專利名稱：：利用核酸酶-適配體復(fù)合物檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及利用核酸酶-適配體(aptamer)復(fù)合物檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法。
背景技術(shù)：
：業(yè)已開發(fā)了許多檢測(cè)感興趣核苷酸序列(本文也稱為“靶核苷酸序列”)的分子技術(shù)。在許多其它應(yīng)用中這些方法已用于，例如，公眾健康、食物和水的病原體(GMO)檢測(cè)、流行病學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因生物體(geneticallymodifiedorganism)的檢測(cè)、醫(yī)藥、臨床診斷、疾病可疑性診斷、組織分型、血液篩選、法醫(yī)學(xué)、生物武器檢測(cè)、分子毒理學(xué)、基因治療和DNA靶向(治療)，等等?，F(xiàn)有的檢測(cè)靶DNA序列的方法一般涉及一種分子技術(shù)或數(shù)種分子技術(shù)的組合。這些技術(shù)通常分為三類，不嚴(yán)格地定義為序列特異性檢測(cè)，序列特異性富集和信號(hào)擴(kuò)增。大多數(shù)檢測(cè)技術(shù)通過利用互補(bǔ)性探針或寡核苷酸與靶DNA樣品中感興趣序列的堿基配對(duì)而獲知其序列特異性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和Southern印跡法(Southernblot)這兩種最常用的DNA檢測(cè)方法差別是它們?nèi)绾螐拇它c(diǎn)開始而進(jìn)行下去。PCR方法通過一系列擴(kuò)增循環(huán)富集靶DNA，通過利用例如顏色、熒光或放射標(biāo)記的來檢測(cè)信號(hào)。而Southern印跡法雖不包括DNA富集步驟，但利用了高能32P作信號(hào)擴(kuò)增。這些已廣泛使用的技術(shù)雖已高度發(fā)展，但仍有顯著缺點(diǎn)。PCR需要昂貴的設(shè)備，費(fèi)時(shí)和對(duì)專業(yè)技能的需求高。Southern印跡法常常要采用有害的放射標(biāo)記物，要花費(fèi)多達(dá)一周時(shí)間才能完成，并且需要大量的底物DNA。檢測(cè)樣品中特異性DNA序列的有效生物傳感器也有目前所用技術(shù)的一種或多種缺陷，但基本上不喪失靶特異性或敏感性是合乎要求的。另外，理想地也要求這類技術(shù)的資金輸入低(特別是有設(shè)備需求的情況下)，專業(yè)技能或特定技術(shù)培訓(xùn)最少，以及能提供快速精確的結(jié)果。本說明書中提及的任何現(xiàn)有技術(shù)，不是和不應(yīng)被認(rèn)為或任何形式地提議是承認(rèn)此種現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成任何國家中常用一般知識(shí)的一部分。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，其中該方法采用了核酸酶-適配體復(fù)合物。因此，本發(fā)明第一方面，提供了一種檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，該方法包括提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了此核酸酶的活性，當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)即直接或間接地減少或消除適配體對(duì)核酸酶活性的抑制；將核酸酶_適配體復(fù)合物加入到樣品中；檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在靶核苷酸序列。在適配體復(fù)合物中核酸酶具體用作指示劑，因?yàn)樵S多核酸酶比其它酶活性高，可實(shí)現(xiàn)較高程度的信號(hào)擴(kuò)增。而且現(xiàn)已有廣泛陣列的核酸酶可購得，其中許多酶作用于不同的核酸底物或特異性核酸序列。這種靶特異性也使本發(fā)明得以提供“多重”檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)樣品中的多種靶序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述核酸酶是限制性內(nèi)切核酸酶。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法利用適配體與靶核苷酸序列之間的雜交來修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合。因此，在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性，當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)該適配體能與靶核苷酸序列雜交從而修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合；將核酸酶_適配體復(fù)合物加入到樣品中；如果樣品中存在靶核苷酸序列，該序列即與適配體雜交；和檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。在本發(fā)明上述實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)和選擇適配體使之包含能結(jié)合核酸酶的區(qū)域和能與靶核苷酸序列雜交的區(qū)域。然而，在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，對(duì)設(shè)計(jì)和選擇同時(shí)包含核酸酶結(jié)合區(qū)和靶核苷酸序列結(jié)合區(qū)的適配體的必要性可通過使用接頭核酸而消除。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性；提供一種接頭核酸，其包含能與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交的第一部分，并包含該接頭核酸第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)能與適配體雜交的第二部分，其中適配體與接頭核酸第二部分之間的雜交修飾、減少或消除了適配體與核酸酶之間的結(jié)合；將核酸酶_適配體復(fù)合物加入到樣品中；將接頭核酸加入到樣品中；使接頭核酸第一部分與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交；當(dāng)該接頭核酸第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)，使接頭核酸第二部分與適配體雜交；禾口檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。核酸酶_適配體復(fù)合物在本發(fā)明方法中的使用也使本發(fā)明方法能夠進(jìn)行多重檢測(cè)，即本發(fā)明也提供同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法。第二方面，本發(fā)明提供一種篩檢某生物體中是否存在靶核苷酸序列的方法，該方法包括獲得該生物體的含核酸樣品，及按本發(fā)明第一方面的方法檢測(cè)該樣品中是否存在靶核苷酸序列。第三方面，本發(fā)明提供一種核酸酶結(jié)合性適配體，該適配體與核酸酶結(jié)合可抑制核酸酶的活性。第四方面，本發(fā)明提供一種核酸酶-適配體復(fù)合物，其包含與適配體結(jié)合的核酸酶。第五方面，本發(fā)明包括一種接頭核酸，其包含能與靶核苷酸序列雜交的第一部分，并包含該接頭核酸第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)能與核酸酶-適配體復(fù)合物中的適配體雜交的第二部分，其中適配體與接頭核酸第二部分之間的雜交修飾、減少或消除了核酸酶_適配體復(fù)合物中適配體與核酸酶之間的結(jié)合。第六方面，本發(fā)明提供一種用于實(shí)施本發(fā)明任何一種方法的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明第三方面的一種或多種適配體；本發(fā)明第四方面的核酸酶-適配體復(fù)合物；和/或本發(fā)明第五方面的接頭核酸。在本說明書全篇中，除了另作指明的內(nèi)容外，詞語“包含”或其變化詞，如“包括”或“含有”，應(yīng)理解為包括所述的基本組分、基本組分的整體或組別，但不排除任何其它基本組分、基本組分的整體或組別。本文中，用序列標(biāo)識(shí)符(SEQIDNO:)稱呼核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO數(shù)字與序列表中該序列標(biāo)識(shí)符相對(duì)應(yīng)，如<400>1(SEQIDNO1),<400>2(SEQIDNO2)等等。表1提供了序列標(biāo)識(shí)符概要，說明書末尾處提供了序列表。表1.序列標(biāo)識(shí)符概要<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>示范性實(shí)施方式的描述應(yīng)理解，以下描述目的只是說明具體實(shí)施方式，不是將本發(fā)明限制于所描述的方面。第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，該方法包括提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性，其中當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)適配體對(duì)核酸酶活性的抑制被直接或間接地減少或消除；將核酸酶-適配體復(fù)合物加入到樣品中；檢測(cè)該核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。