專利名稱：一種新的載脂蛋白a-ⅱ的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)及其制備，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)重組人載脂蛋 白A-II (rhApoA-II)，以及優(yōu)化的高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組人載脂蛋白A-II的方法。
背景技術(shù)：
載脂蛋白A-lKapolipoprotein A-II, ApoA-II)由肝臟和小腸合成，人血漿中的 ApoA-II半衰期為4. 4天，是血清高密度脂蛋白(HDL)中第二種主要的載脂蛋白，約占HDL 中蛋白總量的20%。在乳靡微粒(CM)中它的含量可達(dá)總載脂蛋白的7% 10%，極低密度 脂蛋白(VLDL)中也有少量的ApoA-II存在，血漿中ApoA-II的濃度為0. 35 0. 5g/L(羅 靜聰，劉秉文，藍(lán)天鶴.人血漿載脂蛋白A-II的分離純化及鑒定[J].生物化學(xué)雜志，1990， 6(2) 157-161)。ApoA-II是由兩條各含77個(gè)氨基酸的肽鏈組成，單體分子量為8700D，在人血漿中 以二聚體形式存在，在不加還原劑的SDS-PAGE中測出相對(duì)分子質(zhì)量約為17. 5kD。ApoA-II 有多態(tài)性存在，最主要的多態(tài)性等電點(diǎn)為4.9。人ApoA-II mRNA長473個(gè)堿基，含有一個(gè) 58bp的5’不翻譯區(qū)。人類和鼠的ApoA-II定位于1號(hào)染色體上。其基因結(jié)構(gòu)與ApoA_I、 A-IV、C-II、C-III及E的基因結(jié)構(gòu)頗為相似，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子I長 169bp，插入基因組5’不翻譯區(qū)；內(nèi)含子II長293bp，插入緊鄰信號(hào)肽基因酶切位點(diǎn)的密碼 區(qū)；內(nèi)含子III插入成熟肽的編碼區(qū)。ApoA-II具有多種生理功能①維持HDL結(jié)構(gòu)=ApoA-II肽段12 31和肽段50 77具有與磷脂的結(jié)合能力，經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，殘基17 30和51 62形成的雙性螺 旋結(jié)構(gòu)是人ApoA-II與脂質(zhì)結(jié)合的分子基礎(chǔ)；②激活肝脂酶(h印atic lipase，HL)，用以水 解CM和VLDL中的三酰甘油和磷脂；③抑制凝血酶原活性；④抑制卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移 酶(LCAT)活性，從而阻礙細(xì)胞內(nèi)膽固醇的運(yùn)出，酯化和轉(zhuǎn)移；⑤其他=ApoA-II還具有置換 HDL顆粒中的ApoA-I，識(shí)別HDL受體、結(jié)合脂蛋白和部分拮抗低密度脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損 傷作用，從而保持內(nèi)皮細(xì)胞膜的完整性等功能。ApoA-II的多種生物學(xué)活性使其在脂質(zhì)代謝調(diào)控中起著十分重要的作用?，F(xiàn)階 段，對(duì)ApoA-II的檢測多限于試驗(yàn)研究，對(duì)某些疾病的診斷或研究起到輔助作用。目前， ApoA-II多是從血漿中分離并純化得到的，成本高而產(chǎn)量低。因此，有必要建立和發(fā)展重組 表達(dá)和純化ApoA-II的方法，以便滿足實(shí)驗(yàn)室研究的需求。甲基營養(yǎng)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達(dá)系統(tǒng)，并已被 用于表達(dá)許多有用的蛋白質(zhì)。例如，美國專利5，324，639公開了在甲基營養(yǎng)酵母特別是巴 斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)胰島素樣生長因子1的方法；美國專利5，330，901公開了使用 巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)人血清白蛋白的方法；美國專利5，965，389提供了在甲基營養(yǎng) 酵母中表達(dá)L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構(gòu)建體以及由之制備純的GAD65的方法；美 國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)血小板衍生的細(xì)胞因子(PDGF)的方法；美國專利 6，780，615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)應(yīng)樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關(guān) 于使用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)人載脂蛋白A-II的報(bào)道。
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發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白 A-II(rhApoA-II)多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營 養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的 (1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(2)編碼載脂蛋白A-II的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4) 可選擇標(biāo)志，從而以至少50mg/L培養(yǎng)基的濃度產(chǎn)生載脂蛋白A-II多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于表達(dá)重組人載脂蛋白A-II的甲基營養(yǎng)酵母，該 酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼 載脂蛋白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)重組人載脂蛋白A-II 多肽的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼載 脂蛋白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)重組人載脂蛋白 A-II多肽的優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件，特征在于其中發(fā)酵溫度維持在28°C 30°C，所使用的pH 值為6. 