專利名稱：一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取活 性成分的方法。
背景技術(shù)：
冠菌素(1)，也稱冠毒素(coronatine，簡(jiǎn)稱COR)是20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的 微生物產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)，其由兩個(gè)特殊結(jié)構(gòu)部分組成，即雙環(huán)羧酸，稱為冠面酸 (II)(coronafacic acid，簡(jiǎn)稱CFA)，和環(huán)丙基氨基酸，稱為冠氨酸(III)(coronamic acid，簡(jiǎn)稱CMA)。
冠菌素對(duì)植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)呈現(xiàn)多種功能，如促進(jìn)塊莖的形成與膨大，抑制種子的 萌發(fā)與根的生長(zhǎng)，促進(jìn)果實(shí)脫落等(Weiler, 1994; Vignutelli , 1998; Koda， 1994)。有關(guān)冠菌素的應(yīng)用已申請(qǐng)多項(xiàng)專利。例如中國(guó)發(fā)明專利(公開號(hào)CN1126441C， 專利號(hào)98111562.4)公開了冠菌素作為植物生長(zhǎng)生理調(diào)節(jié)劑可望開發(fā)成雜交水稻穎 花花時(shí)調(diào)節(jié)劑，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)(公開號(hào)CN101107901A)公開了冠菌素作為水稻 種子萌發(fā)抑制劑，美國(guó)專利US6， 511， 939公開了冠菌素作為果實(shí)脫落劑，US6， 465， 221 公開了冠菌素作為醫(yī)療上的腫瘤抑制劑等。因此，冠菌素作為具有多種生物活性的化 合物，在上述領(lǐng)域開發(fā)出產(chǎn)品化后極有可能產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。 冠菌素產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的關(guān)鍵之一是冠菌素的工業(yè)化制備。由于冠菌素特殊的分子結(jié) 構(gòu)，化學(xué)合成比較困難。而冠菌素最早由Ichihara從丁香假單胞菌絳紅致病變種 (尸.sy"'72卵e萍《az^r,，，)的培養(yǎng)液中分離得至(J(Ichihara A， Shiraishi K. et <3丄 The structure of coronatine. /cwi7232 of f力e力/z7erj.c朋6bcj'e^r. 1977， 99: 636-637)。因此，對(duì)冠菌素工業(yè)化生產(chǎn)而言，從細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純是 一條可行之路。
從目前文獻(xiàn)資料顯示，從發(fā)酵液中分離冠菌素的方法有①萃取法此法根據(jù)不 同pH條件下，冠菌素可溶于有機(jī)相或水相的特性，首先調(diào)整發(fā)酵液pH為堿性，使冠 菌素溶于水，用乙酸乙酯分離萃取，保留水相；再調(diào)整水相pH為2.0，使冠菌素返 溶于有機(jī)相中，再次通過乙酸乙酯提取，保留有機(jī)相，最后經(jīng)無水Na2S04過濾及減壓 蒸發(fā)除去乙酸乙酯，獲得冠菌素(Palmer D. A. ， Bender C. L. Effects of Environmental and Nutritional Factors on Production of the Polyketide Phytotoxin Corormtine by尸sew^/咖o朋s 5TJvz'y^ae ,. 67ycj'/2ea Appl Environ Microbiol. 1993， 59 (5): 1619-1626.)。此方法僅為實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定用。收率低， 分離冠菌素純度偏低，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)用。②樹脂法根據(jù)冠菌素與吸附劑極性的相似性和溶劑的極性，將被冠菌素吸附于大孔吸附樹脂，再在適宜的溫度、pH值和 鹽濃度等物理?xiàng)l件下洗脫，獲得初步純化的冠菌素。此法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作條件溫和，但回收率偏低，約為48-86%，分離純度不高，約為53%,且洗脫與樹脂預(yù)處理等使用 的有機(jī)溶劑、鹽類等對(duì)環(huán)境有一定的污染。適用于冠菌素發(fā)酵液的初步分離純化。(吳 曉玉，豐娟，周靜，儲(chǔ)炬.樹脂法提取冠毒素的研究.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2007, 29: 660-664.;周靜，李仕祥，郭成志，吳曉玉.大孔吸附樹脂對(duì)冠毒素的吸附工藝研究. