專利名稱：：使用糖聚乙二醇化g-csf的治療方法使用糖聚乙二醇化G-CSF的治療方法相關(guān)申請的交互引用本申請要求2007年4月3日提交的美國臨時申請?zhí)?0/909，917、2007年4月13日提交的美國臨時申請?zhí)?0/911，788和2007年11月7日提交的美國臨時申請?zhí)?0/986，240的優(yōu)先權(quán)，所述所有申請為了所有目的在此以其整體引入。
背景技術(shù)：
：粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)是剌激嗜中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞和成熟嗜中性粒細(xì)胞存活、增殖、分化和功能的糖蛋白。臨床使用的兩種形式的重組人G-CSF是嗜中性粒細(xì)胞的粒細(xì)胞生成的有效剌激劑，并在預(yù)防一些嗜中性白細(xì)胞減少癥的感染性并發(fā)癥中表現(xiàn)出有效性。它們可用來加快嗜中性粒細(xì)胞從骨髓抑制治療中恢復(fù)。G-CSF通過降低發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的發(fā)病率、骨髓移植支持的高劑量化學(xué)療法的死亡率和嚴(yán)重慢性嗜中性白細(xì)胞減少癥病人感染的發(fā)病率和持續(xù)時間來減少癌癥化學(xué)療法的死亡率。此外，已顯示在心肌梗塞起始后施用時，G-CSF具有療效。作為細(xì)胞毒性化學(xué)療法的結(jié)果，急性骨髓抑制是公認(rèn)的癌癥治療中的劑量限定因素。雖然其他正常組織也可能受不利影響，但骨髓對如化學(xué)療法和放射療法的增殖特異性治療尤其敏感。對一些癌癥病人，造血毒性常限制了化學(xué)療法劑量增加的可能性。反復(fù)的或高劑量的化學(xué)療法周期可導(dǎo)致造血干細(xì)胞及其后代的干細(xì)胞衰竭。預(yù)防和防止化學(xué)療法和放射療法的副作用對癌癥病人大有裨益。已顯示G-CSF和其他生長因子通過增加正常關(guān)鍵靶細(xì)胞(尤其是造血祖細(xì)胞)的數(shù)目來減輕此類副作用。來自日本和美國的小組于1986年克隆了人形式的G-CSF(見如Nagata等人，Nature319:415-418,1986)。這種天然人類糖蛋白以兩種形式存在，一種具有175個氨基酸，另一種具有178個氨基酸。豐度更高和活性更高的175個氨基酸形式已用于通過重組DNA技術(shù)開發(fā)藥物產(chǎn)品。大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)中合成的重組人G-CSF稱為非格司亭。非格司亭的結(jié)構(gòu)與天然糖蛋白略有不同。重組人G-CSF的另一種形式稱為來格司亭，是在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中合成的。hG-CSF是單體蛋白質(zhì)，其通過形成2個G-CSF分子和2個受體分子的2:2復(fù)合體二聚化G-CSF受體(Horan等人，Biochemistry,35(15):4886-96(1996))。已通過X射線晶體衍射研究將以下hG-CSF殘基鑒定為受體結(jié)合界面的部分G4、P5、A6、S7、S8、L9、PIO、Q11、S12、L15、K16、E19、Q20、L108、D109、D112、T115、T116、Q119、E122、E123禾口L124(見如Aritomi等人，(1999)Nature401:713)。市售rhG-CSF形式具有短期藥理學(xué)作用，必須在白細(xì)胞減少狀態(tài)期間多于每天一次地經(jīng)常施用。具有更長循環(huán)半衰期的分子可減少減輕白細(xì)胞減少和預(yù)防后續(xù)感染必要的給藥次數(shù)。目前可用的rG-CSF產(chǎn)品的另一問題是劑量依賴性骨痛的發(fā)生。由于骨痛作為rG-CSF治療的明顯副作用為病人所體驗，因此希望提供一種不引起骨痛的rG-CSF產(chǎn)品，或借助于本身不具這種作用的產(chǎn)品，或借助于在不引起骨痛的足夠小的劑量下有效的產(chǎn)品。因此，明顯存在對改進(jìn)型重組G-CSF分子的需要。已報道了hG-CSF的蛋白質(zhì)工程變體(美國專利號5，581，476，美國5，214，132，美國5，362，853，美國4，904，584和Riedhaar-01son等人，Biochemistry35:9034-9041，1996)。還報道了與天然多肽相比引入了至少一條附加糖鏈的hG-CSF和其他多肽的修飾(美國專利號5，218，092)。此外，已報道和研究了天然hG-CSF的聚合物修飾(包含連接PEG基團(tuán))(見如Satake-Ishikawa等人，(1992)CellStructureandFunction17:157;Bowen等人(1999)ExperimentalHematology27:425;美國專利號5，824，778、美國5，824，784、W096/11953、W095/21629和W094/20069)。在改進(jìn)糖蛋白藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì)的嘗試中，將合成聚合物連接至肽主鏈為本領(lǐng)域公知。聚乙二醇("PEG")是已結(jié)合至肽的示例性聚合物。已表明用PEG衍生肽治療劑可降低肽的免疫原性。例如，美國專利號4，179，337(Davis等人)公開了非免疫原性多肽，如偶聯(lián)至聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的酶和肽類激素。除降低免疫原性外，由于所述多肽的PEG綴合物尺寸增加，還延長了循環(huán)清除時間。將PEG(及其衍生物)連接至肽的一種方式是通過肽氨基酸殘基的非特異性結(jié)合(見如美國專利號4，088，538、美國專利號4，496，689、美國專利號4，414，147、美國專利號4，055，635和PCTWO87/00056)。將PEG連接至肽的另一方式是通過糖肽上糖殘基的非特異性氧化(見如W094/05332)。在這些非特異性方法中，聚乙二醇以隨機(jī)、非特異的方式加至肽主鏈的反應(yīng)性殘基。當(dāng)然，PEG分子的隨機(jī)加入具有其缺點，包括終產(chǎn)物缺乏同質(zhì)性和降低肽的生物活性或酶活性的可能性。因此，對治療肽的生產(chǎn)，導(dǎo)致形成特異性標(biāo)記、易于鑒定、基本同質(zhì)的產(chǎn)物的衍生策略較為優(yōu)越。已經(jīng)開發(fā)了這樣的方法。可通過酶的作用在體外生產(chǎn)特異性標(biāo)記的同質(zhì)肽類治療劑。與將合成聚合物或其他標(biāo)簽連接至肽的一般非特異性方法不同，基于酶的合成具有區(qū)域選擇性和立體選擇性的優(yōu)點。用于標(biāo)簽肽合成的兩類主要的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶(如唾液酸轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)和糖苷酶。這些酶可用于糖的特異性連接，隨后可對糖進(jìn)行修飾，使其包含治療部分。備選地，可用糖基轉(zhuǎn)移酶和經(jīng)修飾的糖苷酶直接將經(jīng)修飾的糖轉(zhuǎn)移至肽主鏈(見如美國專利6，399，336及美國專利申請公開20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，所述每一專利在此引用作為參考)。還已知將化學(xué)和酶合成元件聯(lián)用的方法(見如Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305:415-422(1998)和美國專利申請公開20040137557，其在此引用作為參考)。響應(yīng)對改進(jìn)型治療性G-CSF的需要，本發(fā)明提供一種具有治療活性的糖聚乙二醇化G-CSF，其與未經(jīng)糖聚乙二醇化的相同或非常相似的G-CSF肽相比，具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)參數(shù)和性質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供增加受試者(尤其是已接受或?qū)⒔邮芊派浏煼ɑ蚧瘜W(xué)療法的患者)中造血作用的方法。發(fā)明概述相應(yīng)地，一方面，本發(fā)明提供動員骨髓移植受體干細(xì)胞產(chǎn)生的方法和組合物。這些方法和組合物包括對骨髓移植受體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。一方面，聚合的修飾基團(tuán)通過完整的糖基連接基團(tuán)，在肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至該肽。另一方面，本發(fā)明提供增加受試者粒細(xì)胞數(shù)目的方法和組合物。該方法包括對所述受試者施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。一方面，G-CSF肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，聚合的修飾基團(tuán)在從126位甘氨酸延伸至143位絲氨酸的氨基酸序列區(qū)域內(nèi)共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供增加受試者干細(xì)胞產(chǎn)生的方法和組合物。該方法包括對受試者施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。另一方面，G-CSF肽包含以下通式的結(jié)構(gòu)其中n為1至2000的整數(shù)。—方面，本發(fā)明提供預(yù)防、治療和減輕骨髓抑制(尤其是癌癥化學(xué)療法引起的骨髓抑制)的方法。一方面，此方法包括對受體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至該G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供治療受試者疾病的方法，其中所述疾病以受試者中白細(xì)胞產(chǎn)生減弱為特征。一方面，治療此疾病的方法包括對受試者施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。對受試者施用的肽的量對改善受試者疾病是有效的。另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法。這些方法包括施用藥學(xué)有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物血小板減少癥的方法。這些方法包括施用藥學(xué)有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽?！矫?，本發(fā)明提供擴(kuò)大造血干細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。這些方法包括對干細(xì)胞施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>射q為O或1;且Sia-PEG具有以下通式的結(jié)構(gòu)聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供剌激受試者造血作用的方法。這些方法包括對受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供增加受試者造血祖細(xì)胞數(shù)目的方法。這些方法包括對受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。—方面，本發(fā)明提供動員供體干細(xì)胞產(chǎn)生的方法。這些方法包括對供體施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)提供給受體的骨髓的長期植入的方法。這些方法包括對骨髓受體施用肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。共價綴合物的聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。另一方面，本發(fā)明提供動員受試者造血祖細(xì)胞的方法。這些方法包括對受試者施用第一種組合物(包含式l，l'-[1，4-亞苯基-雙-(亞甲基)-雙-1，4，8，11_四氮雜環(huán)十四烷(AMD3100)的化合物)和第二種組合物(包含肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物)的步驟。聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。第一種和第二種組合物可按任一順序順序地或同時對受試者施用?！矫妫景l(fā)明提供一種口服劑型。此口服劑型可包含成分(a)肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。聚合的修飾基團(tuán)可通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽；(b)表面活性劑；(c)脂肪酸；(d)腸溶物質(zhì)。一方面，成分(a)、(b)和(c)混合于液相，并在與成分(d)組合前凍干。另一方面，本發(fā)明提供增加供體干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，其中該方法包括對供體施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。另一方面，聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)，在肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至該肽。另一方面，對供體施用的肽的量在從約lmg至約20mg的范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供增加供體干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，其中該方法包括對供體施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。另一方面，聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)，在肽的糖基或氨基酸殘基處連接至該肽。另一方面，對供體施用的肽的量為單位劑型。在一個實施方案中，單位劑量選自25iig/kg、50iig/kg、100iig/kg禾口200iig/kg。附圖描述圖1表示與B向應(yīng)XM22(25iig/kg、50iig/kg、100iig/kg)禾口Neulasta(100iig/kg)的嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)相關(guān)的數(shù)據(jù)。圖2表示與B向應(yīng)XM22(25iig/kg、50iig/kg、100iig/kg)禾口Neulasta(100iig/kg)的CD34+細(xì)胞計數(shù)相關(guān)的數(shù)據(jù)。圖3是與四個不同測試組的藥代動力學(xué)參數(shù)相關(guān)的數(shù)據(jù)表。圖4表示與響應(yīng)XM22(6mg)和Neulasta(6mg)的嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)相關(guān)的數(shù)據(jù)。圖5表示與響應(yīng)XM22(6mg)和Neulasta(6mg)的CD34+細(xì)胞計數(shù)相關(guān)的數(shù)據(jù)。圖6表示短尾猴中與響應(yīng)G-CSF、糖聚乙二醇化G-CSF、Neulasta和對照組合物的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)相關(guān)的藥效數(shù)據(jù)。圖7表示短尾猴中與所示化合物的血漿濃度相關(guān)的藥效數(shù)據(jù)。圖8是糖聚乙二醇化GCSF及其受體結(jié)構(gòu)的示意模型。圖9表示與施用三種不同劑量的XM22禾P100iig/kg的Neulasta后XM22和Neulasta的血清濃度相關(guān)的數(shù)據(jù)。圖10表示與施用6mgXM22和6mgNeulasta后XM22和Neulasta的血清濃度相關(guān)的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述和優(yōu)選實施方案縮寫詞PEG,聚乙二醇；PPG，聚丙二醇；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N_乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N_乙酰葡萄糖胺基；Man,甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基(N_乙酰神經(jīng)氨?；?；M6P，甘露糖-6-磷酸；Sia，唾液酸、N_乙酰神經(jīng)氨酸基及其衍生物和類似物。"G-CSF"指粒細(xì)胞集落剌激因子。除非另作定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語一般與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同意義。一般來說，本文所用命名法和細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)的實驗室操作為本領(lǐng)域公知和通常使用的。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行核酸和肽合成。技術(shù)和操作一般按本文全文給出的本領(lǐng)域的常規(guī)方法和幾種一般參考文獻(xiàn)(一般見Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，其在此弓l用作為參考)進(jìn)行。本文所用命名法和下述分析化學(xué)、有機(jī)合成的實驗室操作是本領(lǐng)域公知和通常采用的。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改進(jìn)行化學(xué)合成和化學(xué)分析。本文所述所有寡糖用非還原糖的名稱或縮寫描述(即Gal)，后跟糖苷鍵的構(gòu)型(a或P)、環(huán)鍵(l或2)、參與成鍵的還原糖的環(huán)位置(2、3、4、6或8)，隨后是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優(yōu)選為吡喃糖。標(biāo)準(zhǔn)的糖生物學(xué)命名法綜述見EssentialsofGlycobiology，Varki等人編輯，CSHLPress(1999)。無論還原端的糖實際上是否是還原糖，都認(rèn)為寡糖具有還原端和非還原端。按照公認(rèn)的命名法，本文將寡糖描述為非還原端在左邊，還原端在右邊。術(shù)語"唾液酸"指九碳羧化糖家族的任一成員。唾液酸家族最常見的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基_3，5-雙脫氧-D-甘油基_D_galactononulopyranos_l_onicacid(?？s寫為Neu5Ac，NeuAc或NANA))。此家族的第二個成員是N-羥乙酰基-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N_乙酰基被羥基化。第三個唾液酸家族成員是2-酮-3-脫氧-no皿losonicacid(KDN)(Nadano等人(1986)，J.Biol.Chem.261:11550-11557;Kanamori等人，J.Biol.Chem.265:21811-21819(1990))。還包含諸如9-0_C「C6酰基-Neu5Ac樣的9-0-乳?；?Neu5Ac或9-0-乙酰基-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac的9-取代的唾液酸。唾液酸家族的綜述見如Varki，Glycobiology2:25-40(1992);SialicAcids:Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer編車茸(Springer-Verlag，紐約(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化操作中的合成和用途公開于1992年10月1日發(fā)表的國際申請W092/16640。"肽"指聚合物，其中單體是氨基酸，通過酰胺鍵連接在一起，備選地稱為多肽。此外，還包含非天然氨基酸，如e-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本發(fā)明中還可使用非基因編碼的氨基酸。此外，本發(fā)明還可使用修飾為包含反應(yīng)基團(tuán)、糖基化位點、聚合物、治療部分、活性分子等的氨基酸。本發(fā)明使用的所有氨基酸可為D-或L-異構(gòu)體。一般優(yōu)選L-異構(gòu)體。此外，其他肽模擬物在本發(fā)明中也是有用的。如本文所用，"肽"指糖基化和非糖基化的肽。還包含通過表達(dá)該肽的系統(tǒng)不完全糖基化的肽。一般綜述見Spatola，A.F.，ChemistryandBiochemistryofAminoAcids中，PeptidesandProteins,B.Weinstein編輯，MarcelDekker，紐約，267頁(1983)。若二者間存在一定程度的序列同一性，則肽的氨基酸或核苷酸序列與另一序列"同源"。優(yōu)選地，同源序列與參考序列具有至少約85%的序列同一性，優(yōu)選與參考氨基酸或核苷酸序列至少具有約90%至100%序列同一性，更優(yōu)選具有至少約91%的序列同一性，具有至少約92%的序列同一性，具有至少約93%的序列同一性，具有至少約94%的序列同一性，更優(yōu)選具有約95%至99%的序列同一性，優(yōu)選具有至少約96%的序列同一性，具有至少約97%的序列同一性，具有至少約98%的序列同一性，更優(yōu)選具有至少約99%的序列同一性和約100%的序列同一性。術(shù)語"肽綴合物"指本發(fā)明的類型，其中肽與本文所述的經(jīng)修飾的糖綴合。術(shù)語"氨基酸"指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些隨后經(jīng)修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、Y_羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即a碳與氫、羧基、氨基和R基結(jié)合，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有經(jīng)修飾的R基(如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但保持了與天然存在的氨基酸一樣的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。本文所用術(shù)語"經(jīng)修飾的糖"指天然或非天然存在的碳水化合物，在本發(fā)明的方法中將其酶促附加至肽的氨基酸或糖殘基上。經(jīng)修飾的糖選自酶底物，其包含但不限于糖核苷酸(單、二和三磷酸)、活性糖(如糖基鹵化物、糖基甲磺酸酯)及既無活性又非核苷酸的糖。"經(jīng)修飾的糖"用"修飾基團(tuán)"共價官能化。有用的修飾基團(tuán)包含但不限于PEG部分、治療部分、診斷部分、生物分子等。修飾基團(tuán)優(yōu)選為非天然存在的或未經(jīng)修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團(tuán)官能化的部位，使得其不妨礙"經(jīng)修飾的糖"通過酶促加入肽。術(shù)語"水溶性的"指在水中具有某種可檢測程度的溶解度的部分。檢測和/或定量水溶解度的方法為本領(lǐng)域公知。示例性水溶性聚合物包含肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有由單個氨基酸組成的混合序列，如聚賴氨酸。示例性多糖是聚唾液酸。示例性聚醚是聚乙二醇。聚乙烯亞胺是示例性聚胺，聚丙烯酸是代表性的聚羧酸。水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚乙二醇(即PEG)。但是，應(yīng)理解其他相關(guān)聚合物也適用于本發(fā)明的實施，在這一方面，術(shù)語PEG或聚乙二醇的使用旨在包含而非排除。術(shù)語PEG包含任一形式的聚乙二醇，包括烷氧基PEG、雙功能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、分支PEG、懸掛PEG(即有一個或多個官能團(tuán)懸掛至聚合物主鏈的PEG或相關(guān)聚合物)或其中具有可降解連接的PEG。聚合物主鏈可以是線性的或分支的。分支聚合物主鏈一般為本領(lǐng)域公知。通常，分支聚合物具有一個中央分支核心部分，多條線性聚合物鏈連接至中央分支核心。通常使用PEG的分支形式，其可通過將環(huán)氧乙烷加入不同多元醇制備，如丙三醇、季戊四醇和山梨醇。中央分支部分也可從幾種氨基酸衍生，如賴氨酸。分支聚乙二醇可用通式R(-PEG-OH)m表示，其中R表示核心部分，如丙三醇或季戊四醇，m表示臂的數(shù)目。如美國專利號5，932，462(在此以其整體引入作為參考)中所述的多臂PEG分子也可用作聚合物主鏈。許多其他聚合物也適用于本發(fā)明。具有2至約300個末端的非肽且水溶性聚合物主鏈在本發(fā)明中尤其有用。適合的聚合物實例包含但不限于其他聚亞烷基二醇(如聚丙二醇("PPG")、乙二醇和丙二醇的共聚物等)、美國專利號5，629，384(在此以其整體引入作為參考)中所述的聚(氧乙基化多元醇)、聚烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚a-羥酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)及其共聚物、三聚物和混合物。雖然聚合物主鏈每一條鏈的分子量可能不同，但其一般在從約100Da至約100，000Da的范圍內(nèi)，通常從約6，000Da至約80，000Da。本文在對患者施用肽藥物的上下文中所用的"曲線下面積"或"AUC"的定義是曲線下總面積，所述曲線描述了作為從O至無窮的時間的函數(shù)的患者體循環(huán)中的藥物濃度。如本文在對患者施用肽類藥物的內(nèi)容中所用，術(shù)語"半衰期"或"tl/2"定義為患者的藥物血漿濃度降低一半所需的時間。依據(jù)多種清除機(jī)制、重新分布及其他本領(lǐng)域公知的機(jī)制，與肽類藥物相關(guān)的半衰期可能不止一個。通常這樣定義a和|3半衰期，a期與重新分布相關(guān)，P期與清除相關(guān)。但是，對其大部分限制于血流中的蛋白質(zhì)藥物，至少可能有兩個清除半衰期。對一些糖基化的肽，可能通過巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上識別末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或巖藻糖的受體介導(dǎo)快速的13期清除。較慢的13期清除可通過對有效半徑小于2nm(大約68kD)的分子的腎小球濾過作用和/或組織內(nèi)的特異性或非特異性吸收和代謝發(fā)生。糖聚乙二醇化可封閉末端糖(如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)，從而阻斷通過識別這些糖的受體的快速a期清除?？赡苓€賦以更大的有效半徑，從而降低分布容量和組織吸收，從而延長隨后的P期。因此，如本領(lǐng)域公知，糖聚乙二醇化對a期和|3期半衰期的精確影響可依據(jù)尺寸、糖基化狀態(tài)及其他參數(shù)而不同。"半衰期"的進(jìn)一步解釋見于PharmaceuticalBiotechnology(1997，DFACro騰lin禾卩RDSindelar編輯，Har罰d出版社，阿姆斯特丹，101頁-120頁)。本文所用術(shù)語"糖結(jié)合"指酶介導(dǎo)的經(jīng)修飾的糖種類與多肽(如本發(fā)明的G-CSF肽)的氨基酸或糖殘基的結(jié)合。"糖聚乙二醇化"是"糖結(jié)合"的亞類，其中經(jīng)修飾的糖的修飾基團(tuán)是聚乙二醇及其烷基衍生物(如m-PEG)或反應(yīng)性衍生物(如H2N-PEG、H00C-PEG)。術(shù)語"大規(guī)模"和"工業(yè)規(guī)模"可互換使用，指的是一個反應(yīng)周期完成時，生產(chǎn)至少大約250mg、優(yōu)選至少大約500mg、更優(yōu)選至少大約1克糖結(jié)合物的反應(yīng)周期。本文所用術(shù)語"糖基連接基團(tuán)"指修飾基團(tuán)(如PEG部分、治療部分、生物分子)共價連接的糖殘基；糖基連接基團(tuán)將修飾基團(tuán)加入綴合物的剩余部分。在本發(fā)明的方法中，"糖基連接基團(tuán)"共價連接至糖基化或非糖基化的肽，從而將試劑連接至肽的氨基酸和/或糖殘基上。"