專利名稱：一種抑制動脈粥樣硬化的天然抗氧化低密度脂蛋白抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以抑制動脈粥樣硬化
的天然辱性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M (IgM)亞類抗體。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化是一種慢性血管壁疾病，可以導(dǎo)致心肌梗死，心衰， 外周血管性疾病及中風(fēng)。多重危險因素在不同方面導(dǎo)致了動脈粥樣硬化 的形成，內(nèi)皮功能受損是動脈粥樣病變的起始環(huán)節(jié)，各種危險因素均可 造成內(nèi)皮損傷。內(nèi)皮受損后，血漿低密度脂蛋白(LDL)通過受損的內(nèi) 皮侵潤進(jìn)入動脈壁，氧化成為oxLDL，被巨噬細(xì)胞吞噬，成為泡沫細(xì)胞， 逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊，各種原因?qū)е掳邏K破裂，使局部血小板聚 集，血管栓塞，形成心肌或者腦梗死。
在動脈粥樣硬化形成過程中，巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL后形成泡沬細(xì)胞 起了關(guān)鍵作用。動脈粥樣硬化是一個慢性炎癥性疾病，與血管壁的LDL 水平升高明顯相關(guān)。高脂血癥時，血漿LDL浸潤進(jìn)入動脈壁，通過氧化 修飾成為oxLDL。 oxLDL被巨噬細(xì)胞上的清道夫受體攝取，這種攝取無 反饋性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致大量膽固醇蓄積，形成泡沫細(xì)胞，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的致 動脈粥樣硬化作用。隨著損害的進(jìn)展，這些充滿脂質(zhì)的細(xì)胞許多發(fā)生凋 亡，但是不能被充分的清除，導(dǎo)致在損傷部位凋亡細(xì)胞不正常的蓄積。 在這種條件下，凋亡細(xì)胞有可能發(fā)生二次壞死，易變形成為進(jìn)展的動脈 粥樣硬化斑塊非蜂窩狀的的粥樣特性。平滑肌細(xì)胞增殖并且分泌厚的膠 原帽可能會穩(wěn)定這種損害，但是脆弱的斑塊區(qū)域最終被侵蝕或者破裂， 導(dǎo)致斑塊破裂，血栓形成，梗死，缺血等臨床事件發(fā)生甚至死亡。
基于動脈粥樣硬化在血管疾病中的不良后果，動脈粥樣硬化的預(yù)防 及治療被持續(xù)重視，從降低LDL水平角度，目前通過飲食性預(yù)防、調(diào)脂 藥等方法治療。從斑塊破裂，血栓形成的角度，目前有抗栓藥治療。但 是從減少巨噬細(xì)胞對oxLDL的攝取，目前還沒有成熟的方法，近幾年，
4關(guān)于天然抗體在該領(lǐng)域的研究逐年增多。
天然抗體通常定義為人或動物未經(jīng)明顯感染或人工注射抗原而天然 存在于體內(nèi)的各種抗體。天然抗體的產(chǎn)生與食物、花粉或某些異物的刺激 有關(guān)。以IgM亞類為主，可識別多個不同的抗原表位。在維持機(jī)體自身正 常內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、防止自身免疫病發(fā)生等方面具有重要的作用。大量研究 表明天然抗體可以識別多種與動脈粥樣硬化相關(guān)的脂類或脂蛋白。天然抗 體在動脈粥樣硬化形成中的作用，已經(jīng)達(dá)成以下共識天然IgM亞類抗體
阻止了巨噬細(xì)胞和oxLDL結(jié)合，從而封閉了單核-巨噬細(xì)胞對oxLDL的攝
取，因此，在體內(nèi)阻止了泡沫細(xì)胞的形成，從而降低動脈粥樣硬化斑塊的
形成。在動脈粥樣硬化的進(jìn)程中，oxLDL的抗原決定簇誘導(dǎo)產(chǎn)生天然自身 抗體，由此激活存在oxLDL的高膽固醇血癥小鼠的免疫反應(yīng)，可改善動脈 粥樣硬化。oxLDL不僅促炎癥和促動脈粥樣硬化，并且在氧化過程中產(chǎn)生 的幾個新生表位是有很高的致免疫能力，并導(dǎo)致產(chǎn)生天然自身IgM抗體， 抑制動脈粥樣硬化進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是制備并鑒定小鼠天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗 體，為研究oxLDL及其天然抗體在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一個目的是該天然抗體在預(yù)防和治療動脈粥樣硬化領(lǐng)域 中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過下述方法實現(xiàn)的， 一種抑制動脈粥樣硬化的天然 屬性抗oxLDL IgM亞類抗體，其特征在于通過雜交瘤細(xì)技術(shù)制備出天然 屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6,該抗體的作用在于與oxLDL結(jié)合形成 免疫復(fù)合物，封閉了巨噬細(xì)胞對oxLDL的吞噬，減少了小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW-264.7向泡沬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，對apoE(載脂蛋白E)基因敲除小鼠胸主動 脈粥樣硬化斑塊形成有抑制作用，因此該抗體可以用于抑制小鼠動脈粥樣 硬化斑塊的形成。該抗體的制備為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展和治療提 供了新的思路和方法。