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2008， 17: 132-138.)。膜分離作為一門新型的分離、濃縮、提純及凈化技術(shù)，在近30年來發(fā)展迅速， 已成為解決當(dāng)代能源、資源和環(huán)境污染問題的重要高新技術(shù)及可持續(xù)發(fā)展技術(shù)的基礎(chǔ)， 它具有節(jié)能、不破壞產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、少污染和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。而利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵 液中分離提取冠菌素還未見報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法。該 方法操作簡(jiǎn)單，收率高，可達(dá)90%以上，對(duì)冠菌素的結(jié)構(gòu)和活性無影響，而且耗能少、 污染小，完全適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本發(fā)明提供一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法，包括微濾和 超濾的步驟含有冠菌素的發(fā)酵液經(jīng)微濾膜過濾除去雜質(zhì)微粒、菌體，通過超濾膜過 濾去除蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，得到澄清的濾液，再經(jīng)過常規(guī)的樹脂交 換、真空濃縮、結(jié)晶成冠菌素。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的 方法的具體步驟為(1) 發(fā)酵液的粗提取將含有冠菌素的發(fā)酵液通過孔徑為0. l-10um的微濾膜過濾， 去除雜質(zhì)微粒和菌體，得到冠菌素粗提液；微濾操作壓力為0.1-l.OMPa，操作溫度 為10-5(TC，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料液體積的10-80%;(2) 發(fā)酵液大分子雜質(zhì)的去除:將所述步驟1得到的粗提液通過孔徑為0. 001-0. 1 n m 超濾膜過濾，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)；超濾操作壓 力0. 15-2. 5MPa，溫度10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn) 料量的10-50%;(3) 濃縮、結(jié)晶將所述步驟2得到的澄清無色的冠菌素發(fā)酵液以常規(guī)方法進(jìn)行樹 脂吸附交換或柱層析、真空濃縮、結(jié)晶，得到純度大于95%的冠菌素。所述微濾膜的材料優(yōu)選無機(jī)類、纖維素類、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟 乙烯、聚碳酸酯材料中的一種或幾種；微濾膜的孔徑優(yōu)選0.5-5ym。所述超濾膜的材料優(yōu)選無機(jī)類、含氟高分子材料類、聚烯烴類、聚酰胺類、聚砜類、甲殼素類或纖維素類膜材料中的一種或幾種；超濾膜的孔徑優(yōu)選0. 005-0. 05um。 為了提高分離效率，達(dá)到更好的分離效果，本發(fā)明優(yōu)選將經(jīng)過微濾和超濾得到的濾液再經(jīng)過納濾，去除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子雜質(zhì)，而后經(jīng)過常規(guī)的樹脂交換或柱層析，最后濃縮、結(jié)晶，或者直接噴霧干燥得到冠菌素。所述納濾步驟的優(yōu)選工藝條件是納濾膜的截留分子量為400-800，操作壓力0. 15-3MPa，溫度10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料量的10-50%。所述納濾膜的材料優(yōu)選無機(jī)類、芳香聚酰胺類、聚砜類、聚哌嗪酰胺類、聚偏氟 乙烯類、聚丙烯腈類、殼聚糖類或纖維素類膜材料中的一種或幾種。本發(fā)明還優(yōu)選在所述利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法中增加 發(fā)酵液的預(yù)處理即冠菌素發(fā)酵液首先通過孔徑為l-10um的濾膜過濾，除去發(fā)酵液 中較大的雜質(zhì)微粒和部分菌體，預(yù)處理后的冠菌素發(fā)酵液再經(jīng)過所述微濾和超濾，或 者經(jīng)過所述微濾、超濾和納濾，最后經(jīng)過常規(guī)的樹脂交換或柱層析、真空濃縮、結(jié)晶 成冠菌素。所述發(fā)酵液預(yù)處理步驟的優(yōu)選工藝條件是操作壓力為0. l-0.5MPa，操作溫度為 10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料體積的10-60%。所述預(yù)處理的濾膜的材料優(yōu)選纖維素類、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙 烯、聚碳酸酯材料中的一種或幾種。