0 6. 5，并且培養(yǎng)基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)生產(chǎn)、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)載脂 蛋白A-II的方法。巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)是20世紀(jì)80_90年代發(fā)展起來的極具潛力的酵母 表達(dá)系統(tǒng)，由于其在蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)而得到越來越廣泛的應(yīng)用。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu) 點(diǎn)①屬于單細(xì)胞生物，故保留了易于操作和生長速度快的特點(diǎn)；②營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成 分簡單，生產(chǎn)成本低，特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；③通過同源重組，可將表達(dá)載體穩(wěn)定 地整合到宿主染色體中，連續(xù)傳代中不易丟失；④具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因(AOX)啟 動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)；⑤表達(dá)量高，許多蛋白的產(chǎn)率可達(dá)到每升克以上水平； ⑥表達(dá)的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很 低，十分有利于目的產(chǎn)物純化；⑦作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的正確加 工和修飾；⑧糖基化程度低。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)由一個(gè)外源基因表達(dá)框和AOXl啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)(MCS)和 一個(gè)從AOXl基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。同時(shí)，大多數(shù)載體都包含作為篩選標(biāo) 記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復(fù)制起始點(diǎn)和抗氨芐青霉素基因)。替代或插入方式整合到染色體的AOXl部位的A0X13’非編碼 區(qū)序列。本發(fā)明所使用的載體是由啟動(dòng)子、終止子、選擇標(biāo)記、報(bào)告基因、復(fù)制起點(diǎn)等元件構(gòu) 成。另外分泌型載體還需要有信號(hào)序列。最常用的啟動(dòng)子是AOXl啟動(dòng)子，它的甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)，因而它控制下的外源基因 能得到較高的表達(dá)。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力是由AOXl提供的。當(dāng)在以葡萄糖或 甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)，AOXl轉(zhuǎn)錄受到抑制；而在以甲醇為唯一生長碳源時(shí)，則可 誘導(dǎo)AOXl基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)。選擇標(biāo)記(HIS4) —般是對(duì)應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野 生型基因。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白質(zhì)很少，所以分泌表達(dá)是一種理想的表達(dá)方式。 同時(shí)，胞外表達(dá)更有利于蛋白質(zhì)的提取和純化。本發(fā)明優(yōu)選的信號(hào)肽是a因子(aMF)。a因 子信號(hào)序列由87個(gè)氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S. cerevsia)的a性成熟因子前導(dǎo)序列， 并且已將這段序列編碼的信號(hào)肽插人到巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體中。本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可以是胞內(nèi)表達(dá)的，也可以是分泌表達(dá)的。這 些載體都包括一個(gè)由0.9kb的5' AOXl序列片段和約0.3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3'序列組 成的表達(dá)盒。分泌型表達(dá)載體可以是pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞 內(nèi)表達(dá)的載體可以是 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHW010E121、pGAPZ、pGAPZa 等。