Dnastar軟件包中的MegAlign，將我們所克隆的CC0L2A1全 長cDNA及其相應蛋白質(zhì)序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到的犬(AF023169，AF242201)、人 (L10347)、斑點魚(U23822)和小鼠(M65161)等不同種屬的II型膠原三螺旋區(qū)cDNA序列及 蛋白質(zhì)序列進行了同源性比較與分析，通過Genedoc程序編輯，繪制出進化樹。結果顯示， 雞CII與犬CII在種族進化上同源性最高，cDNA與氨基酸同源性分別為79. 03%和94. 77%； 其次為雞與人的CII，同源性分別為78. 96%和93. 89% ；雞與小鼠CII的同源性最低分別 為77. 38%和92. 90%。人與犬CII在所比較的五種種屬中同源性最高，核苷酸與氨基酸同 源性分別為91. 89%和98. 52% ；其次為人與鼠CII，同源性分別為88. 63%和96. 15%。在成功地揭示了有關CC0L2A1 cDNA、基因組DNA及其進化特征后，及時準確地將 CC0L2A1在染色體上進行定位則顯得十分重要。雖然RH雜交作圖是目前基因在染色體定位 最精確的方法，但限于雞RH雜交板目前尚無廠家出售。為此我們采用染色體FISH技術，利 用地高辛標記的CC0L2A13’ UTR基因片段為探針，與從雞外周血細胞中制備的中期分裂相 染色體進行雜交。經(jīng)統(tǒng)計分析確證，編碼CC0L2A1的基因定位于4號染色體短臂2區(qū)，而小 鼠、人相應的C0L2A1則分別定位于8號及12號染色體(Barnett ML,Combitchi D,Trentham DE.，Arthritis & Rheumatism,1996，394 :623_628)。我們知道，膠原在機體內(nèi)廣泛存在，不同的膠原型可公用其中的一條鏈，XI型膠 原與II型膠原之間則屬于此情況。XI型膠原是由三個不同的多肽亞單位α 、α 2、α 3 組成的，其中α 3是Cil(II)基因的表達產(chǎn)物，S卩α3與II型膠原α 1鏈僅羥化賴氨酸含 量不同(Rousseau JC, Farjanel J, Boutillon MM, et al.，J Biol Chem，1996，271 (39) 23743-8) ；XIII型膠原為II型膠原的跨膜形式，即XIII型膠原與II型膠原鏈的組成完全 相同(Snellman A, Keranen MR，Hagg P0, et al. J Biol Chem，2000，275 (12) :8936_44)。為了深入認識CC0L2A1在雞整個胚胎發(fā)育進化中的重要作用，本發(fā)明采用RT-PCR 與雙抗體夾心ELISA法分別對CC0L2A1在雞胚與成雞各組織中的構成性表達進行了全面 系統(tǒng)的分析。結果表明，CC0L2AlmRNA在發(fā)育雞胚的心、肝、玻璃體、角膜、皮膚、胸肌、胸 骨、小腸、關節(jié)軟骨、半月板及顱骨中存在著相應表達，而在脾臟、胸腺與睪丸中未檢測到 CC0L2AlmRNA的表達；對成雞CCII蛋白質(zhì)水平的檢測顯示，CCII蛋白除了在胸骨與關節(jié)軟 骨中有表達外，在胰臟與小腸中亦有表達，其中以關節(jié)軟骨中的表達水平為最高，其次為胸 骨。應說明的是，在成年雞II型膠原蛋白表達譜的檢測中，由于ELISA實驗中雞II型膠原 蛋白經(jīng)胃蛋白酶、彈性蛋白酶消化后，II型膠原形成α鏈小短肽，因此含有α I(II)鏈的 膠原均可與雞II型膠原蛋白單克隆抗體結合，因此實驗中不能排出同時檢測到ΧΙ,ΧΙΙΙ型 膠原蛋白的可能。應強調(diào)的是，CC0L2A1外顯子的剪切方式十分復雜，尤其是II型膠原外顯子2在 不同的組織采取不同的剪接方式。為此，我們對雞胚發(fā)育時的軟骨組織如胸骨、關節(jié)軟骨和 非軟骨組織如心臟、肝臟、胸肌、小腸、眼球玻璃體、角膜中N端外顯子2剪切方式進行了分 析。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)17日齡雞胚胸骨、生長板、關節(jié)軟骨中獲取的編碼雞II型膠原蛋白的cDNA不含外顯子2 ；而心臟、肝臟、眼球玻璃體、角膜、小腸、肌肉、皮膚、胸肌等非軟骨組 織中以含有外顯子2的表達存在；其中眼球玻璃體、角膜中提取的總RT-PCR發(fā)現(xiàn)存 在含與不含有外顯子2兩種情形；但眼球玻璃體RT-PCR顯示，在較小日齡的雞胚(小于14 天)僅以含外顯子2的形式存在(數(shù)據(jù)未給出)；而當雞胚發(fā)育至17天，RT-PCR結果卻出 現(xiàn)另外一種情形，以不含外顯子2為主要表達形式。這是迄今國際上首次對CC0L2A1外顯 子2在不同組織中進行剪切方式的研究報道。對于上述現(xiàn)象只能以下面的解釋作為答案雞II型膠原蛋白在軟骨組織中已不 含外顯子2的形式存在，而在非軟骨組織中如心臟、肝臟、角膜、小腸、肌肉、皮膚等中主要 以含有外顯子2的形式存在；II型膠原基因組存在調(diào)控序列，其調(diào)控II型膠原在胚胎發(fā) 育的不同時期及不同組織中的表達；雞II型膠原蛋白在各臟器廣泛存在的現(xiàn)象隨著雞 的成長發(fā)育而消失，而代之于雞II型膠原蛋白僅在軟骨組織中表達；發(fā)育的雞胚胸骨中 雞 π 型膠原蛋白含量豐富(Young MF, VogeliG, Nunez AM, et al.，Nucleic Acids Res, 1984,12(10) 4207-4228 ；Marshall GE, Konstas AGP，Lee WR.，BrJ Ophthalmol,1993, 77 :515-524)，但隨雞的生長發(fā)育，胸軟骨逐漸鈣化，雞II型膠原蛋白含量逐漸下降。關 于雞II型膠原在機體內(nèi)的表達，目前認為雞II型膠原在成熟的個體存在于眼球玻璃體 與軟骨(Seery CM, DavisionPF. , Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32 :1540_1550 ; Huerre-JeanpierreC, Mattei MG，Weil D，et al. , Am J Hum Genet, 1986,38(1) 26-37), 而我們對天然雞II型膠原的表達檢測中卻發(fā)現(xiàn)眼球玻璃體中不存在II型膠原的表達。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人對編碼雞II型膠原蛋白的cDNA成功進行了克隆、 染色體定位、表達譜分析、基因組DNA克隆以及CC0L2A1相關生物信息學分析。尤其是編碼 雞II型膠原蛋白全長cDNA的克隆成為本發(fā)明完成的堅實基礎，意義重大。雞II型膠原蛋 白作為口服耐受治療RA的新策略，其cDNA的克隆無疑將使基因工程方法生產(chǎn)重組雞II型 膠原蛋白成為可能。具體的，本發(fā)明一個方面涉及一種如SEQ ID NO :1所示包含編碼全長雞II型膠原 蛋白的多核苷酸序列之分離的核酸分子，或其具有相同生物學功能的片段。本發(fā)明又一方面涉及由本發(fā)明所述分離的核酸分子編碼序列所編碼的雞II型膠 原蛋白，或其具有相同生物學活性的片段或其保守性變體。本發(fā)明中，蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個或多個氨基酸或核苷酸改 變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨 基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與 原氨基酸相類似的結構或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改 變，如用色氨酸替換甘氨酸。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一個或多個氨基酸或核苷酸的缺失?！安迦搿被颉疤砑印笔侵冈诎被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械母淖儗е屡c天然存在的分 子相比，一個或多個氨基酸或核苷酸的增加?！疤鎿Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個或多個氨基酸或核苷酸?！吧锘钚浴笔侵妇哂刑烊环肿拥慕Y構、調(diào)控或生物化學功能的蛋白質(zhì)?！跋嗨菩浴笔侵赴被嵝蛄兄g排列對比時相應位置氨基酸殘基的相同或保守性 取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，帶負電荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；