冠菌素發(fā)酵液在膜分離之前還可以先離心，得到的上清液再通過分級(jí)膜過濾，同 樣可以提高膜分離效率。經(jīng)過多級(jí)膜分離后得到的富集冠菌素的濾液還需要經(jīng)過樹脂交換或柱層析。本發(fā) 明所述樹脂交換及柱層析均采用本領(lǐng)域常規(guī)的條件。樹脂交換采用大孔吸附樹脂或離 子交換樹脂，大孔樹脂洗脫劑采用1 %氨水-60 %乙醇的混合洗脫劑，離子交換樹脂 采用2mol/LNaOH洗脫劑。柱層析通常采用硅膠為吸附劑以三氯甲垸-乙酸乙酯-丙酮 為洗脫劑，收集冠菌素集中的流份。本發(fā)明所述的冠菌素發(fā)酵液以本領(lǐng)域通用的技術(shù)手段經(jīng)過發(fā)酵得到將產(chǎn)冠菌素 菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)，然后接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，最后放罐，獲得含 冠菌素發(fā)酵液。所述產(chǎn)冠菌素菌株可以是保藏的，例如CN1900269A公開的基因工程菌-丁香假單孢大豆致病變種(/^ez^咖o/ as sj^z'/ 卵epk. Wyc2'/7ae)，保藏號(hào)CGMCC1412;或者市場(chǎng)上購買的，例如CN101033457A提及的洋蔥伯克霍爾德菌膜在使用過程中，盡管操作條件保持不變，但膜通量——在一定壓力下，單位時(shí) 間內(nèi)通過單位面積濾膜的透過液量——仍會(huì)逐漸降低。這是由于膜污染的原因。因此必須采取一定的清洗方法除去膜面或膜孔內(nèi)的污染物，達(dá)到膜通量恢復(fù)的目的。采用0. 1 0. 2%的NaOH溶液作為清洗液，使用低壓高流速法(清洗條件進(jìn)口壓力0. 2 MPa; 出口壓力0. 10 MPa，清洗時(shí)間30min)或反壓法清洗(清洗條件反向壓力0. 1 MPa， 清洗時(shí)間5min)，都可以達(dá)到滿意的效果。或者兩者結(jié)合起來，清洗的效果會(huì)更好。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有的冠菌素的分離提純方法的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單，分離步驟少， 生產(chǎn)能耗少，條件溫和，不破壞產(chǎn)品結(jié)構(gòu)?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)存在的收率不高，污水排 放量大的缺陷。


圖l是冠菌素(1)、冠面酸(II)和冠氨酸(III)的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這些實(shí)施例不能用于限制本發(fā)明。 實(shí)施例l冠菌素含量測(cè)定采用高效液相色譜檢測(cè)，色譜工作條件為色譜柱SymmetryC18柱(Waters， 4. 6 X150臓，5 um);流動(dòng)相為含O. 05 %磷酸的60 %甲醇溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm; 流速l. OmL/min;柱溫35'C。標(biāo)準(zhǔn)品由日本北海道大學(xué)有機(jī)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。 實(shí)施例2冠菌素發(fā)酵液的制備1. 菌株冠菌素產(chǎn)生菌洋蔥伯克霍爾德菌(^y/^/ oA/ei^'s cepacia)。2. 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、牛肉膏3 、蛋白胨5、酵母浸膏1、瓊脂15、 p朋.8-7. 0。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、牛肉膏20 、 KH2P04 4. 1、 K2HP04 1. 8、 MgS04 7H20 0.2、 FeCl3(1.5 umol/L)、 pH6. 8-7. 0。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、黃豆餅粉20 、尿素10、糖蜜10、 KH2P044. 1、 K2HP04 3.6、 MgS04*7H20 0.2、 FeCl3(1.5 u mol/L) 、 p朋.8-7. 0。3. 冠菌素發(fā)酵液的制備菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)l天，接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)，再轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵3 天后放罐，獲得含冠菌素發(fā)酵液。實(shí)施例3冠菌素發(fā)酵液10L通過孔徑為1 ii m聚氯乙烯微濾膜去除雜質(zhì)微粒和部分菌體， 操作壓力0.2MPa，溫度30。C，濃縮倍數(shù)20倍，透析水量2L;過濾后的粗提液流經(jīng) 孔徑為0.05um聚烯烴類超濾膜，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力O. 15MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)15倍，透析水量4L;采用實(shí)施例 l相同的方法測(cè)定，冠菌素總收率為90%。