本 發(fā)明優(yōu)選的是pPICZa。一般用于外源基因表達(dá)的巴斯德畢赤酵母菌株包括Y-11430、M_6100_3、GSl 15、 KM7U SMDl 168等，本發(fā)明優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母X_33菌株。得到攜帶載脂蛋白A-II基因的重組表達(dá)載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)球 法和電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞。其中，本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿 孑L法(Sambrook，ed. Molecular Cloning :A Laboratory Manul(2nd. ed.)，Vols. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory,1998)。導(dǎo)入酵母體內(nèi)的重組表達(dá)載體只有與酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染 色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在并得以表達(dá)。本發(fā)明中，為了穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，可以 在His或5' AOXl的單酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒載體線性化(Sac I)，使之通過單交換整合到酵母 細(xì)胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲醇利用能力的轉(zhuǎn)化子。用于本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母含有典型高等真核生物的許多翻譯后修飾功 能。這些功能包括信號(hào)肽的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵的形成、0-及N-型糖基化和?；?等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白質(zhì)的糖基化鏈參與細(xì)胞識(shí)別、激素受 體結(jié)合、蛋白質(zhì)定位及宿主_微生物間相互作用。糖基化過程是經(jīng)一系列剪接并產(chǎn)生由 Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)組成的寡核糖的反應(yīng)。巴斯德畢赤酵母能夠?qū)⑻妓衔?連接到分泌表達(dá)的外源蛋白質(zhì)上。巴斯德畢赤酵母修飾糖鏈的平均長度為8 14甘露糖， 而且外鏈不含a_l，3甘露糖，所以其表達(dá)的糖蛋白特別適于治療應(yīng)用。由于本發(fā)明中充分優(yōu)化了發(fā)酵pH值、攪拌速率、營養(yǎng)補(bǔ)給等培養(yǎng)條件，所以可使 酵母菌高密度生長，從而導(dǎo)致產(chǎn)物的高效表達(dá)。例如，在5L搖瓶培養(yǎng)條件下，本發(fā)明的重組 載脂蛋白A-II多肽表達(dá)產(chǎn)率可達(dá)到50mg/L。絕大多數(shù)情況下，巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷貝外源基因會(huì)提高 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量，所以本發(fā)明優(yōu)先選擇分泌型、高拷貝標(biāo)記和易操作的穿梭載體，特別是
5PPICZa作為ApoA-II多肽的表達(dá)載體。另外，由于在His位點(diǎn)整合時(shí)，染色體突變的His位點(diǎn)可與表達(dá)盒的HIS4基因位 點(diǎn)之間發(fā)生基因交換會(huì)導(dǎo)致表達(dá)盒的丟失，故一般優(yōu)先選擇AOXl位點(diǎn)。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基可以是BMGY/BMMY，BMG/B匪，MGY/MM等培養(yǎng) 基，但優(yōu)選的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養(yǎng)基。作為唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般為培養(yǎng)體積的0. 5-1. 0% (V/V)。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可使用已知的方法檢測由被轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離物所產(chǎn)生的ApoA-II 多肽含量，并從中選擇有高產(chǎn)率的細(xì)胞分離物，用于放大生產(chǎn)。可使用飽和硫酸銨鹽析、離子交換層析、親合層析等方法分離并純化所需ApoA-II 多肽。本發(fā)明首次在酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達(dá)了 rhApoA-II，建立了穩(wěn)定 WrhApoA-II畢赤酵母高效表達(dá)體系。與在大腸桿菌中的表達(dá)相比，本發(fā)明的方法具有如 下特點(diǎn)①表達(dá)體系穩(wěn)定，含目的基因的表達(dá)盒通過同源重組整合進(jìn)入酵母的染色體中，菌 種穩(wěn)定，不存在質(zhì)粒丟失的問題；②有效的分泌表達(dá)，目的蛋白質(zhì)的表達(dá)受醇氧化酶啟動(dòng)子 的嚴(yán)格控制，可在甲醇誘導(dǎo)下啟動(dòng)表達(dá)并將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，而且畢赤酵母本身 的蛋白很少分泌到培養(yǎng)基中，使目的蛋白更易于純化；③表達(dá)產(chǎn)量高，rhApoA-II在畢赤酵 母中的搖瓶規(guī)模表達(dá)量可高達(dá)50mg/L ；④不存在內(nèi)毒素污染問題；⑤大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)成本低。