7帶正電荷的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的頭部基團有相似親水性的氨基 酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇 氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸?！胺蛛x的”一詞指將物質(zhì)從它原來的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán) 境)之中移出。比如說，一個自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動物中就是沒有被分離 出來，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開就是分離 的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合 物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。本發(fā)明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和 合成的DNA。DNA可以是雙鏈或者單鏈的，單鏈也可以是有義鏈或者反義鏈。編碼多肽的多 核苷酸序列可以與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一個由于遺傳密碼 的冗余或簡并性而不同的多核苷酸序列，但它編碼與SEQ ID No. 2相同的成熟多肽。本發(fā)明進一步涉及利用本發(fā)明所述的多核苷酸的各種變體，它們編碼含有SEQ ID No. 2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、類似物和衍生物。這些多核苷酸變體可以是天 然存在的等位基因變體或非天然存在的多核苷酸變體。編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸也可能與特定的標記序列在同一讀框中相融合，標記 序列可幫助本發(fā)明多肽的純化。標記序列在使用細菌宿主時可以是PQE載體的六聚組氨酸 標記，以利于融合有標記的成熟多肽的純化，或者當使用哺乳類宿主(如猴腎成纖維細胞 的C0S-7細胞系)時，標記序列可以是一種血細胞凝集素(HA)標記。此外，包含編碼本發(fā) 明多肽的多核苷酸序列還可包含同源或異源的特定信號肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到 原核細胞或真核細胞膜外。本領域普通技術人員知曉，上述標記序列和信號肽序列也可通 過重組方法或化學法添加在用于表達本發(fā)明多肽的載體上。本發(fā)明進一步涉及具有SEQ ID No. 2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、 類似物和衍生物。SEQ ID No. 2所示多肽的“具有相同生物學活性的片段”指能基本保留該多肽的生 物學功能或活性的多肽。由本發(fā)明所述方法制備的雞II型膠原蛋白為重組蛋白、多肽或其片段、衍生物和 類似物。具體的，SEQ ID No. 2所示多肽的片段、衍生物和類似物可以是(i) 一個或多個 氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基所取代(優(yōu)選是保守性氨基酸殘基)的多肽， 取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸。例如，可以通過氨基酸殘基的插 入、取代和/或刪除，得到雞II型膠原蛋白的沉默突變體或功能等同物?？苫诎被釟?基之間在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性等方面的相似性進行保守性氨 基酸取代，只要保留雞II型膠原蛋白的活性；或(ii) 一個或多個氨基酸殘基帶有取代基團 的多肽；或(iii)成熟多肽與其它功能性化合物，如提高多肽半壽期的化合物(例如聚乙二 醇)融合在一起的多肽；或(iv)成熟多肽與其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它 氨基酸序列包括諸如幫助純化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。這些幫助純化的結 構域包括但不限于金屬鰲合肽，如用于在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊；用于 在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域以及用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)的結構域 (IMMUNEX公司，Seattle，Wash.)。特異于因子XA或腸激酶的斷裂接頭序列也可用于幫助目的蛋白質(zhì)的純化(Porath,J.等人(1992)，Prot. Exp. Purif. 3 :263-281)。從這些公開內(nèi) 容看，這樣的片段、衍生物和類似物的應處于本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。本發(fā)明的雞II型膠原蛋白包括SEQ ID No. 2所示的雞II型膠原蛋白，即成熟多 肽，也包括與SEQ ID No. 2多肽至少有至少有90%相似性(優(yōu)選是90%的相同性)的多肽， 更優(yōu)選至少有95%相似性(優(yōu)選是95%相同性)的多肽，也包括這些多肽的一些部分，通 常這些多肽部分至少含有30個氨基酸、優(yōu)選至少50個氨基酸。本發(fā)明的多肽、其保守性變體和生物活性片段及衍生物可以用常規(guī)的肽合成的方 法制備，例如固相肽合成(Merrifield J. (1963)，美國化學學會雜志(J. Am. Chem. Soc.) 85 2149-2154 ；Roberge, J. Y.等人，(1995)科學，269 :202_204)。蛋白質(zhì)合成可以手工完成， 也可利用肽自動合成儀如Applied Biosystems 431A肽合成儀進行(PerkinElmer)。本發(fā) 明雞II型膠原蛋白也可以從天然生物材料中經(jīng)分離純化得到，但優(yōu)選利用本發(fā)明提供的 多核苷酸用重組DNA技術制備。根據(jù)常規(guī)的重組DNA技術，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可表達或制備重組的雞II 型膠原蛋白。本發(fā)明因而涉及制備本發(fā)明雞II型膠原蛋白的方法，一般包括以下步驟(1).用本發(fā)明編碼雞II型膠原蛋白的多核苷酸(或變體)或含有該多核苷酸的 重組表達載體轉化合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中及適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組載體、帶有本發(fā)明重組載體的遺傳工程 化宿主細胞和通過重組技術制備本發(fā)明多肽的方法。本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術產(chǎn)生多肽。例如，該多核苷酸可以存在于 選自多種用于表達多肽的表達載體中的任一載體上，這些載體包括染色體的、非染色體的 及合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、細菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬 菌體DNA結合的載體、病毒DNA、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及偽狂犬病毒，包括 但不限于 pQE 系列(Qiagen)、pBS、pDIO、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、 pNH 系列(Stratagene)、pTRC99a、pKK223_3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia) ；pWLNE0、pSV2CAT、 pOG44、pXTl、pSG (Stratagene)、ρSVK3、pBPV、pMSG、ρSVL (Pharmacia)。不過，只要是能在宿 主中復制和存活，其它質(zhì)?；蜉d體也可應用。本發(fā)明也包括含有本發(fā)明多核苷酸的重組構建體。該構建體包括載體，如上述質(zhì) ?；虿《据d體，其中可正向或反向插入本發(fā)明的多核苷酸序列。構建體中還包含調(diào)節(jié)序列， 例如，有效地連接到本發(fā)明多核苷酸序列上的啟動子(包括組成型和誘導型啟動子)，介導 下游結構序列的轉錄。合適的啟動子包括但不限于，λ噬菌體的PL啟動子、桿狀病毒多角 體蛋白啟動子；細菌啟動子如；LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λ PR,PL和trp ；真核啟動子如=CMV 立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒的LTR和小鼠 金屬硫蛋白I啟動子；還包括衍生自植物細胞基因組中的啟動子，如熱休克蛋白、RUBISC0 啟動子。表達載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結合位點和轉錄終止子，其還可以具有 增強表達的合適序列，如增強子。增強子是DNA的順式作用因子，通常有大約10-300bp， 作用于啟動子，提高它的轉錄。例如，SV40中位于復制起點后側100-270bp處的增強子，
9巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起點后側的多形瘤增強子及腺病毒增強子。此 外，表達載體優(yōu)選還包含能提供表型特征的一種或多種選擇性基因、抗性基因和/或標記 基因，以便于轉化宿主細胞的篩選。選擇性基因如幫助細胞利用吲哚或組氨醇的trpB、 hisD(Hartman, S. C.，和 R. C. Mulligan(1988)美國國家科學院院報 85 8047-51)，用于 tk-或aprt-細胞的肝皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，Μ.等人(1977)細胞11 :223_32) 和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy，I.等人(1980)細胞22 :817_23)；抗性基因如賦予氨 甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶DHFR(Wigler，Μ.等人(1989)，美國國家科學院院報，77 3567-70)或賦予新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人(1981)生物化學 雜志(J. Mol. Biol.)，150:1-14)，以及四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。哺乳類表達載體一 般包括復制起點、適當?shù)膯幼?、增強子及任何必需的核糖體結合位點、多腺苷化位點、拼 接供體和受體位點、轉錄終止序列和5’側翼非轉錄序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序 列和多腺苷化位點可用于提供所需要的非轉錄遺傳元件。此外，包含編碼本發(fā)明多肽的核 苷酸序列的載體還可包含同源或異源的特定信號肽序列，以幫助目的蛋白質(zhì)分泌到原核細 胞或真核細胞膜外。本領域普通技術人員知曉，上述表達載體及構建體中含有的標記序列 和信號肽序列也可通過重組方法或化學法添加在編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸上。合適載體和啟動子的選擇為本領域普通技術人員周知。細菌適用的有效表達載體 可以這樣來構建將編碼目的蛋白的結構DNA序列隨同適當?shù)姆g起始和終止信號被插入 到帶有一個功能啟動子的可操縱的閱讀框中。本領域普通技術人員周知用于構建含有本發(fā) 明核苷酸序列以及合適的轉錄及翻譯調(diào)控元件的方法。這些方法包括體外重組DNA技術、 合成技術以及體內(nèi)遺傳重組技術(SambrookJ. (1989)，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Press ；Plainview, N. Y. ；Ausubel, F. Μ. (1989)當代分子生物學方法(Current Protocolsin Molecular Biology), John Wiley & Sons, N. Y.)。包含上述合適的DNA序列、合適的啟動子或控制序列的載體可以用于轉化合適的 宿主，讓宿主表達該蛋白。本領域技術人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達載體或構建體的種類和 特性選擇合適的宿主以表達目的蛋白質(zhì)。適于表達本發(fā)明的多肽的宿主包括但不限于原 核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細 胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9 ；動物細胞，如CH0、COS (猴腎成纖維細胞系，Gluzman (細 胞23 175，1981)及其它的能表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CH0、HeLa、BHK、Bowes 黑素瘤細胞；植物細胞以及腺病毒等等。各種哺乳動物細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也能用于表達重組 蛋白。從這些講授看，合適宿主的選擇應該在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。帶有如上所述的含有本發(fā)明核苷酸序列之載體或構建體能夠通過傳統(tǒng)的方法導 入合適的宿主細胞中以產(chǎn)生重組產(chǎn)物。將構建體導入上述宿主細胞的方法為本領域技術 人員周知，包括但不限于氯化鈣介導的轉化、磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、電 穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J. (1989)，分子克隆實驗室手冊， Cold Spring Harbor Press ；Plainview, N. Y. ；Ausubel, F. Μ. (1989)當代分子生物學方 法，John Wiley & Sons, N. Y. ；Hobbs, S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992), McGraw Hill, N. Y. 191-196 ；Engelhard, E. K.等人，美國國家科學院院 報，91 =3224-3227 ；Logan, J.等人，美國國家科學院院報，81 =3655-3659)
在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當?shù)?細胞密度之后，用適當?shù)姆椒?例如溫度轉變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將 細胞再培養(yǎng)一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞選擇以及所表達的目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)相 應的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領域技術人員知識范圍之內(nèi)。在合適的啟動子控制下可以在哺乳類細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達成熟蛋 白。利用由本發(fā)明的DNA構建體衍生的RNA，也可以用無細胞翻譯體系產(chǎn)生這種蛋白質(zhì) (Sambrook, J. (1989)，分子克隆實驗室手冊，第 18 章第 4 節(jié)，Cold Spring Harbor Press ； Plainview, N. Y.)。通常用離心的方法收獲細胞或培養(yǎng)液。對于目的蛋白質(zhì)保留在胞內(nèi)的情況，一般 可用任何便捷的物理、化學方法或酶法，包括凍融循環(huán)、超聲波、機械破碎，或使用細胞溶解 劑或特定的酶破碎細胞，將所得粗提物保留以進一步純化。對于目的蛋白質(zhì)分泌到胞外的 情況，可直接從培養(yǎng)上清液中利用常規(guī)方法回收目的蛋白質(zhì)。這些方法都是本領域的技術 人員熟知的。將多肽從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化的方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰 離子或陽離子交換層析、體積排阻層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和 植物凝集素層析。形成成熟蛋白的完整構象還需要蛋白質(zhì)的重折疊步驟。通常高效液相層 析(HPLC)或毛細管電泳可應用于最后的純化步驟。本發(fā)明還涉及了根據(jù)本發(fā)明所述多核苷酸序列制備的雞II型膠原蛋白在制備治 療和/或預防類風濕性關節(jié)炎等病的藥物的用途。具體的，本發(fā)明所述核酸分子的編碼區(qū) 或其部分，如全長序列、部分序列或其突變體均能用于有效表達本發(fā)明所述雞II型膠原蛋 白或其功能性片段。本發(fā)明特別涉及了一種用于預防和/或治療骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎的藥物組 合物，其中包含治療有效量的由本發(fā)明所述方法制備的雞II型膠原蛋白，和任選的，藥學 可接受的載體。本發(fā)明還包括食品或飲料組合物，其特征在于包含一定量的由本發(fā)明所述方法制 備的雞II型膠原蛋白。在發(fā)明的一個實施方案中，所述雞II型膠原蛋白用于制備保健食 品或食品添加劑等產(chǎn)品以對尤其是對骨關節(jié)病中的類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎等病起到保 健作用。本發(fā)明也包括一種食品添加劑組合物，其中包含一定量的由本發(fā)明所述方法制備 的雞II型膠原蛋白。本發(fā)明還包括了本發(fā)明所述核酸分子或其片段用于基因治療的用途。