要檢測(cè)靶核苷酸序列的“樣品”可以是推測(cè)含有靶核苷酸序列的任何樣品。例如，此樣品可以是生物學(xué)樣品，包括得自生物體的樣品，含一種細(xì)胞或多種細(xì)胞的樣品，血液樣品，血漿樣品，及腦脊液(CSF)樣品，羊水樣品等等；環(huán)境樣品，如水、空氣或土壤樣品；食物或飲料樣品等等。此處考慮的樣品可以粗制形式使用，或可按本發(fā)明方法加工后使用。例如，可對(duì)所述樣品進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核酸提取或純化步驟以使樣品中存在的任何核酸純化或半純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定提取和純化一系列樣品中核酸的方法。關(guān)于這點(diǎn)，可參見“核酸方案手冊(cè)(TheNucleicAcidProtocolsHandbook)”(Rapley主編，Humana出版社，2000)。參見本文，“核酸酶”應(yīng)理解為能切割核酸的糖_磷酸骨架的任何酶。這樣，“核酸酶”應(yīng)理解為包括內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶。此外，考慮可用于本發(fā)明的核酸酶可以是脫氧核糖核酸酶(切割DNA)或核糖核酸酶(切割RNA)。通常本發(fā)明用的核酸酶，是一旦受到適配體抑制其活性降低或消失而不能切割或消化靶核苷酸序列，但仍能切割或消化其它核苷酸序列(如報(bào)告核酸，見下文)的核酸酶，故可檢測(cè)此核酸酶的活性?？捎糜诒景l(fā)明的核酸酶包括，例如，限制性內(nèi)切核酸酶、能切割序列錯(cuò)配的核酸酶、Sl核酸酶、T7內(nèi)切核酸酶I、T4內(nèi)切核酸酶VII、CELI(屬于Sl核酸酶家族的一種植物特異性胞外糖蛋白)和核糖核酸酶，如RNA酶A和H)。然而，在本發(fā)明某些具體實(shí)施方式中(見下文)，核酸酶可以是限制性內(nèi)切核酸酶。術(shù)語“適配體”本文中應(yīng)理解為一種核酸分子，此分子的至少一部分能結(jié)合另一分子。核酸適配體通常是單鏈核酸分子，具有復(fù)雜的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)(如下文討論的可包含雙鏈部分或區(qū)域)，能以高親和力特異性結(jié)合靶分子。當(dāng)與酶結(jié)合時(shí)，某些適配體能降低或抑制酶的活性。本發(fā)明考慮的核酸酶結(jié)合適配體至少能結(jié)合一種核酸酶而改變此酶的活性。而且，本發(fā)明考慮的核酸酶結(jié)合性適配體當(dāng)與核酸酶結(jié)合時(shí)，通常降低或消除了此酶的活性。本發(fā)明的適配體也可包含不結(jié)合核酸酶的區(qū)域，此區(qū)域或核酸酶結(jié)合區(qū)域本身也可顯示對(duì)其它分子如靶核苷酸序列或接頭核酸具有結(jié)合親和力(見下文)?？紤]可用于本發(fā)明的適配體可以是任何合適的核酸或其等價(jià)物。就此點(diǎn)而言，所述適配體包括，例如DNA、RNA、核酸擬似物如肽核酸(PNA)或封閉的核酸(LNA)、含有一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸的DNA或RNA等等?！靶揎椀摹焙塑账岚?，例如，其磷酸骨架、糖部分或堿基部分含有化學(xué)修飾的、含三苯甲基化堿基的和含稀有堿基如肌苷的核苷酸。采用修飾的核苷酸還可影響適配體與核酸酶的結(jié)合特性，例如參見Latham等(NuclAcidsRes22(14)2817-2822,1994)所述。在某些具體實(shí)施方式中可采用RNA適配體，因?yàn)镽NA能形成DNA通常不能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如假結(jié)和堿基三連體。核酸適配體也可用許多方法修飾，例如用以提高其穩(wěn)定性，包括例如(i)用L-核苷酸(天然核苷酸的鏡像物)合成適配體，這樣它們不會(huì)被天然核酸酶降解；(ii)在適配體中摻入封閉的核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)殘基，LNA和PNA也能增強(qiáng)核酸雙鏈體的穩(wěn)定性；(iii)其它化學(xué)修飾的核糖核酸，如2’-氨基-和2’-氟-嘧啶核苷酸或2’-0-甲基核苷酸；和/或(iv)用脫氧胸苷加帽3’末端以增強(qiáng)其對(duì)外切核酸酶的抗性。可用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生能結(jié)合和抑制特定蛋白質(zhì)(如核酸酶)活性的核酸適配體。例如，可采用體外選擇法(如參見Ellingon和Szostak，Nature346(6287)=818-22,1990)和SELEX法(如參見Tuerk和Gold，Science249(4968):505_510，1990)。也可在Osborne和Ellington(ChemRev97(2)=349-370,1997)的綜述中找到關(guān)于產(chǎn)生和選擇適配體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。鑒于以上所述，“核酸酶-適配體復(fù)合物”應(yīng)理解為核酸酶已與適配體結(jié)合，或在實(shí)施本發(fā)明方法的條件下核酸酶與適配體可形成結(jié)合，因此適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性，但當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)，其直接或間接減少或消除了適配體對(duì)核酸酶活性的抑制。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，樣品中存在的靶核苷酸序列能修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合，從而減少或消除適配體對(duì)核酸酶活性的抑制。本文提及的修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合，指適配體與核酸酶之間結(jié)合性質(zhì)的任何質(zhì)或量的變化，這種變化造成了適配體對(duì)核酸酶活性抑制的降低或消除。這種變化的出現(xiàn)是由于適配體與另一種分子(如靶核苷酸序列或接頭核酸)之間發(fā)生結(jié)合，或核酸酶-適配體復(fù)合物與另一種分子(如靶核苷酸序列或接頭核酸)之間發(fā)生結(jié)合的結(jié)果。適配體與核酸酶之間結(jié)合性質(zhì)的“質(zhì)或量的變化”可包括，例如，核酸酶與適配體之間結(jié)合強(qiáng)度的變化；核酸酶和/或適配體相互作用或結(jié)合位點(diǎn)的變化；核酸酶_適配體復(fù)合物的解離，任選地適配體與另一分子的結(jié)合；適配體或核酸酶的構(gòu)型、二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化降低了適配體對(duì)核酸酶的抑制；適配體和/或核酸酶上結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)位置的改變等等。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法利用適配體與靶核苷酸序列之間的雜交來修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合。因此，在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性，其中當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)，該適配體能與靶核苷酸序列雜交而修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合；將核酸酶_適配體復(fù)合物加入到樣品中；如果樣品中存在靶核苷酸序列，該序列即與適配體雜交；和檢測(cè)該核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。在本發(fā)明此實(shí)施方式中，適配體能與靶核苷酸序列雜交而修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合。在樣品的起始條件下，可發(fā)生靶核苷酸序列與適配體之間的雜交，與伴隨的核酸酶與適配體之間結(jié)合的修飾、減少或消除，或者可改變條件以使適配體與靶核苷酸序列(如果存在的話)之間發(fā)生結(jié)合或促進(jìn)其結(jié)合。例如，可通過改變鹽濃度和/或溫度來改變適配體與靶核苷酸序列之間的結(jié)合，和/或適配體與核酸酶之間的結(jié)合。此外，也可利用去穩(wěn)定劑如甲酰胺來改變適配體與任何核酸酶、靶核苷酸序列和/或接頭核酸的結(jié)合。在本發(fā)明此實(shí)施方式中，應(yīng)設(shè)計(jì)或選擇同時(shí)包含核酸酶結(jié)合區(qū)域和至少在某些雜交條件下能與靶核苷酸序列雜交的區(qū)域的適配體。這些區(qū)域可隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基，部分重疊，全部重疊，或一個(gè)區(qū)域可包含在另一個(gè)區(qū)域中，然而，在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)或選擇同時(shí)包含核酸酶結(jié)合區(qū)和靶核苷酸序列結(jié)合區(qū)的適配體的必要性可通過利用接頭核酸而消除。