在rhApoA-II純化方面，因?yàn)閔ApoA-II的等電點(diǎn)約為4.9，所以本發(fā)明采用 PH3. O條件下進(jìn)行陽離子交換層析可很好的避免核酸和內(nèi)毒素的污染，并且有利于保持 rhApoA-II的穩(wěn)定，防止其降解。本發(fā)明建立了在酵母中高效分泌表達(dá)rhApoA-II的方法，同時(shí)建立了聯(lián)合使用陽 離子交換層析和疏水層析技術(shù)純化rhApoA-II產(chǎn)物的方法。使用SDS-PAGE以及蛋白質(zhì) N-端測序分析，證實(shí)按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的rhApoA-II具有與天然ApoA-II相同的序列和 理化性質(zhì)，從而為進(jìn)一步檢測其體內(nèi)外生物學(xué)活性提供了必要條件。結(jié)果顯示，本發(fā)明建立的畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組人載脂蛋白A-II 的產(chǎn)量約為50mg/L發(fā)酵液、產(chǎn)物回收率約為68%、產(chǎn)物的純度高達(dá)94. 3%。本發(fā)明的這些 研究結(jié)果無疑將為重組人載脂蛋白A-II的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)。


圖1顯示重組質(zhì)粒pPICZa/hApoA-II轉(zhuǎn)化酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中泳道 9是DNA分子量標(biāo)志物(DL2000)；泳道1是空白質(zhì)粒pPICZa轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA的 PCR產(chǎn)物；泳道2 8和10 12是不同酵母菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2顯示不同純化階段rhApoA-II的SDS-PAGE圖譜(考馬斯亮藍(lán)染色)。其中泳 道1是甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120h發(fā)酵上清；泳道3是Takara蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物；泳道2是經(jīng) SP Sepharose XL陽離子層析純化的rhApoA-II ；泳道4是經(jīng)SP Sepharose XL陽離子層析 和Source 30疏水層析純化的rhApoA-II。圖3顯示pH對(duì)rhApoA-II表達(dá)的影響(SDS-PAGE分析)。其中泳道1是甲醇誘 導(dǎo)表達(dá)Oh發(fā)酵上清；泳道2 10分別為pH 3. 2,3. 6,4. 0,4. 4,4. 8,5. 2,5. 6,6. 0、6· 5誘導(dǎo)表達(dá)120h上清；泳道11是Takara蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。
具體實(shí)施例方式以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1 人載脂蛋白A-II基因(hApoA-II)的克隆和擴(kuò)增(1)Trizol法從人肝組織中提取總RNA將新鮮分離的人肝組織切成IOOmg的大小，立即放入液氮中速凍。按下列方法從 組織中提取總RNA。取出冰凍的組織300mg放入盛有液氮的研缽中，將組織碾碎。將碾碎 的組織移入50ml離心管中，加入約5ml Trizol,于室溫用勻漿器高速勻漿15 30s。加 Λ 1. Oml氯仿(200 μ 1/ml Trizol)，充分振蕩搖勻，室溫下放置5min。4°C離心(12000" min)15min后將上層水相移至另一離心管中。加入等體積異丙醇，振蕩搖勻，室溫沉淀 10min，4°C離心(12000r/min) 15min，棄上清。加入75%乙醇Iml洗滌沉淀2次，4°C離心 (12000r/min) 5min,室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇。將總RNA沉淀溶于50 μ IDEPC處理過的水 中，-80°C保存?zhèn)溆?。? μ 1樣品稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定Α260和Α280，計(jì)算其濃度和純 度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。RNA含量按下面公式計(jì)算RNA 濃度(μ g/ μ 1) = Α260 X 40 X 稀釋倍數(shù) /1000Α260/Α280 = 1. 8 2. 0 表示純度合格(2)hApoA-II 基因的克隆(RT-PCR 法)RT 反應(yīng)在0. 2ml EP管中加入上述提取的總RNA 1 μ g，1 μ 1 OligodT，70°C變性lOmin，冰 浴lmin，然后加入下列反應(yīng)液MgCl24 μ 110 X RNAPCR 緩沖液2 μ 1RNA 酶抑制劑0. 5 μ 1dNTP(10mmol/L)2μ 1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1無RNA酶滅菌超純水 加至終體積20 μ 1于PCR儀上42°C反應(yīng)60min，然后99°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA用于下一步 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)
向上述0. 2ml EP ■f中加入以下反應(yīng)體系
10 X LAPCR緩沖液8μ 1
LATaq1 μ 1
上游引物1 μ 1
下游引物1 μ 1
滅菌超純水加至終體積100 μ 1