糖基連接基團(tuán)"一般通過酶連接"經(jīng)修飾的糖"至肽的氨基酸和/或糖殘基而衍生自"經(jīng)修飾的糖"。糖基連接基團(tuán)可以是在修飾基團(tuán)-經(jīng)修飾的糖盒形成中降解(如氧化一席夫堿形成一還原)的糖衍生的結(jié)構(gòu)，或者糖基連接基團(tuán)可以是完整的。"完整的糖基連接基團(tuán)"指衍生自糖基部分的連接基團(tuán)，其中連接修飾基團(tuán)至綴合物剩余部分的糖單體未被降解，如氧化，如通過偏高碘酸鈉氧化。本發(fā)明的"完整的糖基連接基團(tuán)"可通過加入糖基單位或從親本糖結(jié)構(gòu)中去除一個或多個糖基單位而衍生自天然存在的寡糖。本文所用術(shù)語"靶向部分"指選擇性地定位至身體特定組織或區(qū)域的種類。定位由分子決定簇的特異識別、靶向試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等介導(dǎo)。將試劑靶向特定組織或區(qū)域的其他機(jī)制為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。示例性靶向部分包含抗體、抗體片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、HS糖蛋白、凝血因子、血清蛋白質(zhì)、P-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。本文所用"治療部分"指對治療有用的任一試劑，包含但不限于抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒素和放射性試劑。"治療部分"包含生物活性劑前體藥物、有一個以上治療部分結(jié)合至載體的構(gòu)建體，如多價試劑。治療部分還包含蛋白質(zhì)和包含蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。示例性蛋白質(zhì)包括但不限于粒細(xì)胞集落剌激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GMCSF)、干擾素(如干擾素-a、-!3、-Y)、白細(xì)胞介素(如白細(xì)胞介素II)、血清蛋白質(zhì)(如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)和抗體融合蛋白質(zhì)(如腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白質(zhì))。本文所用"藥物可接受的載體"包含與綴合物組合時保持綴合物的活性且不與受試者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任一物質(zhì)。實例包含但不限于任一標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，如磷酸緩沖鹽溶液、水、乳劑(如油/水乳劑)和各種類型的濕潤劑。其他載體還可包括無菌溶液、片劑(包括包衣片劑)和膠囊。這些載體一般包含賦形劑，如淀粉、奶、糖、某種類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物脂或油、樹膠、二元醇或其他已知賦形劑。這些載體可以也包括味道和顏色添加劑或其他成分。通過眾所周知的常規(guī)方法配制包含這些載體的組合物。本文所用"給藥"指對受試者口服給藥；作為栓劑給藥；局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、病灶內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下給藥；或植入緩釋裝置，如微型滲透泵。通過包括胃腸外和經(jīng)粘膜(如口腔、鼻腔、陰道或經(jīng)皮膚)的任一途徑給藥。胃腸外給藥包括如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、小動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)給藥。此外，為治療腫瘤而進(jìn)行注射時(如誘導(dǎo)凋亡)，可直接對腫瘤和/或腫瘤周圍的組織給藥。其他遞送方式包含但不限于使用脂質(zhì)體制劑、靜脈內(nèi)輸注、透皮貼劑等。術(shù)語"改善"或"減輕"指病理或疾病治療中任一成功的標(biāo)記，包括任一客觀或主觀參數(shù)，如癥狀的減輕、緩和或縮小，或患者身體或精神健康的改善。癥狀改善可以基于客觀或主觀參數(shù)，包括體檢和/或精神評估的結(jié)果。術(shù)語"治療"指疾病的"治療"，包括預(yù)防疾病發(fā)生于可能易感此疾病但尚未經(jīng)歷或顯示出此疾病癥狀的動物(預(yù)防性治療)、抑制疾病(減慢或阻止其發(fā)展)、提供從此疾病的癥狀或副作用中緩解(包括治標(biāo)療法)和減輕疾病(引起疾病消退)。術(shù)語"有效量"或"對...有效的量"或"治療有效量"或任一語法相當(dāng)?shù)男g(shù)語指對動物施用以治療疾病時足夠有效治療該疾病的量。術(shù)語"分離的"指一種物質(zhì)，其實質(zhì)上或基本上沒有用于生產(chǎn)該物質(zhì)的成分。對本發(fā)明的肽綴合物，術(shù)語"分離的"指一種物質(zhì)，其實質(zhì)上或基本上沒有用于生產(chǎn)肽綴合物的混合物中通常伴隨該物質(zhì)的成分。"分離的"和"純化的"可互換使用。通常，本發(fā)明的分離的肽綴合物具有優(yōu)選表示為一個范圍的純度水平。純度范圍的下端為約60%、約70%或約80%，純度范圍的上端為約70%、約80%、約90%或高于約90%。肽綴合物高于約90%純時，其純度也優(yōu)選表示為一個范圍。純度范圍的下端為約90%、約92%、約94%、約96%或約98%。純度范圍的上端為約92%、約94%、約96%、約98%或約100%純度。通過任一本領(lǐng)域公知的分析方法測定純度(如銀染凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳上的帶強(qiáng)度、HPLC或類似方法)。本文所用術(shù)語"群體的基本上每一成員"描述本發(fā)明的肽綴合物群體的特征，其中加入肽的選定百分比的經(jīng)修飾的糖加入至該肽的多個相同的受體位點。"群體的基本上每一成員"表達(dá)了綴合到經(jīng)修飾的糖的肽上位點的"同質(zhì)性"，并且指本發(fā)明的綴合物，其為至少約80%、優(yōu)選至少約90%及更優(yōu)選至少約95%同質(zhì)。"同質(zhì)性"指經(jīng)修飾的糖結(jié)合的受體部分群體中的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在本發(fā)明的肽綴合物中，當(dāng)每一經(jīng)修飾的糖部分結(jié)合至受體位點，該受體位點與其他每一經(jīng)修飾的糖結(jié)合的受體位點具有相同的結(jié)構(gòu)時，稱肽綴合物約100%同質(zhì)。同質(zhì)性一般表示為一個范圍。肽綴合物同質(zhì)性范圍的下端為約60%、約70%或約80%，純度范圍的上端為約70%、約80%、約90%或高于約90%。當(dāng)肽綴合物高于或等于約90%同質(zhì)時，其同質(zhì)性也優(yōu)選表示為一個范圍。同質(zhì)性范圍的下端為約90%、約92%、約94%、約96%或約98%。純度范圍的上端為約93%、約94%、約96%、約98%或約100%同質(zhì)性。一般通過一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測定肽綴合物的純度，如液相色譜_質(zhì)譜(LC-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)量飛行時間質(zhì)譜(MALDIT0F)、毛細(xì)管電泳等。當(dāng)提及糖肽種類時，"基本均一的糖形"或"基本均一的糖基化模式"指被目的糖基轉(zhuǎn)移酶(如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)糖基化的受體部分的百分比。例如，在a1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，若基本所有(按下文定義)本發(fā)明的肽綴合物中的GaiPl，4-GlcNAc-R及其唾液酸化類似物均被巖藻糖基化，則存在基本均一的巖藻糖基化模式。本文所述的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)uc-GlcNAc連接一般為a1，6或a1，3，一般優(yōu)選a1，6。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，原料中可能包含糖基化的受體部分(如巖藻糖基化的GaiP1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算的糖基化百分?jǐn)?shù)應(yīng)包含通過本發(fā)明的方法糖基化的受體部分以及原料中已經(jīng)糖基化的那些受體部分。上一定義"基本均一"中的術(shù)語"基本"一般指特定糖基轉(zhuǎn)移酶的受體部分至少約40%、至少約70%、至少約80%或更優(yōu)選至少約90%和更優(yōu)選至少約95%被糖基化。通過從左至右書寫的常規(guī)化學(xué)式指定取代基時，其等同地包含了從右至左書寫該結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的化學(xué)上相同的取代基，如_CH20-旨在還表示_0CH2-。除非另有說明，術(shù)語"烷基"本身或作為另一取代基的部分指具有指定數(shù)目的碳原子(即C「Q。指1至10個碳原子)的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，其可以是完全飽和、單不飽和或多不飽和的，并且可包含二價和多價基。飽和烴基的實例包括但不限于諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、環(huán)丙基甲基的基團(tuán)；(如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或異構(gòu)體。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的基團(tuán)。不飽和烷基的實例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2_異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4_戊二烯基)、乙炔基、1_丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基及高級同系物和異構(gòu)體。除非另有說明，術(shù)語"烷基"還意在包括下文更詳細(xì)定義的烷基衍生物，如"雜烷基"。限于烴基的烷基稱為"純烷基"。術(shù)語"亞烷基"本身或作為另一取代基的部分指衍生自烷烴的二價基，以-CH^H^H^H廠為示例但不限于其，還包含下述"雜亞烷基"基團(tuán)。通常，烷基(或亞烷基)具有l(wèi)-24個碳原子，本發(fā)明中優(yōu)選具有IO個或以下碳原子的基團(tuán)。"低級烷基"或"低級亞烷基"是較短鏈的烷基或亞烷基，一般具有8個或以下的碳原子。術(shù)語"烷氧基"、"烷氨基"和"烷硫基"(或硫代烷氧基)以其常規(guī)意義使用，指那些分別通過氧原子、氨基或硫原子連接至分子的剩余部分的烷基。除非另有說明，術(shù)語"雜烷基"本身或與另一術(shù)語組合指由所述數(shù)目的碳原子和至少一種選自0、N、Si和S的原子組成的穩(wěn)定的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，其中氮和硫原子可任選地被氧化，氮雜原子可任選地被季銨化。雜原子0、N、S和Si可位于雜烷基的任一內(nèi)部位置，或位于烷基連接至分子剩余部分的位置。實例包括但不限于_CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)_CH3、-CH2-S_CH2-CH3、_CH2_CH2，_S(0)_CH3、_CH2-CH2_S(0)2_CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2_CH=N-OCH^P-CH=CH_N(CH3)_CH3。兩個以上的雜原子可以是連續(xù)的，如_CH2-NH-0CH3和-CH2-0-Si(CH3)3。類似地，術(shù)語"雜亞烷基"本身或作為另一取代基的部分指衍生自雜烷基的二價基，以-CH廠CH廠S-CH廠CH廠和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-為示例但不限于其。對雜亞烷基，雜原子也可占據(jù)鏈末端的任一個或兩個(如亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷氨基、亞烷二氨基等)。此外，對亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)通式的書寫方向不隱含連接基團(tuán)的方向。例如，通式-C(0^R'-代表了-C(0^R'-和-R'C(0)2-。除非另有說明，術(shù)語"環(huán)烷基"和"雜環(huán)烷基"本身或與其他術(shù)語組合分別表示"烷基"和"雜烷基"的環(huán)狀類型。此外，對雜環(huán)烷基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)連接至分子剩余部分的位置。環(huán)烷基的實例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、l-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實例包括但不限于1_(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等。除非另有說明，術(shù)語"鹵"或"鹵素"本身或作為另一取代基的部分指氟、氯、溴或碘原子。此外，如"鹵烷基"的術(shù)語意在包含單鹵烷基和多鹵烷基。例如，術(shù)語"鹵(Q-Q)烷基"包括但不限于三氟甲基、2，2，2_三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。除非另有說明，術(shù)語"芳基"指多不飽和的芳族取代基，其可以是單環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選1至3環(huán))，多環(huán)稠合在一起或共價連接。術(shù)語"雜芳基"指包含1-4個選自N、0和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子任選地被氧化，氮原子任選地被季銨化。雜芳基可通過雜原子連接至分子的剩余部分。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基u-萘基、2_萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、妣嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-妣啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-噴哚基、1_異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹噁啉基、5-喹噁啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氫苯并[1，4]二噁烯-6-基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。上述每一芳基或雜芳基環(huán)系統(tǒng)的取代基選自下述可接受的取代基組。為簡化，術(shù)語"芳基"與其他術(shù)語(如芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)組合使用時包括以上定義的芳基和雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語"芳烷基"意在包括其中芳基連接至烷基的那些基團(tuán)(如苯甲基、苯乙基、妣啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)被(如)氧原子取代的烷基(如苯氧基甲基、2_吡咯氧基甲基、3-(l-萘氧基)丙基等)。上述每一術(shù)語(如"烷基"、"雜烷基"、"芳基"和"雜芳基")意在包括所示基團(tuán)的取代及非取代形式。下文給出了每種基團(tuán)的優(yōu)選取代基。烷基和雜烷基的取代基(包括常稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的基團(tuán))一般稱為"烷基取代基"，其可以是選自以下多個組但不限于這些組的一種或多種:_0R，、=0、=NR，、=N-0R，、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-SiR，R，，R，"、-0C(0)R，、-C(0)R，、_C02R，、-CONR，R，，、-OC(O)NR，R，，、-NR，，C(O)R，、_NR，_C(0)NR，，R，"、-NR，，C(0)2R，、-NR-C(NR，R，，R，")=NR，"，、-NR-C(NR，R，，)=NR""、-S(0)R，、-S(0)2R，、-S(0)2NR，R"、_NRS02R，、-CN禾口_冊2，數(shù)目從0至2m，+1，其中m，是這種基團(tuán)中碳原子的總數(shù)。R'、R"、R"'和R""各優(yōu)選獨立地指氫；取代的或非取代的雜烷基；取代的或非取代的芳基(如1-3個鹵素取代的芳基)；取代的或非取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包括一個以上R基團(tuán)時，每一個R基團(tuán)都獨立地選擇，如存在一個以上這些基團(tuán)時，每一個R'、R"、R"'和R""基團(tuán)一樣。當(dāng)R'和R"連接至同一個氮原子時，其可與氮原子組合形成五元、六元或七元環(huán)。例如，-NR'R"意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從以上取代基的討論中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，術(shù)語"烷基"意在包括包含結(jié)合至氫基團(tuán)外基團(tuán)的碳原子的基團(tuán)，如鹵烷基(如_CF3和_CH2CF3)和?；?如-C(0)CH3、-C(0)CF3、_C(0)CH2OCH3等)。與關(guān)于烷基取代基所述的類似，芳基和雜芳基的取代基一般稱為"芳基取代基"。取代基選自如鹵素、-OR'、二0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-SiR'R"R"'、_0C(0)R，、-C(0)R，、-C02R，、-CONR，R"、-OC(0)NR，R"、-NR"C(0)R，、_NR，_C(0)NR"R"，、_NR"C(0)2R，、-NR-C(NR，R"R"，)=NR""、-NR-C(NR，R")=NR"，、_S(0)R，，_S(0)2R，、_S(0)2NR，R"、_NRS02R'、-CN和-N02、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(Q-Q)烷氧基和氟(Q-Q)烷基，數(shù)目從O至芳環(huán)系統(tǒng)上打開的化合價的總數(shù)，其中R'、R"、R"'和R""優(yōu)選獨立地選自氫、取代的或非取代的烷基、取代的或非取代的雜烷基、取代的或非取代的芳基和取代或非取代雜芳基。例如，當(dāng)本發(fā)明的化合物包含一個以上R基時，每一個R基都獨立地選擇，如同與存在一個以上這些基團(tuán)時每一個R'、R"、R"'和R""基團(tuán)一樣。在后面的圖示中，符號X代表上述"R"。芳基或雜芳基環(huán)相鄰原子上的取代基之二可以任選地用通式-T-C(O)-(CRR')U-U-的取代基取代，其中T和U獨立地為-NR-、-0-、-CRR'-或單鍵，u為0-3的整數(shù)。備選地，芳基或雜芳基環(huán)相鄰原子上的取代基之二可以任選地用通式-A-(CH2)r_B-的取代基取代，其中A和B獨立地為-CRR'-、-0-、-NR-、_S_、_S(0)-、_S(0)2-、_S(0)2NR，-或單鍵，r為0-4的整數(shù)。這樣形成的新環(huán)的單鍵之一可以任選地用雙鍵取代。備選地，芳基或雜芳基環(huán)相鄰原子上的取代基之二可以任選地用通式-(CRR')Z-X-(CR"R"')d-的取代基取代，其中z和d獨立地為0-3的整數(shù)，X為-O-、-NR，-、-S-、-S(O)-、-S(0)2-或-S(0)2NR，-。取代基R、R'、R"和R"'優(yōu)選獨立地選自氫或取代或非取代(C「C》烷基。本文所用術(shù)語"雜原子"意在包括氧(0)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。"干細(xì)胞"指"一般的"或未分化的細(xì)胞，其可無限地產(chǎn)生自身的拷貝，可成為專門化的體內(nèi)各種組織。干細(xì)胞可生成正常血液成分，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。干細(xì)胞正常定位于骨髓內(nèi)和血液內(nèi)，可收集用于移植。術(shù)語"造血細(xì)胞"指與血細(xì)胞形成相關(guān)的細(xì)胞。此術(shù)語可與以上定義的術(shù)語"干細(xì)胞"互換使用。本文所用術(shù)語"動員干細(xì)胞產(chǎn)生"意在包括在體內(nèi)或體外增加干細(xì)胞數(shù)目的所有方法。干細(xì)胞數(shù)目的增加可以是祖細(xì)胞數(shù)目增加的結(jié)果。此術(shù)語還包括將干細(xì)胞輸入和輸出骨髓的方法。類似地，術(shù)語"動員造血細(xì)胞產(chǎn)生"意在包括在體內(nèi)或體外增加造血細(xì)胞數(shù)目的所有方法。造血細(xì)胞數(shù)目的增加可以是祖細(xì)胞數(shù)目增加、多能干細(xì)胞成熟為造血細(xì)胞的速率增加和其某種組合的結(jié)果。此術(shù)語還包括將造血細(xì)胞輸入和輸出骨髓的方法。術(shù)語"粒細(xì)胞"指以細(xì)胞質(zhì)中存在顆粒為特征的白細(xì)胞。引言本發(fā)明包括施用糖聚乙二醇化G-CSF以預(yù)防、減輕和治療造血缺陷相關(guān)病癥和疾病的方法，所述造血缺陷常由化學(xué)療法、放射療法和血小板減少引起。G-CSF主要作用于骨髓來增加炎癥白細(xì)胞的產(chǎn)生，并進(jìn)一步作為內(nèi)分泌激素起始炎癥功能中消耗的嗜中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充。G-CSF還在化學(xué)療法后的骨髓替換中具有臨床應(yīng)用。本發(fā)明提供包含粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)的綴合物。本發(fā)明還包括包含具有粒細(xì)胞集落剌激活性的糖基化和非糖基化肽的綴合物。綴合物可以通過進(jìn)一步與如治療部分、診斷部分、靶向部分等的多種種類結(jié)合而額外地修飾。對本文所述G-CSF綴合物而言，聚合的修飾基團(tuán)可在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽，優(yōu)選通過糖基連接基團(tuán)。在示例性實施方案中，聚合的修飾基團(tuán)為水溶性聚合物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，水溶性聚合物為聚乙二醇。在示例性實施方案中，為了預(yù)防經(jīng)歷放射療法、化學(xué)療法和骨髓移植的癌癥患者感染，可以對患者施用本發(fā)明的G-CSF肽，以在外周血祖細(xì)胞移植中動員祖細(xì)胞進(jìn)行收集，進(jìn)行嚴(yán)重的慢性或相對白細(xì)胞減少癥(不考慮病因)治療和支持患急性髓細(xì)胞樣白血病的患者的治療。此外，本發(fā)明的多肽綴合物或組合物可以用于艾滋病或其他免疫缺陷疾病，以及細(xì)菌感染、心臟病和甲型、乙型及丙型肝炎的治療。在一個實施方案中，可以對受試者施用本發(fā)明的G-CSF肽綴合物，以增加造血作19用。造血作用是祖細(xì)胞發(fā)育為成熟血細(xì)胞(包含紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板)的過程。正常的造血作用通過包括如集落剌激因子的糖蛋白的多種調(diào)節(jié)物協(xié)調(diào)。這些調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)祖細(xì)胞和前體細(xì)胞的存活、增殖和分化，以及成熟細(xì)胞的活性狀態(tài)。造血作用減弱時，結(jié)果是血細(xì)胞和血小板產(chǎn)生減少，導(dǎo)致免疫力減弱，不能從創(chuàng)傷和感染痊愈。本發(fā)明提供剌激受試者造血作用的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括對受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物?！矫?，剌激造血作用包括增加受試者造血祖細(xì)胞的數(shù)目，結(jié)果使成熟造血細(xì)胞(血細(xì)胞)的數(shù)目也增加。造血祖細(xì)胞移動至并保留于骨髓內(nèi)，其可在此成熟為紅細(xì)胞和白細(xì)胞。本發(fā)明剌激造血祖細(xì)胞數(shù)目的方法包括對受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。在一個實施方案中，通過肽的應(yīng)用所增加的造血祖細(xì)胞為CD34+細(xì)胞。骨髓抑制骨髓抑制是血細(xì)胞產(chǎn)生的減少。正常血液包含大量細(xì)胞，包括攜氧的紅細(xì)胞和對抗感染的白細(xì)胞。正常血液還包含血小板，其是起始血液凝固的微小的細(xì)胞碎片。這些細(xì)胞和碎片在骨髓內(nèi)生成，骨髓是見于一些骨骼中央的物質(zhì)。健康骨髓每天生成大量的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。在骨髓抑制下，骨髓生成的這些細(xì)胞太少。本發(fā)明提供治療、減輕和預(yù)防骨髓抑制的方法和組合物。骨髓抑制的一個特征是受試者白細(xì)胞產(chǎn)生減弱。這種白細(xì)胞產(chǎn)生減弱可以由某種治療引起，尤其是癌癥治療，如化學(xué)療法和放射療法。白細(xì)胞產(chǎn)生減弱還可以是疾病的結(jié)果，如原發(fā)性血小板減少性紫癜。一方面，本發(fā)明的綴合物用來治療和改善以白細(xì)胞產(chǎn)生減弱為特征的疾病。骨髓抑制引起的疾病包括嗜中性白細(xì)胞減少癥(包括發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥)和血小板減少癥。嗜中性白細(xì)胞減少癥是以血液中嗜中性粒細(xì)胞(最常見的白細(xì)胞類型)數(shù)目的異常減少為特征的疾病。減少可以是相對的或絕對的。一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法。這些方法包括施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的G-CSF綴合物的步驟。已顯示G-CSF影響成年癌癥患者的發(fā)熱性嗜中性粒細(xì)胞減少和死亡率(Kuderer等人，J.Clin.One.(2007)，25(21):3158-67)。血小板減少癥是血液中血小板數(shù)目異常地低并通常伴隨著異常出血的疾病。本發(fā)明的方法包括治療哺乳動物血小板減少癥。這些方法包括施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的G-CSF綴合物的步驟。如本文所用，術(shù)語血小板減少癥包括病因已知的疾病及原發(fā)性血小板減少癥。本文也將血小板減少癥和原發(fā)性血小板減少癥稱為"血小板減少性紫癜"和"原發(fā)性血小板減少性紫癜"。干細(xì)胞動員對抗骨髓抑制的一種途徑是動員干細(xì)胞產(chǎn)生。動員干細(xì)胞產(chǎn)生包括增加干細(xì)胞的數(shù)目，包括造血祖細(xì)胞的數(shù)目和粒細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)的數(shù)目。動員干細(xì)胞產(chǎn)生還包括增加干細(xì)胞從骨髓向外周血的輸送。這種動員的目的是從供體收集干細(xì)胞，因為外周血比骨髓更易于接近。一方面，本發(fā)明提供動員受試者干細(xì)胞產(chǎn)生的方法。另一方面，通過動員受試者造血祖細(xì)胞，使用本發(fā)明的方法和組合物預(yù)防、減輕和治療骨髓抑制。動員造血祖細(xì)胞包括增加造血祖細(xì)胞的數(shù)目及增加細(xì)胞至骨髓和從骨髓向外的輸送。造血祖細(xì)胞(如CD34+細(xì)胞)成熟和分化為血液成分，即紅細(xì)胞和白細(xì)胞。