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，其中適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性；提供一種接頭核酸，其包含能與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交的第一部分，并包含當(dāng)該接頭核酸的第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)能與適配體雜交的第二部分，其中適配體與接頭核酸第二部分之間的雜交修飾、減少或消除了適配體與核酸酶之間的結(jié)合；將核酸酶_適配體復(fù)合物加入到樣品中；將接頭核酸加入到樣品中；使接頭核酸的第一部分與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交；當(dāng)該接頭核酸的第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)，使接頭核酸的第二部分與適配體雜交；和檢測(cè)該核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。在一實(shí)施方式中，所述接頭核酸包含一莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且該接頭的第一部分至少一部分包含在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，該接頭的第二部分至少一部分包含在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干中。在一實(shí)施方式中，當(dāng)接頭與靶核苷酸序列結(jié)合時(shí)，所述接頭第二部分(即適配體結(jié)合部分)的長度通常足夠允許其莖干部分變性或解離。如此，接頭的第一部分(至少其一部分包含在莖環(huán)的環(huán)區(qū)內(nèi))雜交時(shí)通常會(huì)作用于接頭的莖干部分使之變性或解離，從而暴露出接頭核酸的適配體結(jié)合區(qū)。鑒于以上所述，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分通常包含至少5個(gè)核苷酸，并且其長度可延伸約50個(gè)核苷酸。然而，不應(yīng)認(rèn)為這將本發(fā)明限制于任何特定長度的序列，而是本發(fā)明可采用能提供上述功能的其它長度序列。在另一實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)的接頭當(dāng)與靶序列雜交時(shí)，該接頭第一部分的解鏈溫度高于接頭莖干的解鏈溫度。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)與靶序列雜交時(shí)，該接頭第一部分的解鏈溫度高于接頭莖干的解鏈溫度約l°c、約2°C、約3°C、約4°C、約5°C、約6°C、約7°C、約8°C、約9°C、約10°C、約11°C、約12°C、約13°C、約14°C、約15°C、約16°C、約17°C、約18°C、約19°C或約20°C。在一具體實(shí)施方式中，當(dāng)與靶序列雜交時(shí)，該接頭第一部分的解鏈溫度高于接頭莖干的解鏈溫度約10°C。在此實(shí)施方式中，當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)，熱變性或化學(xué)變性的接頭與靶序列的結(jié)合優(yōu)先于熱變性或化學(xué)變性后引入復(fù)性條件而恢復(fù)其天然的莖/環(huán)結(jié)構(gòu)。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分可以是完全同源的，即雜交序列中無錯(cuò)配?；蛘?，此莖干部分可包含一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)。例如，在本發(fā)明方法中，可利用此種錯(cuò)配來促進(jìn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分變性，和/或使適配體與莖干部分之間雜交。也可將例如錯(cuò)配和/或突出端摻入到該莖干中以獲得合適的解鏈溫度差異，從而避免需要過分長的靶-互補(bǔ)序列。在其它實(shí)施方式中，所述的第一部分可不全部包含在環(huán)中，也可以是莖干的一部分。類似地，所述第二部分可以不需要全部包含在莖干部分中，可以伸入環(huán)部分。在其它實(shí)施方式中，接頭的第一和第二部分可以隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基、部分重疊、全部重疊，或一個(gè)區(qū)域可包含在另一個(gè)區(qū)域中。采用本發(fā)明此實(shí)施方式的接頭核酸也提供了一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，即不需要設(shè)計(jì)和選擇具有靶核苷酸序列結(jié)合區(qū)域的適配體。而是，可將該靶核苷酸序列結(jié)合區(qū)域摻入到所述接頭的第一部分中，和設(shè)計(jì)與適配體結(jié)合的接頭第二部分。這樣提供的好處是，摻入接頭核酸中的適配體結(jié)合性核苷酸序列比設(shè)計(jì)或選擇同時(shí)包含核酸酶結(jié)合區(qū)域和靶序列結(jié)合區(qū)域的適配體更簡單和/或費(fèi)時(shí)更少。即，可以設(shè)計(jì)出能結(jié)合某適配體(其能結(jié)合核酸酶)的接頭核酸，而不是根據(jù)能否結(jié)合核酸酶和靶核苷酸序列二者來選擇適配體。另一顯著優(yōu)點(diǎn)是，可采用單一的一種核酸酶_適配體復(fù)合物，簡單地通過修飾接頭的第一部分來檢測(cè)許多不同的靶序列。如以上所述，本發(fā)明方法涉及檢測(cè)核酸酶的活性，其中核酸酶活性升高表明樣品中存在靶核苷酸序列。檢測(cè)核酸酶活性所用的方法可以是適合檢測(cè)目標(biāo)核酸酶的任何方法。例如，分別通過觀察DNA、RNA或DNA/RNA雜交報(bào)告核酸的降解或切割來確定DNA酶或RNA酶的活性。此種報(bào)告核酸可以是單鏈或雙鏈核酸，只要適合于核酸活性的檢測(cè)即可?？捎萌魏我阎椒z測(cè)報(bào)告核酸的切割。例如，可用電泳方法、染色方法、標(biāo)記核苷酸的釋放、熒光/猝滅劑標(biāo)記核酸被切斷而釋放熒光團(tuán)，來檢測(cè)報(bào)告核酸被切斷成較低分子量的產(chǎn)物等等。如以上所述，在某些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所用的核酸酶是限制性內(nèi)切核酸酶。如本文所述，“限制性內(nèi)切核酸酶”指能結(jié)合雙鏈DNA的特定核苷酸序列的任何內(nèi)切核酸酶，如果DNA雙鏈的所述序列缺乏相應(yīng)的修飾，就在該DNA分子的識(shí)別序列或另一位點(diǎn)切割該DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難查明，有許多具有不同識(shí)別位點(diǎn)和不同切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。例如，可從NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA,USA)處獲得許多限制性內(nèi)核酸酶。在本發(fā)明采用限制性內(nèi)切核酸酶的實(shí)施方式中，通過其對(duì)包含雙鏈DNA至少一個(gè)區(qū)域的報(bào)告核酸的切割速率或程度來測(cè)定限制性內(nèi)核酸酶的活性。在一具體實(shí)施方式中，使熒光團(tuán)結(jié)合于該報(bào)告核酸，能猝滅熒光團(tuán)熒光的猝滅劑也結(jié)合于該報(bào)告核酸，當(dāng)該報(bào)告核酸被核酸酶切斷時(shí)即減少或消除了猝滅劑對(duì)熒光團(tuán)的猝滅作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難獲得示范性熒光團(tuán)和猝滅劑的信息，關(guān)于這點(diǎn)可參考Marras的綜述(MethodsMolBiol335，3-16，2006)。在一具體實(shí)施方式中，如Biggins等(ProcNatlAcadSciUSA,97(25)13537-13542,2000)所述，包含熒光團(tuán)和猝滅劑的報(bào)告核酸可包含分子斷裂光(molecularbreaklight,MBL)。在另一示范性實(shí)施方式中，一條多肽結(jié)合于該報(bào)告核酸并且固定物也結(jié)合于該報(bào)告核酸，當(dāng)報(bào)告核酸被切斷時(shí)使多肽從固定物釋放，因此當(dāng)報(bào)告核酸與固定物的固定處被切斷后，未固定多肽的量可表明核酸酶的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難弄明白各種“固定物”的信息，可包括，例如(i)某種抗原，可通過使之接觸能結(jié)合該抗原的固定抗體而將其固定；(ii)某種抗體，可通過使之接觸能結(jié)合該抗體的固定抗原或抗獨(dú)特性抗體而將其固定；(iii)含有組氨酸尾的多肽，可通過使之接觸包含鎳或鈷離子的親和介質(zhì)將其固定；(iv)生物素，可通過使之接觸固定的親和素或鏈霉親和素而將其固定；(ν)親和素或鏈霉親和素，可通過使之接觸固定的生物素而將其固定；和/或(vi)磁性或順磁性顆粒，可通過磁場(chǎng)將其固定。如上所述，某些固定物可通過使之接觸本身已被固定的結(jié)合伴侶而固定。采用該領(lǐng)域已知的方法可達(dá)到結(jié)合伴侶的固定。例如，可將固定物的結(jié)合伴侶固定在培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管或平板(已預(yù)先用試劑如硅烷處理過)表面上，固定在珠子或其它顆粒表面上，固定在層析柱或其它層析介質(zhì)上，或固定在膜上。本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難獲得許多其它固定物的信息，不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明以任何方式受限于以上例舉的固定物。