圖1。顯示本發(fā)明所述雞II型膠原蛋白編碼基因的PCR克隆策略。圖2。顯示本發(fā)明所述全長雞II型膠原蛋白的結構。圖3。顯示雞胚中II型膠原蛋白編碼基因3’非翻譯區(qū)(UTR)的PCR結果。圖4。顯示成雞中II型膠原蛋白編碼基因的組織特異性表達。圖5。II型膠原蛋白濃度與吸光度標準曲線圖6。雞II型膠原蛋白編碼基因外顯子的剪切分析
圖7。雞II型膠原蛋白編碼基因的染色體分帶。圖8。雞染色體中期分裂相圖9。ISH雜交結果。圖10。人、犬、鼠、雞、斑點魚之II型膠原蛋白與基因同源性比較進化樹。圖11。pPIC9K/CC0L2Al (A)與及 pPICZ α B/CC0L2A1 (B)誘導表達上清及胞漿中表 達產(chǎn)物的WB分析，其中，M為蛋白分子量標準，1-5為WB陽性帶，6為空載體對照。圖 12pPICZa B/CC0L2A1/GS115 與 pPIC9K/P4Ha . ρΡΙ09/Ρ4Ηβ 共表達的 WB 分析， 其中，M為蛋白分子量標準，1-5為WB陽性帶，6為空載體對照。本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述。但是本發(fā)明并不局限于這些實施例。其中，分子生物學、生物化學、免疫學等常規(guī)操作均按照“分子克隆實驗指南”第 2版中的描述進行。所述酶切條件和緩沖液均按照生產(chǎn)廠家的說明書操作。通常所用的溫 育時間大約是37°C—個小時，但根據(jù)廠家的指示可以有所改變。實施例1雞胚胸骨總RNA提取17日齡SPF雞胚(中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，北京)經(jīng)消毒后破殼，取雞胚， 置冰冷生理鹽水中沖洗，無菌取胸骨，迅速置Trizol (Invitrogen)中快速研磨，轉移至 1. 5ml eppendorf管，室溫放置lOmin，4°C、IOOOOg離心lOmin，將上清轉移至一 DEPC處理 的印pendorf管，每管加200 μ 1氯仿，混勻，室溫放置lOmins，離心同上。將水相轉移至一 新印pendorf管，加等量異丙醇，室溫再放置lOmin，離心，75%乙醇洗滌沉淀，無RNase水溶 解，-80°C保存待反轉錄。cDNA 合成提取的總RNA，以 3，RACE 試劑盒(TAKARA)中的 oligodT_3sites adaptor primer 作為下游引物進行反轉錄。反轉錄完畢95°C處理5分鐘滅活反轉錄酶并將cDNA置-20°C 保存?zhèn)溆?。雞C0L2AlcDNA C-端原肽 cDNA 的 PCR 擴增根據(jù)已知雞C0L2A1C 端 UTR 的序列(Sandell LJ,Prentice HL, Kravis D, Upholt WB. , J Biol Chem，1984,259(12)7826-7834)，利用引物 col2al-2F，col2al_2R(如表 1 所 示)，擴增雞C0L2A1C-端原肽部分。C-端原肽(C0L2A1-2) cDNA進行以下PCR擴增程序弓| 物 col2al-2F, col2al_2R，10 X PCR 緩沖液；5 μ L, MgCl2 (25Mm) 5 μ L, dNTP Mix(IOMm) 1 μ L, 引物各自為 lyL(20pmol/yL)lyL，100% 甘油 2.5yL(終濃度 5% )，cDNA 2μ L, Taq 0. 8 μ L，總體積 50 μ L。PCR 所用程序 96 "C IOmin, 96 "C Imin, 62 "C Imin, 72 "C 3min, 72°C 7min。PCR反應體系內(nèi)含終濃度5%甘油，瓊脂糖電泳檢查擴增結果，并采用凝膠回 收試劑盒(Invitrogen)回收目的基因，連接pGEM-T載體(Promega)，轉化DH5 α，酶切鑒定 后測序。雞C0L2A13，UTR cDNA 的克隆根據(jù)已知雞C0L2A1基因序列設計擴增雞C0L2A13，UTR的上游引物col2al-lF (參 見表1)，采用3’ RACE策略，以反轉錄相對應的3sites adaptor primer (col2al_lR)擴增 3，UTR，其中，采用 PCR緩沖液，引物 col2al-lR為 3sites adaptor primers，采用 96°C 5min, 96°C lmin，63°C lmin，72°C 30sec (4 個循環(huán))，96°C 30sec,61°C 30sec,72°C 20sec(26 個循 環(huán))，72°C7min?；厥占稗D化均同前述步驟。
雞C0L2A1N-原肽cDNA的克隆col2al-5F, col2al-5R為上下游引物擴增5，N原肽。采用PCR緩沖液，退火與延 伸在同一溫度點上。96°C 5min，96°C lmin，72°C 50sec (30 個循環(huán))，72°C 7min。重組質(zhì)粒載體的構建及序列測定質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、轉化、構建重組質(zhì)粒的鑒定等均按《分子克隆實驗指 南〉〉(Sambook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning :a laboratory manual. 2nd ed Cold Spring HarborLaboratory Press，1989.)進行，將上述構建好的雞C0L2AlcDNA系 列片段基因以及SOE連接的雞C0L2AlcDNA系列片段及全長雞C0L2A1分別插入pGEM_T載 體(Promega)，酶切鑒定后測序。其中所述質(zhì)粒的構建和制備如下進行凝膠快速提取試劑盒回收過程PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，切膠回收目的基 因，再經(jīng)凝膠快速提取試劑盒回收。過程如下1)含目的基因的凝膠置于印pendorf管中，加入Iml溶液L1，50°C水浴15分鐘， 使凝膠徹底溶解；
2)將溶解好的凝膠加入離心柱中，12000rpm離心，柱內(nèi)再加入500μ 1 Li，室溫放 置1分鐘，離心同上；3)加L2700y 1，室溫放置5分鐘，離心同上；4) 12000rpm再離心2分鐘，使酒精揮發(fā)；5)將柱轉移至1新印pendorf管中，加入熱(約70°C )的TE 30μ 1，室溫放置2 分鐘，12000rpm離心，柱下的液體即為回收的目的DNA?；厥誅NA經(jīng)1 %瓊脂糖電泳，確定濃 度為 40 μ g/μ 1。目的DNA與pGEMT載體的連接連接體系如下2X連接緩沖液5 μ 1，目的DNA 3 μ 1，T載體1 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，共計10 μ 1，混勻，4°C放置過夜。大腸桿菌DH5a 感受態(tài)的制備參照 Sambook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning -.a laboratory manual. 2nd ed ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989.中所述方法。PCR連接產(chǎn)物轉化DH5a感受態(tài)取如上述連接好的pGEMT-col2al_l (2，3，4，5 等)4 μ 1，加入100 μ 1新鮮制備的感受態(tài)，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再迅速置冰水中 2-3分鐘，加入90(^1無氨芐1^，371、160印111輕搖45分鐘，加入1]\0 164“1，16“1(5011^/ ml)X-gal，涂布氨芐LB平板，37°C下培養(yǎng)16小時至菌落大小合適為止。陽性轉化子的篩選挑取IPTGX-gal氨芐青霉素 平板上的白色克隆接種含有 200 μ g/ml氨芐青霉素的LB中，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)12小時，提取質(zhì)粒。由上述方法制備得到本發(fā)明所述pGEMT-col2al_2，pGEMT-col2al_l、 pGEMT-col2al-3, pGEMT_col2al-(1+2)和 col2al_5、col2al_4 質(zhì)粒質(zhì)粒采用Not I與Nco I雙酶切鑒定陽性克隆。NotI與Nco I雙酶切體系 οχ μ 1,0. 1% BSA 1 μ 1，采用 Promega Α7500 試劑盒提取質(zhì)粒 8 μ 1，Not I 1 μ 1, Nco I 1μ 1，水8μ 1，共計20μ 1，37°C酶切2小時。酶切完畢，瓊脂糖電泳鑒定陽性克隆，將酶 切陽性的克隆送樣測序。核酸測序儀為PE公司的ABI377。雞C0L2A1 全長 cDNA 的 S0E-PCR為獲得雞C0L2A1全長cDNA，本研究采用重疊延伸-PCR (SOE-PCR)策略來進行構建(Horton RM，Hunt HD, Ho SN, et al. , Gene, 1989,77 :61_68)，這需進行四次 PCR 反應。