本發(fā)明提供動員受試者中造血祖細(xì)胞的方法，其包括對受試者施用以下組合物的步驟(i)包含式(l)l，l'-[1，4-亞苯基-雙-(亞甲基)-雙-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(AMD3100)的化合物的第一種組合物，和(2)包含肽的第二種組合物，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。在一個實施方案中，按任一順序順序地對受試者施用第一種組合物和第二種組合物。在另一實施方案中，第一種組合物和第二種組合物同時施用。在一個實施方案中，兩種組合物均經(jīng)皮下對受試者施用。AMD3100是bicyclam衍生物，已顯示其在正常受試者和癌癥患者中均可動員巨大數(shù)目的CD34+細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)(Liles等人，Blood，(2003)，102:2728-30;Devine等人，J.Clin.Oncol.，(2004)，22:1095-1102)。研究顯示，AMD3100與G-CSF的非糖基化形式組合可比單獨施用G-CSF動員更高數(shù)目的CD34+細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)(Flomenberg等人，Blood，(2005)，106(5):1867-1874)。在一個實施方案中，動員即將作為骨髓或造血細(xì)胞供體的受試者的干細(xì)胞產(chǎn)生。按以上所述將肽綴合物提供給供體。供體的干細(xì)胞數(shù)目增加，并被動員從骨髓移動至外周血。然后易于通過本領(lǐng)域公知的方法從供體分離這些細(xì)胞。這種實施方案中的供體可以與骨髓或造血細(xì)胞的受體相同(自體供體)，或者供體可以是非受體受試者(異體供體)。另一方面，本發(fā)明的肽綴合物與至少一種化療劑組合提供。骨髓移植在一些方面，本發(fā)明提供動員骨髓移植受體中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法和組合物。這些方法包括對受體施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。在一個實施方案中，聚合的修飾基團(tuán)是水溶性聚合物，其可優(yōu)選通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽?？梢栽诠撬枰浦睬?、骨髓移植后或移植的同時對受體施用肽。長期植入對成功的移植很重要。術(shù)語"植入"指輸入或移植入的供體干細(xì)胞歸巢至受體的骨髓并產(chǎn)生所有類型的血細(xì)胞的過程。干細(xì)胞移植后，新的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板開始在受體的血液中出現(xiàn)時植入首次明顯。長期植入指輸入或植入的供體細(xì)胞不受受體免疫系統(tǒng)排斥，長期保留于受體骨髓內(nèi)并產(chǎn)生血細(xì)胞的過程。在移植物中包含中期和晚期的祖細(xì)胞可加速供體來源的成熟細(xì)胞的產(chǎn)生和支持植入過程。相應(yīng)地，本發(fā)明提供增強(qiáng)提供給受體的骨髓的長期植入的方法和組合物。在一示例性實施方案中，在骨髓移植前對供體施用本發(fā)明的肽。肽增加了供體的造血作用，尤其是增加了祖細(xì)胞的數(shù)目，其在骨髓和/或造血細(xì)胞植入受體時增加了植入的成功率和壽命。移植的骨髓可以是受體自身的骨髓(自體)，或者骨髓可以從相同物種的供體移植(異體)。在另一實施方案中，對骨髓移植受體施用本發(fā)明的肽，以增強(qiáng)供給的骨髓(不論骨髓來自受體自身或來自另一個體)的長期植入。對受體應(yīng)用肽可增加受體的造血作用，從而通過剌激供給的骨髓增加造血祖細(xì)胞的產(chǎn)生來增強(qiáng)植入。造血細(xì)胞移植造血細(xì)胞移植是多種遺傳或惡性疾病共同的治療方法。一些移植操作利用整個骨髓群體，而另一些操作利用更確定的群體富集干細(xì)胞。除骨髓外，這種細(xì)胞可從其他來源獲得，如外周血和新生兒臍帶血。使用外周血干細(xì)胞的一個優(yōu)點是，這些細(xì)胞在外周血中比在骨髓中易于接近。但是，外周血干細(xì)胞移植的限制因素是循環(huán)多能干/祖細(xì)胞數(shù)量少。因此，需要離體擴(kuò)大干細(xì)胞以用于移植。因此，本發(fā)明提供擴(kuò)大造血細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。這種方法包括在示例性實施方案中對造血細(xì)胞培養(yǎng)物施用有效量的本發(fā)明的肽。這種肽將在示例性實施方案中是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的綴合物。在一個實施方案中，聚合的修飾基團(tuán)為水溶性聚合物，其可優(yōu)選通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，該方法提供擴(kuò)大的干細(xì)胞及祖細(xì)胞群體(其可用于移植)。這些方法包括對干細(xì)胞培養(yǎng)物施用有效量的本發(fā)明的肽的步驟。器官移植與骨髓移植類似，實體器官移植(如肝臟、腎臟、心臟和肺)可引起受體的許多免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)可導(dǎo)致這些移植物的急性排斥。G-CSF及其他造血生長因子可用于治療這種反應(yīng)(美國專利號5，718，893)。相應(yīng)地，本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù)防或減少患者中器官移植急性排斥的發(fā)生。心臟病在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于減輕心臟病和改善心臟功能。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于剌激血管形成干細(xì)胞的釋放。G-CSF治療可減少心臟病患者的心絞痛，所述患者包括已經(jīng)歷多次手術(shù)和使用最大劑量的常規(guī)藥物的患者(見如MedicalNewsToday，2007年6月4日，"SevereHeartDiseasePatientsOfferedNewHope")。其他研究顯示，即使心肌已為心臟病所損傷，G_CSF也可挽救和保護(hù)心肌，防止這些肌肉死亡(見如SundayTelegraphNews,2007年8月5日，"OurWorld-firstheartsthatR印airThemselves")。G-CSF單獨或與來自患者的成體干細(xì)胞組合可以作為一種療法來修復(fù)心臟的壞死組織和產(chǎn)生新的血管。神經(jīng)疾病在一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療神經(jīng)疾病，包括但不限于阿爾茨海默氏病及其他退化性腦功能障礙。阿爾茨海默氏病的小鼠模型中的研究顯示，G-CSF可逆轉(zhuǎn)這些模型中的阿爾茨海默樣癥狀(見Tsai等人，(2007)，J.E鄧.Med.204(6):1273-80)。這些研究表明，向血流中注射G-CSF可促進(jìn)造血干細(xì)胞從骨髓釋放。這些干細(xì)胞從血流進(jìn)入腦，附著至腦中的損傷位點并分化為新細(xì)胞。G-CSF的應(yīng)用引起新細(xì)胞在神經(jīng)元損傷最嚴(yán)重的部位生長。G-CSF綴合物根據(jù)上述任一方法，肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物。聚合的修飾基團(tuán)可優(yōu)選通過糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽。在一個實施方案中，糖基連接基團(tuán)是完整的糖基連接基團(tuán)。在優(yōu)選實施方案中，聚合的修飾基團(tuán)和糖基連接基團(tuán)通過連接體連接。在示例性實施方案中，聚合的修飾基團(tuán)為水溶性聚合物，如聚乙二醇。G-CSF已被克隆和測序。在示例性實施方案中，G-CSF具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。技術(shù)人員可容易地理解，本發(fā)明不限于本文所描述的序列。本發(fā)明還包含本領(lǐng)域公知的G-CSF變體。作為實例，但不以任何方式意在限制本發(fā)明，美國專利號6，166，183中描述了G-CSF變體，其中描述了包含賴氨酸殘基的天然補(bǔ)充并進(jìn)一步連接至一個或兩個聚乙二醇分子的G-CSF。此外，美國專利號6，004，548，5，580，755，5，582，823和5，676，941描述了G-CSF變體，其中17、36、42、64和74位的半胱氨酸殘基中的一個或多個為丙氨酸或備選地為絲氨酸所取代。美國專利號5，416，195描述了G-CSF分子，其中17位的半胱氨酸、27位的天冬氨酸、65位和66位的絲氨酸分別為絲氨酸、絲氨酸、脯氨酸和脯氨酸所取代。其他變體為本領(lǐng)域公知，并描述于(如)美國專利號5，399，345。其他變體具有選自SEQIDNo:3-11的氨基酸。本發(fā)明的經(jīng)修飾的G-CSF分子的表達(dá)和活性可用本領(lǐng)域公知和描述于(如)美國專利號4，810，643中的方法測定。作為實例，活性可用放射標(biāo)記的胸苷吸收測定法測定。簡言之，用Ficoll-Hypaque(l.077g/ml，Pharmacia,Piscataway，NJ)對來自健康供體的人骨髓進(jìn)行密度分離，低密度細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Iscove培養(yǎng)基(GIBCO，LaJolla，CA)。將2X104個人骨髓細(xì)胞與對照培養(yǎng)基或本發(fā)明的G-CSF置于96孔平底板中，于37t:、空氣中含5%C02的條件下孵育大約2天。然后用0.5yCi/孔的3H_胸苷(NewEnglandNuclear,Boston,Mass.)脈沖培養(yǎng)物約4小時，按(如)Ventua等人(1983，Blood61:781)中所述測定吸收。與用對照化合物處理的骨髓細(xì)胞相比，摻入人骨髓細(xì)胞中的3H_胸苷的增加表明是有活性和可行的G-CSF化合物。本發(fā)明的綴合物是通過酶連接經(jīng)修飾的糖至糖基化或非糖基化的G-CSF肽形成的。當(dāng)嵌入G-CSF肽和糖上的修飾基團(tuán)間時，經(jīng)修飾的糖成為在本文中可稱為的(如)"完整的糖基連接基團(tuán)"。通過如糖基轉(zhuǎn)移酶的酶的精密的選擇性，本發(fā)明提供在一個或多個特異性位置處具有想要的基團(tuán)的肽。因此，根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)修飾的糖直接連接至G-CSF肽鏈上的選定部位或，備選地，經(jīng)修飾的糖附加至糖蛋白的糖部分。這樣的肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中經(jīng)修飾的糖同時結(jié)合至糖肽碳水化合物并直接結(jié)合至G-CSF肽主鏈的氨基酸殘基上。與已知的化學(xué)和酶學(xué)肽加工策略不同，用本發(fā)明的方法可能組裝具有基本同質(zhì)的衍生模式的肽和糖肽；本發(fā)明使用的酶一般對G-CSF肽的特定氨基酸殘基或氨基酸殘基組合有選擇性。這種方法也可用于經(jīng)修飾的肽和糖肽的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的方法為具有預(yù)先選定的一致衍生模式的糖肽的大規(guī)模制備提供了實際的手段。此方法尤其適用于治療性肽的修飾，所述肽包括但不限于在培養(yǎng)細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因植物或動物生產(chǎn)中被不完全糖基化的糖肽。本發(fā)明還提供糖基化和非糖基化G-CSF肽的綴合物，由于(如)清除率降低或免疫或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吸收率降低，所述綴合物的治療半衰期增加。此外，本發(fā)明的方法提供掩蔽肽上的抗原決定簇、從而降低或消除宿主針對該肽的宿主免疫反應(yīng)的手段。靶向試劑的選擇性連接還可將肽靶向?qū)μ囟ò邢蛟噭┯刑禺愋缘奶囟ńM織或細(xì)胞表面受體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供選定修飾基團(tuán)和G-CSF肽間的綴合物。肽和修飾部分間的連接包括嵌入肽和選定部分間的糖基連接基團(tuán)。如本文所討論，選定的修飾部分基本上是可連接至糖單位導(dǎo)致形成可被適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶識別的"經(jīng)修飾的糖"的任一種類，所述轉(zhuǎn)移酶將經(jīng)修飾的糖附加至肽或?qū)⑻腔鶜埢B接至肽。當(dāng)嵌入肽和選定部分間時，經(jīng)修飾的糖的糖成分成為"糖基連接基團(tuán)"，如"完整的糖基連基團(tuán)"。糖基連接基團(tuán)形成自任一單糖或寡糖，經(jīng)修飾基團(tuán)修飾后，其是酶的底物，所述酶將經(jīng)修飾的糖加入肽的氨基酸或糖殘基。糖基連接基團(tuán)可以是(或可包括)在修飾基團(tuán)加入前或加入中經(jīng)降解性修飾的糖部分。例如，糖基連接基團(tuán)可衍生自糖殘基，所述糖殘基是氧化降解完整的糖成為對應(yīng)的醛(如通過偏高碘酸的作用)、隨后轉(zhuǎn)化為具有適當(dāng)胺的席夫堿(其隨后還原為對應(yīng)的胺)產(chǎn)生的。本發(fā)明的綴合物通常對應(yīng)于一般結(jié)構(gòu)其中符號a、b、c、d和S代表正的非0整數(shù)；t為0或正整數(shù)。"試劑"一般為水溶性部分，如PEG部分。連接體可以是一系列連接基團(tuán)中的任一種(下文)。備選地，連接體可以是單鍵或"零級連接體"。如本文所進(jìn)一步討論，修飾基團(tuán)可以包括可連接至糖單位的任一種類。這種基團(tuán)包括聚合物(包括水溶性和非水溶性聚合物)，還可包括治療部分、診斷部分、耙向部分、毒素部分等。在示例性實施方案中，選定的修飾基團(tuán)為水溶性聚合物，如m-PEG。水溶性聚合物通過糖基連接基團(tuán)共價連接至G-CSF肽，所述糖基連接基團(tuán)共價連接至G-CSF肽的氨基酸殘基或糖殘基。本發(fā)明還提供用糖基連接基團(tuán)對其中的氨基酸殘基和糖殘基進(jìn)行了修飾的綴合物。本發(fā)明的肽包含至少一個N-或0-連接的糖基化位點。除提供通過酶加入糖基連接基團(tuán)形成的綴合物外，本發(fā)明還提供取代模式中高度同質(zhì)的綴合物。使用本發(fā)明的方法，可能形成肽綴合物，其中本發(fā)明的綴合物群體的基本所有經(jīng)修飾的糖部分都連接至結(jié)構(gòu)一致的氨基酸或糖殘基的多個拷貝。因此，一方面，本發(fā)明提供具有水溶性聚合物部分的群體的肽綴合物，所述水溶性聚合物部分通過完整的糖基連接基團(tuán)共價連接至G-CSF肽。在本發(fā)明的綴合物的示例性實施方案中，水溶性聚合物部分群體的基本每一成員都通過糖基連接基團(tuán)連接至G-CSF肽的糖殘基，糖基連接基團(tuán)連接的G-CSF肽的每一糖殘基都具有相同的結(jié)構(gòu)。還提供肽綴合物，其具有通過糖基連接基團(tuán)共價連接至肽的水溶性聚合物部分的群體。在一個實施方案中，水溶性聚合物部分群體的基本每一成員都通過糖基連接基團(tuán)結(jié)合至G-CSF肽的氨基酸殘基，糖基連接基團(tuán)連接的每一氨基酸殘基都具有相同的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供類似于上述綴合物的綴合物，其中G-CSF肽通過完整的糖基連接基團(tuán)綴合治療部分、診斷部分、耙向部分、毒素部分等。上述部分的每一個可以是小分子、天然聚合物(如多肽)或合成聚合物。經(jīng)修飾的糖本發(fā)明提供經(jīng)修飾的糖、經(jīng)修飾的糖核苷酸和經(jīng)修飾的糖的綴合物。在本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖化合物中，糖部分優(yōu)選為糖、脫氧糖、氨基糖或N-?；?。術(shù)語"糖"及其同等詞、"糖基"、"糖"指單體、二聚體、寡聚體和多聚體。糖部分也用修飾基團(tuán)官能化。修飾基團(tuán)一般通過與糖上的的胺、巰基或羥基(如伯羥基)部分綴合而綴合至糖部分。在示例性實施方案中，修飾基團(tuán)通過糖上的胺部分連接，如通過胺與修飾基團(tuán)的反應(yīng)性衍生物反應(yīng)形成的酰胺、氨基甲酸乙酯或尿素。任一糖均可用作本發(fā)明綴合物的糖核心。在形成本發(fā)明的組合物中有用的示例性糖核心包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖，如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺類似物等。糖核心可以是天然結(jié)構(gòu)，或其可經(jīng)修飾以提供結(jié)合修飾基團(tuán)的位點。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含唾液酸衍生物的肽綴合物，所述唾液酸衍生物中的9-羥基部分被胺取代。用選定修飾基團(tuán)的活化類似物易于衍生胺。糖某連接某團(tuán)根據(jù)上述任一方法的肽綴合物，肽綴合物的一些實施方案包含糖基連接基團(tuán)，其是唾液酸殘基。G-CSF肽和選定部分(如水溶性聚合物)間的連接包括插入肽和選定部分間的完整的糖基連接基團(tuán)。如本文討論，選定部分基本上是可連接至糖單位形成可被適當(dāng)轉(zhuǎn)移酶(其將經(jīng)修飾的糖附加至G-CSF肽)識別的"經(jīng)修飾的糖"的任一類型。當(dāng)插入G-CSF肽和選定部分間時，經(jīng)修飾的糖的糖成分成為"完整的糖基連接基團(tuán)"。糖基連接基團(tuán)形成自任一單糖或寡糖，其經(jīng)選定部分修飾后是適當(dāng)轉(zhuǎn)移酶的底物。在一個實施方案中，糖基連接基團(tuán)為具有以下通式結(jié)構(gòu)的唾液酸殘基其中R為水溶性聚合物，水溶性聚合物通過所述連接體連接至唾液酸殘基在另一實施方案中，糖基連接基團(tuán)是具有以下通式的唾液酸殘基其中n為1-2000的整數(shù)。在另一實施方案中，糖基連接基團(tuán)包含具有以下通式的經(jīng)修飾的唾液酸殘基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中R2為H、CH20R7、C00R7或OR7其中R7代表H、取代或未取代烷基、或取代或未取代雜烷基；R3和R4為獨立地選自H、取代或未取代烷基、0R8、NHC(0)R9的成員其中R8和RS獨立地選自H、取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基或唾液酸；La為選自鍵、取代或未取代烷基和取代或未取代雜烷基的連接體；R16和R17為獨立選擇的聚合物臂；X2和X4為獨立地選擇的連接聚合物部分R16和R17至C的連接片段；XS為非反應(yīng)性基團(tuán)。在另一實施方案中，氨基酸殘基是選自絲氨酸或蘇氨酸的成員。在另一實施方案中，氨基酸殘基是SEQ.ID.N0:1的133位蘇氨酸。在一個實施方案中，糖基連接基團(tuán)包含選自以下的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中R15為經(jīng)修飾的唾液酸殘基；禾口p為l-10的整數(shù)。在另一實施方案中，糖基連接基團(tuán)具有選自以下的通式(Fuc)tMan—(GlcNAc—Gal)p—R15-GlcNAc—GlcNAc—Man(Fuc)tManAA—GlcNAc——GlcNAc—ManI化.Man-(GlcNAc—Gal)p—R15(Fuc)tMan——(GlcNAc—Gal)p—R15,AA—GlcNAc—GlcNAc—Man^Jv^Man-(GlcNAc—Gal)p—R15'Man——(GlcNAc—Gal)p—R15,T(Fuc)tIAA—GlcNAc—GlcNAc—Man—(GlcNAc—Gal)p—R15'Man——(GlcNAc—Gal)p—R15'GlcNAc—Gal)p_r15'"an——(GlcNAc—Gal)p—R15'(Fuc)tAa—GlcNAc—GlcNAc—Man—(GlcNAc—Gal)p—r15'iyian——(GlcNAc—Gal)p—R15';和'(GlcNAc—Gal)p—r15,其中AA為所述肽的氨基酸殘基；t為等于O或l的整數(shù)；p為l-10的整數(shù)；禾口R15'為選自H、OH、唾液酸、所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基和Sia-Siap的成員其中SiaP為所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基，其中至少一個R15，選自所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基和Sia-Siap。在一個實施方案中，氨基酸殘基為天冬酰胺殘基。在另一實施方案中，所述G-CSF肽包含以下通式的結(jié)構(gòu)，~Thrl34—O—GalNAc-(Gal)q—Sia—PEG其中q為0或1;Sia-PEG具有以下通式的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>其中n為1-2000的整數(shù)。在另一實施方案中，n為400-500的整數(shù)。在另一實施方案中，G-CSF肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。在隨后的討論中，通過參考選定的唾液酸衍生物的使用來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)可，討論的中心是為了說明的明晰性，所述結(jié)構(gòu)和組合物一般適用于各種糖基、經(jīng)修飾的糖基、活化的經(jīng)修飾糖基和經(jīng)修飾糖基的綴合物。在示例性實施方案中，本發(fā)明提供包含經(jīng)修飾的糖胺的肽綴合物，所述糖胺具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>其中G為糖基部分，L為鍵或連接體，R1為修飾基團(tuán)。示例性鍵為糖基部分的NH2和修飾基團(tuán)上具有互補(bǔ)反應(yīng)性的基團(tuán)間形成的鍵。因此，示例性鍵包括但不限于NHR、OR1、SR1等。例如，當(dāng)R1包含羧酸部分時，此部分可被激活并與糖殘基上的NH2部分偶聯(lián)，提供具有NHC(0)R1結(jié)構(gòu)的鍵。類似地，OH和SH基團(tuán)可分別轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的醚或硫醚衍生物。示例性連接體包括烷基和雜烷基部分。連接體包括連接基團(tuán)，例如基于?；倪B接基團(tuán)，如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。連接基團(tuán)是本發(fā)明的種類的成分間形成的鍵，如糖基部分和連接體(L)間、或連接體和修飾基團(tuán)(R1)間。其他連接基團(tuán)為醚、硫醚和胺。例如，在一個實施方案中，連接體為氨基酸殘基，如甘氨酸殘基。甘氨酸的羧酸部分通過與糖殘基上的胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺，甘氨酸的胺通過與活化的羧酸或修飾基團(tuán)的碳酸根反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺或氨基甲酸乙酯。另一示例性連接體為PEG部分或用氨基酸殘基官能化的PEG部分。PEG在一個PEG末端通過氨基酸殘基結(jié)合至糖基，通過另一PEG末端結(jié)合至R1。備選地，氨基酸殘基結(jié)合至R1，未連接至氨基酸的PEG末端結(jié)合至糖基。NH-L-R1的示例性種類具有通式-NH{C(0)(CH2)aNH}s{C(0)(CH2)b(0CH2CH2)c0(CH2)dN招tR、其中指數(shù)s和t獨立地為0或1。指數(shù)a、b和d獨立地為0-20的整數(shù)，c為1-2500的整數(shù)。其他類似的連接體基于這樣的種類，其中-NH部分被如-S、-0和-CH2取代。更具體地，本發(fā)明提供包含化合物的肽綴合物，所述化合物中NH-L-R1為NHC(O)(CH2)aNHC(0)(CH2)b(0CH2CH2)c0(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(0CH2CH2)c0(CH2)dNHR1、NHC(O)0(CH2)b(0CH2CH2)c0(CH2)，R1、NH(CH2)aNHC(0)(CH2)b(0CH2CH2)c0(CH2)d冊R1、NHC(0)(CH2)aN服^NH(CH》aN服1和N服1。在這些通式中，指數(shù)a、b和d為獨立地選自0_20的整數(shù)，優(yōu)選1-5。指數(shù)c為1-2500的整數(shù)。在說明性實施方案中，G為唾液酸，本發(fā)明的選定化合物具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，上述示例性化合物的唾液酸部分可用任一其他氨基糖取代，其包括但不限于葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺及它們的N-乙酰衍生物等。在另一說明性實施方案中，糖的伯羥基部分用修飾基團(tuán)官能化。例如，唾液酸的9-羥基可轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的胺并官能化以提供本發(fā)明的化合物。此實施方案的通式包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供了包含經(jīng)修飾的糖的肽綴合物，所述經(jīng)修飾的糖中的6-羥基位置轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的胺部分，其具有連接體_修飾基團(tuán)盒，如上述的那些?？捎米鬟@些經(jīng)修飾的糖的核心的示例性糖基包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。此實施方案的代表性經(jīng)修飾的糖具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>其中R3-R5和R7為獨立地選自H、0H、C(0)CH3、NH和NHC(0)CH3的成員。R6為上述0R'、NHR1或NH-L-R1。本發(fā)明的選定綴合物基于甘露糖、半乳糖或葡萄糖、或具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立體結(jié)構(gòu)的種類。這些綴合物的通式為在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供活化為對應(yīng)的核苷酸糖的上述化合物。在本發(fā)明中以其經(jīng)修飾的形式使用的示例性糖核苷酸包括核苷酸單磷酸、二磷酸或三磷酸或其類似物。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的糖核苷酸的糖核苷酸部分選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示例性實施方案中，核苷酸磷酸連接至C-1。因此，在糖基部分為唾液酸的說明性實施方案中，本發(fā)明提供用具有以下通式的化合物形成的肽綴合物■CH(OH)CH(OH)CH2NH——L'一R'NHC(0)CH3其中L-R1如上文討論，L1-!1代表連接至修飾基團(tuán)的連接體。與L一樣，L1的示例性連接體種類包括鍵、烷基或雜烷基部分。在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖和底物(如肽、脂類、糖苷配基等)間形成的綴合物，更具體地為經(jīng)修飾的糖和糖肽或糖脂的糖殘基間形成的綴合物。在此實施方案中，經(jīng)修飾的糖的糖部分成為插入底物和修飾基團(tuán)間的糖基連接基團(tuán)。示例性糖基連接基團(tuán)為完整的糖基連接基團(tuán)，其中形成連接基團(tuán)的糖基部分未被化學(xué)(如偏高碘酸鈉)或酶學(xué)方法(如氧化酶)降解。本發(fā)明的選定綴合物包含連接至氨基糖(如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修飾基團(tuán)。根據(jù)此基序的示例性修飾基團(tuán)-完整的糖基連接基團(tuán)盒基于唾液酸結(jié)構(gòu)，如具有以下通式的結(jié)構(gòu)^OH工OOH.HCT丫\、。，R1—L1—NH,丫，和CH3(0)CNH^^y^0HR1、L1和L2如上文所述。,C00H在另一示例性實施方案中，綴合物形成于底物和糖基部分的1-位之間，修飾基團(tuán)通過連接體在糖基部分的6-碳位置連接至糖基部分。因此，此實施方案的說明性綴合物具有通式""^,HN、^0、《H;和其中基團(tuán)如上文所述。技術(shù)人員應(yīng)理解，上述經(jīng)修飾的糖部分也可結(jié)合至底物的2、3、4或5位碳原子處。