所述抗體的制備步驟如下 (1)抗原的制備LDL的分離提取及oxLDL的制備取空腹12小時
5的正常人血漿，通過密度梯度離心法獲得LDL 。將制備好的LDL于4°C， PBS透析24h，去除EDTA,與硫酸銅(5pmol/L)在37°C下共同孵育4 h 或者16h。得到銅氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)。
(2)雜交瘤細(xì)胞的制備在無特殊病原體條件下飼養(yǎng)BaW/c小鼠，給 予高膽固醇飲食4周。分離脾細(xì)胞，其主要成分為B細(xì)胞。B細(xì)胞與骨 髓瘤細(xì)胞以化學(xué)方法融合，獲得雜交瘤細(xì)胞。以純化的LDL和oxLDL為 抗原，對陽性雜交瘤細(xì)胞生長孔進(jìn)行間接ELISA實驗，確定陽性克隆孔， 利用有限稀釋法，篩選出所需克隆陽性細(xì)胞。將獲得的克隆陽性細(xì)胞進(jìn)行 克隆擴(kuò)增，得到產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，獲得所需單克隆抗體。
所述小鼠為Babl/c品系小鼠，雌性，4-6周齡。
含抗體的腹水制備及抗體純化(所述單克隆抗體的分離和滴定測定) 腹腔注射0.5ml降植烷(Pristane)或液體石蠟于Balb/c鼠，1 2周后腹 腔注射1乂106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7 10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀 察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前， 處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，用1/10體積的1.0mol/L氨基丁三 醇(Tris) (pH8.0)調(diào)節(jié)粗制抗體的pH值。用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡 柱子。將抗體溶液用蛋白G微珠層析柱過濾，每次上2ml的樣品。用10 倍體積的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗滌微珠。用10倍體積的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗滌微珠。用2ml的50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脫濾柱。收集 洗脫峰于裝有1A0體積的1.0mol/L Tris(pH8.0)的試管內(nèi)，輕輕搖勻。用 IO倍體積的，lmol/L Tris(pH8.0)洗滌微珠。重復(fù)以上過程。測定蛋白濃 度，并進(jìn)行十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測抗體 的純度。
所述抗體的單克隆抗體亞類、效價和特異性的鑒定 抗體亞類的鑒定經(jīng)4次克隆化獲得的100%陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞培
養(yǎng)上清作為待檢樣品，使用Sigma公司小鼠免疫球蛋白亞類夾心ELISA試 劑盒檢測雜交瘤產(chǎn)生抗體的亞類和亞型；同上述方法以純化提取的LDL 包被微量酶標(biāo)板，常規(guī)間接ELISA法測定單抗腹水效價，ABTS (美國 Sigma公司)為顯色底物。
抗體效價及特異性的鑒定將抗原LDL、氧化4小時oxLDL
6(4h-oxLDL)、氧化16小時oxLDL (16h-oxLDL)和兩者混合oxLDL (mix-oxLDL ) 5pg/ml分別包被于96孑L ELISA板4。C過夜；以 PBS/0.2n/。Tween洗滌孔4次，然后以含1% BSA的PBS封閉30 min;將腹水 按照l; IO數(shù)量級稀釋后加入ELISA板中，37。C水浴作用l小時，以 PBS/0.27。Tween洗滌孔4次，加入l: 1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊 抗小鼠IgM抗體，37。C水浴作用l小時，PBS/0.2。/。Tween洗滌孔4次，加入 ABTS顯色10-15min，最后于ELISA讀數(shù)儀中在410 nm測定吸光度；含 IgM的腹水按照McCarthy等的方法以兩步法純化，即快速的陽離子交換 層析捕獲和用陰離子交換色譜洗脫純化。 所述抗體的作用如下
(1) 天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6，在體外試驗中能夠抑制小 鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7對oxLDL的吞噬，從而降低泡沫細(xì)胞的形成。
(2) apoE基因敲除小鼠腹腔注射天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6 后，高脂飼料喂養(yǎng)16周后，與對照組(腹腔注射PBS)和腹腔注射天然 屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8組比較差異有顯著性，顯著降低了胸主動 脈粥樣硬化斑塊面積和校正面積。