在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)棰?4°C 2min②94°C 30s, 57°C 30s, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)(3) 72°C IOmin此PCR反應(yīng)引物序列如下上游引物5，-ATGAAGCTGCTCGCAGCAACTGT-3，(SEQID NO 1)下游引物5，-TTATCACTGGGTGGCAGGCTGT-3，(SEQID NO 2)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小是否與預(yù)期結(jié)果吻合，確定是否 得到正確目的基因。(3)克隆載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增回收PCR擴(kuò)增的hApoA-II基因片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥蘸?，將 hApoA-II基因片段與T載體16°C連接30分鐘。連接反應(yīng)體系包括hApoA-II基因片段 0. 1 0. 3pmol ；T載體0. 03pmol ；溶液I (含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載 體試劑盒)5 μ 1 ；滅菌超純水至終體積10 μ 1。按照常規(guī)方法，從37°C培養(yǎng)16小時(shí)的XL1-Blue陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的LB 瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落(直徑2 3mm)，接種于含有100ml LB培養(yǎng)基的IL培養(yǎng)瓶中，以 制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并于-80°C凍存?zhèn)溆?。取一份凍存的感受態(tài)細(xì)胞融化后，加入上述連接產(chǎn)物，進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化。然后取 200 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含X-Gal、IPTG ( 二者可在涂菌前半小時(shí)涂于LB瓊脂平 板表面)和氨芐青霉素(100yg/ml)的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 16小時(shí)。(4)重組載體的鑒定隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落(“藍(lán)白篩選”)，接種于含氨芐青霉素(100yg/ml) 的LB培養(yǎng)基中，37°C強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)過夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。取1 μ 1溶解的DNA沉淀 物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37°C Xho I.EcoR I雙酶消化2小時(shí)，1 %瓊脂 糖凝膠電泳后根據(jù)內(nèi)切酶譜鑒定正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于DNA 測序。實(shí)施例2 :hApoA-II畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZa/hApoA-II的構(gòu)建和宿主細(xì) 胞轉(zhuǎn)化取上述測序鑒定正確的攜帶hApoA-II基因的質(zhì)粒50ng，按上述比例在0. 2ml EP 管中建立PCR反應(yīng)體系。利用上述PCR反應(yīng)體系和條件，借助上游引物5’-AACCTCGAGAAGAG ACAGGCAAAGGAGCCATGT-3’ (SEQ ID NO 3)引入酵母a因子信號(hào)肽的部分序列和XhoI位點(diǎn)， 并利用下游引物5，-GCGTCTAGATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3，(SEQ ID NO 4)引入 EcoR I 位點(diǎn)。PCR引入上述序列和酶切位點(diǎn)后，回收目的片段。用相應(yīng)酶切后，連入用同樣酶切后 的質(zhì)粒pPICZa，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa/hApoA-II，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒并 進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列測定分析。取測序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠 電泳法進(jìn)行定量分析。取10 15 μ g pPICZa/hApoA-II重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶消化(線性 化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10 μ 1超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母Χ-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于5ml YPD培養(yǎng)基中，250rpm，3(TC震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，以常規(guī)方法制備酵母感受態(tài) 細(xì)胞。