第一次PCR 反應是以質(zhì)粒 pGEMT-col2al_2，pGEMT-col2al_lPCR 產(chǎn)物為模板， 以col2a-2F、col2al_lR為上、下游引物，使col2al_2、col2al_l連接起來形成產(chǎn)物 col2al-(2+l)；采用 Pfu DNA 聚合酶，PCR 擴增條件96°C 5min，96°C lmin，60°C lmin, 72°C 150sec(4 個循環(huán))，96°C 30sec,58°C 30sec,72°C 130sec(26 個循環(huán))，72°C 7min。；第二次PCR 反應是以質(zhì)粒 pGEMT-col2al_3，pGEMT-col2al_ (1+2) PCR 產(chǎn)物為模板， 以 col2a-3F、col2al-lR 為上、下游引物。PCR 擴增條件:96°C 5min，96°C lmin，64°C lmin, 72°C 120sec (4 個循環(huán))，96°C 30sec,62°C lmin, 72°C 90sec (26 個循環(huán))，72°C 7min。第三次PCR反應中，以col2a_5F、col2al_4R為上、下游引物，將col2al_5、 col2al-4 質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物為模板。PCR 擴增條件96 "C 5min，96 "C lmin, 62 "C 2min, 72°C 120sec (4 個循環(huán))，96°C lmin, 60°C lmin, 72°C 90sec (26 個循環(huán))，72°C 7min。第四次PCR反應則以col2a-5F、col2al-lR為上、下游引物，以前三次連接好 的 PCR 產(chǎn)物(col2al-5+4, col2al 1+2+3)為模板，可獲得全長 col2aIcDNA0 PCR 擴增 條件96 "C 5min，96 "C lmin, 64 "C 2min，72 "C 210sec (4cycles), 96 "C lmin, 62 "C lmin, 72°C 180sec(26cycles) ,72°C 7min。雞C0L2A1全長cDNA克隆所用引物序列如表1示表1.雞C0L2A1全長cDNA擴增引物序列
col2al- IF5'-TCT ATC GCG CAC CCG TTG TGC -3'co!2al- 1R5，-GTC TTG TAG TGC TAC GGC TTG C -3'col2a-12F5，-TTG CAG ATG TCT CCA ATA CCA G -3'col2al-2R5'-GCA CAA CGG CTC GGG CAA TGT GCT AAC G -3'col2al--3F5'-GCT CGG AAG CAA CGG CCT CG -3'col2al·-3R5'-CTC GTC CCG GAC GCG ACG G -3'col2al--4F5'-CGC TGC GAT CGT CAT GCG G -3'col2al--4R5'-GTA GTG ACC CTA CGC CCG AG -3'col2al--5F5'-ACG CCG GCT CTC GTG CTC CTC GTG GTG C -3'col2al.-5R5'-CCG CCC GGG TCC GAA TGC CCG CAT -3'本研究采用重疊延伸-PCR(SOE-PCR)策略來獲得全長4837bp雞C0L2AlcDNA(圖 1)。由于雞C0L2A1基因GC含量較高，基因擴增過程中反應體系采用適宜擴增高GC含量的 緩沖液，擴增產(chǎn)物特異性極高，將其插入PGEM-T載體。利用大腸桿菌DH5ci ；以及Promega 出品的工具酶進行酶切、轉化和序列測定。其中上述引物由上海博亞生物技術有限公司合 成，測序由日本TAKARA公司完成。所得結果見后附序列表中SEQ ID N0:1。實施例2雞C0L2A1基因組DNA的提取雞C0L2A1 基因組 DNA 的提取采用 Wizard genomic DNApurification kit (Promega)進行。具體操作見試劑盒說明書。提取DNA純度測定260/280為1. 6-1. 8 (BECKMAN, DU 640)。雞C0L2A1基因組DNA的PCR克隆及文庫篩選以PgF 與 PgR 為上、下游引物，引物序列為=PgF 5，CCA GGC AAGGAT GGC GCA CG 3，；PgR 5，CCT GAT CGG CTC CGC CAA TGTCCA TAG G 3，，進行 CC0L2A1C 端基因組的克隆。 選用LA Taq酶(GC buffer)對CC0L2A1基因組DNA進行PCR擴增。采用0.8%瓊脂糖電泳 檢查PCR擴增結果，以凝膠回收試劑盒回收目的基因并連至pGEM-T載體，酶切鑒定、測序鑒 定陽性克隆。由于CC0L2A1基因組序列中的高GC含量及polyT結構，亦通過SOE-PCR方法 以全血總DNA為模板分段克隆CC0L2A1基因組N-端序列，以拼接成接近于全長的CC0L2A1 基因組DNA序列。最初我們通過PCR對雞外周血中提取的DNA進行擴增，能獲得CC0L2A13 ’端 5494bp的片段，擴增產(chǎn)物特異性極高(圖1-9)，將其插入pGEM-T載體，得到pGEM_T/ CC0L2A1，進行測序。測序結果可以看出雞CC0L2A13’端基因組DNA包含部分三螺旋區(qū)、3’端肽及3’原 肽，此克隆基因組部分含有19個內(nèi)含子及20個外顯子。然而對3’端以外的基因組序列，無論如何調(diào)整模板、引物及PCR擴增條件，均未能 獲得該目的基因。隨后，又對從雞基因組DNA文庫中篩選到的陽性克隆進行測序，但也因高 GC含量及PolyT結構限制了測序反應的進行，使測序信號中斷。為此，我們采取了利用已知的外顯子序列，設計多個測序引物，才使CC0L2A1基因 組DNA的測序得以完成。最終我們獲得長度為12003bp的CC0L2A1基因組DNA序列，其中 包含45個外顯子和44個內(nèi)含子，內(nèi)含子、外顯子結構如表2示。所得雞C0L2A13’端基因 的結構如圖2所示。經(jīng)查新檢索證實，該基因組DNA序列為CC0L2A1基因組所特有，國際上 未曾報道過。相關基因序列亦已遞交GenBank，Accession No為AF452711。表2 雞C0L2A1基因組DNA 3，端的外顯子、內(nèi)含子結構 注外顯子、內(nèi)含子的命名采用Upholt 等 J Biol Chem, 1984,259(12) =7826-7834
的方法。實施例3雞C0L2A1 Q1(II)組織特異性表達
雞胚C0L2A1表達譜C0L2A13’ UTR經(jīng)Blast的核甘酸序列數(shù)據(jù)庫檢索為C0L2A1所特有。因此以 C0L2A IcDNA 3，UTR為擴增對象，研究α 1 (II)在發(fā)育的雞胚中的表達。應用RT-PCR對 17日齡雞胚心、肝、玻璃體、角膜、皮膚、胸肌、胸骨等臟器進分析，所用引物為表1中的 col2al-lF，col2al_lR，產(chǎn)物連pGEMT_easy載體，酶切后測序。同時以GAPDH作為內(nèi)參，利 用引物 PFgapdh 5，GC AGA GGT GCTGCC CAG AAC 3，；PRgapdh 5 ‘TCA CTC CTT GGA TGC CAT GTG3，擴增 412bp 片段的 GAPDH。從17日齡雞胚C0L2A13’UTR R T-PCR結果可以看出，雞C0L2AlmRNA在雞胚的心、 肝、玻璃體、角膜、皮膚、胸肌、胸骨、小腸、關節(jié)軟骨、半月板、顱骨中有表達，而脾臟、胸腺、 睪丸卻檢測不到C0L2AImRNA。(參見圖3)。成雞II型膠原蛋白表達譜采用天然II型膠原檢測試劑盒(Chondrex)對四周齡雞心、肝、脾、腎、玻璃體、角 膜、皮膚、胸肌、半月板、胰臟、胸腺、小腸、胃、睪丸、骨骼肌、大腦、小腦、關節(jié)軟骨、胸骨、肺 臟共20個臟器進行ELISA檢測II型膠原蛋白的存在。(凍干組織各5mg，充分勻漿，0. 8ml 50mM醋酸-0. 2M NaCl (pH2. 9-3. 0)溶解，100 μ 1 20mg/ml 的胃蛋白酶(Sigma)4°C^f|K48h ； 加入250 μ 1 10XTSB，并用IMNaOH調(diào)ρΗ至8. 0，加入100 μ 1 2mg/ml的彈性蛋白酶(Sigma) 混勻，4°C消化過夜。10000g，4°C離心5分鐘，棄沉淀，上清定容至lml，4°C保存?zhèn)溆?。采用雙抗體夾心ELISA法檢測提取的II型膠原蛋白。選用兩種針對雞II型膠原 蛋白分子不同表位的單克隆抗體，其中，一種作為包被抗體，另一種作為酶標檢測抗體。首 先捕獲抗體包被ELISA板，4°C過夜，洗滌三次，處理好的樣品1 200稀釋并與標準品一同 點樣于包被好的ELISA板，37°C2h洗滌同上；生物素標記的雞II型膠原蛋白單克隆抗體加 入各孔，37°C孵育2h，洗滌同上，最后加入酶標鏈親和素，37°C Ih ；充分洗滌，最后加顯色液 0PD，37°C顯色半小時，1. 25M硫酸終止反應。測0D490光密度值。具體操作見試劑盒說明 書。成雞20種臟器天然II型膠原蛋白檢測實驗發(fā)現(xiàn)，雞II型膠原蛋白在胸骨、關節(jié) 軟骨、胰臟、小腸有表達，而在其它臟器卻不見表達。(參見圖4)同時以雞天然II型膠原蛋白作為標準品，制作濃度、吸光度標準曲線，依據(jù)標準 曲線計算相應各陽性組織中雞II型膠原蛋白的表達量(參見圖5)。據(jù)標準曲線得出胸骨中雞II型膠原蛋白的表達量為0. 4%，關節(jié)軟骨表達量在四 周雞所檢測組織中表達量最高達1. 