本發(fā)明為解決目前治療動脈粥樣硬化方面的不足，通過雜交瘤細(xì)技術(shù) 制備出一株天然屬性的抗oxLDL IgM亞類抗體(命名為3A6)，可以與 oxLDL發(fā)生高親和力結(jié)合，可以滿足間接ELISA等實驗要求。并且研究 證實，該抗體的作用在于與oxLDL結(jié)合，封閉了單核-巨噬細(xì)胞與oxLDL 的吞噬，？咸少了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在體動 物實驗可顯著降低apoE基因敲除小鼠胸主動脈斑塊面積和校正面積，與 對照組和無關(guān)對照組(腹腔注射天然屬性抗LDL抗體5G8組)比較，差 異有顯著性(P<0.05)。該抗體可以用于抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形 成。該抗體的制備為研究天然抗體在體內(nèi)脂質(zhì)代謝和相關(guān)心腦血管疾病如 動脈粥樣硬化等發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的研究工具，對動脈粥樣硬 化形成有預(yù)防作用。該天然抗氧化低密度脂蛋白抗體可應(yīng)用于抑制動脈粥 樣硬化研究和治療。
在制備該抗體的過程中，我們也制備出兩株天然屬性的LDL IgM亞 類抗體(命名為5G8和2H7)，研究證實，此類抗體不識別oxLDL，與天
7然屬性的抗oxLDL IgM亞類抗體3A6沒有交叉識別現(xiàn)象。并且天然屬性 抗LDL IgM亞類抗體在體外試驗中不能夠抑制巨噬細(xì)胞與oxLDL的結(jié) 合，不能降低泡沫細(xì)胞的形成；在體動物實驗也不能降低apoE基因敲除 小鼠胸主動脈斑塊面積和校正面積，與天然屬性的抗oxLDL IgM亞類抗 體3A6組比較差異有顯著性。 本發(fā)明獲得的有益結(jié)果是
1 .雜交瘤細(xì)胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗體通過ELISA法被 篩選出來，可以與LDL或oxLDL發(fā)生高親和力結(jié)合，經(jīng)過4次克隆化， 最終獲得2株穩(wěn)定分泌天然屬性抗LDL抗體，命名為5G8和2H7，及l(fā) 株穩(wěn)定分泌天然屬性抗oxLDL抗體，命名為3A6， 3株抗體均屬于IgM 亞類，無交叉反應(yīng)，可以滿足間接ELISA法等實驗要求。
2. 天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6，在體外試驗中能夠抑制小 鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7細(xì)胞對oxLDL的吞噬，從而降低泡沫細(xì)胞的形 成。
3. apoE基因敲除小鼠腹腔注射天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6 后，高脂飼料喂養(yǎng)16周后，與對照組(腹腔注射PBS)和腹腔注射天然 屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8組比較差異有顯著性，顯著降低了胸主動 脈粥樣硬化斑塊面積和校正面積。


下面結(jié)合實施實例附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。 表l是獲得的單克隆抗體亞型和效價鑒定。
圖1是抗原LDL與oxLDL的蛋白電泳。成功分離純化出了 LDL并 制備了 oxLDL，經(jīng)SDS-PAGE檢測，oxLDL的電泳遷移率較LDL升高， 提示LDL已經(jīng)被有效氧化。1.蛋白標(biāo)記；2.純化的LDL; 3. oxLDL。
圖2是天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體雜交瘤細(xì)胞株建立的模式圖。 小鼠高脂飲食四周后，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過抗體篩選，克隆 擴(kuò)增，最后獲取單抗。
圖3是間接ELISA法鑒定天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體和天然屬 性抗LDL IgM亞類抗體示意圖。圖3A表明天然屬性抗oxLDL IgM亞類 抗體3A6和4h-、 16h-oxLDL和其混合物都反應(yīng)，但不識別對照組牛血清
8白蛋白(BSA)，在各組之間沒有明顯差異(P〉0.05)，說明天然屬性抗
oxLDL IgM亞類抗體3A6能特異性識別oxLDL。圖3B表明天然屬性抗 oxLDL IgM亞類抗體3A6和天然屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8和2H7 之間沒有交叉識別現(xiàn)象。
圖4是天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6對小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW-264.7與oxLDL結(jié)合的影響。天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6 抑制巨噬細(xì)胞與125I-oxLDL結(jié)合，而天然屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8 和2H7則不能。(**P<0.01)。