在一具體實(shí)施方式中，所述固定物是磁珠，通過向樣品施加磁場(chǎng)來影響固定物的固定。被固定物固定后，可用蛋白檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)樣品中仍然“游離”的多肽，如本領(lǐng)域所知，例如，電泳、免疫色譜試驗(yàn)包括橫向流紙條、免疫印染、質(zhì)譜、用生物傳感器檢測(cè)(基于生物傳感器的溶液蛋白質(zhì)檢測(cè)綜述參見Leca-Bouvier和Blum，AnalyticalLetters,38(10):1491_1517，2005)?？稍凇暗鞍缀偷鞍踪|(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(ProteinandProteomics:ALaboratoryManual)”(Simpson，CSHL出版社，2003)中找到許多示范性蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。在本發(fā)明方法中采用核酸酶-適配體復(fù)合物也使本發(fā)明方法可進(jìn)行多重檢測(cè)，即本發(fā)明提供了可同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法。例如，在適配體結(jié)合靶核苷酸序列的本發(fā)明實(shí)施方式中，同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法可包括提供多種核酸酶-適配體復(fù)合物，其中至少兩種核酸酶_適配體復(fù)合物包含(i)能與不同靶核苷酸序列發(fā)雜交的適配體，(ii)其活性可分別檢測(cè)的不同核酸酶。在適配體結(jié)合于接頭核酸的本發(fā)明實(shí)施方式中，同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法包括提供多種接頭核酸，其中至少兩種接頭核酸包含能與不同靶核苷酸序列雜交的不同的第一部分，并且還包含能與不同適配體雜交的不同的第二部分；和提供多種核酸酶_適配體復(fù)合物，其中至少兩種核酸酶_適配體復(fù)合物包含能與不同的接頭核酸第二部分優(yōu)先雜交的適配體，并且包含其活性能分別檢測(cè)的不同核酸酶。在另一實(shí)施方式中，采用單一的一種核酸酶-適配體復(fù)合物來檢測(cè)樣品中的一種或多種不同靶序列。即在適配體結(jié)合接頭核酸的本發(fā)明實(shí)施方式中，同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法，包括提供多種接頭核酸，其中至少兩種接頭核酸包含能與不同靶核苷酸序列雜交的不同的第一部分，但該接頭核酸包含能與同一適配體雜交的第二部分；和提供含有能與該接頭核酸第二部分雜交的適配體的核酸酶-適配體復(fù)合物。在上述實(shí)施方式中，核酸酶活性升高表明樣品中存在一種或多種靶核苷酸序列。如上所述，可斷言，本發(fā)明方法同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的某些實(shí)施方式部分是基于采用了多種核酸酶_適配體復(fù)合物，其中至少兩種核酸酶_適配體復(fù)合物包含其活性能分別檢測(cè)的不同核酸酶。如上文所述“其活性能分別檢測(cè)的不同核酸酶”指，例如，其作用是切割或消化可鑒別性報(bào)告核酸的核酸酶。例如，一種可切割或消化RNA的核酸酶，而另一種可切割或消化DNA。在另一實(shí)施方式中，提供多種報(bào)告核酸，其中至少兩種包含提供不同限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和/或切割位點(diǎn)的不同核苷酸序列。例如，可用電泳方法、標(biāo)記核苷酸的釋放、熒光團(tuán)/猝滅劑標(biāo)記的核酸被切斷釋放出熒光團(tuán)等等，來檢測(cè)對(duì)不同報(bào)告核酸的切割，只要能夠鑒別一種報(bào)告核酸與另一種報(bào)告核酸的切斷即可。例如，在一實(shí)施方式中，用于不同核酸酶的這種報(bào)告核酸包含的熒光團(tuán)從猝滅劑釋放后能被分別檢測(cè)。在另一實(shí)施方式中，用于不同核酸酶的這種報(bào)告核酸包含的多肽從固定物釋放后能被分別檢測(cè)?！皬墓潭ㄎ镝尫藕竽鼙环謩e檢測(cè)”的多肽包括，例如，可用電泳或質(zhì)譜分辨的分子量不同的多肽，可用等電聚焦分辨的帶有不同電荷的多肽，可利用抗體結(jié)合活性差異分辨的具有不同抗原性的多肽，具有不同酶活性可用一種或多種酶活性試驗(yàn)分辨的多肽，具有一種或多種獨(dú)特物理特征(如特定波長熒光)可依據(jù)不同物理特征分辨的多肽，摻入了一種或多種獨(dú)特的可檢測(cè)標(biāo)記(如放射標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記或熒光標(biāo)記)的多肽，等等。第二方面，本發(fā)明提供篩檢某生物體是否存在靶核苷酸序列的方法，該方法包括獲得該生物的核酸樣品，及按照本發(fā)明第一方面方法檢測(cè)樣品中存在的靶核苷酸序列。本發(fā)明第二方面的方法可用于檢測(cè)生物體核酸樣品中的任何靶核苷酸序列。例如，此靶核苷酸序列可以是該生物體的內(nèi)源性或天然的核苷酸序列，或者，此靶核苷酸序列可以是引入的或外源的核苷酸序列。因此，可用本發(fā)明第二方面方法檢測(cè)的靶核苷酸序列包括，例如，基因組核苷酸序列、轉(zhuǎn)基因、等位基因核苷酸序列、單個(gè)核苷酸多樣性、突變的核苷酸序列、轉(zhuǎn)座子核苷酸序列或病毒核苷酸序列。本發(fā)明第二方面的方法可用于檢測(cè)任何生物體中的靶核苷酸序列。然而，在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明第二方面的方法可用于檢測(cè)植物核酸樣品中的靶核苷酸序列。在本發(fā)明此實(shí)施方式的內(nèi)容中，應(yīng)將植物的核酸樣品理解為包括活植物的樣品(或其一部分，如器官、組織或細(xì)胞)或得自植物的樣品或其經(jīng)過加工的部分，如用作食物的經(jīng)過加工的植物部分(如面粉等等)。檢測(cè)植物中特定的核苷酸序列特別有用，例如，診斷植物的疾病，檢測(cè)食物污染，植物和植物各部分的分類學(xué)鑒定，及檢測(cè)基因修飾的植物(受環(huán)境影響或加工用作食物的植物)。在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明應(yīng)用于檢測(cè)糧食中的基因修飾植物。就此點(diǎn)而言，已知曉在95%以上現(xiàn)有的基因修飾的農(nóng)作物植物中發(fā)現(xiàn)了花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子、根癌土壤桿菌胭脂堿合酶終末子和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)編碼核苷酸序列的至少一種。因此，這些序列代表了檢測(cè)基因修飾植物材料特別有價(jià)值的目標(biāo)靶子。因此，在本發(fā)明第二方面的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述靶核苷酸序列包括花椰菜鑲嵌病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子序列、根癌土壤桿菌胭脂堿合酶(nos)終末子序列、或5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)編碼核苷酸序列之一種或多種。第三方面，本發(fā)明還提供一種核酸酶-結(jié)合性適配體。本發(fā)明第三方面的核酸酶_結(jié)合性適配體的作用通常是與某核酸酶結(jié)合時(shí)可抑制該核酸酶的活性。可用已報(bào)導(dǎo)的已知的適配體產(chǎn)生或選擇方法制備本發(fā)明的適配體。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的適配體能結(jié)合和/或抑制限制性內(nèi)切核酸酶的活性，包括修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列。術(shù)語“修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列”應(yīng)理解為適配體中能結(jié)合某限制性內(nèi)切核酸酶的一種核苷酸序列，但此種序列又足以與該限制性內(nèi)切核酸酶的天然識(shí)別序列相區(qū)別，因此該適配體本身不是此制性內(nèi)切核酸酶切割的底物。在某些實(shí)施方式中，修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列包含適配體的雙鏈區(qū)域，該區(qū)域含有該限制性內(nèi)切核酸酶的攜帶有一個(gè)或多個(gè)以下修飾的天然識(shí)別序列(i)相對(duì)于天然識(shí)別序列的核苷酸序列，其一條或二條鏈中含有一處或多處核苷酸取代；(ii)該修飾的識(shí)別序列中含有一對(duì)或多對(duì)核苷酸錯(cuò)配；(iii)相對(duì)于其天然識(shí)別序列，含有一處或多處雙鏈插入或缺失；和/或(iv)該修飾的識(shí)別序列一條或二條鏈中含有一處或多處插入或缺失從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此環(huán)狀結(jié)構(gòu)在雙鏈區(qū)的一條或二條鏈中含有一個(gè)或多個(gè)不成對(duì)的核苷酸。修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列相對(duì)于天然序列可包含一個(gè)或多個(gè)修飾。例如，根據(jù)所要修飾的天然識(shí)別序列的性質(zhì)和長度制作1、2、3、4、5、6、7、8、9、10處或更多處修飾。然而，實(shí)施時(shí)，修飾的數(shù)目將受到使適配體保留其結(jié)合限制性內(nèi)切酶能力的同時(shí)所能耐受的修飾數(shù)目的限制。