此實施方案的說明性化合物包括具有以下通式的化合物R'、,0、,CH2NHC(0)(CH2)aNHC(0)(CH2)bpCH2CH2)cO<CH2)。NHR，R7、70、7CH2NHC(。)(CH》sNHC(0)0(Chyo(OCH;;CH。cO(CH2)oNHR1R5',CH2NH(CH2)aNHC(O)0(CH2)b(OCH2CH2)c0(CH2)。NHR，R3CH2NHC(0)(CH2)aNHR1R7、y0、zCH2NHC(0)O(CH2)aNHR1F^4CH2NHC(0)(CH。。(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1R3,CH2NHC(0)Q(CH2)b(OCH2CH2)cOR，和括其中的R基團(tuán)和指數(shù)如上文所述。本發(fā)明還提供在6-碳位置用L-R1修飾的糖核苷酸。此實施方案的示例性種類包32<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>其中R基和L代表上文討論的部分。指數(shù)"y"為0、1或2。本發(fā)明的另一示例性核苷酸糖基于具有GDP甘露糖立體結(jié)構(gòu)的種類。此實施方案的示例性種類具有結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供基于UDP半乳糖立體結(jié)構(gòu)的綴合物。此實施方案的示例性化合物具有結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>在另一示例性實施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立體結(jié)構(gòu)。此實施方案的示例性種類具有通式修飾基團(tuán)Rl是多種種類中的一種，所述種類包括但不限于水溶性聚合物、非水溶性聚合物、治療劑、診斷劑等。下文詳細(xì)討論了示例性修飾基團(tuán)的性質(zhì)。水溶性聚合物在一些實施方案中，本發(fā)明的G-CSF綴合物的聚合的修飾基團(tuán)為水溶性聚合物。這些水溶性聚合物可為線性或分支聚合物。在一個實施方案中，水溶性聚合物具有基本均勻分散的分子量分布。在一些實施方案中，本發(fā)明的綴合物包含水溶性聚合物，所述水溶性聚合物為聚乙二醇，如甲氧基-聚乙二醇。本發(fā)明所用的聚乙二醇不限于任一特定形式或分子量范圍。對非分支聚乙二醇分子，分子量優(yōu)選在500-100，000之間。優(yōu)選使用2，000-60，000的分子量，更優(yōu)選約5，000-約30，000。在另一實施方案中，聚乙二醇為有一個以上連接的PEG部分的分支PEG。分支PEG的實例描述于美國專利號5，932，462、美國專利號5，342，940、美國專利號5，643，575、美國專利號5，919，455、美國專利號6，113，906、美國專利號5，183，660、WO02/09766、KoderaY.，BioconjugateChemistry5:283-288(1994)禾口Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，52:2125-2127，1998。本文公開了其他有用的分支PEG結(jié)構(gòu)。在示例性實施方案中，分支PEG中每一聚乙二醇的分子量等于或大于約2，000，5，000、10，000、15，000、20，000、40，000或60，000道爾頓。許多水溶性聚合物為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并且在實施本發(fā)明中有用。術(shù)語水溶性聚合物包含以下種類糖，如葡聚糖、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、聚唾液酸、類肝素、肝素等；聚氨基酸，如聚天冬氨酸和聚谷氨酸；核酸；合成聚合物，如聚丙烯酸、聚醚(如聚乙二醇)；肽、蛋白質(zhì)等。可用任一水溶性聚合物實施本發(fā)明，唯一的限制是聚合物必須包含供綴合物剩余部分連接的點。聚合物激活的方法可見于W094/17039、美國專利號5,324,844、W094/18247、W094/04193、美國專利號5，219，564、美國專利號5，122，614、W090/13540、美國專利號5，281，698和W093/15189，以及活化聚合物和肽，如凝血因子VIII(W094/15625)、血紅蛋白(W094/09027)、攜氧分子(美國專利號4，412，989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11:141-45(1985))之間的綴合。在本發(fā)明的一個實施方案中，所用水溶性聚合物為這樣的聚合物，其中聚合物樣品中的大部分聚合物分子具有大致相同的分子量，這種聚合物為"均勻分散"。通過參考聚乙二醇綴合物來進(jìn)一步說明本發(fā)明。可獲得有關(guān)PEG的功能化和綴合的幾篇綜述和專題文章。見如Macronol.Chem.Phys.C25:325-373(1985);Scouten，MethodsinEnzymology135:30-65(1987);Wong等人，EnzymeMicrob.Technol.14:866-874(1992);Delgado等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems9:249-304(1992);Zalipsky，BioconjugateChem.6:150-165(1995);Bhadra等人，Pharmazie，57:5-29(2002)。制備反應(yīng)性PEG分子和用反應(yīng)性分子形成綴合物的方法為本領(lǐng)域公知。例如，美國專利號5，672，662公開了選自線性或分支的聚環(huán)氧烷、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇和聚丙烯嗎啉的聚合物酸的活性酯的水溶性和可分離的綴合物。美國專利號6，376，604中描述了通過聚合物的末端羥基與二(l-苯并三唑基)碳酸酯在有機(jī)溶劑中反應(yīng)，制備水溶性非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性酯用于形成帶有生物活性劑(如蛋白質(zhì)或肽)的綴合物。W099/45964描述了包含生物活性劑和活化的水溶性聚合物的綴合物，所述水溶性聚合物包含聚合物主鏈，其具有通過穩(wěn)定連接連接至聚合物主鏈的至少一個末端，其中所述至少一個末端包含分支部分，其具有連接至分支部分的鄰近反應(yīng)基團(tuán)，其中生物活性劑連接至至少一個鄰近反應(yīng)基團(tuán)。其他分支聚乙二醇描述于W096/21469，美國專利號5，932，462描述了用分支PEG分子形成的綴合物，所述分支PEG分子包含分支末端，分支末端包含反應(yīng)性官能團(tuán)。可獲得自由反應(yīng)性基團(tuán)與如蛋白質(zhì)或肽的生物活性種類反應(yīng)，形成聚乙二醇和生物活性種類間的綴合物。美國專利號5，446，090描述了雙功能PEG連接體及其形成在每一PEG連接體末端具有肽的綴合物中的用途。包含可降解PEG連接的綴合物描述于WO99/34833和W099/14259，以及美國專利號6，348，558。這種可降解連接適用于本發(fā)明。上述聚合物激活的本領(lǐng)域公知的方法在本發(fā)明的背景下形成本文所述分支聚合物中有用，對這些分支聚合物與其他種類(如糖、糖核苷酸等)的結(jié)合也有用。在本發(fā)明中有用的示例性聚乙二醇分子包括但不限于具有以下通式的分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>Z^^(CH2)「X(CH2CH20)e(CH2)d—A1—R8其中R8為H、0H、NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的雜烷基，如乙縮醛、0HC-、H2N-(CH2)q_、HS-(CH2),或-(CH2),C(Y)Z1。指數(shù)"e"代表1-2500的整數(shù)。指數(shù)b、d和q獨立地代表0-20的整數(shù)。符號Z和Z1獨立地代表0H、NHy離去基團(tuán)，如咪唑、對-硝基苯基、H0BT、四唑、鹵化物、S-R9、活化酯的醇部分、-(CH2)pC(Y0V或-(CH2)pU(CH丄C(Y1),。符號Y代表H(2)、二0、=S、=N-R1。。符號X、Y、Y'、A'和U獨立地代表0、S、N-R"部分。符號V代表0H、NH2、卣素、S-R活化酯的醇部分、活化酰胺的胺成分、糖核苷酸和蛋白質(zhì)。指數(shù)p、q、s和v為獨立地選自0-20的成員。符號R9、R1Q、R11和R12獨立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基和取代或未取代的雜芳基。在其他示例性實施方案中，聚乙二醇分子選自以下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>在形成本發(fā)明的綴合物中有用的聚乙二醇為線性的或分支的。適合在本發(fā)明中使用的分支聚乙二醇分子包括但不限于以下通式描述的分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中R8和RS'為獨立地選自以上為lf定義的基團(tuán)的成員。At和^為獨立地選自以上為^定義的基團(tuán)的成員。指數(shù)e、f、o和q如上文所述。Z和Y如上文所述。X1和X1'為獨立地選自S、SC(0)NH、HNC(0)S、SC(0)0、0、NH、NHC(0)、(0)CNH和NHC(0)0、0C(0)NH的成員。在另一示例性實施方案中，分支PEG基于半胱氨酸、絲氨酸或雙賴氨酸核心。因此，示例性分支PEG包括oNHC(0)CH2CH2(OCH2CH2),OCH3NHCCHsCCHzChWDCH:(CH2CH20)eCH3NHC(0)CH2CH2(OCH2CH2)fOCH3NHC(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH:NHC(O)CH:在另一實施方案中，分支PEG部分基于三賴氨酸肽。三賴氨酸可為單、雙、三或四聚乙二醇化的。根據(jù)此實施方案的示例性種類具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>其中e、f和f'為獨立地選自1-2500的整數(shù)；q、q'和q"為獨立地選自1-20的整數(shù)。在本發(fā)明的示例性實施方案中，PEG為m-PEG(5kD、10kD或20kD)。示例性分支PEG為絲氨酸-m-PEG或半胱氨酸-m-PEG，其中m-PEG為20kD的m-PEG。如技術(shù)人員所知，在本發(fā)明中有用的分支聚合物包括上述主題的變型。例如，上述二_賴氨酸-PEG綴合物可包括三個聚合的亞單位，第三個亞單位結(jié)合至上述結(jié)構(gòu)中顯示為未經(jīng)修飾的a-胺。類似地，用三個或四個聚合的亞單位官能化的三-賴氨酸的用途也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>和及這些種類的碳酸酯和活性酯，如適于激活在制備本文所述化合物中有用的線性PEG的其他激活(或離去)基團(tuán)包括但不限于以下種類WO04/083259中描述了用這些和其他種類激活的PEG分子及制備活化PEG的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，分支聚合物的m-PEG臂中的一個或多個可為具有不同末端(如0H、C00H、NH2、C廠Q。-烷基等)的PEG部分所取代。此外，上述結(jié)構(gòu)易于通過在a-碳原子和側(cè)鏈的官能團(tuán)之間插入烷基連接體(或移去碳原子)進(jìn)行修飾。因此，"均勻"衍生物和高級同系物以及低級同系物都包含于在本發(fā)明中所用的分支PEG的核心的范圍內(nèi)。本文所述分支PEG類型易于通過如以下圖示的方法制備39其中Xa為0或S，r為1-5的整數(shù)。指數(shù)e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。因此，根據(jù)此圖示，天然或非天然氨基酸與活化的m-PEG衍生物接觸，這種情況下，甲苯磺酸通過烷化側(cè)鏈的雜原子Xa形成1。將單官能化m-PEG氨基酸進(jìn)行使用反應(yīng)性m-PEG衍生物的N-?；瘲l件，從而組裝分支m-PEG2。如技術(shù)人員將理解，甲苯磺酸離去基團(tuán)可用任一適合的離去基團(tuán)取代，如鹵素、甲磺酸、三氟甲磺酸等。類似地，用來?；返姆磻?yīng)性碳酸酯可用活性酯，如N-羥基琥珀酰亞胺等取代，或者可用如二環(huán)己基碳二亞胺、羧基二咪唑等的脫水劑原位激活所述酸。在示例性實施方案中，修飾基團(tuán)為PEG部分，但是，任一修飾基團(tuán)(如水溶性聚合物、非水溶性聚合物、治療部分等)均可通過適當(dāng)?shù)倪B接摻入糖基部分。通過酶方法、化學(xué)方法或兩種方法聯(lián)用形成經(jīng)修飾的糖，從而產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖。在示例性實施方案中，用活性胺在任一位置取代糖，該位置容許修飾部分的連接，還容許糖作為能將經(jīng)修飾的糖偶聯(lián)至G-CSF肽的酶的底物起作用。在示例性實施方案中，當(dāng)半乳糖胺為經(jīng)修飾的糖時，胺部分在6-位連接至C原子。還可用如聚乙二醇(PEG)的PEG部分增強(qiáng)治療性糖肽的體內(nèi)半衰期。例如，用PEG對蛋白質(zhì)進(jìn)行的化學(xué)修飾(PEG化)增大了其分子大小，降低了其表面和官能團(tuán)的可及性，二者均依賴于連接至蛋白質(zhì)的PEG的大小。這導(dǎo)致了血漿半衰期和蛋白水解穩(wěn)定性的改進(jìn)，和免疫原性和肝攝取的降低(Chaffee等人J.Clin.Invest.89:1643-1651(1992);Pyatak等人Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29:113-127(1980))。已報道白細(xì)胞介素-2的聚乙二醇化增加了其在體內(nèi)的抗腫瘤功效(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:1487-1491(1987)，并且衍生自單克隆抗體A7的F(ab')2的聚乙二醇化改進(jìn)了其腫瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.28:1387-1394(1990))。因此，在另一實施方案中，與非衍生肽的體內(nèi)半衰期相比，通過本發(fā)明的方法用PEG部分衍生的肽的體內(nèi)半衰期增加了。肽體內(nèi)半衰期的增加最好表示為此數(shù)量百分?jǐn)?shù)增加的范圍。百分?jǐn)?shù)增加范圍的下端為約40%、約60%、約80%、約100%、約150%和約200%。范圍的上端為約60%、約80%、約100%、約150%或高于約250%。G-CSF肽基本任一具有任一序列的粒細(xì)胞集落剌激因子肽或試劑用作本發(fā)明綴合物的肽成分。粒細(xì)胞集落剌激因子已被克隆和測序。在示例性實施方案中，G-CSF肽具有SEQIDNO:1所示序列:MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDN0:1).。在另一示例性實施方案中，G-CSF肽具有SEQIDNO:2所示序列TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDN0:2).。在另一示例性實施方案中，G-CSF肽具有以下SEQIDNO:3-11所示序列MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:3)MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:4)MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:5)MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:6);MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHTLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:7);MVTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:8);MQTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:9);MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQPTQGAMP;(SEQIDNO:10)禾口MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGSSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPTTTPTQTAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP(SEQIDNO:11)本發(fā)明不以任何方式限制于本文所述序列。在示例性實施方案中，本發(fā)明的G-CSF肽包含至少一個0-連接的糖基化位點，其被包含PEG部分的糖殘基糖基化。PEG通過完整的糖基連接基團(tuán)共價連接至G-CSF肽。糖基連接接團(tuán)共價連接至G-CSF肽的氨基酸殘基或糖殘基。備選地，糖基連接基團(tuán)連接至糖肽的一個或多個糖基單位。本發(fā)明還提供糖基連接基團(tuán)連接至氨基酸殘基和糖殘基二者的綴合物。PEG部分直接或通過非糖基連接體(如取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基)連接至完整的糖基連接體。在示例性實施方案中，G-CSF部分包含具有通式I的部分。通式I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>其中D為選自-OH和RLL-HN-的成員；G為選自W-L-和_C(0)(C「C6)烷基的成員；W為包含選自直鏈或支鏈聚乙二醇?xì)埢某蓡T的部分；L為選自鍵、取代或未取代烷基和取代或未取代的雜烷基的成員的連接體，這樣當(dāng)D為OH時，G為W-L-，當(dāng)G為-C(O)(C「Ce)烷基時，D為W-L-NH-。在本文所述經(jīng)修飾的唾液酸結(jié)構(gòu)中，COOH還代表COO—和/或其鹽。在一個實施方案中，R1《具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>其中a為0-20的整數(shù)。在示例性實施方案中，R1具有選自以下成員的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>其中e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)；q為選自1_20的整數(shù)。在其他實施方案中，R1具有選自以下成員的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>其中e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)；q為1_20的整數(shù)。在其他實施方案中，R1具有選自以下成員的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>其中f和f'為獨立地選自1-2500的整數(shù)；q和q'為獨立地選自1-20的整數(shù)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供G-CSF肽綴合物，其中R1具有選自以下成員的結(jié)NHC(0)OCH2CH2(OCH2CH2)eOCH3NHC(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3HC(0)OCH2CH2(OCH2CH2)fOCH3和NHC(0)CH2CH2(OCH2CH2)eOCH3NHC(0)CH2CH2(OCH2CH2)fOCH3HC(0)CH2CH2(OCH2CH2)fOCH3其中e、f和f'為獨立地選自1-2500的整數(shù)；q、q'和q"為獨立地選自1_20的整在其他實施方案中，R1具有選自以下成員的結(jié)構(gòu)^—C(0)CH2CH2(〇CH2CH2)eOCH3;和^—C(0)〇CH2CH2(〇CH2CH2)fOCH3其中e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供包含具有以下通式的部分的肽HOG——HN.COOH、0——GalOHGal可連接至氨基酸，或連接至直接或間接地(如通過糖殘基)連接至氨基酸的糖在另一實施方案中，此部分具有通式HO'G——HN'.COOH、0——Gal—GalNAc-OHGalNAc可連接至氨基酸，或連接至直接或間接地(如通過糖殘基)連接至氨基酸的糖殘基。在另一示例性實施方案中，肽包含以下通式的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>其中AA為所述肽的氨基酸殘基，在以上每一結(jié)構(gòu)中，D和G如本文所述。可結(jié)合一個或多個上述種類的G-CSF肽的示例性氨基酸殘基包括絲氨酸和蘇氨SEQ.ID.NO.:1的133位蘇氨酸。在另一示例性實施方案中，本發(fā)明提供G-CSF綴合物，其包括具有以下通式的糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨立地選自0和1的整數(shù)。指數(shù)q為l。指數(shù)e、f、g和h為獨立地選自0-6的整數(shù)。指數(shù)j、k、l和m為獨立地選自0-100的整數(shù)。指數(shù)v、w、x禾Py獨立地選自0和1，且v、w、x和y中至少有一個為1。符號AA代表G-CSF肽的氨符號Sia-(R)代表具有以下通式的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>其中D選自-OH和R[L-HN-。符號G代表R匸L-或_C(0)(C「C6)烷基。R1代表包含直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢牟糠帧為連接體，其是選自鍵、取代或未取代烷基和取代或未取代雜烷基的成員。一般，當(dāng)D為0H時，G為W-L-，當(dāng)G為-C(O)(CrC》烷基時，D為R[L-NH-。在另一示例性實施方案中，本發(fā)明的綴合物中經(jīng)PEG修飾的唾液酸部分具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>其中指數(shù)"s"代表0-20的整數(shù)，n為1-2500的整數(shù)。在一個實施方案中，s等于1;m-PEG部分具有約20kD的分子量。在更進(jìn)一步的示例性實施方案中，經(jīng)PEG修飾的唾液酸具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>其中L為連接唾液酸部分和PEG部分的取代或未取代烷基或取代或未取代雜烷基連接部分。在一個實施方案中，上述天冬酰胺殘基的至少兩個、更優(yōu)選地三個、更優(yōu)選地四個用以上所示的N-連接聚糖鏈官能化。本發(fā)明的綴合物包含單價或多價(如觸角結(jié)構(gòu))的完整的糖基連接基團(tuán)。因此本發(fā)明的綴合物包含兩類型，其中選定部分通過單價糖基連接基團(tuán)和多價連接基團(tuán)連接至肽。本發(fā)明還包含其中有一個以上的選定部分通過多價連接基團(tuán)連接至肽的綴合物。水不溶性聚合物在另一實施方案中，類似于上文所討論，經(jīng)修飾的糖包含水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本發(fā)明的綴合物還可包含一個或多個水不溶性聚合物。通過將綴合物用作載體以受控的方式遞送治療性肽來說明本發(fā)明的此實施方案。聚合的藥物遞送系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知。見如Dunn等人編輯，PolymericDrugsAndDrugDeliverySystems,ACSSymposiumSeries469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991。本令頁域技術(shù)人員應(yīng)理解，基本任一已知藥物遞送系統(tǒng)均適用于本發(fā)明的綴合物。上述R1、L-R1、R15、R15'及其他基團(tuán)的基序同等地適用于水不溶性聚合物，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員易于利用的化學(xué)方法，無限制地?fù)饺刖€性和分支結(jié)構(gòu)。代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸十二酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烯、聚對苯二酸亞乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯基苯酚和其共聚物。在本發(fā)明的綴合物中有用的經(jīng)合成修飾的天然聚合物包括但不限于烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。經(jīng)合成修飾的天然聚合物大類的尤其優(yōu)選的成員包括但不限于甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、醋酞纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽和丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯與藻酸的聚合物。本文討論的這些及其他聚合物可容易地從商業(yè)來源獲得，如SigmaChemicalCo.(St.Louis，M0.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee,WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond,CA)，或通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成自從這些供應(yīng)商獲得的單體。在本發(fā)明的綴合物中有用的代表性生物可降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚對苯二酸亞乙酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己內(nèi)酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。形成凝膠的組合物，如包含膠原、pluronics等的組合物尤其有用。本發(fā)明中有用的聚合物包括含水不溶性材料的"雜合"聚合物，水不溶性材料在其結(jié)構(gòu)的至少一部分內(nèi)具有生物可再吸收分子。這種聚合物的實例是包括水不溶性共聚物的聚合物，其每一聚合物鏈均具有生物可再吸收區(qū)、親水區(qū)和多個可交聯(lián)的官能團(tuán)。為本發(fā)明的目的，"水不溶性材料"包括在水或含水環(huán)境中基本不溶解的材料。因此，雖然共聚物的某些區(qū)域或片段可以是親水的或甚至是水溶性的，但作為整體，聚合物分子不在任一實質(zhì)的程度下溶于水。為本發(fā)明的目的，術(shù)語"生物可再吸收分子"包含一個區(qū)域，該區(qū)域可被身體代謝或降解，并被再吸收和/或通過正常排泄途徑排出。優(yōu)選這種代謝產(chǎn)物或降解產(chǎn)物基本對身體是無毒的。只要共聚物組合物作為整體不溶于水，生物可再吸收區(qū)域可以是疏水的或親水的。因此，基于聚合物作為整體保持水不溶性的優(yōu)先性來選擇生物可再吸收區(qū)域。相應(yīng)地，選擇生物可再吸收區(qū)和親水區(qū)所含的官能團(tuán)的種類和相對比例，以確保有用的生物可再吸收組合物保持水不溶性。示例性可再吸收聚合物包含(如)聚(a-羥基-羧酸)/聚氧化烯的合成產(chǎn)生的可再吸收的嵌段共聚物(見Cohn等人，美國專利號4，826，945)。這些共聚物是未交聯(lián)的，水溶性的，使得身體可排出降解的嵌段共聚物成分。見Younes等人，JBiomed.Mater.Res.21:1301-1316(1987);Cohn等人，JBiomed.Mater.Res.22:993-1009(1988)。目前優(yōu)選的生物可再吸收聚合物包括選自聚酯、聚羥酸、聚內(nèi)酯、聚酰胺、聚(酯_酰胺)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酯、聚硫酯、多糖和其混合物的一種或多種成分。更優(yōu)選地，生物可再吸收的聚合物包括聚羥酸成分。在聚羥酸中，優(yōu)選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。除形成在體內(nèi)被吸收("生物再吸收")的片段外，本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的聚合物包衣還可形成可排泄和/或可代謝的片段。高級共聚物也可用于本發(fā)明。例如，Casey等人的美國專利號4，438，253(1984年3月20日發(fā)行)公開了三嵌段共聚物，其產(chǎn)生自聚乙醇酸和以羥基結(jié)尾的聚亞烷基二醇的轉(zhuǎn)酯作用。