該透過液用柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的處理，濃 縮結(jié)晶后，得到純度為97%的冠菌素成品。 實(shí)施例4冠菌素發(fā)酵液15L通過孔徑為5"m纖維素類微濾膜去除雜質(zhì)微粒和部分菌體， 操作壓力0.2MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)20倍，透析水量3L;過濾后的粗提液流經(jīng) 孔徑為0.01ixm含氟高分子材料類超濾膜，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體 顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力O. 15MPa，溫度3(TC,濃縮倍數(shù)15倍，透析水量6L;流 出液經(jīng)截留分子量為500的聚哌嗪酰胺類納濾膜過濾，脫除色素、低聚糖、核苷酸、 多肽、脂肪酸小分子雜質(zhì)，操作壓力0.5MPa，溫度4(TC，濃縮倍數(shù)25倍，透析水量 7L;冠菌素總收率為91%。該透過液可用柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的處理，噴霧千燥后，得 到純度為97%的冠菌素成品。 實(shí)施例5冠菌素發(fā)酵液50L通過孔徑為10um纖維素類濾膜去除雜質(zhì)顆粒和部分菌體，操 作壓力0.25MPa，溫度25。C，濃縮倍數(shù)15倍，透析水量6L;濾液經(jīng)2ym聚氯乙烯 微濾膜去除雜質(zhì)微粒和菌體，操作壓力0.2MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)20倍，透析水 量8L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑為0.03um聚酰胺類超濾膜，去除發(fā)酵液中殘存的 蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力0. 15MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)15 倍，透析水量10L;冠菌素總收率為92%。該透過液可用樹脂交換或柱層析進(jìn)行進(jìn)一 步的處理，濃縮結(jié)晶后，得到純度為95%的冠菌素成品。 實(shí)施例6冠菌素發(fā)酵液IOOL通過孔徑為10ym陶瓷(無機(jī)類)濾膜去除雜質(zhì)顆粒和部分 菌體，操作壓力0.35MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)15倍，透析水量30L;濾液通過孔 徑為lura聚酰胺類微濾膜去除雜質(zhì)微粒和菌體，操作壓力0.25MPa，溫度3(TC，濃 縮倍數(shù)20倍，透析水量35L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑為0. 02 y m陶瓷(無機(jī)類) 超濾膜，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力0. 15MPa, 溫度3(TC，濃縮倍數(shù)15倍，透析水量40L;流出液經(jīng)截留分子量為500的聚偏氟乙 烯類納濾膜過濾，脫除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子雜質(zhì)，操作壓力 0.45MPa，溫度35"C，濃縮倍數(shù)25倍，透析水量30L;冠菌素總收率為95%。該透過 液可用柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的處理，噴霧千燥后，得到純度為97%的冠菌素成品。 實(shí)施例7冠菌素發(fā)酵液100L通過孔徑為8 ii m聚酰胺類濾膜去除雜質(zhì)顆粒和部分菌體，操 作壓力0.45MPa，溫度30。C，濃縮倍數(shù)20倍，透析水量35L;濾液通過孔徑為2 " m質(zhì)微粒和菌體，操作壓力0.25MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)20倍， 透析水量35L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑為0. 01 u m甲殼素類超濾膜，去除發(fā)酵液中 殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力0.15MPa，溫度3(TC，濃縮倍 數(shù)15倍，透析水量45L;冠菌素總收率為95%。該透過液用樹脂交換和柱層析進(jìn)行進(jìn) 一步的處理，噴霧干燥后，得到純度為95%的冠菌素成品。 實(shí)施例8冠菌素發(fā)酵液20L通過孔徑為1 " ra聚四氟乙烯濾膜去除雜質(zhì)顆粒和部分菌體， 操作壓力0. 