圖5是天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6抑制體外泡沫細(xì)胞形成。 將巨噬細(xì)胞單獨或者分別與oxLDL、 3A6/oxLDL及5G8/oxLDL共同孵育 后加入油紅O染色觀察泡沬細(xì)胞形成。圖5A表明沒有加入oxLDL共培 養(yǎng)的巨噬細(xì)胞未見油紅O染色。圖5 B表明巨噬細(xì)胞加入oxLDL后油紅 O強(qiáng)染色，巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。圖5C表明巨噬細(xì)胞 與3A6 /oxLDL共同孵育后油紅O染色減弱，表明天然屬性抗oxLDL IgM 亞類抗體3A6，在體外試驗中能夠抑制小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7細(xì)胞 對oxLDL的吞噬，從而降低泡沫細(xì)胞的形成。圖5D表明巨噬細(xì)胞與5G8 /oxLDL共同孵育后油紅O染色較3A6組增強(qiáng)，表明天然屬性抗LDL IgM 亞類抗體5G8，不能抑制巨噬細(xì)胞對oxLDL的吞噬。
圖6是天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6和天然屬性抗LDL IgM 亞類抗體5G8對apoE基因敲除小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊的影 響。(HE染色，xl00)圖6A:對照組；圖6B: 5G8組；圖6C: 3A6組。 圖6D:是apoE基因敲除小鼠各組動脈粥樣斑塊面積比較。結(jié)果表明3A6 組可顯著降低胸主動脈斑塊面積和校正面積，與對照組和5G8組比較差 異有顯著性(P<0. 05)。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。 (一)、抗原的制備
1、 LDL的分離提取及oxLDL的制備
取空腹12小時的正常人血漿，定量移入小燒杯中，用固體溴化鉀調(diào)血
9清密度至1.300g/ml，待固體溴化鉀完全溶解后，分別移至6個透明的離心 管中，每管10ml，再用注射器長針頭沿管壁小心鋪加密度為1.006 g/ml的 氯化鈉溶液28ml，勿使界面混擾。平衡后加蓋封閉，小心放入RPV-50T 型垂直轉(zhuǎn)頭，置入Beckman optima L-100XP超高速低溫離心機(jī)(美國 Fullerton公司)中，選用慢加速工作程序，8°C， 32 OOOrpm，離心360分 鐘。緩慢停機(jī)后，小心取出離心管，可見血清脂蛋白已經(jīng)分層。頂部乳白 色為極低密度脂蛋白，中間淡黃色為低密度脂蛋白，其下層為高密度脂蛋 白，底部為無脂蛋白血清，各區(qū)帶之間均有透明的生理鹽水相隔。將各層 脂蛋白分部收集于系列試管中，對PBS行透析并測定蛋白含量。將制備好 的LDL于4。C， PBS透析24h，去除EDTA，與硫酸銅(5jimol/L)在37。C下 共同孵育4h或者16h。得到銅氧化的LDL (oxLDL)， EDTA中止反應(yīng)。對 PBS行透析，過濾除菌，分裝，4。C保存?zhèn)溆谩?2、實驗結(jié)果(見圖l)
成功分離純化出了 LDL并制備了 oxLDL，經(jīng)SDS-PAGE檢測， oxLDL的電泳遷移率較LDL升高，提示LDL已經(jīng)被有效氧化。 (二)、抗體的制備和鑒定
1、天然屬性抗oxLDLIgM亞類抗體的制備(見圖2)
(1) 免疫接種過程 Balb/c品系小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，取2只5周齡小鼠詞
養(yǎng)于無特殊病原體條件下，給予高脂飼料飼喂4周。
(2) 單克隆抗體細(xì)胞(脾細(xì)胞)的分離
頸椎脫臼法處死小鼠，用酒精消毒表體。無菌條件下取出脾臟，剃除 結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次。把脾臟置于已消毒的 90-100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中。在脾中部切開一小口，用注射器芯從一 端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中， 或用注射器向脾臟內(nèi)注入3 ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì) 胞，再制成細(xì)胞懸液亦可。把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，力Q10-20ml培 養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘。離心(800-1000轉(zhuǎn)/分)計數(shù)，備 用。
(3) 兩種細(xì)胞的融合步驟
10骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0 (美國ATCC公司)，在含10%胎牛血清(美國 Invitrogen公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，37°C， 5%C02, 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將lml40G/。的PEG8000液一滴滴加入到細(xì)胞團(tuán)中，在 60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管。在不斷轉(zhuǎn) 動離心管中加lml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完。于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml 無血清培養(yǎng)基。離心(800轉(zhuǎn)/分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml 懸浮，輕輕混勻。取96孔板，每孔加50微升。取等體積細(xì)胞懸液，向另 一96孔板中加50微升。送入5n/。C02溫箱中37'C培養(yǎng)，24小時后更換成HAT (美國Sigma公司)選擇性培養(yǎng)液。