公開這種組合物用作可再吸收的單纖維縫線。通過將芳族原碳酸酯(如原碳酸四對甲苯酯)摻入共聚物結(jié)構(gòu)來控制這種組合物的彈性。還可利用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如，1993年4月13日公布的Spi皿的美國專利號5，202，413公開了生物可降解多嵌段共聚物，其具有聚丙交酯和/或聚乙醇酸交酯的連續(xù)有序的嵌段，其是通過將丙交酯和/或乙醇酸交酯開環(huán)聚合至低聚二醇或二胺殘基，然后用雙功能化合物(如二異氰酸鹽、二酰氯或二氯甲硅烷)進(jìn)行鏈延伸而產(chǎn)生的。在本發(fā)明中有用的包衣的生物可再吸收區(qū)可設(shè)計為可水解和/或酶切割的。為本發(fā)明的目的，"可水解切割"指共聚物，特別是生物可再吸收區(qū)對在水或含水環(huán)境中的水解作用的敏感性。類似地，本文所用"可酶切割"指共聚物，特別是生物可再吸收區(qū)對內(nèi)源或外源酶切割的敏感性。當(dāng)置于體內(nèi)時，親水區(qū)可被加工為可排泄和/或可代謝的片段。因此，親水區(qū)可包括，例如，聚醚、聚環(huán)氧烷、多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)及其共聚物和混合物。此外，親水區(qū)還可以是(如)聚環(huán)氧烷。這種聚環(huán)氧烷可包含(如)聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷及其混合物和共聚物。為水凝膠成分的聚合物在本發(fā)明中也有用。水凝膠是可吸收相對大量的水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物實例包括但不限于聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉菜膠和其他多糖、羥乙基甲基丙烯酸(HEMA)、以及它們的衍生物等?？芍苽浞€(wěn)定、生物可降解和生物可再吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可包含表現(xiàn)出一種或多種這些性質(zhì)的亞單位?？赏ㄟ^交聯(lián)來控制其完整性的生物相容性水凝膠組合物是已知的并且當(dāng)前在本發(fā)明方法中優(yōu)選使用。例如，Hubbell等人的美國專利號5，410，016(1995年4月25日公布)和5，529，914(1996年6月25日公布)公開了水溶性系統(tǒng)，其是交聯(lián)的嵌段共聚物，具有水溶性中央嵌段，該嵌段夾在兩個對水解作用不穩(wěn)定的延伸部分間。用可光可聚合的丙烯酸官能性進(jìn)一步對這種共聚物進(jìn)行封端。這些系統(tǒng)交聯(lián)時成為水凝膠。這種共聚物的水溶性中央嵌段可包含聚乙二醇，而對水解作用不穩(wěn)定的延伸部分可為聚a-羥酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。見Sawhney等人，Macromolecules26:581-587(1993)。在另一優(yōu)選實施方案中，凝膠為熱可逆凝膠。目前優(yōu)選包含如pluronics、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝膠、聚氨基甲酸酯-尿素水凝膠及其組合的成分的熱可逆凝膠。在另一示例性實施方案中，本發(fā)明的綴合物包含脂質(zhì)體成分?？砂幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備脂質(zhì)體，例如，按Eppstein等人的美國專利號4，522,811中所述。例如，可按以下方法制備脂質(zhì)體制劑將適當(dāng)?shù)闹?如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬酯酰磷脂酰膽堿、arachadoyl磷脂酰膽堿和膽固醇)溶于無機(jī)溶劑，然后蒸發(fā)干溶劑，在容器表面上留下干脂薄膜。往容器中加入活性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的水溶液。然后用手渦旋容器，使脂質(zhì)物質(zhì)從容器邊緣釋放并分散脂質(zhì)聚集體，從而形成脂質(zhì)體懸液。上文所述微粒及制備微粒的方法以實例的方式給出，其并非旨在限定在本發(fā)明中所用的微粒的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一系列通過不同方法制造的微粒在本發(fā)明中是有用的。上文在水溶性聚合物的背景中討論的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)形式，一般也適用于水不溶性聚合物。因此，例如半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸分支核心可用兩個水不溶性聚合物部分官能化。用來產(chǎn)生這些種類的方法一般非常類似于用來產(chǎn)生水溶性聚合物的方法。制備G-CSF綴合物的方法除上文討論的綴合物外，本發(fā)明提供制備這些綴合物和其他綴合物的方法。因此，一方面，本發(fā)明提供在選定部分和G-CSF肽間形成共價綴合物的方法。此外，本發(fā)明提供將本發(fā)明的綴合物靶向身體特定組織或區(qū)域的方法。在示例性實施方案中，綴合物形成于PEG部分(或包含PEG部分的可酶促轉(zhuǎn)移的糖基部分)和糖基化或非糖基化肽之間。PEG通過完整的糖基修飾基團(tuán)結(jié)合至G-CSF肽，完整的糖基連接基團(tuán)插入其間并共價連接至G-CSF肽和PEG部分二者，或連接至PEG-非糖基連接體(如取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基)構(gòu)建體。該方法包括將G-CSF肽與混合物接觸，所述混合物包含經(jīng)修飾的糖和糖基轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)修飾的糖是所述糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。反應(yīng)在足以形成經(jīng)修飾的糖和G-CSF肽間共價鍵的條件下進(jìn)行。經(jīng)修飾的糖的糖部分選自核苷酸糖、活化糖和既非核苷酸又未活化的糖。受體肽(糖基化或非糖基化的)一般從頭合成，或重組表達(dá)于原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli))或真核細(xì)胞(如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細(xì)胞)。G-CSF肽可以是全長蛋白質(zhì)或片段。此外，G-CSF肽可以是野生型的肽或突變的肽。在示例性實施方案中，G-CSF肽包含突變，該突變?yōu)殡男蛄性黾恿艘粋€或多個N-或0-連接的糖基化位點。在示例性實施方案中，因子IX為0-糖基化的，并以下述方式用水溶性聚合物官能化。通過可用的氨基酸糖基化位點生產(chǎn)肽，或若該位點是糖基化的，則修剪糖基部分以暴露氨基酸。例如，絲氨酸或蘇氨酸為a-lN-乙酰氨基半乳糖基化(GalNAc)的，通過ST6GalNAcTl用唾液酸-修飾基團(tuán)盒將NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化。備選地，用Core-l-GalT-1將NAc-半乳糖基化的肽半乳糖基化，產(chǎn)物通過ST3GalTl用唾液酸-修飾基團(tuán)盒唾液酸化。此方法的示例性綴合物具有以下連接Thr-a-1-GalNAc-P-l，3-Gal-a2，3-Sia*，其中Sia*為唾液酸_修飾基團(tuán)盒。在本發(fā)明的使用多種酶和糖基供體的方法(如上文所述)中，單個糖基化步驟可分開進(jìn)行或組合于"單罐"反應(yīng)中。例如，在上述三種酶的反應(yīng)中，GalNAc轉(zhuǎn)移酶、GalT和SiaT及其供體可組合于單個容器。備選地，GalNAc反應(yīng)可單獨進(jìn)行，GalT和SiaT和適當(dāng)?shù)奶腔w都作為單個步驟加入。進(jìn)行反應(yīng)的另一模式包含，連續(xù)地加入每一種酶和適當(dāng)?shù)墓w，以"單罐"模式進(jìn)行反應(yīng)。上述每一方法的組合可用于制備本發(fā)明的化合物。在本發(fā)明的綴合物，尤其是糖聚乙二醇化的N-連接的聚糖中，Sia-修飾基團(tuán)盒可以a-2，6或a-2，3鍵連接至Gal。本發(fā)明的方法還提供重組生產(chǎn)的不完全糖基化的肽的修飾。在本發(fā)明的方法中，通過經(jīng)修飾的糖，可用如PEG部分、治療劑等同時進(jìn)一步糖基化和衍生G-CSF肽。經(jīng)修飾的糖的糖部分可以是可正確結(jié)合至完全糖基化的肽中受體的殘基，或具有所需性質(zhì)的另一糖部分。經(jīng)本發(fā)明方法修飾的G-CSF肽可以是合成的或野生型的肽，或其可以是通過本領(lǐng)域公知的方法(如位點定向誘變)產(chǎn)生的突變肽。肽的糖基化一般為N-連接或O-連接的。示例性N-連接是經(jīng)修飾的糖與天冬酰胺殘基側(cè)鏈的連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸(其中X為脯氨酸外的任一氨基酸)是酶連接碳水化合物部分至天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中任一這些三肽序列的存在將產(chǎn)生潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)連接至羥基氨基酸的羥基側(cè)鏈，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。在一示例性實施方案中，G-CSF肽表達(dá)于哺乳動物系統(tǒng)，通過唾液酸酶處理修飾以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供體聚乙二醇化。在另一示例性實施方案中，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的G-CSF先用唾液酸酶處理以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供體聚乙二醇化，再用ST3Gal3和唾液酸供體唾液酸化。哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)的G-CSF還可用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理削減其唾液酸和半乳糖殘基，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶半乳糖基化，再用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供體聚乙二醇化。在另一實施方案中，G-CSF不先用唾液酸酶處理，而用修飾基團(tuán)-唾液酸盒和如ST3Gal3的酶通過唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行糖聚乙二醇化。在進(jìn)一步的示例性實施方案中，G-CSF表達(dá)于昆蟲細(xì)胞，并經(jīng)以下步驟修飾先用適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體和GnT-I、II、IV和V中的一種或幾種將N-乙酰葡糖胺加入G-CSF，然后用PEG-半乳糖的供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶將G-CSF聚乙二醇化。酵母中生產(chǎn)的G-CSF也可糖聚乙二醇化。例如，G-CSF先經(jīng)內(nèi)切聚糖酶處理修剪糖基基團(tuán)，用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸的供體聚乙二醇化。通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個糖基化位點，可方便地實現(xiàn)在肽或其他結(jié)構(gòu)中加入糖基化位點。也可通過在G-CSF肽的序列內(nèi)摻入1個或多個提供-OH基團(tuán)的種類(優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸殘基)進(jìn)行加入(對O-連接的糖基化位點而言)?？赏ㄟ^G-CSF肽的突變或全化學(xué)合成進(jìn)行加入。優(yōu)選通過DNA水平的改變來改變G-CSF肽的氨基酸序列，尤其是在預(yù)先選定的堿基處突變編碼肽的DNA，以產(chǎn)生將翻譯為所需氨基酸的密碼子。優(yōu)選使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行DNA突變。在示例性實施方案中，通過改組多核苷酸加入糖基化位點。編碼候選肽的多核苷酸可用DNA改組方案調(diào)節(jié)。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，通過一群相關(guān)基因的隨機(jī)片段化，隨后通過類似于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法將片段重新組裝來進(jìn)行。見如Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751(1994);Ste騰r，Nature370:389-391(1994);美國專利號5，605，793、5，837，458、5，830，721和5，811，238。本發(fā)明還提供將一個或多個選定糖殘基加入(或除去)肽的方法，其后將經(jīng)修飾的糖結(jié)合至肽的至少一個選定糖殘基。例如，當(dāng)希望將經(jīng)修飾的糖結(jié)合至在肽上不存在或不以所希望的量存在的選定糖殘基時，本實施方案是有用的。因此，在將經(jīng)修飾的糖偶聯(lián)至肽之前，通過酶法或化學(xué)偶聯(lián)將選定糖殘基結(jié)合至G-CSF肽。在另一實施方案中，通過從糖肽除去碳水化合物殘基，在結(jié)合經(jīng)修飾的糖之前改變糖肽的糖基化模式。見如W098/31826。存在于糖肽上的任一碳水化合物部分的加入或去除可通過化學(xué)法或酶法實現(xiàn)?；瘜W(xué)法去糖基化優(yōu)選通過將多肽變體暴露于三氟甲磺酸化合物或同等化合物而發(fā)生。這一處理導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖被切割，而保持肽完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118:131(1981)中描述了化學(xué)法去糖基化。多肽變體上碳水化合物部分的酶切割可按Thotakura等人，Meth.Enzymol.138:350(1987)所述，通過使用各種內(nèi)切和外切糖苷酶實現(xiàn)。糖基部分的化學(xué)法加入通過任一本領(lǐng)域公知的方法實現(xiàn)。糖部分的酶促加入優(yōu)選通過本文所述方法的修改實現(xiàn)，用固有糖基單位取代本發(fā)明中使用的經(jīng)修飾的糖。加入糖部分的其他方法公開于美國專利號5，876，980、6，030，815、5，728，554和5，922，577。選定糖殘基的示例性連接點包括但不限于(a)N-和0-糖基化的共有位點；(b)末端糖基部分，其是糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)自由羧基；(e)自由巰基，如半胱氨酸的巰基；(f)自由羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(g)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；(h)谷氨酰胺的酰胺基。在本發(fā)明中有用的示例性方法描述于1987年9月11日公開的W087/05330，以及Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，259頁-306頁(1981)。在示例性實施方案中，本發(fā)明提供制備包含以下部分的聚乙二醇化G-CSF的方法其中d為-0H或W-l-HN-。符號g代表W-l-或_c(0)(c「c6)烷基。r1為包含直鏈或支鏈聚乙二醇?xì)埢牟糠?。符號L代表選自鍵、取代或未取代烷基和取代或未取代雜烷基的連接體。一般，當(dāng)D為0H時，G為R匸L-，當(dāng)G為-C(O)(C「C6)烷基時，D為R[L-NH-。本發(fā)明的方法包括，(a)用PEG-唾液酸供體和酶接觸底物G-CSF肽，所述酶能將PEG-唾液酸部分從供體轉(zhuǎn)移至底物G-CSF肽。示例性PEG-唾液酸供體是核苷酸糖，如具有以下通式的核苷酸糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>和在適合轉(zhuǎn)移的條件下將PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移至G-CSF肽的氨基酸或糖殘基的酶。在一個實施方案中，在形成本發(fā)明的綴合物前，底物G-CSF肽表達(dá)于宿主細(xì)胞。示例性宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌或真菌。本文所述方法適用于以上部分所述的每一G-CSF綴合物。經(jīng)本發(fā)明方法修飾的G-CSF肽可以是合成的或野生型的肽，或它們可以是通過本領(lǐng)域公知的方法(如位點定向誘變)產(chǎn)生的突變肽。肽的糖基化一般為N-連接的或O-連接的。示例性N-連接是經(jīng)修飾的糖與天冬酰胺殘基側(cè)鏈的連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸(其中X為脯氨酸外的任一氨基酸)是酶連接碳水化合物部分至天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中任一這些三肽序列的存在產(chǎn)生潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)連接至羥基氨基酸的羥基側(cè)鏈，所述羥基氨基酸優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以使用不常見或非天然的氨基酸如5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。依照本發(fā)明，通過改變氨基酸序列以使其包含一個或多個糖基化位點，可實現(xiàn)往肽或其他結(jié)構(gòu)中加入糖基化位點。糖基化位點的加入也可通過在肽序列內(nèi)摻入l個或多個提供-OH基團(tuán)的種類(優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸殘基)實現(xiàn)(對0-連接的糖基化位點而言)?？赏ㄟ^肽的突變或全化學(xué)合成實現(xiàn)加入。在一些實施方案中，通過DNA水平的改變來改變肽的氨基酸序列，尤其是通過在預(yù)先選定的堿基處突變編碼肽的DNA，以產(chǎn)生將翻譯為所需氨基酸的密碼子。用本領(lǐng)域公知的方法實現(xiàn)DNA突變。在示例性實施方案中，通過改組多核苷酸加入糖基化位點。編碼候選肽的多核苷酸可用DNA改組方案調(diào)節(jié)。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，通過一群相關(guān)基因的隨機(jī)片段化，隨后通過類似于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法將片段重新組裝來進(jìn)行。見如Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751(1994);Ste騰r，Nature370:389-391(1994);美國專利號5，605，793、5，837，458、5，830，721和5，811，238。W004/099231、W003/031464及相關(guān)的美國和PCT申請中詳述了加入或去除糖基化位點、及加入或去除糖基結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)的示例性方法。本發(fā)明還使用將一個或多個選定糖殘基加入(或去除)G-CSF肽的方法，其后將經(jīng)修飾的糖結(jié)合至肽的至少一個選定糖殘基。例如，當(dāng)希望將經(jīng)修飾的糖結(jié)合至G-CSF肽上不存在或不以所希望的量存在的選定糖殘基時，這些技術(shù)是有用的。因此，在將經(jīng)修飾的糖偶聯(lián)至肽之前，通過酶法或化學(xué)偶聯(lián)將選定糖殘基結(jié)合至G-CSF肽。在另一實施方案中，通過從糖肽中去除碳水化合物殘基，在結(jié)合經(jīng)修飾的糖之前改變糖肽的糖基化模式。見如WO98/31826。選定糖殘基的示例性連接點包括但不限于(a)N-連接糖基化的共有位點和0_連接糖基化的共有位點；(b)末端糖基部分，其是糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)自由羧基；(e)自由巰基，如半胱氨酸的巰基；(f)自由羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(g)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；(h)谷氨酰胺的酰胺基。在本發(fā)明中有用的示例性方法描述于1987年9月11日公開的W087/05330，以及Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，259頁-306頁(1981)。依照本發(fā)明，用適合的酶介導(dǎo)結(jié)合，將經(jīng)PEG修飾的糖結(jié)合至糖基化或非糖基化的肽。優(yōu)選地，經(jīng)修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度如此選擇，使糖基化進(jìn)行至受體的修飾達(dá)到所希望的程度。應(yīng)理解，下文在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的上下文中所討論的考慮事項，一般適用于其他糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。已知許多用糖基轉(zhuǎn)移酶合成希望的寡糖結(jié)構(gòu)的方法，其一般適用于本發(fā)明。示例性方法描述于(如)W096/32491;Ito等人，PureAppl.Chem.65:753(1993);美國專利號5，352，670、5，374，541、5，545，553和共有的美國專利號6，399，336和6，440，703，其在此引用作為參考。通過單個糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的組合實施本發(fā)明。例如，可用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合。在使用一種以上酶的實施方案中，優(yōu)選將酶和底物混合于起始反應(yīng)混合物，或者在第一個酶反應(yīng)完成或接近完成時，加入第二個酶反應(yīng)的酶和試劑。通過在單個容器中依次進(jìn)行兩個酶反應(yīng)，總產(chǎn)量可超過分離中間種類的方法。此外，減少了過量溶劑和副產(chǎn)物的清除和處理。在一個實施方案中，第一種和第二種酶均為糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一優(yōu)選實施方案中，一種酶為內(nèi)切糖苷酶。在另一實施方案中，使用了兩種以上的酶來組裝本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖蛋白。在經(jīng)修飾的糖加入肽之前或之后，用酶改變G-CSF肽在任一點上的糖結(jié)構(gòu)。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法使用一種或多種外切或內(nèi)切糖苷酶。糖苷酶可以是突變體和/或變體，其可形成或被設(shè)計成可形成糖苷鍵，而不是使糖苷鍵斷裂。這種突變體聚糖酶一般包含用氨基酸殘基取代活性位點的酸性氨基酸殘基。例如，當(dāng)內(nèi)切聚糖酶為endo-H時，被取代的活性位點殘基通常為130位的Asp、132位的Glu或二者的組合。一般用絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺來取代氨基酸。這種突變體酶可通過類似于內(nèi)切聚糖酶水解步驟的逆反應(yīng)的合成步驟催化反應(yīng)。在這種實施方案中，糖基供體分子(如想得到的寡聚糖或單糖結(jié)構(gòu))包含離去基團(tuán)，隨反應(yīng)進(jìn)行，供體分子加入蛋白質(zhì)的GlcNAc殘基。例如，離去基團(tuán)可以是鹵素，如氟化物。在其他實施方案中，離去基團(tuán)為Asn或Asn-肽部分。在另一實施方案中，糖基供體分子上的GlcNAc殘基是經(jīng)修飾的。例如，GlcNAc殘基可以包含1，2噁唑啉部分。在一個實施方案中，用來生產(chǎn)本發(fā)明的綴合物的酶以催化量存在。特定酶的催化量依該酶底物的濃度及反應(yīng)條件如溫度、時間和pH值而不同。在預(yù)先選定的底物濃度和反應(yīng)條件下測定給定酶的催化量的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。本發(fā)明反應(yīng)進(jìn)行的溫度可從略高于冰點至使大部分敏感酶變性的溫度。優(yōu)選溫度范圍為約0°C-約55t:，更優(yōu)選約20°C-約37°C。在另一示例性實施方案中，用耐熱酶在提高的溫度下進(jìn)行本方法的一個或多個成分?！矫?，反應(yīng)混合物維持足以使受體糖基化的一段時間，從而形成想得到的綴合物。幾小時后常可檢測到一些綴合物，通常在24小時或更短時間內(nèi)獲得可回收的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，反應(yīng)速度依賴于為選定系統(tǒng)優(yōu)化的許多可變因素(如酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)。本發(fā)明還提供經(jīng)修飾的肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。如本文所用，"工業(yè)規(guī)模"一般指至少l克成品純化綴合物的生產(chǎn)。在后續(xù)討論中，本發(fā)明以經(jīng)修飾的唾液酸部分與糖基化肽的綴合為例。示例性的經(jīng)修飾的唾液酸用PEG標(biāo)記。以下關(guān)于PEG-修飾的唾液酸和糖基化肽的討論的中心是為了說明的明晰性，并非旨在暗示本發(fā)明限制于這兩個配偶體的綴合。技術(shù)人員理解，此討論一般適用于除唾液酸外的經(jīng)修飾的糖基部分的加入。此外，此討論同等地適用于用除PEG外的試劑進(jìn)行的糖基單位的修飾，所述試劑包括其他PEG部分、治療部分和生物分子?？捎妹阜ㄟx擇地將聚乙二醇化或聚丙二醇化的碳水化合物引入肽或糖肽。此方法使用包含PEG、PPG或被掩蔽的反應(yīng)性官能團(tuán)的經(jīng)修飾的糖，并與適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合酶組合。通過選擇將形成想得到的碳水化合物連接的糖基轉(zhuǎn)移酶，并利用經(jīng)修飾的糖作為供體底物，可直接將PEG或PPG引入G-CSF肽主鏈、糖肽上已有的糖殘基或已加入肽的糖殘基上。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體存在于待通過本發(fā)明的方法修飾的G-CSF肽上，作為天然存在的結(jié)構(gòu)或通過重組法、酶法或化學(xué)法放置的結(jié)構(gòu)。適合的受體包括(如)半乳糖基受體(如GalP1、4GlcNAc、GalP1、4GalNAc、GalP1、3GalNAc、lacto-N-tetraose、GalP1、3GlcNAc、GaiP1、3Ara、GaiP1、6GlcNAc、GalP1、4Glc(乳糖))和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他受體(見如Paulson等人，J.Biol.Chem.253:5617-5624(1978))。在一個實施方案中，糖肽在體內(nèi)合成后，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體存在于待修飾的糖肽上。這種糖肽可通過所要求保護(hù)的方法唾液酸化，無需先修改糖肽的糖基化模式。備選地，本發(fā)明的方法可用于唾液酸化不含適合受體的肽；首先通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法修飾G-CSF肽，使其包含受體。在示例性實施方案中，通過GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用加入GalNAc殘基。在示例性實施方案中，通過連接半乳糖殘基至已連接G-CSF肽的適當(dāng)受體(如GlcNAc)來組裝半乳糖基受體。