然后取80 μ 1上述感受態(tài)菌，與10 15 μ g線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒混合，移入 0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50 100 μ 1轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin (100 μ g/ml) 的YPD平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長狀況。然后用PCR方法篩選轉(zhuǎn)化酵母菌。離心回收菌體后，提取酵母基因組DNA并進(jìn)行 PCR鑒定，鑒定結(jié)果如附圖1所示。實(shí)施例3 =ApoA-II多肽的表達(dá)和純化(1)重組人載脂蛋白A-II(rhApoA-II)的表達(dá)取上述鑒定結(jié)果陽性的克隆接種IOml BMGY(pH6.0)培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)24 小時(shí)，至0D_達(dá)到2. 0 6. 0時(shí)收集細(xì)胞。用等體積(IOml)BMMY(pH6. 0)重懸細(xì)胞沉淀， 30°C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)過程中，每24小時(shí)補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%，同時(shí)補(bǔ)充 滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144、168小時(shí)等 時(shí)間點(diǎn)各取0. 5ml發(fā)酵液，離心取上清用于蛋白質(zhì)分析(SDS-PAGE，N-端氨基酸序列分析
寸乂 O(2) rhApoA-II 的純化發(fā)酵液經(jīng)高速大容量離心機(jī)(5000r/min)連續(xù)離心分離發(fā)酵液上清。上清經(jīng) SPSepharose XL陽離子柱層析(緩沖液為20mmol · L—1 HAc-NaAc緩沖液，洗脫液為含 0. 5mol · L-1NaCl 的 20mmol · Γ1 HAc-NaAc 緩沖液)和 Source 30RPC 反相疏水柱層析(洗 脫液為含0. 1% TFA的50%甲醇)后用升降恒溫浴鍋37°C減壓蒸餾甲醇洗脫液，脫甲醇濃 縮，獲得純化的rhApoA-II。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，如此純化的rhApoA_II至少達(dá)到電泳純，且產(chǎn)物的的收 率和純度分別達(dá)到約68%和94. 3% (參見附圖2)。實(shí)施例4 =ApoA-II多肽的理化性質(zhì)鑒定(I)Tricine-SDS-PAGE 分析用Tricine-SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量的測定和粗略定量分析。方法如下1)制膠按如下比例灌制分離膠和濃縮膠。
0097]①15%分離膠的配制
0098]超純水0. 34ml
0099]30% 丙烯酰胺4.7ml
0100]3. Omol · L^1Tris-HCl (ρΗ8· 45)3. Oml
0101]甘油0.95ml
0102]10% 過硫酸銨0.03ml
0103]TEMED0. 006ml
0104]②濃縮膠的配制
0105]超純水3. 12ml
0106]30% 丙烯酰胺0.64ml
0107]3mol · L^1Tris-HCl (ρΗ8· 45)1. 24ml
0108]10% 過硫酸銨0.03ml
9
TEMED0.006ml2)分別取2處、4811、7211、9611、12011培養(yǎng)上清按4 1比例加入5XSDS樣品緩沖 液，混勻后，煮沸5min。3)取出上述樣品，冷卻至室溫后，離心(10000r/min)30S，取上清每孔加樣50μ 1。4)50V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到100V，恒壓電泳分離。5)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，觀察分析結(jié)果。(2)表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是其高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，用基因重組技術(shù)表達(dá)分泌型蛋白時(shí)，表 達(dá)的異源蛋白在加工成熟過程中容易出現(xiàn)信號(hào)肽錯(cuò)誤切割現(xiàn)象，繼而影響表達(dá)蛋白的高級(jí) 結(jié)構(gòu)和生物活性的發(fā)揮。因此，在SDS-PAGE確定分子量正確的情況下，應(yīng)對(duì)所表達(dá)的重組 蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)N-末端的氨基酸序列測定，以確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)的正確性。測序結(jié)果表明， 按照本發(fā)明方法制備的重組人載脂蛋白A-II具有與野生型載脂蛋白A-II完全相同的氨基 酸序列。實(shí)施例5 :rhApoA-II發(fā)酵最佳pH的確定畢赤酵母對(duì)培養(yǎng)基的pH適應(yīng)范圍很廣，在pH 3. 0 6. 0都能很好地生長，但是 在發(fā)酵表達(dá)外源蛋白的過程中，發(fā)酵液PH對(duì)外源蛋白的表達(dá)有很大的影響，在大規(guī)模發(fā) 酵細(xì)胞高密度培養(yǎng)時(shí)尤為明顯。因此，在進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵前，在搖床水平進(jìn)行了發(fā)酵表達(dá) rhApoA-II的pH優(yōu)化，為rhApoA-II的大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)提供必要參數(shù)。選取表達(dá)量高的rhApoA-II畢赤酵母工程菌接種于IOml YPD培養(yǎng)基中，30°C、 250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。