(4) 細(xì)胞毒性選擇條件
將融合后的細(xì)胞于5。/。C02溫箱，37'C培養(yǎng)， 一周后第一次更換培養(yǎng) 液，培養(yǎng)板中預(yù)先接種有飼養(yǎng)細(xì)胞，加2xHAT選擇培養(yǎng)液與原等量培養(yǎng) 液混合后，即成為1 x的HAT培養(yǎng)基。融合后7 10天用HAT培養(yǎng)液變量換液， 以后每隔2 3天半量換液一次。2 3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個大， 圓且透明。待集落增殖生長至l/3孔時，進(jìn)行抗體檢測。
(5) 雜交瘤的篩選 將分離提取的LDL和oxLDL分別用包被緩沖液稀釋至10叱/ml，按
10(Vl/孔分別加入到96孔微量酶標(biāo)板中，4。C包被過夜。以0.5%牛血清白 蛋白/PBS封閉酶標(biāo)板上剩余非特異結(jié)合位點，PBS洗板3次后每孔加入陽 性雜交瘤生長孔上清10(V1。 37°C、飽和濕度條件下溫育lh，用含 0.05。/。Tween-20的PBS洗板3次。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgM抗體(HRP-G-a-MIg)(丹麥Dako公司)，37。C，飽和濕度條件下溫育 lh，用含0.05。/。Tween-20的PBS洗板3次。每孔加入底物ABTS顯色，酶標(biāo) 儀(美國Bio-Rad公司)測定410nm處吸光度。以吸光度值大于空白對照 2.1倍的上清液判定為陽性。
(6) 克隆過程
制備有飼養(yǎng)細(xì)胞底層的細(xì)胞培養(yǎng)板。收集細(xì)胞、計數(shù)陽性培養(yǎng)細(xì)胞。 細(xì)胞懸液調(diào)至5 10個細(xì)胞/ml。 96孔板中每孔加0.1ml。 002溫箱培養(yǎng)一周
后，半畺換液，繼續(xù)培養(yǎng)。適時檢測每孔培養(yǎng)上清，挑選呈陽性培養(yǎng)孔的 細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，直至確信孔中細(xì)胞為單克隆抗體為止。
ii2、單克隆抗體亞類鑒定，抗體制備，特異性和效價測定
(1) 單克隆抗體亞類鑒定 經(jīng)過4次克隆化獲得的100%陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為待
檢樣品，按照說明書要求，使用小鼠免疫球蛋白亞類夾心ELISA試劑盒(美 國Sigma公司)檢測雜交瘤產(chǎn)生抗體的亞類和亞型。
(2) 單克隆抗體制備
腹腔注射0.5ml Pristane降植垸或液體石蠟于Balb/c鼠，1 2周后腹 腔注射lxl(^個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7 10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察 動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處 死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，用1/10體積的l.OmoVL Tris(pH8.0) 調(diào)節(jié)粗制抗體的pH值。用0.1mol/LTris(pH8.0)平衡柱子。將抗體溶液用 蛋白G微珠層析柱過濾，每次上2ml的樣品。用10倍體積的O.lmol/L Tris(pH8.0)洗滌微珠。用10倍體積的0.01mol/LTris(pH8.0)洗滌微珠。用 2ml的50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脫濾柱。收集洗脫峰于裝有1/10體積 的1.0mol/L Tris(pH8.0)的試管內(nèi)，輕輕搖勻。用10倍體積的，lmol/L Tris(pH8.0)洗滌微珠。重復(fù)以上過程。測定蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE
檢測抗體的純度。
(3) 單克隆抗體效價鑒定
將抗原(LDL和混合oxLDL) (5pg/ml)分別包被于96孔ELISA板4。C 過夜。以PBS/0.2。/。Tween洗滌孑L4次，然后以含1% BSA的PBS封閉30 min。 將腹水袪照l: IO數(shù)量級稀釋后加入ELISA板中，37。C水浴作用l小時，以 PBS/0.2y。Tween洗滌孔4次，加入l: 1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊 抗小鼠IgM (武漢博士德生物工程有限公司)，37。C水浴作用l小時， PBS/0.2。/。Tween洗滌孔4次，加入ABTS顯色10-15min，最后于ELISA讀 數(shù)儀中在410 nm測定吸光度。
(4) 單克隆抗體特異性鑒定
將抗原(LDL， 4h oxLDL， 16h oxLDL和混合oxLDL) (5pg/ml)分別 包被于96孔ELISA板4。C過夜。以PBS/0.2。/。Tween洗滌孔4次，然后以含1% BSA的PBS封閉30min。分別將抗體3A6、 5G8和2H7按照1: 104稀釋后加 入ELISA板中，37。C水浴作用l小時，以PBS/0.2。/oTween洗滌孑L4次，加入
121: lOOO稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgM (武漢博士德生物工 程有限公司)，37。C水浴作用l小時，PBS/0.2。/。Tween洗滌孔4次，加入 ABTS顯色10-15min，最后于ELISA讀數(shù)儀中在410 nm測定吸光度。 3、實驗結(jié)果