5%，胰臟、小腸中的表達量分別為0. 84%與0. 2%。實施例4雞C0L2A15’原肽外顯子2剪接分析采用RT-PCR分析雞C0L2A1外顯子2在雞胚各臟器中的剪接情況，以表1中 C012al-5F，C012al-5R為上、下游引物對雞皮膚、肝臟、眼球玻璃體、角膜、胸肌、小腸、胸骨、 關節(jié)軟骨等進行PCR擴增分析，瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的特異性。RT-PCR結果表 明，雞C0L2A15’ N原肽外顯子2存在于雞心臟、肝臟、眼球玻璃體、角膜、胸肌、小腸，而軟骨 組織如胸骨、關節(jié)軟骨中以不含外顯子2的表達形式存在。(參見圖6)實施例5雞C0L2A1基因染色體的定位為了將雞C0L2A1基因精細定位于染色體，采用染色體ISH技術，應用地高辛高效 標記檢測試劑盒(Roche)標記的雞C0L2A13’ UTR基因片段為探針，與中期分裂相的雞染色體進行雜交，研究其在染色體上的定位。采用ISH原位雜交，以地高辛標記的雞C0L2A13’ UTR基因片段為探針，與雞中期 分裂相的染色體精細雜交，雜交信號經(jīng)統(tǒng)計分析，將雞C0L2A1基因定位于4號染色體短臂 2區(qū)(參見圖7，8，和9)。實施例6雞C0L2A1同源性比較利用Dnastar軟件包中的MegAlign對已獲得的雞C0L2A1與從GenBank數(shù)據(jù)庫中 檢索到的犬(AF023169，AF242201)、人(MM001844)、斑點魚(U23822)、小鼠(M65161)等不同 種屬的II型膠原三螺旋區(qū)cDNA序列及蛋白質(zhì)序列進行同源性的比較和分析，Genedoc程 序編輯，繪制進化樹(參見圖10)。雞C0L2A1 cDNA序列與已知的人、犬、小鼠、斑點魚進行了同源性比較，結果顯示 雞C0L2A1與犬CII在種族進化上同源性最高，其氨基酸與cDNA同源性分別為79. 03%, 94. 77% ；其次為雞與人，同源性分別為78. 96%,93. 89% ；雞與鼠同源性分別為77. 38%, 92.90%。人與犬在所比較的五種種屬中同源性最高，氨基酸與蛋白質(zhì)分別為91. 89%、 98. 52%。其次為人與鼠，分別為88. 63%,96. 15%，比較結果建立進化樹。參考文獻1. 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ArthritisRheum，2002，46 1109-20.實施例7重組CC0L2A1全長cDNA的表達實施例中所采用的材料、試劑和儀器如下所述pPIC9K、pPIC9、pPICZ α A、B、C表達載體系統(tǒng)及GS115、Χ33酵母菌株均購自 Invitrogen 公司；綠豆核酸 Sl 購自 NEB 公司；Spheroplast kit for yeast 與 Pichia EasyComp kit購自Invitrogen公司；Mini II型蛋白電泳儀及蛋白半干電轉儀(Bio-Rad 公司)；GeL_Pro3. 1凝膠成像系統(tǒng)(Media Cybernetic公司)；而640型核酸-蛋白分析儀 (Beckman 公司)。1) pPICZ α B/CC0L2A1真核表達載體的構建用于構建pPICZaB/CC0L2Al真核表達載體。引物序列25 :5，GGT ACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3，，引物 26 序列5，GGT ACC GTT ACA AGA AGC AGA CTG 3，，以 質(zhì)粒PGEM-T/CC0L2A1為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為2XGCBuffer I 25 μ 1， dNTP (2. 5mM)4y 1，引物 25 (20 μ Μ) 0. 5 μ 1，引物 26 (20 μ Μ) 0. 5 μ 1，PCR 擴增程序如下 96 "C 5min — 4X (96 "C lmin，67 "C lmin，72 "C 3min) — 26X (96 "C lmin，65 "C 30sec, 72 °C 2. 5min) — 72 °C 5min。回收PCR產(chǎn)物克隆入pPICZ a B表達載體中，采用限制性內(nèi)切酶BamHI鑒定正確插 入方向的表達載體pPICZ a B/CC0L2A1。2)酵母表達載體pPIC9K/CC0L2Al的構建為提高pPICZaB/CC0L2Al載體在畢赤酵母中的表達穩(wěn)定性和表達量，進一步將CC0L2A1構建在多拷貝載體pPIC9K中，構建pPIC9K/CC0L2Al。pPIC9K/CC0L2Al的構建流程 詳見下圖，簡述如下首先pPICZaB/CC0L2Al經(jīng)KpnI線形化后再用綠豆核酸酶進行削平， 同時PPIC9K經(jīng)平端酶SnaBI削平，兩者由T4DNA連接酶連接，構建成pPIC9K/CC0L2Al表達 載體，經(jīng)測序確定閱讀框正確否。3)P. pastoris GS115 原生質(zhì)體的制備采用原生質(zhì)體法轉化酵母，流程如下a)、將P. pastoris GSl 15劃線接種于YPD平板，30°C培養(yǎng)2d，挑取單克隆接種于 5ml YPD培養(yǎng)基中，30°C 300rpm培養(yǎng)過夜；b)、l 1000 稀釋接種菌懸液至 100ml YPD，30°C 300rpm 培養(yǎng)至 0D600 為 0. 2-0. 3 時，l，500g離心5min，棄上清；c)、分別以20ml無菌水、20ml SED及20ml IM山梨醇各洗滌細胞一次，每次洗完后 1，500g離心5min，棄上清，最后加20ml SCE重懸細胞，分成IOml的A、B兩管；d)、取 1.5ml 印pendorf，每管加 800 μ 1 15 % SDS，并分別標上 0、2、4、5、6、8、 9、10、15、18、20、25、30、35、40分別代表Zymolyase消化細胞壁的時間(min)；從A管中 取200 μ 1菌懸液加入后，放入冷凍中作為Zymolyase消化分鐘的對照管。加7. 5 μ 1 Zymolyase (2. 25units)到A管，輕輕混勻，30°C保溫；根據(jù)管上標記的時間，每次從A管取 200 μ 1消化的細胞懸液并加800 μ 1 5% SDS至印pendorf管中，并立即放置冰上以終止酶 反應；e)、依據(jù)下列公式計算每個時間點形成原生質(zhì)體的百分比原生質(zhì)體％ = 100-[(0D800(min)/0D800(0min) X100)，以計算形成 70% 原生質(zhì)體的時間(t min)；加 7. 5 μ 1 Zymolyase 至Ij B 管，30°C保溫 tmin ；f)、室溫750g離心lOmin，棄上清，分別用IOml IM的山梨醇10ml CaS洗滌原生質(zhì) 體，棄上清，最后用0. 6ml CaS重懸原生質(zhì)體，用于轉化。4) PPIC9K/CC0L2A1、pPICZ α B/CC0L2A1 轉化 GSl 15 原生質(zhì)體a)、約 10 μ g 線形化的 pPICZ α B/CC0L2AUpPIC9K/CC0L2A1 分別與 100 μ 1 剛制備 好的原生質(zhì)體輕輕混合，室溫放置IOmin ；同時以pPIC9K/GS115及pPICZ α B/GS115空質(zhì)粒 載體作為陰性對照；b)、加Iml新鮮配制的PEG/CaT (1 1)溶液，輕輕混合，室溫再放置IOmin ；c)、750g離心lOmin，盡可能吸去上清，用150μ 1 SOS重懸細胞并靜置20min，加 850 μ 1 IM的山梨醇；d)、每150 μ 1已轉化的原生質(zhì)體與10ml RD瓊脂糖培養(yǎng)基混合，并鋪在RDB平板 上層，28-30°C培養(yǎng)4-6d并觀察結果。5) pPICZ α B/CC0L2A1/GS115 及 pPIC9K/CC0L2Al/GS115 陽性轉化子的抗性篩選培養(yǎng)后的pPIC9K/CC0L2Al/GS115 與 pPICZ α B/CC0L2A1/GS115 在 RDB 平板長出約 100個的轉化子，為了獲得多拷貝，將各轉化子分別轉移至在含不同濃度的G418或Zeocin 的抗性平板(G418 濃度0· 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2. 0mg/ml、3. 0mg/ml、4. Omg/ml ； Zeocin 濃度 100μ g/ml，200y g/ml)上篩選多拷貝。6)酵母基因組DNA的提取及目的基因在酵母基因組中整合的PCR鑒定分別將抗性轉化子及空載體對照，接種到2ml的YPD中，30°C 300rpm培養(yǎng)2d，離心后提取基因組DNA，采用PCR檢測CC0L2A1基因在酵母基因組中的整合，其中以 CC0L2AIcDNA 的特異性引物:F :5，GGTACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3，，R :5，GGTACCGTT ACA AGA AGC AGA CTG 3，。PCR 循環(huán)參數(shù)為96 °C 5min — 5X (96 °C lmin，60 °C 2min， 72°C 3min) — 25X (96°C lmin,58°C lmin,72°C 2min) — 72°C 5min。