專利名稱：近江牡蠣體內(nèi)抗人類(lèi)腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質(zhì)及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種近江牡蠣體內(nèi)抗人類(lèi)腫瘤急性早幼粒白血病細(xì)胞株 (HL60)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體可溶性細(xì)胞因子蛋白質(zhì)及其引物。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL), 又稱為凋亡素2配體(AP02 ligand， AP0-2L) (Wiley et al,, 1995; Pitti et al, ， 1996)， 其胞外結(jié)構(gòu)域在金屬蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的細(xì)胞因子sTRAIL (Soluble TRAIL ) ， sTRAIL具有TRAIL的生物學(xué)功能(Bodmer et al., 2000) 。 TRAIL是TNF超家族 中一類(lèi)重要的跨膜細(xì)胞因子(Wiley et al. ， 1995; Pitti et al. ， 1996)，可選擇性地引起人 類(lèi)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡包括腦、腎、肝、肺、胃、結(jié)腸、乳腺、前列腺、胰腺、 膽管、宮頸、皮膚和造血系統(tǒng)來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)或僅具有極低的毒性(Dphil， 2007 :馬遠(yuǎn)方，2007)。
我國(guó)是水產(chǎn)大國(guó)，牡蠣等貝類(lèi)養(yǎng)殖是我國(guó)海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組 織(FA0)的數(shù)字顯示，我國(guó)每年牡蠣的產(chǎn)量具全世界首位，達(dá)到300多萬(wàn)噸(濕重)，占 我國(guó)海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量(約1000萬(wàn)噸)的約三分之一。牡蠣不僅肉質(zhì)細(xì)嫩、肉味鮮美、 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還具有抗癌降血脂等功效，有"海洋牛奶"之美譽(yù)，是世界性的水產(chǎn)佳肴。目 前國(guó)內(nèi)外通過(guò)提取牡蠣等貝類(lèi)體內(nèi)的多糖等生物活性物質(zhì)，并開(kāi)發(fā)出了保健食品。但以上多 為多糖等物質(zhì)的混合物，是免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品，并且基礎(chǔ)研究資料少，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用較 低，對(duì)其功效及副作用等所知不多。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種近江牡蠣中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡 誘導(dǎo)配體可溶性細(xì)胞因子蛋白質(zhì)及其引物。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的提供一種近江牡蠣體內(nèi)抗急
性早幼粒白血病細(xì)胞株(HL60)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體可溶性細(xì)胞因子蛋白質(zhì)， 具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼前述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種用于擴(kuò)增前述蛋白質(zhì)的基因的寡聚核苷酸引物，其結(jié)構(gòu)為
TRAILf: 5' -GTGAGAGAAAGAG-3， TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTAAAAG-3'。 本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的牡蠣中sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，對(duì)HL60腫瘤細(xì)胞具有殺傷 性強(qiáng)、特異性高、安全性好、能夠大量生產(chǎn)、易于貯存等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的下述實(shí)施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。
本發(fā)明中，近江牡蠣sTRAIL蛋白質(zhì)即腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體可溶性細(xì)胞因子 蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)稱CasTRAIL,其中Ca代表近江牡蠣，sTRAIL代表腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配 體可溶性細(xì)胞因子；HL60即急性早幼粒白血病細(xì)胞株。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)步驟包括
1、 以近江牡蠣cDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增sTRAIL蛋白質(zhì)基因的引物，獲得編碼sTRAIL蛋 白質(zhì)的基因全序列。
2、 利用DNA重組技術(shù)將sTRAIL基因片段克隆到合適的pMD19-T載體(購(gòu)自Takara公 司，日本)中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28(a)原核表達(dá)載體(購(gòu)自 Novagen公司，美國(guó))相連接，獲得表達(dá)載體pET-28a(+)-sTRAIL。
3、 sTRAIL蛋白質(zhì)的體外誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡 (Western blot)等方法鑒定目的蛋白質(zhì)。
4、 利用親和柱分離純化目的蛋白質(zhì)，獲得重組的sTRAIL蛋白質(zhì)。
5、 培養(yǎng)急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60 (購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，中國(guó))，
添加純化的近江牡蠣sTRAIL (CasTRAIL)重組蛋白質(zhì)，培養(yǎng)細(xì)胞0-24小時(shí)。
6、 分別收集細(xì)胞，利用以下兩種方法鑒定HL60細(xì)胞的凋亡用流式細(xì)胞儀檢測(cè) 凋亡率；提取DNA檢測(cè)DNA ladder的形成。
具體的操作步驟如下 1、引物設(shè)計(jì)與合成