取上述培養(yǎng)的菌液Iml接種于100ml BMGY培養(yǎng)基中30°C、 250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。分別取上述菌液IOml置于50ml離心管中，室溫離心(3000r/ min) IOmin,棄上清。各管分別加入未加緩沖液的BMMY 9ml，加入Imol · L^1Na2HPO4和 0. 5mol · Γ1檸檬酸配制成不同pH的BMMY誘導(dǎo)表達(dá)(hApoA-II工程菌分別在pH為3. 2、 3. 6,4. 0,4. 4,4. 8,5. 2,5. 6,6. 0,6. 5的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，確定rhApoA-II發(fā)酵的最適pH)， 30°C,250r/min震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過程中每24h補(bǔ)充甲醇至終濃度為0. 5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌去 離子水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)72、96、120、144、168小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)各取0. 5ml 發(fā)酵液，離心取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析(Tricine-SDS-PAGE法)。結(jié)果顯示在pH低于4.0的發(fā)酵液上清中，幾乎檢測不到rhApoA-II ；在pH值 6. 0 6. 5條件下，rhApoA-II表達(dá)量最高，確定pH 6. 0為rhApoA-II發(fā)酵的最佳pH條件 (參見附圖3)。序列表<110>吉林圣元科技有限責(zé)任公司<120> 一種新的載脂蛋白A-II的制備<140><141><160>4<210>1<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>1ATGAAGCTGC TCGCAGCAAC TGT<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建克隆載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>2TTATCACTGG GTGGCAGGCT GT<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>3AACCTCGAGAAGAGACAGGC AAAGGAGCCA TGT<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)的用作構(gòu)建表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增引物。<400>4ATTGAATTCT CACTGGGTGG CAGGCTGTGT TCC
權(quán)利要求
一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白A II多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的(1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(2)編碼人載脂蛋白A II的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而以至少50mg/L培養(yǎng)基的濃度得到重組人載脂蛋白A II多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的 甲基可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵AOXl基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于表達(dá)重組人載脂蛋白A-II的甲基營養(yǎng)酵母能夠依靠作 為碳源和能源的甲醇生長，并且該酵母是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼人載脂蛋 白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。
4.用于在甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)重組人載脂蛋白A-II的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操 作連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼人載脂蛋白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和 可選擇標(biāo)志。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的構(gòu)建體，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲基 可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。
6.純化載脂蛋白A-II的方法，特征在于依次使用陽離子交換層析和疏水層析技術(shù)分罔ο
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)、純化、鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)重組人載脂蛋白A-II(rhApoA-II)，以及優(yōu)化的高密度發(fā)酵生產(chǎn)和純化重組人載脂蛋白A-II的方法。
文檔編號(hào)C07K1/20GK101928723SQ20091006715
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者蘇曼曼, 顏煒群 申請(qǐng)人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司