(1) 分泌天然抗LDL/oxLDL單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立(見表1) Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后共鋪4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，
經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)篩選1周后，檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板384個孔中共計有219 個孔有雜交瘤細(xì)胞生長，融合率為57%，包被LDL或oxLDL、間接ELISA 方法檢測出到16個孔的雜交瘤上清液可與LDL或oxLDL抗原發(fā)生陽性 反應(yīng)，陽性率7.3%，經(jīng)過4次有限稀釋法克隆化，獲得了2株可穩(wěn)定分 泌抗LDL的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名其克隆編號為5G8和2H7。及株 穩(wěn)定分泌IgM型天然抗oxLDL的單克隆抗體，命名為3A6。
(2) 單克隆抗體亞類和效價鑒定
經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，所獲得的3株抗體5G8， 2H7和3A6的輕重鏈均分 別為k鏈和p鏈，即k亞型、IgM亞類。腹水效價5G8為l(T6， 2H7為 l(T5， 3A6為10-6(表1)。
表l單克隆抗體亞型和效價鑒定
克隆編號抗體輕鏈重鏈腹水效價
5G8LDLk10-6
2H7LDLkl(T5
3A6oxLDLkIO-6
(3)單克隆抗體特異性鑒定
將LDL分別氧化4 h或者16 h。發(fā)現(xiàn)3A6和4-h、 16-h oxLDL和其 混合物都反應(yīng)，但不識別對照組牛血清白蛋白(BSA)。在各組之間沒有 明顯差異(PX).05)，說明3A6能特異性識別oxLDL (圖3A)。為了模擬類 似的病理條件，利用oxLDL.混合物作為實驗進(jìn)一步研究對象。oxLDL特 異性抗體3A6和先前建立的LDL特異性單抗(抗LDL單抗)5G8和2H7 之間沒有交叉識別現(xiàn)象，3A6、 5G8和2H7均不識別對照組BSA(圖3B)。 (三)、天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類抗體在脂蛋白代謝中的作用
131、 1251-LDL和1251-oxLDL的制備
在堿性條件下，以IC1為載體，用Na^I(美國Amersham life science公 司)標(biāo)記LDL。 125I標(biāo)記脂蛋白的比放射活性在200 700cpm/ng之間，游 離碘率不超過3 %。 ^I標(biāo)記oxLDL同標(biāo)記LDL法。
2、 細(xì)胞培養(yǎng)
小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7(美國ATCC公司)培養(yǎng)于含10。/。胎牛血清， 100 unit/ml青霉素禾口 100g/ml鏈霉素的RPMI 1640(美國Gibco公司)中， 37°C、 5%<:02條件下培養(yǎng)。
3、 巨噬細(xì)胞黏附實驗
細(xì)胞預(yù)先在無血清培養(yǎng)基中4。C孵育30min ，然后在冰浴中進(jìn)行黏 附實驗。與"I-oxLDL孵育3h后，然后用冰冷的P/。BSA-PBS洗滌一次， 再用PBS洗滌3次，最后用0.2MNaOH裂解細(xì)胞。最終按照每毫克結(jié)合的 脂蛋白來計算結(jié)合效率。結(jié)果通過Y計數(shù)儀(美國PerkinElmer公司)讀數(shù)確 定。
為證實天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6對"I-oxLDL與巨噬細(xì)胞 結(jié)合的抑制作用，3A6和^I-oxLDL預(yù)先按照特定IgM/ApoB分子比(5: 1)
孵育。然后將復(fù)合物加入實驗體系。細(xì)胞按前述處理。
4、 油紅O染色
巨噬細(xì)胞以每孔lxl(^濃度種植于多孔板中(Nunc)。細(xì)胞以PBS洗滌 3遍，以福爾馬林固定，以油紅O(美國Sigma公司)染色。在光學(xué)顯微鏡下 觀察脂質(zhì)堆積。
5、 實驗結(jié)果
(1)天然屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6減少巨噬細(xì)胞對oxLDL的吞 噬。(見圖4)
RAW-264.7細(xì)胞預(yù)先與50jag LDL或者oxLDL作用后，與2嗎 125I-oxLDL共孵育，細(xì)胞結(jié)合125I-oxLDL以Y計數(shù)儀讀數(shù)確定。預(yù)先用冷 oxLDL孵育過的巨噬細(xì)胞不能再與1251標(biāo)記的oxLDL結(jié)合，但是預(yù)先與 LDL作用的巨噬細(xì)胞并不影響其與1251標(biāo)記的oxLDL結(jié)合。將抗體3A6、 5G8和2H7分別與125I-oxLDL按照5: 1摩爾比作用后與巨噬細(xì)胞結(jié)合來 判斷3A6的中和能力，細(xì)胞結(jié)合"I-oxLDL以Y計數(shù)儀讀數(shù)確定。將巨噬