5MPa，溫度40°C ，濃縮倍數(shù)30倍，透析水量10L;濾液通過孔徑為0. In m 纖維素類微濾膜去除雜質(zhì)微粒和菌體，操作壓力1. OMPa，溫度4(TC，濃縮倍數(shù)40倍， 透析水量5L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑為0.005 ix m含氟高分子材料類超濾膜，去除 發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力2.0MPa，溫度3(TC， 濃縮倍數(shù)15倍，透析水量4L;冠菌素總收率為91%。該透過液用離子交換樹脂進(jìn)行 進(jìn)一步的處理，噴霧干燥后，得到純度為98%的冠菌素成品。 實(shí)施例9冠菌素發(fā)酵液10L通過孔徑為10 u m聚酰胺類微濾膜去除雜質(zhì)微粒和菌體，操作 壓力0.5MPa，溫度30。C，濃縮倍數(shù)20倍，透析水量4L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑 為0.05ym無機(jī)類(陶瓷)超濾膜，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大 分子雜質(zhì)，操作壓力l.OMPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)15倍，透析水量5L;流出液經(jīng) 截留分子量為800的聚砜類納濾膜過濾，脫除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸 小分子雜質(zhì)，操作壓力2.0MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)25倍，透析水量3L;冠菌素 總收率為95%。該透過液用樹脂交換和柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的處理，噴霧干燥后，得到 純度為95%的冠菌素成品。 實(shí)施例10冠菌素發(fā)酵液IOOL通過孔徑為10um聚丙烯濾膜去除雜質(zhì)顆粒和部分菌體，操 作壓力0. 15MPa，溫度25°C，濃縮倍數(shù)20倍，透析水量20L;濾液通過孔徑為0. 1 u m 纖維素類微濾膜去除雜質(zhì)微粒和菌體，操作壓力1. 0MPa，溫度3(TC，濃縮倍數(shù)20倍， 透析水量35L;過濾后的粗提液流經(jīng)孔徑為0.005 ym聚砜類超濾膜，去除發(fā)酵液中 殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，操作壓力2.5MPa，溫度3(TC，濃縮倍 數(shù)15倍，透析水量45L;冠菌素總收率為89%。該透過液用柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的處理， 噴霧干燥后，得到純度為97%的冠菌素成品。
權(quán)利要求
1.一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法，其特征在于包括微濾和超濾的步驟含有冠菌素的發(fā)酵液經(jīng)微濾膜過濾除去雜質(zhì)微粒、菌體，通過超濾膜過濾去除蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，得到澄清的濾液，再經(jīng)過常規(guī)的樹脂交換或柱層析、濃縮、結(jié)晶成冠菌素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法， 其特征在于所述方法的步驟為(1) 發(fā)酵液的粗提取將含有冠菌素的發(fā)酵液通過孔徑為O. 1-lOum的微濾膜 過濾，去除雜質(zhì)微粒和菌體，得到冠菌素粗提液；微濾操作壓力為0.1-l.OMPa，操 作溫度為10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料液體積的10-80%;(2) 發(fā)酵液大分子雜質(zhì)的去除將所述步驟1得到的粗提液通過孔徑為0. 001-0. 1 ix m超濾膜過濾，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜 質(zhì)；超濾操作壓力0. 15-2. 5MPa,溫度10-5CTC，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體 積百分比計(jì)占進(jìn)料量的10-50%;(3) 制得成品將所述步驟2得到的澄清無色的冠菌素發(fā)酵液以常規(guī)方法進(jìn)行 樹脂吸附交換或柱層析濃縮、結(jié)晶，得到純度大于95%的冠菌素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法， 其特征在于所述方法還包括納濾，所述冠菌素發(fā)酵液經(jīng)過微濾和超濾得到的濾液再經(jīng) 納濾膜過濾去除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子雜質(zhì)，而后經(jīng)過常規(guī)的 樹脂交換或柱層析，最后濃縮、結(jié)晶，或者直接噴霧干燥得到冠菌素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法， 其特征在于所述方法的步驟為(1) 發(fā)酵液的粗提取將含有冠菌素的發(fā)酵液通過孔徑為O. 1-10Pm的微濾膜 過濾，去除雜質(zhì)微粒和菌體，得到冠菌素粗提液；微濾操作壓力為0. 