在一具體實(shí)施方式中，限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列相對(duì)于其天然識(shí)別序列含有單一的一個(gè)核苷酸取代。在另一具體實(shí)施方式中，限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列相對(duì)于其天然識(shí)別序列含有單一的一條鏈缺失從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此環(huán)狀結(jié)構(gòu)在該修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的相反鏈中含有單個(gè)不成對(duì)的核苷酸殘基。在還有一實(shí)施方式中，相對(duì)于其天然序列，此環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的單個(gè)不成對(duì)核苷酸殘基被取代。在一實(shí)施方式中，核酸酶_結(jié)合性適配體能結(jié)合EcoRI(酶)并在結(jié)合時(shí)抑制EcoRI的活性。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的EcoRI結(jié)合性適配體包含以下核苷酸序列基序5，-GAGTTC-3，(SEQIDNO1)在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的EcoRI結(jié)合性適配體還可包含以下核苷酸序列基序5，-HSGAGTTCWR-3，(SEQIDNO2)此基序中，H可以是A、T或C之一；S可以是C或G;W可以是A或T；和R可以是A或C。在還有一實(shí)施方式中，本發(fā)明的EcoRI結(jié)合性適配體包含以下所示修飾的EcoRI識(shí)別序列5，-GAGTTC-3，3，-CT-AAG-5，其中，粗體表示的G殘基是形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的不成對(duì)核苷酸殘基。在還有一實(shí)施方式中，本發(fā)明的EcoRI結(jié)合適配體可包含SEQIDNO3所示的核苷酸序列或其保留了結(jié)合和抑制EcoRI活性能力的變體。通常，所考慮的這種變體包含SEQIDN0:1和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列基序，和/或包含以上所示修飾的EcoRI識(shí)別序列。第四方面，本發(fā)明還提供包含結(jié)合于適配體的核酸酶的核酸酶-適配體復(fù)合物。通常，在核酸酶-適配體復(fù)合物中適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性。在某些實(shí)施方式中，核酸酶-適配體復(fù)合物可包含已結(jié)合于適配體的限制性內(nèi)切核酸酶。在這些實(shí)施方式中，該核酸酶-適配體復(fù)合物中的適配體可包含上文所述的修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列。在一具體實(shí)施方式中，所述核酸酶_適配體復(fù)合物包括Ec0RI-適配體復(fù)合物。在此實(shí)施方式中，該EcoRI-適配體復(fù)合物中的適配體可以是上述ECORI-結(jié)合性適配體?？擅靼?，也可將本發(fā)明擴(kuò)展到之前描述的核苷酸序列的檢測(cè)方法，其中核酸酶_適配體復(fù)合物是本發(fā)明第四方面所述的核酸酶_適配體復(fù)合物。第五方面，本發(fā)明還包括接頭核酸，其包含能與靶核苷酸序列雜交的第一部分，和當(dāng)該接頭核酸第一部分與靶核苷酸雜交時(shí)能與核酸酶-適配體復(fù)合物中的適配體雜交的第二部分，其中，適配體與接頭核酸基序第二部分之間的雜交減少或消除了該核酸酶-適配體復(fù)合物中適配體與核酸酶之間的結(jié)合。在一實(shí)施方式中，接頭核酸包含一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該接頭第一部分中的至少一部分包含在此莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，而該接頭第二部分中的至少一部分包含在此莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干中。在另一實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)接頭，其第一部分與靶序列雜交后的解鏈溫度高于上述該接頭莖干的解鏈溫度。在一具體實(shí)施方式中，所述接頭包含的第二部分能與前述EcoRI-結(jié)合性適配體雜交。在另一具體實(shí)施方式中，能與EcoRI-結(jié)合性適配體雜交的該接頭的第二部分包含有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。該接頭的第一部分可適合與任何感興趣靶核苷酸序列結(jié)合。在一示范性實(shí)施方式中，可使該接頭分子第一部分適合與花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子核苷酸序列的某一區(qū)域雜交。在一更具體的實(shí)施方式中，可使該接頭分子第一部分適合與含有SEQIDN0:5所示核苷酸序列的花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子核苷酸序列的區(qū)域雜交。在另一示范性實(shí)施方式中，可使該接頭分子第一部分適合與結(jié)核分枝桿菌的核苷酸序列雜交。在一更具體的實(shí)施方式中，可使該接頭分子第一部分適合與含有SEQIDNO6所示核苷酸序列的結(jié)核分枝桿菌核苷酸序列雜交?？擅靼?，本發(fā)明也可擴(kuò)展到之前描述的核苷酸序列的檢測(cè)方法，其中接頭核酸是本發(fā)明第五方面所述的接頭核酸。第六方面，本發(fā)明提供一種實(shí)行本發(fā)明任何方法的試劑盒，該試劑盒裝有本發(fā)明第三方面的一種或多種適配體；本發(fā)明第四方面的核酸酶_適配體復(fù)合物；和/或本發(fā)明第五方面的接頭核酸。最后，可參見執(zhí)行本發(fā)明所包括的基本技術(shù)方法的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教課書，書中包括了本文所述的產(chǎn)生各種基因構(gòu)建物的DNA限制性內(nèi)切和連接內(nèi)容。參見，例如，Maniatis等人的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(ColdSpringhaborlaboratory出版社，紐約，1982)和Sambrook等(2000，同上)?，F(xiàn)通過以下非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。附圖的簡要說明圖1顯示按照本發(fā)明一實(shí)施方式檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法。圖2顯示按照本發(fā)明另一實(shí)施方式檢同時(shí)測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法。圖3顯示示范性的接頭分子和它們的靶序列。A任意的靶-接頭和靶序列?；パa(bǔ)的靶序列為蘭色陰影。B:35S-接頭和靶序列?；パa(bǔ)的靶序列為綠色陰影。C:結(jié)核分枝桿菌-接頭和靶序列?；パa(bǔ)的靶序列為黃色陰影。所有檢測(cè)器中適配體結(jié)合序列(觸發(fā)部分)為紅色陰影。用MFOLD程序(Zucker,2003http//fronten.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cRi-bin/dna-forml.cri)獲得了預(yù)計(jì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖4顯示，A適配體3_ADJ_L。除了5’和3’引物-結(jié)合區(qū)的一部分外，適配體3_ADJ_L的核苷酸序列與SELEX方法中鑒定到的適配體3相比沒有變化。EcoRI強(qiáng)抑制劑中的普遍保守區(qū)為紅色陰影。對(duì)該接頭分子觸發(fā)部分的結(jié)合位點(diǎn)毗鄰綠色點(diǎn)線。B能強(qiáng)抑制EcoRI的適配體的保守區(qū)。假設(shè)適配體核苷酸序列的此部分是介導(dǎo)抑制EcoRI活性的主要位點(diǎn)的一個(gè)元件。圖5顯示，存在靶核酸時(shí)接頭從無活性轉(zhuǎn)化成活性狀態(tài)的一個(gè)實(shí)例。在接頭處于滅活狀態(tài)時(shí)，其觸發(fā)部分結(jié)合于互補(bǔ)的莖干伴侶，因而不能結(jié)合適配體3_ADJ_L。在其活化狀態(tài)時(shí)，該靶_互補(bǔ)序列結(jié)合于靶核酸，觸發(fā)序列游離以結(jié)合適配體3_ADJ_L。圖6顯示適配體3的凝膠-遷移試驗(yàn)，采用適配體3產(chǎn)生的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物。電泳遷移減慢伴隨著高分子量條帶，表明適配體3/EcoRI復(fù)合體的存在。表明適配體3結(jié)合于限制性內(nèi)切酶EcoRV或牛血清白蛋白(BSA)的同樣條帶沒有出現(xiàn)。圖7顯示EcoRI的分子斷裂光(molecularbreaklight，MBL)。此處顯示了預(yù)計(jì)的莖/環(huán)發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。該寡核苷酸包含5’熒光團(tuán)和3’淬滅劑。該分子的莖干(紅色陰影)中存在限制性內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列。被EcoRI切斷后，熒光團(tuán)與猝滅劑解鏈分離，而產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。