14細(xì)胞與LDL孵育后并不能影響巨噬細(xì)胞與125I-oxLDL的結(jié)合效率，天然 屬性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6按照一定的IgM/ApoB摩爾比(5:1)阻 斷oxLDL與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，而利用天然屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8 和2H7未見阻斷作用。說明巨噬細(xì)胞不吞噬LDL，吞噬oxLDL，天然屬 性抗oxLDL IgM亞類抗體3A6減少巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL，天然屬性抗 LDL IgM亞類抗體5G8和2H7則不能。
(2)天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類抗體抑制體外泡沫細(xì)胞形成 (見圖5)
將巨噬細(xì)胞單獨或者分別與oxLDL、 3A6/oxLDL及5G8/oxLDL共同 孵育后加入油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞形成。沒有加入oxLDL共培養(yǎng)的巨 噬細(xì)胞未見油紅O染色。巨噬細(xì)胞加入oxLDL后油紅O強(qiáng)染色，巨噬細(xì) 胞吞噬oxLDL轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞與3A6 /oxLDL共同孵育后油 紅O染色減弱，表明天然屬性抗oxLDLIgM亞類抗體3A6，在體外試驗 中能夠抑制小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7細(xì)胞對oxLDL的吞噬，從而降低 泡沬細(xì)胞的形成。巨噬細(xì)胞與5G8 /oxLDL共同孵育后油紅O染色較3A6 組增強(qiáng)，表明天然屬性抗LDL IgM亞類抗體5G8，不能抑制巨噬細(xì)胞對 oxLDL的吞噬。
(四)、天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類抗體對載脂蛋白E基因敲 除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響
1、 實驗分組及給藥方法
6周齡雌性apoE基因敲除小鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科技部)，隨機(jī)分 成3組，每組6只小鼠。所有的小鼠給與高脂飼料喂養(yǎng)16周，每次給藥 前均稱量體重。對照組apoE基因敲除小鼠+腹腔注射PBS，每周1次， 每次2ml，共16周。5G8組apoE基因敲除小鼠+腹腔注射與oxLDL 沒有交叉反應(yīng)的IgM亞類抗體5G8, 10昭/g體重，2ml/周，共16周。3A6 組:apoE基因敲除小鼠+腹腔注射天然屬性的抗oxLDL IgM亞類抗體3A6, 10昭/g體重，2ml/周，共16周。
2、 動脈粥樣斑塊分析
固定小鼠，剪開胸腔，剪去胸骨，暴露心臟，用一次性輸液針頭剌 入左心室，剪開右心房，進(jìn)行PBS/生理鹽水灌流10min，至右心房流出
15液清亮為止，再用4%多聚甲醛灌流10min。取出心臟和主動脈，4%多 聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，切片厚5pm。每間隔100pm 連續(xù)取2張切片在顯微鏡下觀察，從主動脈根部出現(xiàn)主動脈瓣作為第一張 切片，每間隔5pm厚度切一張，連續(xù)切40張，每間隔5張取一張，共8 張。石蠟切片60。C烤片30min后，用二甲苯I浸泡3-5min， 二甲苯II浸 泡3-5min， 95%酒精浸泡3-5min， 85%酒精浸泡3-5min，蒸餾水浸泡 3-5min，蘇木素染色5min，稍水洗后用1%鹽酸水溶液分化數(shù)秒鐘，流水 沖洗15min以上，0.5%伊紅酒精溶液染色lmin， 85%酒精浸泡數(shù)秒鐘， 95%酒精浸泡數(shù)秒鐘，100%酒精1浸泡l-3min， 100%酒精I(xiàn)I浸泡l-3min， 二甲苯I浸泡5min， 二甲苯II浸泡5min，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡(曰 本Olympus公司)觀察血管病理形態(tài)改變，圖像分析系統(tǒng)收集圖像。顯微 鏡下拍照，HE染色切片，xl00倍普通光鏡下，利用計算機(jī)IPP圖像分析 軟件(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)對各個切面的動脈粥樣斑塊面積 進(jìn)行分析。測量斑塊面積(PA)、血管橫截面積(CVA)，計算校正斑塊面積 (PA/CVA)，每個標(biāo)本取8個切面的平均值。 3、實驗結(jié)果
斑塊的檢測(見圖6)
三組均出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊，利用計算機(jī)IPP圖像分析軟件對各個 切面的動脈粥樣斑塊面積進(jìn)行分析，3A6組可顯著降低胸主動脈斑塊面積 和校正面積，與對照組和5G8組比較差異有顯著性(P<0. 05)，說明天 然屬性抗oxLDL IgM抗體3A6能夠抑制apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬 化斑塊的形成，而天然抗LDL IgM抗體5G8則不能夠抑制apoE基因敲 除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。
需要說明的是，本發(fā)明提供的附圖是在光學(xué)顯微鏡下采集的細(xì)胞圖 片，為醫(yī)學(xué)研究最清晰的圖片。
以上實施例中未作詳細(xì)敘述部分屬于本行業(yè)或相關(guān)行業(yè)的公知技術(shù)， 采用的設(shè)備是行業(yè)慣例設(shè)備。
1權(quán)利要求