7) pPICZ α B/CC0L2A1 /GS115,pPIC9K/CC0L2A1 /GS115 的甲醇誘導表達及免疫印跡 分析將經(jīng)過鑒定為陽性的克隆，接種至30ml BMGY的培養(yǎng)基中28°C 300rpm培養(yǎng)2d后 離心棄上清，以1/10體積的BMMY重懸，于28°C 300rpm繼續(xù)培養(yǎng)；期間每隔24hr補充甲醇 至體積。分別收集誘導4d培養(yǎng)物的上清及菌體；上清經(jīng)透析、脫鹽后凍干；菌體中加入 破菌buffer與約1/4體積的玻璃珠破菌，10，OOOrpm離心，上清即為胞漿液；誘導上清及胞 漿液經(jīng)10% SDS-PAGE電泳并轉膜分析，20%胎牛血清封閉，4°C過夜；以1 1000稀釋的 95D1A單克隆抗體與NC膜作用，室溫孵育2h，TTBS洗膜三次，每次5min ；然后再用1 500 稀釋的羊抗小鼠二抗-AP與NC膜室溫孵育2h，洗膜同上；最后用NBT/BCIP顯色試劑盒顯 色。結果別取上述各表達載體誘導表述后的上清進行脫鹽、濃縮及10% SDS-PAGE的電泳 分析與WB鑒定。結果表明，pPICZaB/CC0L2Al轉化子中僅在胞漿內(nèi)可見位于80KD左右 CC0L2A1 α鏈的表達帶(圖11A)；而在pPIC9K/CC0L2Al轉化子胞漿中WB檢測到表達完整 的CC0L2A1 α鏈(圖11B)，上清中卻無WB條帶出現(xiàn)。實施例8脯氨酸4羥化酶α亞單位和/或β亞單位表達載體的構建1)脯氨酸4羥化酶α亞單位(P4H a ) cDNA的克隆根據(jù)雞脯氨酸4羥化酶α亞單位(P4Hci)基因的序列，設計引物a :5’ AGA TAC TGC TAC GAA AGA CCC CGA G 3'；引物 b CTC TCT TGG TTG TAG CCC TCA TCT G 3，；PCR 反應體系為10XPCR Buffer 5 μ 1，MgCl2 (25mM) 5 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 4 μ 1， 弓 I 物 a (20 μ Μ) 0· 5 μ 1，弓 I 物 b (20 μ Μ) 0· 5 μ 1，cDNA 1 μ 1，Taq 0· 5 μ 1，H2O 補至 50 μ 1 ; PCR擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖電泳檢測；PCR擴增程序為96 V 5min — 4 X (96 V lmin, 72°C 3min) — 26X (96°C lmin,69°C lmin,72°C 2min) — 72°C 3min。2)pPIC9K/P4Ha真核表達載體的構建將如上述所得P4H α的PCR產(chǎn)物與pGEM_T載體連接，構建pGEM_T/P4H α質(zhì)粒。通 過 PCR 引入 Not I 酶切位點，所用引物 a :5，GCG GCC GCA GAT ACT GCT ACG AAA G 3，；引 物 b :5，GCGGCC GCC TCT CTT GGT TGT AGG 3，；采用 Pfu DNA 聚合酶進行 PCR 擴增，產(chǎn)物 回收后加A尾，連至pGEM-T載體內(nèi)并測序；pGEM-T/P4Ha經(jīng)Notl酶切、回收目的片段，通 過T4DNA連接酶將P4Ha基因與經(jīng)Notl線形化的酵母pPIC9K載體相連接，構建成pPIC9K/ P4Ha表達載體。鑒定插入方向正確。3) P4H β cDNA的克隆及重組表達載體的構建根據(jù)已知雞Ρ4Ηβ亞基基因序列設計引物F :5，GCG GCC GCACAG CCC CTG GAG GAG 3，，引物 R :5，GCG GCC GCG GTG ATGTAG ATC AGT C 3，，并引入 NotI 酶切位點；對 17 日齡 雞胚胸骨細胞中提取的RNA進行PCR擴增，反應體系中采用1. 5mM濃度的[Mg2+]，PCR擴增程 序為96°C 5min — 4X (96°C lmin，53°C lmin，72°C 2min) — 26X (96°C 30sec，51°C 30sec,720C 2min) — 72°C 5min。PCR產(chǎn)物連入pGEM_T載體內(nèi)進行測序；測序正確的克隆再導入 畢赤酵母PPIC9表達載體中，構建成pPIC9/P4Hi3表達載體。實施例9pPIC9K/P4Ha、ρΡΙ09/Ρ4Ηβ 與 pPICZ a B/CC0L2A1 在酵母 GSl 15 中的共
表達將如實施例7和8中所述重組表達載體pPIC9K/P4Ha、ρΡΚ9/Ρ4Ηβ及pPICZ a B/ CC0L2A1分別采用Bglll、Sail、PmelI線形化。各取10 μ g線性化的質(zhì)粒轉化GS115，在含 G418及Zeocin的匪平板篩選陽性轉化子，30°C培養(yǎng)4_6d。實施例lOpPICZ α Α/Ρ4Η α - β雙表達載體的構建pPIC9K/P4H α、pPIC9/P4H β 及 pPICZ α B/CC0L2A1 在共表達時，陽性克隆不穩(wěn) 定，為了克服上述構建的不足之處，將Ρ4Ηα、β構建在同一表達載體pPICZaA，形成 pPICZ α Α/Ρ4Η α -Ρ4Η β 雙表達載體。分別以實施例8和9中所得質(zhì)粒pGEM-T/P4H α及pGEM_T/P4H β為模板進行 PCR, Ρ4Ηα 引物 F:5' GCGGCCGC GAT ACT GCT ACGAAA G3'；引物 R:5' GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAA C 3，；Ρ4Ηβ 引物 F :5，GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG-3，；R 5，GCGGCCGC TTA ATC ATC ATC AGC 3，；PCR 循環(huán)參數(shù)96 "C 5min — 4X (96 "C lmin，66 "C 80sec, 72°C 90sec) — 26X (96°C lmin，64°C 40sec，72°C 50sec) — 72°C 5min。PCR 擴增產(chǎn)物用 1 %瓊脂糖電泳檢查，回收特異性擴增目的條帶并連接pGEM-Teasy載體并測序。測序正確的pGEM_T/P4Ha及ρ6ΕΜ_Τ/Ρ4Ηβ分別采用NotI酶切，連接pPICZ a A, 得到pPICZ a A/P4H α重組表達載體，和pPICZ a A/P4H β表達載體。將？？扣2 0々/^4!^完整表達單元切下，插入？？扣2 0 4/ 4!10。再根據(jù)Bglll、 BamHI為同裂酶，可連接BglII線性化的pPICZ α A/P4H α，構建成pPICZ α Α/Ρ4Η α - β雙表 達載體。根據(jù)Ρ4Ηβ表達單元位于Ρ4Ηβ表達單元的上游，應用PCR鑒定pPICZ α A/ Ρ4Ηα-β雙表達載體中Ρ4Ηα、β表達單元的方向是否一致。上游引物5，GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG 3，，與擴增Ρ4Ηα 特異性的下游引物5，GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAAC 3’進行PCR擴增；如插入為正向，則PCR擴增可獲得4644bp的產(chǎn)物，反之，則PCR擴增無目 的條帶出現(xiàn)。實施例1 lpPIC9K/CC0L2Al 與 pPICZ α Α/Ρ4Η α - β 共表達將pPIC9K/CC0L2Al與ρΡΚΖαΑ/Ρ4Ηα-β共轉化GS115進行三基因的共表達研 究。原生質(zhì)體的制作、陽性轉化子的篩選、PCR鑒定以及甲醇誘導均按前述方法進行。采用SDS-PAGE 及 WB 法對 pPICZ α B/CC0L2A1/GS115 與 pPIC9K/P4Ha . pPIC9/ Ρ4Ηβ共表達的誘導上清及胞漿表達物進行鑒定，WB結果如圖12示，從圖中可看到，共表達 時可在其胞漿內(nèi)得到全長表達的的CC0L2A1 α鏈，而在上清中則未檢測到表達產(chǎn)物。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院<120> 一種編碼雞II型膠原蛋白的全長多核苷酸序列及其用途<130>IDC090157<160>3<170>PatentIn version 3. 1
<210>1
<211>5495
<212>DNA
<213>genomic DNA
<400>1
ccaggcaaggatggcgcacgtgtaagtggg
gctcacagagaccacatcctcatctctctc
ggtccccctggccctgctggccccaacggt
acattacgccccatgggatgaccccagtgc
tgaatccggccctcctggtccatctggtgc
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GlyGinArgGlyAspArgGlyGluLysGlyGluLysGlyAlaProGly
65707580
ProArgGlyArgAspGlyGluProGlyThrProGlyAsnProGlyPro
859095