此方法包括將待修飾的G-CSF肽與包含適量半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(如gal131，3或gal131，4)和適合的半乳糖基供體(如UDP-半乳糖)的反應(yīng)混合物孵育。讓反應(yīng)進(jìn)行至基本完成或，備選地，在加入預(yù)定量的半乳糖殘基時終止反應(yīng)。組裝選定的糖受體的其他方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。在另一實施方案中，糖肽連接的寡糖先經(jīng)完全或部分"修剪"，以暴露出唾液酸轉(zhuǎn)移酶受體或可加入一個或多個適合殘基以獲得合適受體的部分。如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶的酶(見如美國專利號5，716，812)可用于連接和修剪反應(yīng)。在下文的討論中，本發(fā)明的方法以連接PEG部分的經(jīng)修飾的糖的用途為例。討論的中心是說明的明晰性。技術(shù)人員應(yīng)理解，此討論與其中經(jīng)修飾的糖具有治療部分、生物分子等的那些實施方案同等地相關(guān)。在本發(fā)明的示例性實施方案中，在加入經(jīng)修飾的糖之前"修剪"碳水化合物殘基，將高甘露糖削減至第一代雙觸角結(jié)構(gòu)。具有PEG部分的經(jīng)修飾的糖結(jié)合至通過"削減"暴露出的一個或多個糖殘基。在一實例中，通過結(jié)合至PEG部分的GlcNAc部分加入PEG部分。經(jīng)修飾的GlcNAc連接至雙觸角結(jié)構(gòu)的一個或兩個末端甘露糖殘基。備選地，未經(jīng)修飾的GlcNAc可加入至分支種類的一個或兩個末端。在另一示例性實施方案中，PEG部分通過具有半乳糖殘基的經(jīng)修飾的糖(其結(jié)合至加入末端甘露糖殘基的GlcNAc殘基)加入雙觸角結(jié)構(gòu)的一個或兩個末端甘露糖殘基。備選地，未經(jīng)修飾的Gal可加入一個或兩個末端GlcNAc殘基。在進(jìn)一步的實例中，用經(jīng)修飾的唾液酸將PEG部分加至Gal殘基。在另一示例性實施方案中，將高甘露糖結(jié)構(gòu)"削減"至甘露糖，從其分支出雙觸角結(jié)構(gòu)。在一實例中，通過用聚合物修飾的GlcNAc加入PEG部分。備選地，將未經(jīng)修飾的GlcNAc加至甘露糖，后跟連接有PEG部分的Gal。在另一實施方案中，將未經(jīng)修飾的GlcNAc和Gal殘基依次加至甘露糖，后跟經(jīng)PEG部分修飾的唾液酸部分。在進(jìn)一步的示例性實施方案中，將高甘露糖"削減"至連接第一個甘露糖的GlcNAc。將GlcNAc結(jié)合至具有PEG部分的Gal殘基。備選地，將未經(jīng)修飾的Gal加至GlcNAc，然后加入用水溶性糖修飾的唾液酸。在進(jìn)一步的實例中，末端GlcNAc與Gal結(jié)合，隨后用具有PEG部分的經(jīng)修飾的巖藻糖巖藻糖基化GlcNAc。高甘露糖也可削減至連接肽的Asn的第一個GlcNAc。在一實例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc與具有水溶性聚合物的GlcNAc綴合。在另一實例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc經(jīng)帶有水溶性聚合物的Gal修飾。在進(jìn)一步的實施方案中，GlcNAc經(jīng)Gal修飾，然后結(jié)合至用PEG部分修飾的唾液酸的Gal。其他示例性實施方案描述于共有的美國專利申請公開20040132640、20040063911、20040137557;美國專利申請?zhí)?0/369，979、10/410，913、10/360，770、10/410，945和PCT/US02/32263，其在此引用作為參考。上述實例提供了對本文所述方法的功用的說明。使用本文所述方法，有可能"削減"和構(gòu)建出具有基本任一想得到的結(jié)構(gòu)的碳水化合物殘基。經(jīng)修飾的糖可按上文所述加至碳水化合物部分的末端，或其可處于肽核心和碳水化合物末端之間。在示例性實施方案中，用唾液酸酶從G-CSF糖肽上去除現(xiàn)有的唾液酸，從而暴露出所有或大部分的潛在甘露糖基殘基。備選地，用半乳糖殘基或以半乳糖單位結(jié)尾的寡糖殘基標(biāo)記肽或糖肽。暴露或加入半乳糖殘基后，用適當(dāng)?shù)耐僖核徂D(zhuǎn)移酶來加入經(jīng)修飾的唾液酸。圖示l概述了本方法。圖解1PEG或PPGCMP-SA-5-NnCOCII2NII——PEG(PPG)糖蛋白SA-5-NHCOCH2NH-PEGI,GalGal—SA-5-NHCOCH2NH-PEGSA-5-NHCOCH2NH-PEG在概述于圖示2的另一方法中，唾液酸上存在被掩蔽的反應(yīng)官能性。被掩蔽的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選不受用于連接經(jīng)修飾的唾液酸至G-CSF的條件影響。經(jīng)修飾的唾液酸共價連接至G-CSF肽后，去除掩蔽物，將G-CSF肽與如PEG的試劑綴合。試劑通過與經(jīng)修飾的糖殘基上未掩蔽的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)，以特異的方式綴合至肽。圖解2,GalGa卜,一zSA-5-NHCOCH2S-SEt,GalSA-5-NHCOCH2S-SEtGalISA-5-NHCOCH2S-SEt糖蛋白SA-5-NHCOCH2S-PEG-Gal■Gal—SA-5-NHCOCH2S-PEG1.二硫蘇糖醇2.PEG-卣化物或PPG卣化物Gal一-ISA-5-NHCOCH2S-PEG依賴于糖肽寡糖側(cè)鏈的末端糖，本文所述任一經(jīng)修飾的糖均可與其適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶一起使用(表l)。如上文討論，需引入聚乙二醇化結(jié)構(gòu)的糖肽的末端糖可以是表達(dá)中自然引入的，或其可在表達(dá)后用適當(dāng)?shù)奶擒彰?、糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物產(chǎn)生。表1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>在進(jìn)一步的示例性實施方案中，UDP-半乳糖-PEG與牛奶P1，4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而將經(jīng)修飾的半乳糖轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)哪┒薔-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)。正如在如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌的表達(dá)系統(tǒng)中可以發(fā)生的，糖肽上的末端GlcNAc殘基可在表達(dá)中產(chǎn)生，但也可按需要通過用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶處理糖肽而產(chǎn)生。在另一示例性實施方案中，利用GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(如GNT1-5)轉(zhuǎn)移聚乙二醇化GlcN至糖肽上的末端甘露糖殘基。在進(jìn)一步的示例性實施方案中，從糖肽酶促去除N-和/或o-連接的聚糖結(jié)構(gòu)，以暴露出氨基酸或末端糖基殘基，其隨后與經(jīng)修飾的糖綴合。例如，用內(nèi)切聚糖酶去除糖肽的N-連接結(jié)構(gòu)，將末端GlcNAc暴露為糖肽上GlcNAc-連接的Asn。用UDP-Gal-PEG和適當(dāng)?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶將PEG-半乳糖官能性引入暴露的GlcNAc上。在備選實施方案中，使用已知可轉(zhuǎn)移糖殘基至肽主鏈的糖基轉(zhuǎn)移酶，直接將經(jīng)修飾的糖加至G-CSF肽主鏈。圖解3描述了此示例性實施方案。在實施本發(fā)明中有用的示例性糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAcTl_4)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶和甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等。用此方法可將經(jīng)修飾的糖直接加至不具有任一碳水化合物的肽上或者，備選地，加至已有糖肽上。在兩種情況下，經(jīng)修飾的糖的加入發(fā)生于如糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性確定的肽主鏈上的特異性位置，而不是以如化學(xué)法修飾蛋白質(zhì)肽主鏈時發(fā)生的隨機(jī)方式加入。通過將適合的氨基酸序列工程化到多肽鏈中，可將一系列試劑引入不具有糖基轉(zhuǎn)移酶底物肽序列的蛋白質(zhì)或糖肽中。圖解3HO/OHHOOH蛋白質(zhì)或糖蛋白C逸GalNAc轉(zhuǎn)移酶(Ga脆cT3),GalNH-CO(CH2)4NH-PEGGalNH-CO(CH2)4NH-PEGPEG在上述每一示例性實施方案中，經(jīng)修飾的糖結(jié)合至肽后，可利用一個或多個附加的化學(xué)或酶修飾步驟。在示例性實施方案中，用酶(如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)將糖基單位(如巖藻糖)附加至連接G-CSF肽的末端經(jīng)修飾的糖。在另一實例中，利用酶反應(yīng)"封閉"經(jīng)修飾的糖沒有結(jié)合的位點。備選地，利用化學(xué)反應(yīng)改變所結(jié)合的經(jīng)修飾的糖的結(jié)構(gòu)。例如，所結(jié)合的經(jīng)修飾的糖與試劑反應(yīng)反應(yīng)，所述試劑穩(wěn)定或去穩(wěn)定化其與經(jīng)修飾的糖所連接的肽成分之間的連接。在另一實例中，在其結(jié)合至肽后，對經(jīng)修飾的糖成分進(jìn)行去保護(hù)。技術(shù)人員應(yīng)理解，在經(jīng)修飾的糖結(jié)合至G-CSF肽后的階段，有一系列酶和化學(xué)操作可用于本發(fā)明的方法。塵除上文在形成酰基連接綴合物的內(nèi)容中討論的酶外，可通過利用其他酶的方法對綴合物和起始底物(如肽、脂類)的糖基化模式進(jìn)行加工、削減或修飾。2003年4月17日公開的DeFees的W003/031464A2中非常詳細(xì)地討論了用轉(zhuǎn)移糖供體至受體的酶來重塑肽和脂類結(jié)構(gòu)的方法。下文簡要概述了在本方法中所用的選定的酶。糖某轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶催化活化糖(供體NDP-或NMP-糖)以逐步的方式加至蛋白質(zhì)、糖肽、脂類或糖脂或生長中寡糖的非還原端。通過轉(zhuǎn)移酶和脂類連接的寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Mari9，在嵌段轉(zhuǎn)移和隨后的核心修剪中合成N-連接的糖肽。這種情況下，"核心"糖的性質(zhì)與后續(xù)連接物略有不同。大量糖基轉(zhuǎn)移酶為本領(lǐng)域公知。本發(fā)明中使用的糖基轉(zhuǎn)移酶可以是任一種，只要其可將經(jīng)修飾的糖用作糖供體。這種酶的實例包括Leloir途徑糖基轉(zhuǎn)移酶，如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、glucurononyltransferase等。對涉及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的酶促糖合成，糖基轉(zhuǎn)移酶可克隆或分離自任一來源。已知許多已克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶及其核苷酸序列。見如"TheWWWGuideToClonedGlycosyltransferases"(http:〃www.vei.co.uk/TGN/gtguide,htm)。糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(可從其推斷氨基酸序列)還見于公開可得的數(shù)據(jù)59庫，包含GenBank、Swiss-Prot、EMBL等。在本發(fā)明的方法中可用的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、^乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶、葡糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和寡糖基轉(zhuǎn)移酶。適合的糖基轉(zhuǎn)移酶包括從真核細(xì)胞及原核細(xì)胞獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶?？赏ㄟ^化學(xué)合成、通過篩選源自適合細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄物、通過篩選源自適合細(xì)胞的基因組文庫或通過這些方法的組合獲得編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。mRNA或基因組DNA的篩選可用產(chǎn)生自糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的寡核苷酸探針實現(xiàn)。按已知方法用可檢測基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性原子或化學(xué)發(fā)光基團(tuán))標(biāo)記探針，并用于常規(guī)雜交分析。備選地，可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法獲得糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列，PCR寡核苷酸引物產(chǎn)生自糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列。見Mullis等人的美國專利號4，683，195和Mullis的美國專利號4，683，202。糖基轉(zhuǎn)移酶可合成于用包含編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。載體用來擴(kuò)增編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA和/或表達(dá)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA可操作地連接至適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，調(diào)控序列能實現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶在適當(dāng)宿主中的表達(dá)。對這種調(diào)控序列的需要將取決于所選宿主和所選轉(zhuǎn)化方法而不同。一般，調(diào)控序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱基因序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點的序列和調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)域。全部所需的是在宿主中的復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點賦予)和便于識別轉(zhuǎn)化子的選擇基因。在示例性實施方案中，本發(fā)明利用原核細(xì)胞的酶。這種糖基轉(zhuǎn)移酶包括參與脂寡糖(L0S)合成的酶，脂寡糖為許多革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生(Preston等人，CriticalReviewsinMicrobiology23(3):139-180(1996))。此類酶包括但不限于如大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuri咖)等物種的rfa操縱子的蛋白質(zhì)，其包括131，6半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和131，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(見如EMBL檢索號M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL檢索號S56361(鼠傷寒沙門氏菌))、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Swiss-Prot檢索號P25740(大腸桿菌))、P1，2-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaj)(Swiss-Prot檢索號P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot檢索號P19817(鼠傷寒沙門氏菌))、P1，2_N_乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(rfaK)(EMBL檢索號U00039(大腸桿菌))。氨基酸序列已知的其他糖基轉(zhuǎn)移酶包括如rfaB操縱子(已在一些物種中對其進(jìn)行了表征，如肺炎桿菌(Klebsiellapne咖oniae)、大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、腸沙門氏菌(Salmonellaenterica)、小腸結(jié)腸炎耳卩爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)禾口Mycobacteriuml印rosum)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)rhl操縱子編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶。參與產(chǎn)生包含乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-P-l，4-N-乙?；鵢D_葡糖胺基-13-1，3-D-半乳糖基_13-1，4-D-葡萄糖、pk血型三糖序列、D_半乳糖基_a-1，4_D_半乳糖基_1，4-D-葡萄糖的結(jié)構(gòu)的糖基轉(zhuǎn)移酶也適用于本發(fā)明，已在粘膜病原體淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的LOS中對其進(jìn)行了鑒定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41:236-243(1994))。已從腦膜炎奈瑟氏菌免疫型L3和LI(Jennings等人，Mol.Microbiol.18:729-740(1995))和淋病奈瑟氏菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180:2181-2190(1994))中鑒定出腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌中編碼參與這些結(jié)構(gòu)生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的基因。在腦膜炎奈瑟氏菌中，由lgtA、lgtB和lgE三個基因組成的基因座編碼將最后三個糖加入乳糖-N-新四糖鏈所需的糖基轉(zhuǎn)移酶(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271:19166-73(1996))。最近表明了lgtB和lgtA基因產(chǎn)物的酶活性，為他們提出的糖基轉(zhuǎn)移酶功能提供了第一個直接證據(jù)(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45):28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏菌中還有另外兩個基因lgtD，其將13-D-GalNAc加至乳糖_N_新四糖結(jié)構(gòu)末端半乳糖的3位；lgtC，其將末端a-D_Gal加至截短的LOS的乳糖成分，從而產(chǎn)生pk血型抗原結(jié)構(gòu)(Gotshlich(1994)，supra.)。在腦膜炎奈瑟氏菌中，分離的免疫型L1也表達(dá)pk血型抗原，已顯示其具有l(wèi)gtC基因(Je皿ings等人，(1995)，supra.)。美國專利號5，545，553(Gotschlich)中還描述了奈瑟氏菌屬(Neisseria)糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)基因。還表征了幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和a1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Martin等人，J.Biol.Chem.272:21349-21356(1997))?？漳c彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)的糖基轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明中也有用(見如htto:〃afmb.cnrs_mrs.fr/oedro/CAZY/gtf42.html)。g繊雜繊在一些實施方案中，在本發(fā)明方法中使用的糖基轉(zhuǎn)移酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。示例性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移L-巖藻糖至受體糖羥基位置的酶。轉(zhuǎn)移非核苷酸糖至受體的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明中也有用。在一些實施方案中，受體糖是(例如)寡糖糖苷中GaiP(1—3，4)GlcNAcP-基團(tuán)的GlcNAc。適合于此反應(yīng)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括最先在人乳汁中表征的GaiP(1—3，4)GlcNAcP1-a(1—3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)(見Palcic等人，CarbohydrateRes.190:1-11(1989);Prieels等人，J.Biol.Chem.256:10456-10463(1981);Nunez等人，Can.J.Chem.59:2086-2095(1981))和發(fā)現(xiàn)于人血清的GaiP(1—4)GlcNAcP-a巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIV、FTV、FTVI)。還表征了唾液酸a(2—3)GaiP((l—3)GlcNAcP巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTVIIE.C.No.2.4.1.65)。還表征了重組形式的GaiP(1—3，4)GlcNAcP-a(1—3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(見Dumas等人，Bioorg.Med丄etters1:425-428(1991);Kukowska-Latallo等人，GenesandDevelopment4:1288-1303(1990))。其他示例性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括(例如)a1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.69)?？赏ㄟ^Mollicone等人，Eur.J.Biochem.191:169-176(1990)或美國專利號5，374，655中所述的方法實現(xiàn)酶促巖藻糖基化。用來生產(chǎn)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還包括合成GDP-巖藻糖的酶系統(tǒng)。半乳糖某轉(zhuǎn)移酶在另一組實施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶為半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。示例性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括a(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，見如Dabkowski等人，TransplantProc.25:2921(1993);Yamamoto等人，Nature345:229-233(1990);牛(GenBankj04989;Joziasse等人，J.Biol.Chem.264:14290-14297(1989));鼠(GenBankm26925;Larsen等人，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA86:8227-8231(1989));豬(GenBankL36152;Strahan等人，I匪nogenetics41:101-105(1995)))。另一種適合的a1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是參與血型B抗原合成的a1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265:1146-1151(1990)(人類))。另一個示例性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是核心Gal-Tl。|3(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶也適用于本發(fā)明的方法，所述酶包括(例如)EC2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D'Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183:211-217(1989))，人類(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.157:657-663(1988))，鼠(Nakazawa等人，J.Biochem.104:165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38:234-242(1994))。其他適合的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括(例如)a1，2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(來自如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，Ch即ell等人，Mol.Biol.Cell5:519-528(1994))。鵬夜,繊唾液酸轉(zhuǎn)移酶是在本發(fā)明的重組細(xì)胞和反應(yīng)混合物中有用的另一類糖基轉(zhuǎn)移酶。產(chǎn)生重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還產(chǎn)生GMP-唾液酸，GMP-唾液酸是唾液酸轉(zhuǎn)移酶的唾液酸供體。適用于本發(fā)明的唾液酸轉(zhuǎn)移酶實例包含ST3Galni(如大鼠或人ST3GalIII)、ST3GalIV、ST3Gal1、ST3GalII、ST6Gal1、ST3GalV、ST6Gal11、ST6GalNAc1、ST6GalNAcII和ST6GalNAcIII(本文所用唾液酸轉(zhuǎn)移酶命名法如Tsuji等人，Glycobiology6:v-xiv(1996)所述)。示例性a(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶指轉(zhuǎn)移唾液酸至GalP1—3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal的a(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)。見VandenEijnden等人，J.Biol.Chem.256:3159(1981);Weinstein等人，J.Biol.Chem.257:13845(1982);Wen等人，J.Biol.Chem.267:21011(1992)。