圖8顯示對(duì)結(jié)核分枝桿菌靶序列的生物傳感器試驗(yàn)結(jié)果。每種處理的標(biāo)準(zhǔn)化熒光輸出是至少三次重復(fù)反應(yīng)的平均值。5分鐘時(shí)間后300nM靶序列的存在有跡可尋，與OnM靶DNA序列和300nM非靶DNA序列陰性對(duì)照有明顯區(qū)別。圖9顯示對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子靶序列的生物傳感器試驗(yàn)結(jié)果。每種處理的標(biāo)準(zhǔn)化熒光輸出是四次重復(fù)反應(yīng)的平均值。15分鐘時(shí)間后300nM靶序列的存在有跡可尋，與OnM靶DNA序列和300nM非靶DNA序列陰性對(duì)照有明顯區(qū)別。圖10是一種任意靶序列的生物傳感器試驗(yàn)結(jié)果。每種處理的標(biāo)準(zhǔn)化熒光輸出是四次重復(fù)反應(yīng)的平均值。10分鐘時(shí)間后該任意靶序列(300nM)的存在有跡可尋，與OnM任意的靶序列和300nM非靶DNA序列陰性對(duì)照有明顯區(qū)別。圖11顯示半定量生物傳感器試驗(yàn)的結(jié)果。靶(結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的寡核苷酸)序列濃度從OnM遞增至500nM導(dǎo)致在給定時(shí)間期間信號(hào)強(qiáng)度(熒光單位)升高。數(shù)據(jù)是至少二次重復(fù)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化平均值。圖12顯示多重生物傳感器試驗(yàn)的結(jié)果。在一次試驗(yàn)中，同時(shí)檢測(cè)了兩種之一或兩種靶序列(35S和結(jié)核分枝桿菌)。實(shí)施例1.檢測(cè)靶核苷酸序列的方法下面對(duì)應(yīng)于圖1描述本發(fā)明一實(shí)施方式的方法。圖1的分圖1顯示了靶核苷酸序列100和含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭核酸110。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分112包含能與靶核苷酸序列100雜交的第一核苷酸序列113；該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分114包含當(dāng)?shù)谝缓塑账嵝蛄?13與靶核苷酸序列100雜交時(shí)某適配體能與之結(jié)合的第二核苷酸序列115。分圖2顯示了接頭核酸110中第一核苷酸序列113與靶核苷酸序列100之間的雜交。此雜交引起該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分114解離從而暴露出第二核苷酸序列115，使其可用于結(jié)合核酸酶-適配體復(fù)合物120中的適配體。分圖3顯示了適配體124與第二核苷酸序列115之間的雜交。此雜交減少或消除了適配體124對(duì)核酸酶122的抑制。圖中，此種抑制的減少和消除表現(xiàn)為適配體124與核酸酶122的分離，部分作為一種概念幫助。然而，如上文所述，適配體124對(duì)核酸酶122抑制的減少或消除可能或可能并不涉及核酸酶122與適配體124之間真正的分離。分圖4中，核酸酶122脫離了適配體124的抑制而活化，可通過核酸酶122是否切斷了報(bào)告核酸130來檢測(cè)。報(bào)告核酸130含有可被核酸酶122切割的核苷酸序列132。報(bào)告核酸130也含有結(jié)合的熒光團(tuán)134和結(jié)合的猝滅劑136，后者的作用是猝滅熒光團(tuán)134的熒光。然而，如分圖5所示，報(bào)告核酸130被切斷成含熒光團(tuán)的片段138和含片段140的猝滅劑，減少或消除了猝滅劑136對(duì)熒光團(tuán)134的猝滅。因此，核酸酶122切斷報(bào)告核酸130導(dǎo)致了可檢測(cè)到熒光團(tuán)134發(fā)出的熒光信號(hào)。實(shí)施例2.同時(shí)檢測(cè)多種靶核苷酸序列的方法下面對(duì)應(yīng)于圖2描述本發(fā)明另一實(shí)施方式的方法。圖2的分圖1顯示了三種不同的靶核苷酸序列200/300/400，和各自含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的三種接頭核酸210/310/410。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)部分各包含能與特定靶核苷酸序列200/300/400雜交的第一核苷酸序列213/313/413。具體說，第一核苷酸序列213能與靶核苷酸序列200特異性雜交；第一核苷酸序列313能與靶核苷酸序列300特異性雜交；第一核苷酸序列413能與靶核苷酸序列400特異性雜交。接頭核酸的莖干部分各自包含第二核苷酸序列215/315/415，當(dāng)?shù)谝缓塑账嵝蛄?13/313/413與靶核苷酸序列200/300/400雜交時(shí)，特異性適配體即與第二核苷酸序列215/315/415特異性結(jié)合。分圖2顯示了第一核苷酸序列213/313/413與靶核苷酸序列200/300/400之間的雜交。此雜交引起莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干部分解離從而暴露出第二核苷酸序列215/315/415，使之能分別用于結(jié)合核酸酶_適配體復(fù)合物220/320/420中的適配體224/324/424。每種適配體均能優(yōu)先與不同的第二核苷酸序列特異性雜交，具體來說，適配體224/324/424分別優(yōu)先與各自的第二核苷酸序列215/315/415雜交。此外，核酸酶-適配體復(fù)合物220/320/420各自含有不同的核酸酶222/322/422，其活性可分別檢測(cè)。具體來說，在此實(shí)施方式中，核酸酶222/322/422是各自能識(shí)別不同切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶。分圖3顯示了適配體224/324/424與第二核苷酸序列215/315/415之間的雜交。此雜交減少或消除了適配體224/324/424對(duì)核酸酶222/322/422的抑制。見圖1，抑制的此種減少或消除表現(xiàn)為適配體224/324/424與核酸酶222/322/422的分離，部分作為一種概念幫助。然而，如前文所述，適配體224/324/424對(duì)核酸酶222/322/422抑制的減少或消除可能或可能并不涉及核酸酶222/322/422與適配體224/324/424之間的真正解離。分圖4，可通過切斷不同的報(bào)告核酸來檢測(cè)核酸酶222/322/422各自的活性。此種報(bào)告核酸各自包含有不同的核苷酸序列，每種序列分別可被核酸酶222/322/422之一特異性切割。這些報(bào)告核酸各自也包含不同的結(jié)合熒光團(tuán)234/334/434，及能猝滅各熒光團(tuán)234/334/434熒光的結(jié)合猝滅劑236/336/436。然而，當(dāng)各報(bào)告核酸被切斷成含片段238/338/438的熒光團(tuán)和含片段240/340/440的猝滅劑時(shí)，即減少或消除了猝滅劑236/336/436對(duì)熒光團(tuán)234/334/434的猝滅。不同熒光團(tuán)234/334/434各自有不同的發(fā)射光譜，因此一旦脫離了猝滅劑236/336/436的作用而釋放，即可分別檢測(cè)到各熒光團(tuán)234/334/434的信號(hào)。因此，核酸酶222/322/422分別切斷一種或多種報(bào)告核酸，導(dǎo)致可檢測(cè)到從熒光團(tuán)234/334/434發(fā)出的一種或多種各自可檢測(cè)的熒光信號(hào)。實(shí)施例3.利用EcoRI-適配體3_ADJ_L復(fù)合物的生物傳感在一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法所用的靶序列特異性檢測(cè)機(jī)制包含一種接頭分子，當(dāng)其與靶核酸雜交時(shí)能從“無活性”構(gòu)型轉(zhuǎn)變成“活性”構(gòu)型。此“活性”構(gòu)型中，接頭能結(jié)合含限制性內(nèi)切酶(此例為EcoRI)復(fù)合物中的適配體，使該內(nèi)切酶從適配體-介導(dǎo)的抑制中釋放。在“無活性”構(gòu)型時(shí)，該接頭不能與內(nèi)切酶/適配體復(fù)合物相互作用或作用能力顯著降低，當(dāng)從抑制中釋放時(shí)，該核酸酶分子即能切斷信號(hào)分子產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。此系統(tǒng)是半定量系統(tǒng)，在一個(gè)分散范圍內(nèi)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與溶液中的靶核酸分子含量成比例。為了證明此系統(tǒng)可應(yīng)用于真實(shí)世界的核酸檢測(cè)情況，采用了合成的靶序列，它們代表通常表明植物發(fā)生了基因改變的花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子和引起嚴(yán)重的世界性傳染病的結(jié)核分枝桿菌基因組中所含的核苷酸序列。生物傳感系統(tǒng)的此實(shí)施方式是模塊化的，有三種主要成分靶-檢測(cè)接頭、限制性內(nèi)切核酸酶/適配體復(fù)合物和分子斷裂光信號(hào)分子。此靶-檢測(cè)模塊包含折疊成穩(wěn)定的莖/環(huán)發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸接頭(其環(huán)部分與靶序列互補(bǔ))和稱為“觸發(fā)”部分的雙鏈莖干部分的一條鏈(與適配體3_ADJ_L假設(shè)的EcoRI結(jié)合區(qū)互補(bǔ))(圖3和4)。