ProGlyProProGlyProProGlyProProGlyLeuGlyGlyAsnPhe
100105110
AlaAlaGinMetAlaGlyGlyPheAspGluLysAlaGlyGlyAlaGin
115120125
MetGlyValMetGinGlyProMetGlyProMetGlyProArgGlyPro
130135140
ProGlyProThrGlyAlaProGlyProGinGlyPheGinGlyAsnPro
145150155160
GlyGluProGlyGluProGlyAlaAlaGlyProMetGlyProArgGly
165170175
ProProGlyProProGlyLysProGlyAspAspGlyGluThrGlyLys
180185190
ProGlyLysSerGlyGluArgGlyProProGlyProGinGlyAlaArg
195200205
GlyPheProGlyThrProGlyLeuProGlyValLysGlyHi s Arg Gly
210215220
TyrProGlyLeuAspGlyAlaLysGlyGluAlaGlyAlaProGlyAla
225230235240
LysGlyGluSerGlySerProGlyGluAsnGlySerProGlyProMet
245250255
GlyProArgGlyLeuProGlyGluArgGlyArgProGlyProSerGly
260265270
AlaAlaGlyAlaArgGlyAsnAspGlyLeuProGlyProAlaGlyPro
275280285
ProGlyProValGlyProAlaGlyAlaProGlyPheProGlyAlaPro
290295300
GlySerLysGlyGluAlaGlyProThrGlyAlaArgGlyProGluGly
305310315320
AlaGinGlyProArgGlyGluSerGlyThrProGlySerProGlyPro
325330335
AlaGlyAlaPro GlyAsnProGlyThrAspGlylieProGlyAlaLys
340345350
GlySerAlaGlyAlaProGlylieAlaGlyAlaProGlyPheProGly
355360365
ProArgGlyProProGlyProGinGlyAlaThrGlyProLeuGlyPro
GlyAlaAlaGlylieAlaGlyLeuLysGlyAspArgGlyAspValGly
690695700
GluLysGlyProGluGlyAlaProGlyLysAspGlyAlaArgGlyLeu
705710715720
ThrGlyProlieGlyProProGlyProAlaGlyProAsnGlyGluLys
725730735
GlyGluSerGlyProProGlyProSerGlyAlaAlaGlyAlaArgGly
740745750
AlaProGlyGluArgGlyGluProGlyAlaProGlyProAlaGlyPhe
755760765
AlaGlyProProGlyAlaAspGlyGinProGlyAlaLysGlyGluGin
770775780
GlyGluProGlyGinLysGlyAspAlaGlyAlaProGlyProGinGly
785790795800
ProSerGlyAlaProGlyProGinGlyProThrGlyValThrGlyPro
805810815
LysGlyAlaArgGlyAlaGinGlyProProGlyAlaThrGlyPhePro
820825830
GlyAlaAlaGlyArgValGlyProProGlyProAsnGlyAsnProGly
835840845
ProProGlyProProGlySerAlaGlyLysAspGlyProLysGlyVal
850855860
ArgGlyAspAlaGlyProProGlyArgAlaGlyAspProGlyLeuGin
865870875880
GlyProAlaGlyProProGlyGluLysGlyGluProGlyGluAspGly
885890895
ProAlaGlyProAspGlyProProGlyProGinGlyLeuAlaGlyGin
900905910
ArgGlylieValGlyLeuProGlyGinArgGlyGluArgGlyPhePro
915920925
GlyLeuProGlyProSerGlyGluProGlyLysGinGlyAlaProGly
930935940
SerAlaGlyAspArgGlyProProGlyProValGlyProProGlyLeu
945950955960
ThrGlyProAlaGlyGluProGlyArgGluGlyAsnProGlyAlaAsp
965970975
GlyLeuProGlyArgAspGlyAlaAlaGlyValLysGlyAspArgGly
980985990
GluThrGlyProValGlyAlaProGlyAlaProGlyAlaProGlyAla
TyrGly AspGluAsnLeuSer ProAsn ThrAlaSer lieGin
129513001305
ThrPhe LeuArgLeuLeuSer ThrGlu GlySerGin AsnVal
131013151320
TyrHis CysLysAsnSerlie AlaTyr MetAspGlu GluThr
132513301335
AsnLeu LysLysAlalieLeu lieGin GlySerAsn AspVal
134013451350
lieArg AlaGluGlyAsnSer ArgPhe ThrTyrSer ValLeu
135513601365
AspGly CysThrLysHisThr GlyLys TrpGlyLys ThrVal
137013751380
GluTyr ArgLeuGinLysThr SerArg LeuSerlie ValAsp
138513901395
AlaPro MetAsplieGlyGly AlaAsp GinGluPhe GlyVal
140014051410
lieGly ProValCysPheLeu
14151420
Met Thr Gly Glu Glu lie Thr Asp
3權利要求
一種如SEQ ID NO1所示的包含編碼全長雞II型膠原蛋白的多核苷酸序列之分離的核酸分子，或其具有相同生物學功能的片段。
2.權利要求1所述的分離的核酸分子，其為具有如SEQID NO :2所示編碼全長雞II型 膠原蛋白的多核苷酸序列片段。
3.權利要求1所述分離的核酸分子或其具有相同生物學功能的片段編碼的雞II型膠 原蛋白，或其具有相同生物學活性的片段。
4.一種含有權利要求1或2所述核酸分子或其具有相同生物學功能的片段的重組表達 載體。
5.一種由權利要求4所述重組表達載體轉化的宿主細胞，其能夠表達雞II型膠原蛋 白，或其具有相同生物學活性的片段。
6.一種制備權利要求3所述雞II型膠原蛋白的方法，其中包括1)·用權利要求4所述重組表達載體轉化合適的宿主細胞；2).在合適的培養(yǎng)基中及適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細胞；3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化目的蛋白質(zhì)。
7.權利要求6所述方法制備的雞II型膠原蛋白用于制備治療和/或預防類風濕性關 節(jié)炎藥物的用途。
8.一種用于預防和/或治療骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎的藥物組合物，其中包含治療 有效量的根據(jù)權利要求6所述方法制備的雞II型膠原蛋白，和任選的，藥學可接受的載體。
9.一種食品或飲料組合物，其特征在于包含一定量的權利要求6所述方法制備的雞II 型膠原蛋白。
10.一種食品添加劑組合物，其中包含一定量的權利要求6所述方法制備的雞II型膠 原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含如SEQ ID NO1所示編碼全長雞II型膠原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物學功能的片段；及其所編碼的雞II型膠原蛋白。本發(fā)明還涉及一種制備所述雞II型膠原蛋白的方法，以及由本發(fā)明所述方法制備的雞II型膠原蛋白用于制備治療和/或預防類風濕性關節(jié)炎的藥物的用途。本發(fā)明特別涉及一種用于預防和/或治療骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎的藥物組合物，以及食品或飲料組合物或食品添加劑組合物，其中含有本發(fā)明方法制備的所述雞II型膠原蛋白。本發(fā)明還涉及所述核酸分子用于基因治療的用途。
文檔編號C07H21/04GK101899444SQ20091025022
公開日2010年12月1日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權日2002年11月14日
發(fā)明者習彩霞, 奚永志 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院