另一示例性a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.4)轉(zhuǎn)移唾液酸至二糖或糖苷非還原的末端Gal。見Rearick等人，J.Biol.Chem.254:4444(1979);Gillespie等人，J.Biol.Chem.267:21004(1992)。其他示例性酶包含Gal-H，4-GlcNAca-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(見Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219:375-381(1994))。優(yōu)選地，對糖肽碳水化合物的糖基化，唾液酸轉(zhuǎn)移酶能轉(zhuǎn)移唾液酸至序列Gal131，4GlcNAc-，該序列是完全唾液酸化的碳水化合物結(jié)構(gòu)上末端唾液酸之下的最常見的倒數(shù)第二位序列(見表2)。表2:用Gal131，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>1)Goochee等人，Bio/Technology9:1347-1355(1991)2)Yamamoto等人，J.Biochem.120:104-110(1996)3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.271:28271-28276(1996)在所述方法中有用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的實例是ST3GalIII，也將其稱為a(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)。該酶催化唾液酸轉(zhuǎn)移至GalP1，3GlcNAc或GalP1，4GlcNAc糖苷的Gal(見如Wen等人，J.Biol.Chem.267:21011(1992);VandenEijnden等人，J.Biol.Chem.256:3159(1991))，并負(fù)責(zé)糖肽中天冬酰胺連接的寡糖的唾液酸化。唾液酸連接至Gal，在兩個糖間形成a-連接。糖間的結(jié)合(連接)位于NeuAc的2位和Gal的3位之間。這一特定的酶可從大鼠肝臟中分離(Weinstein等人，J.Biol.Chem.257:13845(1982));現(xiàn)已知人類cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.268:22782-22787;Kitagawa和Paulson(1994)J.Biol.Chem.269:1394-1401)和基因組(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271:931-938)DNA序列，便于通過重組表達(dá)生產(chǎn)這種酶。在一個實施方案中，所述唾液酸化方法使用大鼠ST3GalIII。在本發(fā)明中有用的其他示例性唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括從空腸彎曲桿菌中分離的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，其包括CST-I、CST-II和形成a(2，3)連接的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。見如W099/49051。表2所列之外的唾液酸轉(zhuǎn)移酶也可用于在商業(yè)上重要的糖肽的經(jīng)濟(jì)且高效的大規(guī)模唾液酸化方法。作為發(fā)現(xiàn)這些其他酶功用的簡單測試，用不同量的每一種酶(l-100mU/mg蛋白質(zhì))與無唾液酸基-、AGP(l-10mg/ml)反應(yīng)，以比較目的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和牛ST6Gal1、ST3GalIII或這兩種唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化糖肽的能力。備選地，其他糖肽或糖肽，或從肽主鏈酶促釋放的N-連接寡糖可用來取代無唾液酸基的_a^GP用于此評估。具有比ST6GalI更有效地唾液酸化糖肽的N-連接寡糖能力的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可用于肽唾液酸化的實際的大規(guī)模方法中。GalNAc轉(zhuǎn)移酶N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶在實施本發(fā)明中有用，尤其是對將GalNAc部分結(jié)合至肽的0-連接糖基化位點的氨基酸。適合的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于a(1，3)N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶、13(1，4)N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.267:12082-12089(1992);Smith等人，J.BiolChem.269:15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.268:12609(1993))。通過遺傳工程從克隆的基因生產(chǎn)如GalNAc^酶的蛋白質(zhì)眾所周知。見如美國專利號4，761，371。一種方法涉及收集足夠樣品，然后通過N端測序測定酶的氨基酸序列。然后用這一信息來分離編碼全長(膜結(jié)合)轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆，所述酶在昆蟲細(xì)胞系Sf9中表達(dá)時導(dǎo)致具有完全活性的酶的合成。然后通過對16種不同蛋白質(zhì)中的已知糖基化位點附近氨基酸的半定量分析，測定酶的受體特異性，隨后進(jìn)行合成肽的體外糖基化研究。這項工作表明，某些氨基酸在糖基化肽片段中被過多出現(xiàn)，并且糖基化絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍特定位置中的殘基可以比其他氨基酸部分對受體效率具有更顯著的影響。麵齢,雜繊在另一個實施方案中，本發(fā)明方法使用的酶是細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶。雖然已知許多可溶性的糖基轉(zhuǎn)移酶(見如美國專利號5，032，519)，但當(dāng)與細(xì)胞結(jié)合時，糖基轉(zhuǎn)移酶一般是膜結(jié)合的形式。迄今研究過的許多膜結(jié)合的酶被認(rèn)為是內(nèi)在性蛋白質(zhì)，即它們不能通過超聲處理從膜釋放，需用去污劑來溶解。已在脊椎動物和無脊椎動物細(xì)胞表面鑒定出表面糖基轉(zhuǎn)移酶，公認(rèn)這些表面轉(zhuǎn)移酶在生理條件下保持其催化活性。但是，細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶更為公認(rèn)的功能是用于細(xì)胞間識別(Roth，MolecularApproachestoSupracellularPhenomena,1990)。已開發(fā)了改變細(xì)胞表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。例如，在Larsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8227-8231(1989)中，報道了分離克隆的cDNA序列的遺傳學(xué)方法，所述序列決定細(xì)胞表面寡糖結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。用產(chǎn)生自mRNA的cDNA文庫轉(zhuǎn)染C0S-1細(xì)胞，所述mRNA從已知其表達(dá)UDP-半乳糖.P._D_半乳糖基-1，4_N_乙?；?D-氨基葡糖苷a-l，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的鼠細(xì)胞系分離。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，測定1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。Francisco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2713-2717(1992)公開了將P-內(nèi)酰胺酶錨定至大腸桿菌外表面的方法。產(chǎn)生由(i)外膜蛋白質(zhì)的信號序列、(ii)外膜蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)段和(iii)完整的成熟P-內(nèi)酰胺酶序列組成的三部分融合物，形成有活性的膜結(jié)合內(nèi)酰胺酶分子。但是，F(xiàn)rancisco的方法僅限于原核細(xì)胞系統(tǒng)，如作者所承認(rèn)，該方法需要完整的三部分融合以正確發(fā)揮功能?；腔D(zhuǎn)移酶本發(fā)明還提供生產(chǎn)包含硫酸化分子的肽的方法，硫酸化分子包括(例如)硫酸化多糖，如肝素、硫酸乙酰肝素、carragenen和相關(guān)化合物。適合的磺基轉(zhuǎn)移酶包括(例如)軟骨素-6-磺基轉(zhuǎn)移酶(Fukuta等人，J.Biol.Chem.270:18575-18580(1995)所述雞cDNA;GenBank檢索號D49915)、糖胺聚糖N_乙酰葡糖胺N_脫乙酰酶/N_磺基轉(zhuǎn)移酶1(Dixon等人，Genomics26:239-241(1995);UL18918)和糖胺聚糖N_乙酰葡糖胺N_脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶2(0rellana等人，J.Biol.Chem.269:2270-2276(1994)和Eriksson等人，J.Biol.Chem.269:10438-10443(1994)所述鼠cDNA;GenBank檢索號U2304所述人cDNA)。糖苷酶本發(fā)明還包含野生型和突變體糖苷酶的用途。已表明突變體P-半乳糖苷酶通過將a-糖基氟化物偶聯(lián)至半乳糖基受體分子催化二糖的形成(2001年9月4日公布的Withers的美國專利號6，284，494)。在本發(fā)明中有用的其他糖苷酶包括(例如)P_葡糖苷酶、P_半乳糖苷酶、P_甘露糖苷酶、P_乙酰葡糖胺糖苷酶、P-N-乙酰半乳糖胺酶、P_木糖苷酶、P_巖藻糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶、a-甘露糖苷酶、a_N_乙酰葡糖苷酶、a-N-乙酰半乳糖胺糖苷酶、a-木糖苷酶、a-巖藻糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶/唾液酸酶。醇碰本發(fā)明還提供固定在固相和/或可溶性支持體上的酶的用途。在示例性實施方案中，提供了通過本發(fā)明的完整的糖基連接體結(jié)合至PEG的糖基轉(zhuǎn)移酶。PEG-連接體_酶綴合物任選地連接至固相支持體。本發(fā)明方法中固定化酶的使用簡化了反應(yīng)混合物的建立和反應(yīng)產(chǎn)物的純化，還可容易地回收酶。本發(fā)明的方法中使用糖基轉(zhuǎn)移酶綴合物。酶和載體的其他組合為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。齡舶^在其他示例性實施方案中，本發(fā)明的方法使用融合蛋白質(zhì)，其具有一種以上酶活性參與希望的糖肽綴合物的合成。融合多肽可由(例如)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域組成，所述酶連接附屬酶的催化活性結(jié)構(gòu)域組成。附屬酶催化結(jié)構(gòu)域可(例如)催化糖基轉(zhuǎn)移酶的供體——核苷酸糖形成中的一個步驟，或催化涉及糖基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)的反應(yīng)。例如，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可符合讀框地連接至編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。得到的融合蛋白質(zhì)不僅可催化核苷酸糖的合成，還可催化糖部分向受體分子的轉(zhuǎn)移。融合蛋白質(zhì)可以是連接可表達(dá)核苷酸序列的兩種或多種循環(huán)酶。在其他實施方案中，融合蛋白質(zhì)包括兩種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。見如5，641，668。利用多種適合的融合蛋白質(zhì)，可容易地設(shè)計和制造本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖肽(見如PCT專利申請PCT/CA98/01180，其于1999年6月24日公布為W099/31224)。經(jīng)修飾的糖的制備本發(fā)明的方法一般使用經(jīng)修飾的糖。一方面，糖部分或糖部分-連接體盒和PEG或PEG-連接體盒基團(tuán)通過反應(yīng)性基團(tuán)的使用連接在一起，反應(yīng)性基團(tuán)通常被連接方法轉(zhuǎn)化成新的有機(jī)官能團(tuán)或非反應(yīng)性種類。糖反應(yīng)性官能團(tuán)位于糖部分的任一位置。在實施本發(fā)明中有用的反應(yīng)性基團(tuán)和反應(yīng)種類一般是生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域公知的。目前可用于反應(yīng)性糖部分的有利的反應(yīng)種類是在相對溫和的條件下進(jìn)行的反應(yīng)。其包括但不限于親核取代(如胺和醇與酰鹵、活性酯的反應(yīng))、親電取代(如烯胺反應(yīng))和碳_碳及碳_雜原子重鍵的加成(如邁克爾加成反應(yīng)，第爾斯-阿爾德加成)。這些和其他有用的反應(yīng)討論于(例如)March，AdvancedOrganicChemistry,第三片反，JohnWiley&Sons,NewYork,1985;Hermanson，BioconjugateTechniques，AcademicPress,SanDiego，1996;Feeney等人，ModificationofProteins;AdvancesinChemistrySeries,巻198，AmericanChemicalSociety，Washington,D.C.，1982。從糖核或修飾基團(tuán)伸出的有用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括但不限于(a)羧基及其各種衍生物，其包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺酯、N_羥基苯并三唑酯、?；u、?；溥?、硫酯、對硝基苯基酯、烷基酯、烯基酯、炔基酯和芳族酯；(b)羥基，其可轉(zhuǎn)化為如酯、醚、醛等；(c)鹵烷基，其中鹵素隨后可被親核基團(tuán)(如胺、羧酸陰離子、硫醇陰離子、碳負(fù)離子或醇鹽離子)取代，從而導(dǎo)致在鹵素原子官能團(tuán)處新基團(tuán)的共價連接；(d)親雙烯體基團(tuán)，其能參加第爾斯_阿爾德反應(yīng)，如馬來酰亞胺基；(e)醛基或酮基，使得可以通過羰基衍生物的形成(如亞胺、腙、縮氨基脲或后)，或通過如格氏加成或烷基鋰加成的機(jī)制衍生化；(f)磺酰鹵基團(tuán)，其隨后與胺反應(yīng)(例如)形成氨磺酰；(g)硫醇基，其可轉(zhuǎn)化為(例如)二硫化物或與酰鹵反應(yīng)；(h)胺或巰基，其可例如?；?、烷基化或氧化；(i)烯烴，其可進(jìn)行(例如)環(huán)化加成、?；?、邁克爾加成等；(j)環(huán)氧化物，其可與(例如)胺和羥基化合物反應(yīng)。這樣選擇反應(yīng)性官能團(tuán)，使其不參加或干擾組裝反應(yīng)性糖核或修飾基團(tuán)所必需的反應(yīng)。備選地，通過保護(hù)基團(tuán)的存在，可保護(hù)反應(yīng)性官能團(tuán)不參與反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何保護(hù)特定官能團(tuán)，使其不干擾所選擇的一組反應(yīng)條件。有用的保護(hù)基團(tuán)的實例見如Greene等人，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,NewYork,1991。在下文的討論中，給出了在實施本發(fā)明中有用的經(jīng)修飾的糖的許多特定實例。在示例性實施方案中，將唾液酸衍生物用作連接修飾基團(tuán)的糖核。關(guān)于唾液酸衍生物的討論的中心僅是為了說明的明晰性，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以類似于以唾液酸為例所述的方式活化和衍生許多其他糖部分。例如，許多方法可用來修飾半乳糖、葡萄糖、^乙酰半乳糖胺和巖藻糖等以產(chǎn)生一些糖底物，所述糖底物易于通過本領(lǐng)域公知的方法修飾。見如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6:93(1999);Schafer等人，J.Org.Chem.65:24(2000)。在示例性實施方案中，經(jīng)本發(fā)明方法修飾的G-CSF肽是在哺乳動物細(xì)胞(如CH0細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生的糖肽，并從而包含不完全唾液酸化的N-和/或0-連接的寡糖鏈。不具有唾液酸并且包含末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可被聚乙二醇化、聚丙二醇化或用經(jīng)修飾的唾液酸修飾。在圖解4中，用受保護(hù)的氨基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯處理氨基糖苷l，將糖胺殘基轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的受保護(hù)的氨基酸酰胺加合物。用醛縮酶處理加合物，形成a-羥基羧化物2?；衔?通過CMP-SA合成酶的作用轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的CMP衍生物，然后催化加氫CMP衍生物生成化合物3。通過化合物3與活化的PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-0C(0)0-對-硝基苯基)反應(yīng)，將通過甘氨酸加合物的形成引入的胺用作PEG連接的部位，分別生成如4或5的種類。圖解4OH).CMP-SA合成酶，CTP2.H2/Pd/CPEG-6.CMP-SA-5-NHCOCH2NH.PRG管OC(O)O-pNPCCMP-SA-5-NHCOCH2NH2CMP-SA-5-NHCOCH2NH——C(O)O-PEG66表3給出了用PEG部分衍生的糖單磷酸的代表性實例。表3中的某些化合物通過圖解4的方法制備。其他衍生物通過本領(lǐng)域公知的方法制備。見如K印pler等人，Glycobiology11:11R(2001);Charter等人，GlycobiologylO:1049(2000)。其他胺反應(yīng)性PEG和PPG類似物可從商業(yè)渠道獲得，或其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的方法制備。表3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>除上述位置外，可在其他位置取代在實施本發(fā)明中有用的經(jīng)修飾的糖磷酸。目前優(yōu)選的唾液酸取代如以下通式所示其中X為連接基團(tuán)，其優(yōu)選選自-0-、-N(H)-、-S、CH2_和N(R)y其中每一個R為獨立地選自R1-!5的成員。符號Y、Z、A和B各代表選自與上面對X的身份給出的基團(tuán)的基團(tuán)。X、Y、Z、A和B各自獨立地選擇，因此，它們可以相同或不同。符號IMr3、r4和R5代表H、PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分。備選地，這些符號代表結(jié)合PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分的連接體。連接至本文所公開的綴合物的示例性部分包括但不限于PEG衍生物(如?；?PEG、酰基-烷基-PEG.烷基-?；?PEG、氨甲?；?PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(如?；?PPG、?；?烷基-PPG、烷基-?；?PPG、氨甲?；?PPG、芳基-PPG)、治療部分、診斷部分、甘露糖_6-磷酸、肝素、類肝素、SLe"甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基LewisX、FGF、VFGF、蛋白質(zhì)、軟骨素、角質(zhì)素、皮膚素、白蛋白、整聯(lián)蛋白、觸角寡糖、肽等。將各種修飾基團(tuán)結(jié)合至糖部分的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的方法(Poly(EthyleneGlycolChemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications，J.MiltonHarris編車茸，PlenumPub.Corp.，1992;Poly(EthyleneGlycol)ChemicalandBiologicalApplications,J.MiltonHarris編車茸，ACSSymposiumSeriesNo.680，AmericanChemicalSociety,1997;Hermanson，BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego，1996;Dunn等人編車茸，PolymericDrugsAndDrugDeliverySystems,ACSSymposiumSeriesVol.469，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)。連粉本細(xì)(頓細(xì))本發(fā)明方法中所用經(jīng)修飾的糖的制備包括將PEG部分連接至糖殘基和優(yōu)選形成穩(wěn)定加合物，其是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。因此，常優(yōu)選使用連接體，如通過PEG和糖部分與綴合PEG和糖的交聯(lián)試劑反應(yīng)形成的連接體?？捎脕韺⑿揎椈鶊F(tuán)連接至碳水化合物部分的示例性雙功能化合物包括但不限于雙功能聚乙二醇、聚酰胺、聚醚、聚酯等。連接碳水化合物至其他分子的一般方法是文獻(xiàn)中已知的。見如Lee等人，Biochemistry28:1856(1989);Bhatia等人，Anal.Biochem.178:408(1989);Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112:8886(1990);Bednarski等人，W092/18135。在下文的討論中，將反應(yīng)性基團(tuán)處理為對新生經(jīng)修飾的糖的糖部分無危害。討論的中心是為了說明的明晰性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，此討論也與修飾基團(tuán)上的反應(yīng)性基團(tuán)有關(guān)。多種試劑可用來修飾具有分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)的經(jīng)修飾的糖的成分(交聯(lián)試劑綜述和交聯(lián)方法綜述見Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25:623-651,1972;Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，In:EnzymesasDrugs.(Holcenberg禾口Roberts編輯)395頁-442頁，Wiley，NewYork,1981;Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91:580-609，1983;Mattson等人，Mol.Biol.R印.17:167-183，1993，所述所有文獻(xiàn)在此引用作為參考)。優(yōu)選的交聯(lián)試劑衍生自多種零長度、同雙功能和雜雙功能交聯(lián)試劑。零長度交聯(lián)試劑包括兩個內(nèi)在化學(xué)基團(tuán)的直接綴合，不引入外在物質(zhì)。催化二硫鍵形成的試劑屬于這一類別。另一實例是誘導(dǎo)羧基和伯氨基縮合形成酰胺鍵的試劑(如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、Woodward's試劑K(2_乙基-5-苯基異噁唑-3'-磺酸鹽)和羰基二咪唑)。除這些化學(xué)試劑外，可將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(谷氨?；?肽Y-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶；EC2.3.2.13)用作零長度交聯(lián)試劑。此酶在蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰基殘基的氨甲?；幋呋；D(zhuǎn)移，通常以伯氨基為底物。優(yōu)選的同雙功能和雜雙功能試劑分別包含兩個相同的或兩個不同的位點，這些位點對氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性基團(tuán)有反應(yīng)性。重折疊不溶性G-CSF在細(xì)菌中表達(dá)的許多重組蛋白質(zhì)表達(dá)為細(xì)菌包含體內(nèi)不可溶的團(tuán)聚體。包含體是見于細(xì)菌胞質(zhì)和周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)沉積物。(見如Clark，Cur.Op.Biotech.12:202-207(2001))。重組G-CSF蛋白表達(dá)于細(xì)菌包含體，本文給出了重折疊這些蛋白質(zhì)，生成活性G-CSF蛋白質(zhì)的方法。重析疊活件G-CSF的條件為從細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)活性G-CSF蛋白質(zhì)，將G-CSF蛋白質(zhì)以細(xì)菌包含體表達(dá)，收集并破碎細(xì)菌，分離包含體并清洗。在一個實施方案中，進(jìn)行了3次清洗在pH6.0-9.0的緩沖液(單價鹽，如氯化鈉；非離子型去污劑，如TritonX_100;離子型去污劑，如脫氧膽酸納；和EDTA)中的第一次清洗。在無去污劑的緩沖液中的第二次清洗和在水中的第三次清洗。然后對包含體內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解?？赏ㄟ^變性劑鹽酸胍或尿素、極端PH或去污劑或這些的任一組合進(jìn)行溶解。在一個實施方案中，用5-6M的鹽酸胍或尿素溶解GCSF。在另一實施方案中，加入了DTT。溶解后，從GCSF蛋白質(zhì)混合物中去除變性劑?？赏ㄟ^多種方法去除變性劑，包括稀釋至重折疊緩沖液或緩沖液交換方法。緩沖液交換方法包括透析、滲濾、凝膠過濾和將蛋白質(zhì)固定至固相支持體。(見如Clark，Cur.Op.Biotech.12:202-207(2001))?？陕?lián)用上述任一方法去除變性劑。通過加入包含氧化還原對的重折疊緩沖液促進(jìn)GCSF蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成。氧化還原對包括還原型和氧化型谷胱甘肽(-JSF-I/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、DTT/GSSG和DTE/GSSG。(見如Clark，Cur.Op.Biotech.12:202-207(2001))。在一個實施方案中，氧化還原對是比例為10:1的GSH/GSSG。重折疊可在pH(例如)6.0-10.0的緩沖液中進(jìn)行。重折疊緩沖液可包含其他添加劑來增強(qiáng)重折疊，例如L-精氨酸(0.4-1M)、PEG、低濃度變性劑(如l-2M的尿素和0.5_1.5M的鹽酸月瓜)和去污劑(如Ch鄰s、SDS、CTAB、十二烷基麥芽苷、吐溫-80和TritonX-100)。重折疊后，可透析GCSF蛋白質(zhì)，去除氧化還原對或其他不需要的緩沖液成分。在一個實施方案中，用含有乙酸鈉、甘油和非離子型去污劑(如吐溫-SO)的緩沖液進(jìn)行透析。透析后，可進(jìn)一步純化GCSF蛋白質(zhì)和/或通過離子交換層析濃縮。在一個實施方案中，使用了SP-瓊脂糖陽離子交換樹脂。技術(shù)人員公知當(dāng)重折疊的蛋白質(zhì)具有可檢測到的生物活性時，蛋白質(zhì)已正確地重折疊。對GCSF蛋白質(zhì)，可通過多種方法測定生物活性。