1、一種抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗氧化低密度脂蛋白抗體，其特征在于通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備出天然屬性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M(IgM)亞類抗體3A6，該抗體與oxLDL作用形成免疫復(fù)合物，從而減少巨噬細(xì)胞對oxLDL的吞噬。
2、 按照權(quán)利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL 抗體，其特征在于所述抗體的制備步驟如下a抗原的制備正常人血漿，通過密度梯度離心法獲得LDL，將制 備好的LDL與硫酸銅共同孵育，得到氧化的LDL (即oxLDL); b抗體的制備[1) 在無特殊病原體條件下飼養(yǎng)Babl/c小鼠，給予高膽固醇飲食4周；[2) 分離脾細(xì)胞，其主要成分為B細(xì)胞；[3) B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以化學(xué)方法融合，獲得雜交瘤細(xì)胞；[4) 以純化的低密度脂蛋白(LDL)和oxLDL為抗原，對陽性雜交瘤 細(xì)胞生長孔進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)實驗，確定陽性克隆孔， 利用有限稀釋法，篩選出所需克隆陽性細(xì)胞；[5) 將獲得的克隆陽性細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增，得到產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì) 胞，獲得所需單克隆抗體。
3、 按照權(quán)利要求2所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL 抗體，其特征在于使用所述Babl/c小鼠生產(chǎn)抗體。Babl/c品系小鼠為雌性， 4-6周齡。
4、 按照權(quán)利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL 抗體，其特征在于所述抗體的單克隆抗體亞類和效價鑒定經(jīng)4次克隆化 獲得的100%陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為待檢樣品，使用Sigma 公司小鼠免疫球蛋白亞類夾心ELISA試劑盒檢測雜交瘤產(chǎn)生抗體的亞類 和亞型；同上述方法以oxLDL包被微量酶標(biāo)板，常規(guī)間接ELISA法測定單抗腹水效價，ABTS為顯色底物。
5、 按照權(quán)利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL 抗體，其特征在于所述抗體的間接ELISA實驗鑒定將抗原LDL、氧化 4小時oxLDL、氧化16小時oxLDL和兩者混合oxLDL 5jng/ml分別包被 于96孔ELISA板4。C過夜；以PBS/0.2%Tween洗滌孔4次，然后以含 1% BSA的PBS封閉30 min;將腹水按照1: 10數(shù)量級稀釋后加入ELISA 板中，37°C水浴作用1小時，以PBS/0.2%Tween洗滌孔4次，加入1: 1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgM，37。C水浴作用1小時， PBS/0.2%Tween洗滌孔4次，加入ABTS顯色10-15min，最后于ELISA讀 數(shù)儀中在410nm測定吸光度；含IgM的腹水按照McCarthy的方法以兩 步法純化，即快速的陽離子交換層析捕獲和用陰離子交換色譜洗脫純化。
6、 按照權(quán)利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL 抗體，其特征在于所述天然抗氧化低密度脂蛋白抗體可作為在抑制動脈粥 樣硬化研究和治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)IgM亞類抗體，其特征是在無特殊病原體條件下飼養(yǎng)Babl/c小鼠，高膽固醇飲食4周；分離脾細(xì)胞(主要是B細(xì)胞)，B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以化學(xué)方法融合，獲得雜交瘤細(xì)胞；以氧化低密度脂蛋白(oxLDL)為抗原，對陽性雜交瘤細(xì)胞生長孔進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)實驗，確定陽性克隆孔，利用有限稀釋法，篩選出所需克隆陽性細(xì)胞。將獲得的克隆陽性細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增，得到產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，獲得天然屬性的抗oxLDL免疫球蛋白M(IgM)亞類抗體3A6。該抗體可以用于降低小鼠動脈粥樣硬化的形成，為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展和治療提供了新的思路和方法。
文檔編號C07K16/18GK101654481SQ20091016549
公開日2010年2月24日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者馮旭陽, 徐瑞芬, 王海昌 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)