設(shè)計(jì)的此接頭當(dāng)與靶序列雜交時(shí)，該分子的靶_互補(bǔ)部分的解鏈溫度比含觸發(fā)部分莖干結(jié)構(gòu)的解鏈溫度高約10°c。這樣確保了溶液中存在靶核酸時(shí)，該接頭與靶序列結(jié)合經(jīng)加熱變性和冷卻后優(yōu)先逆轉(zhuǎn)恢復(fù)其天然莖/環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，含錯(cuò)配和觸發(fā)部分的莖干伸出得以獲得合適的解鏈溫度差異而不需要過分長的靶-互補(bǔ)序列(圖5)。采用SELEX方案已鑒定到許多能強(qiáng)烈特異性結(jié)合EcoRI的獨(dú)特適配體(如圖6)。所分析的大多數(shù)適配體能顯著抑制EcoRI的活性。用于生物傳感器適配體/EcoRI復(fù)合物中的理想適配體應(yīng)當(dāng)不僅能強(qiáng)烈特異性抑制EcoRI，而且具有易于通過該接頭分子的短觸發(fā)部分雜交而受破壞的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)SELEX鑒定的許多EcoRI-抑制性適配體包含有假設(shè)能結(jié)合EcoRI酶活性位點(diǎn)的高度保守核苷酸序列，可能是由于該保守區(qū)的序列類似于EcoRI的識(shí)別區(qū)(圖4b)。因?yàn)楸Ｊ貐^(qū)中預(yù)計(jì)的適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)含有錯(cuò)配，該位點(diǎn)特別易于通過結(jié)合足夠長度的偏愛互補(bǔ)寡核苷酸發(fā)生鏈置換而變性。適配體3被選為這類適配體的一個(gè)例子。根據(jù)適配體3的核苷酸序列，商業(yè)上合成了其去除了SELEX引物結(jié)合位點(diǎn)部分的修飾版本(適配體3_ADJ_L)，構(gòu)成了生物傳感器的適配體/EcoRI模塊的基礎(chǔ)。當(dāng)接頭分子與靶核酸結(jié)合構(gòu)轉(zhuǎn)變成其活性狀態(tài)時(shí)，暴露出的觸發(fā)部分能結(jié)合適配體3_ADJ_L，繼而適配體3_ADJ_L構(gòu)型改變?yōu)椴辉倌芤种艵coRI的活性。為檢測(cè)活化EcoRI的活性及靶核酸的存在，修飾版本的分子斷裂光(MBL)分子(如Biggins等，2000所描述的，同上)起了信號(hào)傳遞模塊的作用(圖7)。MBL是一種寡核苷酸，其5’-標(biāo)記了熒光團(tuán)(如FAM)而3’-標(biāo)記了猝滅劑(如熒光素)。在EcoRI活化的溫度時(shí)，它形成發(fā)夾莖/環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于熒光團(tuán)與猝滅劑緊密靠近，福斯特(F0rster)共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)確保激發(fā)熒光團(tuán)發(fā)射光遭受強(qiáng)烈猝滅。EcoRI識(shí)別序列在莖干結(jié)構(gòu)中，當(dāng)被EcoRI切斷時(shí)，熒光團(tuán)立即與猝滅劑解鏈分離，其熒光信號(hào)不再受到猝滅因而易于檢測(cè)到。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與溶液中消化產(chǎn)生的斷裂光分子含量成比例，因而與活化的EcoRI量成比例。進(jìn)行全部傳感器試驗(yàn)有二種順次反應(yīng)。將DNA樣品加入到含接頭的溶液中后，力口熱變性反應(yīng)物并冷卻到至少37°C。將該制備好的靶/接頭樣品加入到含適當(dāng)濃度適配體/EcoRI復(fù)合物和MBL的緩沖液中立即進(jìn)行分析。熒光檢測(cè)在RotorGeneRG-3000實(shí)時(shí)PCR儀上30°C或37°C恒溫下進(jìn)行。圖8、9和10分別顯示靶序列是合成結(jié)核分枝桿菌靶序列、合成35S靶序列和產(chǎn)生無二級(jí)結(jié)構(gòu)的任意靶序列的生物傳感器反應(yīng)數(shù)據(jù)。顯示產(chǎn)生信號(hào)是靶核酸存在時(shí)的產(chǎn)物而非人為產(chǎn)物的對(duì)照包括0_靶對(duì)照；非靶對(duì)照；用于證明特異性的另一種非靶寡核苷酸；證明靶序列與接頭之間相互作用是使EcoRI從抑制中特異性釋放的非-接頭對(duì)照；和用于證明適配體3_ADJ_L抑制EcoRI活性基線的非-靶非接頭對(duì)照。目前形式的生物傳感器能特異性檢測(cè)極少試驗(yàn)體積(20微升)中的低至皮摩爾濃度范圍的靶核酸決定生物傳感系統(tǒng)靈敏度的主要因素是試驗(yàn)所用儀器的檢測(cè)限度；進(jìn)行試驗(yàn)的時(shí)間；和試驗(yàn)中存在的背景信號(hào)強(qiáng)度。與適配體介導(dǎo)的EcoRI不完全抑制和/或接頭在其“滅活”狀態(tài)時(shí)使EcoRI分子從抑制中釋放所致的相關(guān)背景熒光，易于使靶序列產(chǎn)生的低水平信號(hào)不被檢出。接頭分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定介導(dǎo)了與接頭不完全滅活相關(guān)的背景熒光。針對(duì)任意的靶序列設(shè)計(jì)的接頭莖/環(huán)結(jié)構(gòu)在生物傳感器反應(yīng)溫度(30°C-37°C)下穩(wěn)定性比35S和結(jié)核分枝桿菌接頭差，致使甚至在缺乏靶核酸時(shí)接頭莖干的一部分解鏈而暴露出觸發(fā)部分與適配體3_ADJ_L雜交。然而在30°C溫度下反應(yīng)15-20分鐘后，存在與缺乏靶核酸之間的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生明顯差異。由于結(jié)核分枝桿菌和35S接頭分子的靶核酸結(jié)合序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這些接頭在30°C仍然無活性，出現(xiàn)接頭介導(dǎo)的背景信號(hào)不明顯或顯著減少。這樣，經(jīng)15分鐘時(shí)間反應(yīng)后可清晰辨別6皮摩爾靶序列的存在。所有傳感器實(shí)施例中存在的背景來源是由于適配體3_ADJ_L對(duì)EcoRI的不完全抑制。這主要是由于用于傳感器反應(yīng)之前系統(tǒng)簡單地混合EcoRI與過量的適配體3_ADJ_L，在37°C結(jié)合45分鐘，殘留了顯著量的未結(jié)合適配體3_ADJ_L(它降低了傳感器的靈敏度)和未結(jié)合的EcoRI(它產(chǎn)生背景信號(hào))。去除未結(jié)合的適配體/EcoRI和適配體與EcoRI潛在的共價(jià)結(jié)合預(yù)期將顯著減少或消除這種背景信號(hào)的形成由于在一定的離散范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與溶液中的靶序列含量成比例，該系統(tǒng)是半定量系統(tǒng)(圖11)。減少背景信號(hào)將進(jìn)一步增大系統(tǒng)的半定量測(cè)定范圍。采用多種限制性內(nèi)切核酸酶得以同時(shí)檢測(cè)多種靶序列。在最適反應(yīng)條件下，即使當(dāng)同一消化反應(yīng)中存在多種酶，限制性內(nèi)切核酸酶仍為高度序列特異。類似地，預(yù)計(jì)在一次反應(yīng)中采用多種獨(dú)特的接頭、適配體/酶復(fù)合物和信號(hào)分子將特異和精確地檢測(cè)出存在的多種獨(dú)特靶分子。材料和方法(i)EcoRI-結(jié)合件適配型的詵擇用SELEX(指數(shù)富集性配體系統(tǒng)進(jìn)化)方法從隨機(jī)庫中選擇DNA適配體(參見Tuerk和Gold,1990，同上)。為選擇能結(jié)合并抑制限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI的適配體，采用包含側(cè)接有20個(gè)堿基對(duì)引物結(jié)合位點(diǎn)的隨機(jī)40-聚體的DNA寡核苷酸文庫(5’-CAAGGCCTCTCCTGATCCGA-40N-GTCGGGAGCTGAAGCTGCTT-3，)。擴(kuò)增文庫的PCR寡核酸苷引物序列是5，-CAAGGCCTCTCCTGATCCGA-3，和5，-生物素-AAGCAGCTTCAGCTCCCGAC-3，。對(duì)于14輪SELEX，采用硝酸纖維濾膜為基礎(chǔ)的結(jié)合方法(Pileur等，NucleicAcidsResearch31:5776-5788,2003)。硝酸纖維濾膜能結(jié)合EcoRI，任何DNA也能結(jié)合EcoRI。大多數(shù)未結(jié)合的DNA自由通過此膜伴有少量背景留存。洗脫濾膜上結(jié)合的DNA，擴(kuò)增，用于后續(xù)SELEX輪次。對(duì)每輪SELEX，采用500微升含50mMNaClUOmMTris-HCl和IOmMMgCl2的緩沖液(PH8)配制4微克寡核苷酸庫。在這樣的緩沖條件下EcoRI為高活性。為了讓該寡核苷酸庫中的各序列形成其天然二級(jí)結(jié)構(gòu)，將此緩沖系統(tǒng)加熱至94°C，二分鐘后立即放置冰上10分鐘。先將4微升濃縮的EcoRI(NewEnglandBiolabs,100,000U/ml)加入到此緩沖系統(tǒng)中，然后室溫培育20分鐘。在各SELEX后續(xù)步驟中加入遞減量的EcoRI。SELEX第7和第9輪采用不加EcoRI的陰性對(duì)照溶液來相對(duì)定量測(cè)定回收的EcoRI-結(jié)合DNA與濾膜-結(jié)合的背景DNA。使這些混合液減壓通過預(yù)先洗滌過的堿處理的25mm0.45μM硝酸纖維素HAWP濾膜(Millipore)。用3ml緩沖液洗滌后，在預(yù)熱至80°C的7M尿素、50mMEDTA、400mM乙酸鈉的400μ1溶液中破碎濾膜洗脫結(jié)合成分，室溫培育10分鐘。用800μ1100%乙醇和2μ1GlycoBlue(Ambion)沉淀上清液中的DNA。