1-l.OMPa，操 作溫度為10-5CTC，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料液體積的 10-80%;(2) 發(fā)酵液大分子雜質(zhì)的去除將所述步驟1得到的粗提液通過孔徑為 0. 001-0. 1 u ra的超濾膜過濾，去除發(fā)酵液中殘存的蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子 雜質(zhì)；超濾操作壓力0. 15-2. 5MPa，溫度10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以 體積百分比計(jì)占進(jìn)料量的10-50%;(3) 發(fā)酵液小分子雜質(zhì)的去除將所述步驟2得到的流出液通過截留分子量為400-800的納濾膜系統(tǒng)過濾，脫除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子雜質(zhì)， 得到澄清無色的冠菌素溶液;納濾操作壓力0. 15-3MPa，溫度10-5(TC，濃縮倍數(shù)10-40 倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料量的10-50%;(4)制得成品將所述步驟3得到的澄清無色的冠菌素發(fā)酵液以常規(guī)方法進(jìn)行 樹脂吸附交換或柱層析，然后濃縮、結(jié)晶，或者直接噴霧干燥得到純度大于95%的冠菌素成品o
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素 的方法，其特征在于所述微濾膜的材料是無機(jī)類、纖維素類、聚氯乙烯、聚酰胺、聚 丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一種或幾種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素 的方法，其特征在于所述微濾膜的孔徑為0. 5-5 u m。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素 的方法，其特征在于^f述超濾膜的材料是無機(jī)類、含氟高分子材料類、聚烯烴類、聚 酰胺類、聚砜類、甲殼素類或纖維素類膜材料中的一種或幾種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素 的方法，其特征在于所述超濾膜的孔徑為0. 005-0. 05 U m。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方 法，其特征在于所述納濾膜的材料是無機(jī)類、芳香聚酰胺類、聚砜類、聚哌嗪酰胺類、 聚偏氟乙烯類、聚丙烯腈類、殼聚糖類或纖維素類膜材料中的一種或幾種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法，其特征在于所述方法還包括發(fā)酵液的預(yù)處理，將冠菌素發(fā)酵液通過孔徑為 l-10um的濾膜過濾，除去發(fā)酵液中較大的雜質(zhì)微粒和部分菌體，預(yù)處理后的冠菌素 發(fā)酵液再經(jīng)過微濾和超濾，或經(jīng)過微濾、超濾和納濾，最后經(jīng)過常規(guī)的樹脂交換、真 空濃縮、結(jié)晶成冠菌素。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方 法，其特征在于所述發(fā)酵液的預(yù)處理步驟的工藝條件是操作壓力為0. 1-0.5MPa， 操作溫度為10-50°C，濃縮倍數(shù)10-40倍，透析水量以體積百分比計(jì)占進(jìn)料體積的 10-60%。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方 法，其特征在于所述預(yù)處理的濾膜的材料是纖維素類、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、 聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取冠菌素的方法，包括微濾和超濾的步驟含有冠菌素的發(fā)酵液經(jīng)孔徑為0.1-10μm微濾膜過濾除去雜質(zhì)微粒、菌體，通過孔徑為0.001-0.1μm超濾膜過濾去除蛋白質(zhì)、核酸、膠體顆粒大分子雜質(zhì)，得到澄清的濾液，再經(jīng)過常規(guī)的樹脂交換或柱層析、濃縮、結(jié)晶成冠菌素。為了提高分離純化的效果，還可以在微濾前增加預(yù)處理，即將冠菌素發(fā)酵液通過孔徑為1-10μm的濾膜過濾；在超濾后增加納濾，即流出液通過截留分子量為400-800的納濾膜系統(tǒng)過濾。該方法操作簡(jiǎn)單，收率高，可達(dá)90％以上，對(duì)冠菌素的結(jié)構(gòu)和活性無影響，而且耗能少、污染小，完全適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C07C235/82GK101665448SQ20091018613
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者吳曉玉 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)