例如，生物活性GCSF蛋白質(zhì)是描述于2004年1月8日提交的美國專利申請60/535284、2004年2月12日提交的60/544411和2004年2月20日提交的律師巻號019957-018820US(其為了所有目的在此引用作為參考)中的O-連接的糖基化的底物。GCSF蛋白質(zhì)的活性還可通過大鼠中的細(xì)胞增殖測定或白細(xì)胞(WBC)測定來測量。(也描述于2004年1月8日提交的美國專利申請60/535284、2004年2月12日提交的60/544411和2004年2月20日提交的律師巻號019957-018820US，其為了所有目的在此引用作為參考。)增殖測定和WBC測定可在重折疊的GCSF蛋白質(zhì)的O-連接糖基化之前或之后進(jìn)行。分離本發(fā)明的綴合物的方法備選地，通過上述方法生產(chǎn)的產(chǎn)物可不經(jīng)純化即使用。但是，通常優(yōu)選回收產(chǎn)物?？捎帽娝苤臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行糖基化糖的回收，如薄層或厚層層析、柱層析、離子交換層析或膜過濾。如下文和本文中引用的文獻(xiàn)所討論，優(yōu)選使用膜過濾(更優(yōu)選使用反滲透膜)或一種或多種柱層析技術(shù)進(jìn)行回收。例如，可用其中膜具有約3000-約IO，OOO的分子量截斷的膜過濾來去除蛋白質(zhì)，如糖基轉(zhuǎn)移酶。然后可用納米過濾或反滲透去除鹽和/或純化產(chǎn)物糖(見如WO98/15581)。納米濾膜是一種反滲透膜，其可濾過單價鹽，但是截留大于約100-約2，000道爾頓的多價鹽和不帶電荷的溶質(zhì)，這取決于所用的膜。因此，在典型應(yīng)用中，通過本發(fā)明的方法制備的糖將被截留在膜中，而雜質(zhì)鹽將穿過。若經(jīng)修飾的糖蛋白是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，則第一步，通過(例如)離心或超濾去除微粒碎片(宿主細(xì)胞或裂解片段)；任選地，可用市售蛋白質(zhì)濃縮濾器濃縮蛋白質(zhì)，然后通過一個或多個選自下列方法的步驟將多肽變體從其他雜質(zhì)中分離出來免疫親和層析；離子交換柱分級分離(如在二乙基氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基質(zhì)上)；Blue-S印harose、CMBlue-S印harose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-S印harose、WGA—S印harose、ConA—S印harose、EtherToyopearl、butylToyopearl、phenylToyopearl或A蛋白-S印harose層析；SDS-PAGE層析；硅膠層析；層析聚焦；反相HPLC(如附帶脂肪族基團(tuán)的硅膠)；使用(例如)S印hadex分子篩的凝膠過濾或大小排阻層析；選擇性結(jié)合多肽的柱層析；乙醇或硫酸銨沉淀。通常通過以下方法分離在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的經(jīng)修飾的糖肽先從細(xì)胞、酶等中提取，然后進(jìn)行一個或多個濃縮、鹽析、水相離子交換或大小排阻層析步驟。此外，可以通過親和層析純化經(jīng)修飾的糖蛋白。最后，可以用HPLC進(jìn)行最后的純化步驟。上述任一步驟中可以包含蛋白酶抑制劑(如甲基磺酰氟化物(PMSF))來抑制蛋白質(zhì)水解作用，可以包含抗生素以防止偶發(fā)的污染物的生長。在另一實施方案中，先用市售蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾裝置)對來自生產(chǎn)本發(fā)明經(jīng)修飾的糖肽的系統(tǒng)的上清進(jìn)行濃縮。濃縮步驟之后，可將濃縮物加至適合的純化基質(zhì)。例如，適合的親和基質(zhì)可以包含肽的配體、結(jié)合至適合支持體的凝集素或抗體分子。備選地，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有側(cè)翼DEAE基團(tuán)的基質(zhì)或底物。適合的基質(zhì)包含丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或其他在蛋白質(zhì)純化中常用的類型。備選地，可以使用陽離子交換步驟。適合的陽離子交換劑包含多種含有磺丙基或羧甲基的不可溶基質(zhì)。尤其優(yōu)選磺丙基。最后，可以使用一個或多個使用疏水RP-HPLC介質(zhì)(如具有側(cè)翼甲基或其他脂肪族基團(tuán)的硅膠)的RP-HPLC步驟進(jìn)一步純化多肽變體組合物?？梢允褂们笆龅募兓襟E的一些或全部的各種組合，以提供同質(zhì)的經(jīng)修飾的糖蛋白。可以通過類似于Urdal等人，J.Chromatog.296:171(1984)中所公開的方法，純化產(chǎn)生自大規(guī)模發(fā)酵的本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖肽。這篇參考文獻(xiàn)描述了在制備性HPLC柱上純化重組人IL-2的兩個連續(xù)的RP-HPLC步驟。備選地，可以用如親和層析的技術(shù)來純化經(jīng)修飾的糖蛋白。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物。藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑和非天然存在的PEG部分、治療部分或生物分子與糖基化或非糖基化肽間的共價綴合物。聚合物、治療部分或生物分子通過完整的糖基連接基團(tuán)結(jié)合至G-CSF肽，所述糖基連接基團(tuán)插入G-CSF肽和聚合物、治療部分或生物分子之間，并與二者共價連接。本發(fā)明的藥物組合物適用于多種藥物遞送系統(tǒng)。適用于本發(fā)明的制劑見于Remington'sPharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,Philadelphia,PA，第17版(1985)。藥物遞送方法的簡要綜述見Langer，Science249:1527-1533(1990)。藥物組合物可配制用于任一種適合的給藥方式，包含(例如)局部、口腔、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。對腸胃外給藥(如皮下注射)，載體優(yōu)選包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對口服給藥，可使用上述任一載體或固相支持體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。還可用生物可降解的微球體(如聚乳酸、聚甘醇酸)作為本發(fā)明的藥物組合物的載體。適合的生物可降解的微球體公開于(例如)美國專利號4，897，268和5，075，109。通常，藥物組合物經(jīng)腸胃外施用，如靜脈內(nèi)。因此，本發(fā)明提供腸胃外給藥的組合物，其包含溶解或懸浮于可接受載體(優(yōu)選含水載體，如水、緩沖液、鹽水、PBS等)的化合物。組合物可以包含接近生理條件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑、去污劑等。這些組合物可以經(jīng)常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌或過濾除菌。獲得的水溶液以水溶液形式包裝使用，或經(jīng)凍干，在給藥前將凍干制劑與無菌的水性載體混合。制劑的PH值一般在3-11之間，更優(yōu)選在5-9之間，最優(yōu)選在7-8之間。在一些實施方案中，本發(fā)明的糖肽可摻入形成自標(biāo)準(zhǔn)囊形成脂類的脂質(zhì)體內(nèi)?？色@得制備脂質(zhì)體的多種方法，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、美國專利號4，235，871、4，501，728和4，837，028中所述。用多種靶向試劑(如本發(fā)明的唾液酸基半乳糖苷)進(jìn)行脂質(zhì)體的靶向為本領(lǐng)域公知(見如美國專利號4，957，773和4，603，044)?？墒褂脤邢蛟噭┡悸?lián)至脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法一般涉及脂類成分如磷酯酰乙醇胺摻入脂質(zhì)體，所述脂類成分活化后可連接靶向試劑或衍生的親脂化合物，如本發(fā)明中的脂類衍生的糖肽。靶向機(jī)制一般需將靶向試劑置于脂質(zhì)體表面，通過這樣的方式使得靶部分可與靶點(如細(xì)胞表面受體)相互作用。在脂質(zhì)體形成前，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(如分別用長鏈烷基鹵或脂肪酸將碳水化合物上存在的羥基烷化或?；?，將本發(fā)明的碳水化合物連接至脂類分子。備選地，可以以在形成膜時先將連接體部分摻入膜內(nèi)的方式制備脂質(zhì)體。連接體部分必須具有親脂部分，其可穩(wěn)固植入和錨定在膜內(nèi)。連接體部分還必須具有反應(yīng)性部分，其可在脂質(zhì)體水相表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。選擇反應(yīng)性部分，使其適合通過化學(xué)反應(yīng)與后來加入的靶向試劑或碳水化合物形成穩(wěn)定化學(xué)鍵。一些情況下，可能直接將靶向試劑連接至連接體分子，但大多數(shù)情況下，更適于使用第三個分子作為化學(xué)橋，從而將膜內(nèi)的連接體分子連接至靶向試劑或碳水化合物，所述靶向試劑或碳水化合物在三維上伸出囊表面。通過本發(fā)明方法制備的化合物還可用作診斷試劑。例如，在疑似炎癥患者中，可用帶標(biāo)記的化合物來定位炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移的區(qū)域。對此用途，可用251、14(:或氚標(biāo)記化合物。本發(fā)明的藥物組合物中所用的活性成分是糖聚乙二醇化G-CSF及其衍生物，所述糖聚乙二醇化G-CSF及其衍生物具有促卵泡激素的生物學(xué)特性以增加(如)排卵。優(yōu)選地，本發(fā)明的G-CSF組合物經(jīng)腸胃外給藥(如IV、IM、SC或IP)。預(yù)期有效劑量依所治療的疾病和給藥途徑而有明顯變化，但預(yù)期其處于約0.1(7U)-100(7000U)iig活性物質(zhì)/kg體重的范圍內(nèi)。治療貧血的優(yōu)選劑量為約50-約300U/kg，每周三次。因為本發(fā)明提供體內(nèi)駐留時間增強(qiáng)的G-CSF，所以在施用本發(fā)明的組合物時，任選地降低所述劑量。劑型在優(yōu)選的方面，根據(jù)上述任一方法，以口服劑型提供治療與造血作用或骨髓抑制相關(guān)的疾病所用的肽綴合物。在優(yōu)選實施方案中，這些口服劑型包含以下成分(a)為G-CSF肽和水溶性聚合物間的共價綴合物的肽，其中水溶性聚合物通過完整的糖基連接基團(tuán)，在G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至G-CSF肽；(b)—種或多種表面活性劑；(c)一種或多種脂肪酸；(d)腸溶物質(zhì)。在尤其優(yōu)選的實施方案中，肽、表面活性劑和脂肪酸混合于液相，凍干后與腸溶物質(zhì)組合。應(yīng)理解，本文所述實例和實施方案僅是出于說明性的目的，根據(jù)這些實例和實施方案的各種修改或改變將向本領(lǐng)域技術(shù)人員暗示并且將包含于本申請的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用的所用出版物、專利和專利申請都為了所有目的在此以其整體引入作為參考。提供以下實施例來說明本發(fā)明的組合物和方法，但不限制要求保護(hù)的發(fā)明。實施例實施例1:與響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物肽的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)相關(guān)的藥物動力學(xué)羅響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物和市售G-CSFNeulasta的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)的藥物動力學(xué)研究顯示，在相同濃度下，本發(fā)明的組合物顯示出與Neulasta相似的作用時序(圖l)。嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)具有劑量依賴性，增加本發(fā)明G-CSF綴合物(糖聚乙二醇化G-CSF)的濃度導(dǎo)致活性時序峰值處的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目增加。糖聚乙二醇化G-CSF產(chǎn)生比Neulasta高約30%的反應(yīng)，表明在相當(dāng)?shù)膭┝肯?，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60%。此研究包含53名受試者。每一劑量組有20名受試者，隨機(jī)選擇15名受試者至糖聚乙二醇化G-CSF組，5名受試者至Neulasta組。糖聚乙二醇化G-CSF—般被很好地耐受，不良事件譜與Neulasta類似。未出現(xiàn)因不良事件而中止。也未出現(xiàn)任何嚴(yán)重不良事件。此72外，未檢測到針對糖聚乙二醇化G-CSF的抗體。表4列出了施用糖聚乙二醇化G-CSF后24小時至168小時內(nèi)三種不同糖聚乙二醇化G-CSF濃度的一些代表性數(shù)據(jù)點。表4小時<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>實施例2:與響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物肽的CD34+計數(shù)相關(guān)的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物(Glyco-PEGG-CSF)和市售G-CSFNeulasta的CD34+計數(shù)的藥物動力學(xué)研究顯示，在相同濃度下，本發(fā)明的組合物具有與Neulasta相似的作用時序(圖2)。在相同濃度下，糖聚乙二醇化G-CSF在其活性峰值處顯示出明顯高于Neulasta的CD34+計數(shù)。細(xì)胞計數(shù)具有劑量依賴性，增加糖聚乙二醇化G-CSF的濃度導(dǎo)致活性時序峰值處的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目增加。表5列出了施用糖聚乙二醇化G-CSF后72小時至168小時內(nèi)三種不同糖聚乙二醇化G-CSF濃度的一些代表性數(shù)據(jù)點。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實施例3:與響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物肽的嗜中件粒細(xì)胞計數(shù)相關(guān)的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)固定劑量研究響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物(糖聚乙二醇化G-CSF)和市售G-CSFNeulasta的嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)的固定劑量藥物動力學(xué)研究顯示，本發(fā)明的組合物顯示出與Neulasta相似的作用時序(圖4)。糖聚乙二醇化G-CSF產(chǎn)生比Neulasta高約30%的反應(yīng)，表明在此劑量下，糖聚乙二醇化G-CSF的生物利用度比Neulasta高60%。此研究招募了36名健康受試者。糖聚乙二醇化G-CSF—般被很好地耐受，不良事件與Neulasta類似。未出現(xiàn)因不良事件而中止，也未出現(xiàn)任何嚴(yán)重不良事件。未檢測到針對糖聚乙二醇化G-CSF的抗體。實施例4:與響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物肽的CD34+計數(shù)相關(guān)的藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)固定劑量研究響應(yīng)本發(fā)明G-CSF綴合物(糖聚乙二醇化G-CSF)和市售G-CSFNeulasta的CD34+計數(shù)固定劑量藥物動力學(xué)研究顯示，本發(fā)明的組合物顯示出與Neulasta相似的作用時序(圖5)。實施例5:同種異體/自體CD34+外周血祖細(xì)胞的動員用10-20iig/kg的糖聚乙二醇化GCSF(Glyco-PEGG-CSF)治療骨髓移植供體5天，將CD34+細(xì)胞從靜息水平(2/iiL)增加至約10/yL，該量足夠在單次成分輸血中提供2-4X106CD34+細(xì)胞/kg。骨髓移植供體可以是同種異體(與受體相同)或自體(與受體不同)供體。權(quán)利要求增加供體中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述供體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合的修飾基團(tuán)是水溶性聚合物。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述水溶性聚合物是選自線性水溶性聚合物和分支水溶性聚合物的成員。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述聚合的修飾基團(tuán)和所述糖基連接基團(tuán)通過連接體共價連接。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述糖基連接基團(tuán)包含經(jīng)修飾的唾液酸殘基，其中所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基具有根據(jù)以下通式的結(jié)構(gòu)其中R是所述聚合的修飾基團(tuán)，并且所述聚合的修飾基團(tuán)通過所述連接體連接至所述唾液酸殘基。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基具有根據(jù)以下通式的結(jié)構(gòu)其中n是1-2000的整數(shù)。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述聚合的修飾基團(tuán)具有基本均勻分散的分子量分布。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基連接基團(tuán)包含具有以下通式的經(jīng)修飾的唾液酸殘射R2為H、CH20R7、C00R7或0R7，射R7代表H、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的雜烷基；R3和R4是獨立地選自H、取代或未取代的烷基、0R8、NHC(0)R9的成員，射R8和R9獨立地選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基或唾液酸；La是選自鍵、取代或未取代的烷基和取代或未取代的雜烷基的連接體，R16和R"是獨立選擇的聚合臂；X2和X4是獨立選擇的連接片段，其連接聚合部分R16和R17至C;X5是非反應(yīng)性基團(tuán)。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述氨基酸殘基是選自絲氨酸或蘇氨酸的成員。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述G-CSF肽具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述氨基酸殘基是SEQ.ID.NO:1的134位蘇氨酸。13.權(quán)利要求6的方法，其中所述糖基連接基團(tuán)包含選自以下的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>R15是所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基；P和q是獨立選自0或1的整數(shù)。14.權(quán)利要求13的方法，其中q是O。15.權(quán)利要求6的方法，其中所述糖基連接基團(tuán)具有選自以下的通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>AA是所述肽的氨基酸殘基；t是等于0或1的整數(shù)；P是0-10的整數(shù)；禾口R15'是選自H、OH、唾液酸、所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基和Sia-Siap的成員；射Siap是所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基，其中至少一個R15'選自所述經(jīng)修飾的唾液酸殘基和Sia-Siap。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述氨基酸殘基是天冬酰胺殘基。17.增加受試者中粒細(xì)胞數(shù)目的方法，其中所述受試者適合進(jìn)行骨髓移植，所述方法包括對所述受試者施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述G-CSF肽具有SEQIDNO:l的氨基酸序列，其中所述聚合的修飾基團(tuán)在所述G-CSF肽的從126位甘氨酸延伸至143位絲氨酸的區(qū)域內(nèi)共價連接至所述G-CSF肽。18.增加受試者中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述受試者施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述G-CSF肽包含根據(jù)以下通式的結(jié)構(gòu)其中n是1-2000的整數(shù)。19.權(quán)利要求18的方法，其中n是400-500的整數(shù)。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述G-CSF肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。21.預(yù)防、治療和減輕癌癥治療引起的骨髓抑制的方法，所述方法包括對所述癌癥治療受體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述癌癥治療包括選自放射療法和化學(xué)療法的成員。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述聚合的修飾基團(tuán)和所述糖基連接基團(tuán)通過連接體共價連接。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述糖基連接基團(tuán)是唾液酸殘基，其中所述唾液酸殘基具有根據(jù)以下通式的結(jié)構(gòu)其中R是所述聚合的修飾基團(tuán)，并且所述聚合的修飾基團(tuán)通過所述連接體連接至所述唾液酸殘基。25.治療需進(jìn)行該治療的受試者中疾病的方法，所述疾病特征在于所述受試者中白細(xì)胞產(chǎn)生減弱，所述方法包括對所述受試者施用一定量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽，其中所述量有效改善所述受試者的所述疾病。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述白細(xì)胞產(chǎn)生減弱是化學(xué)療法、放射療法或原發(fā)性血Thrl34——O—GalNAc—(Gal)q—Sia—PEG射q是0或1;和Sia-PEG具有根據(jù)以下通式的結(jié)構(gòu)小板減少性紫癜的結(jié)果。27.治療哺乳動物中嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，包括施用藥學(xué)有效量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。28.治療哺乳動物中血小板減少癥的方法，包括施用藥學(xué)有效量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。29.擴(kuò)增培養(yǎng)物中造血干細(xì)胞的方法，所述方法包括對所述干細(xì)胞施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。30.增加受試者中造血作用的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。31.增加受試者中造血祖細(xì)胞數(shù)目的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的肽的步驟，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述造血祖細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。33.增加供體中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述供體施用有效量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。34.提供骨髓的穩(wěn)定植入的方法，所述方法包括(a)對所述骨髓的供體施用肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽；(2)從所述供體分離所述骨髓；并(3)將所述骨髓輸入受體。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述供體與所述受體是同一個體。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述供體與所述受體是不同個體。37.增加受試者中造血祖細(xì)胞數(shù)目的方法，所述方法包括對所述受試者施用(a)第一種組合物，其包含式(l)l，l'-[1，4-亞苯基-雙-(亞甲基)-雙-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(AMD3100)的化合物；(b)第二種組合物，其包含肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述第一種組合物和所述第二種組合物以任一順序順序施用。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述第一種組合物和所述第二種組合物同時施用。40.權(quán)利要求37的方法，其中所述造血祖細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。41.包含以下成分的口服劑型(a)肽，所述肽是G-CSF肽和水溶性聚合物間的共價綴合物，其中所述水溶性聚合物通過完整的糖基連接基團(tuán)，在所述G-CSF肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述G-CSF肽；(b)表面活性劑；(c)脂肪酸；禾口(d)腸溶物質(zhì)，其中所述成分(a)、(b)和(c)混合于液相，并凍干后與成分(d)組合。42.增加供體中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述供體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽，并且其中所述量在約lmg至約20mg的范圍內(nèi)。43.增加供體中干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括對所述供體施用一定量的肽，所述肽是G-CSF肽和聚合的修飾基團(tuán)間的共價綴合物，其中所述聚合的修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述肽的糖基或氨基酸殘基處共價連接至所述肽，其中所述量是選自25yg/kg、50iig/kg、100iig/kg和200iig/kg的單位劑型。全文摘要本發(fā)明提供具有治療活性的糖聚乙二醇化G-CSF，其與未經(jīng)糖聚乙二醇化的相同或非常相似的G-CSF肽相比，具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)參數(shù)和性質(zhì)。此外，本發(fā)明提供動員受試者，尤其是已接受或?qū)⒔邮芊派浏煼ɑ蚧瘜W(xué)療法的受試者中造血作用的方法。本發(fā)明的方法和組合物還可用于預(yù)防、減輕和治療這些療法的骨髓抑制作用。文檔編號C07K1/00GK101796063SQ200880018516公開日2010年8月4日申請日期2008年4月1日優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日發(fā)明者D·A·措普夫,H·盧伯諾申請人:拜奧吉耐里克斯股份公司