設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增sTRAIL蛋白質(zhì)基因的寡聚核苷酸引物為 TRAILf: 5， -GTGAGAGAAAGAG-3， ( SEQ ID NO: 3) TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTMAAG-3， ( SEQ ID NO: 4)。2、 PCR擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建
以近江牡蠣cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性3分鐘； 35個(gè)循環(huán)94°C 30秒鐘，56°C 30秒鐘，72°C 45秒鐘；72°C IO分鐘。PCR產(chǎn)物連入pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (購(gòu)自Takara公司，日本)，涂布含氨芐青霉素的LB篩選平板， 挑若干個(gè)克隆進(jìn)行酶切和PCR鑒定，選一陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以堿法抽提質(zhì)粒.將制備好的 質(zhì)粒以vWel和限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自Takara公司，日本)雙酶切，連入經(jīng)過(guò)同樣雙酶 切的pET-28a(+)載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購(gòu)自Tiangen公司，德國(guó))。 PCR篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體pET-28a(+)-sTRAIL。
經(jīng)上述方式獲得來(lái)自于近江牡蠣體內(nèi)特有的sTRAIL蛋白質(zhì)(CasTRAIL)，該蛋白質(zhì)具有 SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列；編碼該蛋白質(zhì)的基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列。
3、 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與鑒定
將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sTRAIL轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)，涂布含卡那霉素的
LB平板，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液，37'C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取適 量菌液，按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD,為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(購(gòu)自Sangon公司，加拿大)，使其終濃度在0-1. 0 mmol/L， 繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后，離心分離上清液和沉淀，分別上樣， 進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
4、 重組蛋白質(zhì)的純化與抗體制備
利用組氨酸親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。以上述方法大量制備超聲裂解的菌 液，離心分離上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化和洗脫操作，并采用12%的SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。
挑選體重約1.5 kg的健康新西蘭白雄兔進(jìn)行免疫。經(jīng)過(guò)一次初始免疫和兩次加強(qiáng)免疫 后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，存儲(chǔ)于-80。C。
5、 蛋白質(zhì)定量與抗體效價(jià)的檢測(cè)
按Brad-ford法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein_dye binding. Anal Biochem. 1976， 72: 248-254)。
免疫后的兔血清用ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，具體操作如下
(1) 包被與封閉用包被緩沖液將蛋白質(zhì)稀釋至1-10 wg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯酶標(biāo)板 的反應(yīng)孔中加0。 1 ml， 4"C過(guò)夜。棄去孔內(nèi)溶液，5%的脫脂奶粉封閉2小時(shí)，用PBST洗3 次，每次3分鐘。
(2) 加樣加指定稀釋倍數(shù)的待檢樣品(待檢測(cè)的抗血清稀釋于PBST) 0.1 ml于上述已包被的反應(yīng)孔中，置37'C孵育1小時(shí)，PBST洗3次，每次3分鐘(同時(shí)做空白孔，陰性 對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。
(3) 加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0. lml， 37'C1小時(shí)，PBST 洗3次，每次3分鐘。
(4) 加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的0PD底物溶液0. 1 ml， 37。C顯色10-30 分鐘。
(5) 終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2 M反應(yīng)終止液0.05 ml。
(6) 結(jié)果分析用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)各孔OD值，大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2. 1倍， 即為陽(yáng)性。計(jì)算抗體效價(jià)公式(樣本OD值-空白對(duì)照OD值)/(陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照 OD值)。
6、 Western blot (免疫印跡)
Western blot操作按文獻(xiàn)(Sambrook J, Russell DW著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南，第3版.北京科學(xué)出版社，2002. (Sambrook J， Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)，
具體如下
(1) 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳
(2) 轉(zhuǎn)膜(電轉(zhuǎn))電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡20分鐘。預(yù) 先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜(購(gòu)自Millipore公司)，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15分鐘。 轉(zhuǎn)膜裝置的搭建:按從下至上順序依次為陰極塑料板、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙、 陽(yáng)極塑料板，濾紙、凝膠、膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，吸干多余的液體。恒壓38V，轉(zhuǎn) 移3小時(shí)。
(3) 免疫雜交反應(yīng) a用PBST洗膜，5分鐘X3次； b加入封閉液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2小時(shí)； c棄封閉液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
d將膜轉(zhuǎn)入一抗雜交液(抗血清按預(yù)定比例稀釋于封閉液)，室溫雜交2小時(shí)。陰性對(duì) 照中以免疫前的血清取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同； e棄雜交液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
f將膜轉(zhuǎn)入二抗雜交液(辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗按合適稀釋比例稀釋于PBST)，平 穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2小時(shí)；
g棄雜交液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
h加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。具體的實(shí)施例子
1、 sTRAIL重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與鑒定
將陽(yáng)性pET-28a(+)-sTRAIL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)，涂布LBA平板，37°C 培養(yǎng)過(guò)夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37。C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取適量菌液，按 1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6。。為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其 終濃度在0-1. 0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后，離心分 離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
2、 sTRAIL重組蛋白質(zhì)抗腫瘤活性檢測(cè)
(1) HL60細(xì)胞株懸浮生長(zhǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibco公司，美國(guó))中，內(nèi)含10% 小牛血清、lramol/L谷胺酰胺、青霉素和鏈霉素各100U/L。于37。C， 5°/。C02的飽和濕度孵箱 中培養(yǎng)，每2-3天傳代l次，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(2) 將純化的CasTRAIL重組蛋白質(zhì)，加入HL60細(xì)胞中至5 u g/ml，分別培養(yǎng)0或24 小時(shí)。
(3)分別收集細(xì)胞，用以下兩種方法鑒定HL60細(xì)胞的凋亡用分別含lug/ml的FITC-Annexin V和PI標(biāo)記細(xì)胞(購(gòu)自聯(lián)科生物，中國(guó))，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；用DNA提取試 劑盒(購(gòu)自北京賽百盛，中國(guó))提取DNA檢測(cè)DNA ladder的形成。近江牡蠣sTRAIL(CasTRAIL) 重組蛋白質(zhì)24小時(shí)內(nèi)平均可使近20%的HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有很強(qiáng)的抗癌作用。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)施例框架。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有 變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<formula>formula see original document page 8</formula>SEQ ID NO: 3
gtgagagaaa gag 13
SEQ ID NO: 4
ttagccaact taaaag 1權(quán)利要求
1、一種近江牡蠣體內(nèi)抗人類(lèi)腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質(zhì)，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求l所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于，該基因具有SEQIDNO: l所示的 核苷酸序列。
3、 一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的基因的寡聚核苷酸引物，其結(jié)構(gòu)為-TRAILf: 5' -GTGAGAGAAAGAG-3，TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTAAAAG-3'。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供近江牡蠣體內(nèi)抗人類(lèi)腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質(zhì)及其引物。該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；編碼該蛋白質(zhì)的基因具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列本發(fā)明還用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的基因的寡聚核苷酸引物。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的牡蠣中sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，對(duì)HL60腫瘤細(xì)胞具有殺傷性強(qiáng)、特異性高、安全性好、能夠大量生產(chǎn)、易于貯存等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101525380SQ20091009748
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者吳信忠, 楊受保 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)