以1.5ml70%乙醇洗滌DNA沉淀，空氣干燥后重新懸浮于150μ1的IOmMTris-HCl(ρΗ8)溶液中。為下一輪SELEX獲得足夠的DNA，用PCR擴(kuò)增回收的DNA。每100μ1PCR包含ImM的各引物(Sigma-Proligo)、200μMdNTP(Bioline)U.5mMMgCl2(Bioline)、0·5UImmolaseDNA聚合酶(Bioline)UXImmolaseDNA聚合酶緩沖液(Bioline)和10μ1DNA溶液。前8輪的循環(huán)條件如下95°C7分鐘，然后，94°C10秒、60°C30秒和72°C20秒，30個(gè)循環(huán)。72°C延伸5分鐘完成PCR。第9輪SELEX后調(diào)節(jié)PCR循環(huán)條件，采用95°C7分鐘，然后94°C35秒，60°C30秒和72°C20秒，15個(gè)循環(huán)，以防止非特異性PCR人為產(chǎn)物的積累。每輪SELEX進(jìn)行總共12次100μ1的PCR。接著用QiagenMinElute柱純化所有反應(yīng)產(chǎn)物，重新懸浮于5μ1的IOmMTris-HClρΗ8溶液中，合并成60μ1總體積。這些溶液的DNA濃度范圍為500-800ng/μ1。為了從擴(kuò)增的雙鏈DNA產(chǎn)生單鏈DNA寡核苷酸，使30μg生物素化PCR產(chǎn)物在IMNaCl結(jié)合緩沖液中結(jié)合于M-270鏈霉親和素包被的Dynabeads⑧珠(Invitrogen)。用結(jié)合緩沖液洗滌后，在60μ1體積的150mMNaOH液中培育Dynabeads⑧珠-PCR產(chǎn)物復(fù)合物，以斷裂使互補(bǔ)DNA雙鏈結(jié)合在一起的氫鍵。取出含游離單鏈DNA的上清液，用40μ1200mMHCl和7.6μ1IMTris-HCl中和。用另外400μ1IOmMTris-HCl稀釋該中和液用于下一輪SELEX。總共進(jìn)行了14輪SELEX，然后克隆PCR產(chǎn)物并測(cè)序。(ii)克隆EcoRI結(jié)合性適配體將經(jīng)過14輪SELEX產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物按廠商說明書克隆到pGEM_TEasy載體(Promega)中。然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入熱激感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，在氨芐西林選擇下37°C培養(yǎng)過夜。MpGEM-TEasy系統(tǒng)能對(duì)含有插入PCR產(chǎn)物的細(xì)菌菌落作白/蘭選擇。(iii)菌落和非對(duì)稱件PCR為了快速測(cè)試各適配體的結(jié)合與抑制效力，采用了菌落PCR然后非對(duì)稱PCR策略。用無菌移液頭取得各菌落的一部分然后重懸于100μ1雙蒸水中制備菌落的PCR模板。將這些溶液95°C變性2分鐘，冰上冷卻10分鐘。用ImM非生物素化SELEX正向和反向引物(Sigma-Proligo)、0.2mMdNTP(Bioline)UX反應(yīng)緩沖液(Bioline)、5%二甲基亞砜(Sigma),0.5UImmolaseDNA聚合酶(Bioline)和2μ1已制備的PCR模板進(jìn)行20μ1PCR。PCR循環(huán)條件與SELEX方法后階段所用的相同。完成菌落PCR后，用QiagenMinElutePCR純化試劑盒按廠商說明書努力去除過量的引物和反應(yīng)成分，純化反應(yīng)產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物重懸于11μ1的洗脫緩沖液中。用菌落PCR的純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行非對(duì)稱PCR。只加入有義SELEX的正向引物使之在PCR反應(yīng)中延伸，產(chǎn)生序列與原始適配體相同的單鏈DNA產(chǎn)物。PCR反應(yīng)的其它條件與菌落PCR相同，除了省略二甲基亞砜外。反應(yīng)總體積為100μ1，采用菌落PCR純化的PCR產(chǎn)物10μ1。完成此PCR后，95°C加熱產(chǎn)物2分鐘，冰上冷卻10分鐘，使單鏈適配體形成其正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于PCR純化反應(yīng)中過量的引物去除不完全，可發(fā)生某種指數(shù)和線性擴(kuò)增。因此，21輪PCR循環(huán)后約50%產(chǎn)物為單鏈，50%為雙鏈。(iv)凝膠遷移試驗(yàn)用非對(duì)稱PCR方法產(chǎn)生的各適配體進(jìn)行凝膠遷移試驗(yàn)。取10μ1各PCR產(chǎn)物加到用IxNEB緩沖液配的300單位EcoRI(NewEnglandBiolabs)中。對(duì)于選擇性對(duì)照反應(yīng)，力口入限制性內(nèi)切酶EcoRV(NewEnglandBiolabs)或牛血清白蛋白(NewEnglandBiolabs)代替EcoRI。室溫進(jìn)行適配體/配體結(jié)合20分鐘。將樣品加載到10%非變性聚丙烯酰胺凝膠上150V電泳1小時(shí)，然后作溴乙錠染色，在UV透射儀(Syngene)上觀察。(V)適配體抑制試驗(yàn)為測(cè)定各適配體的EcoRI抑制能力，將1μ1非對(duì)稱PCR產(chǎn)物加入到以IX緩沖液配的4單位EcoRI中。37°C進(jìn)行適配體/EcoRI結(jié)合45分鐘。各反應(yīng)中加入4μ1的EcoRI分子斷裂光(330ηΜ)(至最終濃度66ηΜ)。各反應(yīng)的總體積為20μ1。然后立即在37°C恒溫下操作，用CorbettRotorGeneRG-300儀分析反應(yīng)，在FAM通道每間隔一分鐘讀取讀數(shù)。(Vi)質(zhì)粒測(cè)序用M13引物和BigDye終末子V3.1反應(yīng)混合物(AppliedBiosystems)按廠商說明書正向和反向測(cè)定顯示EcoRI強(qiáng)抑制的含適配體序列的各個(gè)質(zhì)粒中插入物的序列。(Vii)牛物傳感器試驗(yàn)采用強(qiáng)抑制劑適配體3的合成版本(Sigma-Proligo)進(jìn)行生物傳感器試驗(yàn)。除了去除二引物結(jié)合位點(diǎn)的一部分之外，適配體3_ADJ_L的序列與適配體3的序列相同。適配體3_ADJ_L的總長度是49個(gè)核苷酸(5，-CCGACGAGCAAGTAGCTCCAAGACGAGTTCAACCCCAGAATCAGGTCGG-3，；SEQIDNO:3)。進(jìn)行此試驗(yàn)前，在含1μg/μ1BSA(NewEnglandBiolabs)的溶液中以約40ng適配體對(duì)4單位EcoRI(NewEnglandBiolabs)的比例使適配體3_ADJ_L結(jié)合于EcoRI。37°C結(jié)合45分鐘。95°C加熱具體實(shí)驗(yàn)所需濃度的接頭和靶序列或?qū)φ誅NA2分鐘，然后以0.1°C/秒的速度緩慢冷卻至4°C。將冷卻的接頭/靶序列樣品與1.5xEcoRINE緩沖液配的EcoRI(4U)/適配體3_ADJ_L復(fù)合物(40ng)和MBL(66ng)混合。在30°C恒溫下操作，用CorbettRotorGeneRG-300儀分析反應(yīng)。以一分鐘間隔檢測(cè)FAM通道的熒光。(Viii)半定量牛物傳感器試驗(yàn)除了試驗(yàn)中加入較高濃度的EcoRI(8U)/適配體3_ADJ_L(80ng)和MBL(122ng)外，按生物傳感器試驗(yàn)進(jìn)行半定量生物傳感器試驗(yàn)。采用了結(jié)核分枝桿菌的接頭和靶序列。最終反應(yīng)液中的靴序列濃度是0nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM。(ix)多重生物傳感器試驗(yàn)除了試驗(yàn)中加入較高濃度的EcoRI(7U)/適配體3_ADJ_L(53ng)和MBL(IOOng)外，按生物傳感器試驗(yàn)進(jìn)行多重生物傳感器試驗(yàn)。靶結(jié)合反應(yīng)中存在結(jié)核分枝桿菌的接頭和35S接頭。各反應(yīng)液中加入5皮摩爾的35S和/或結(jié)核分枝桿菌靶核酸，最終濃度為250nM。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白，不難對(duì)本說明書所描述的本發(fā)明那些具體描述內(nèi)容作各種變化和修飾。但應(yīng)理解本發(fā)明包括所有這些變化和修飾。本發(fā)明還單獨(dú)或綜合地包括本說明書引用或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，及任何兩個(gè)或多個(gè)步驟或特征的任何和所有組合。權(quán)利要求一種檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法，該方法包括提供一種核酸酶-適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了此核酸酶的活性，當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)即直接或間接地減少或消除適配體對(duì)核酸酶活性的抑制；將核酸酶-適配體復(fù)合物加入到樣品中；檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在靶核苷酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，樣品中存在的靶核苷酸序列可修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合，從而減少或消除適配體對(duì)核酸酶活性的抑制。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性，當(dāng)樣品中存在靶核苷酸序列時(shí)該適配體能與靶核苷酸序列雜交從而修飾、減少或消除核酸酶與適配體之間的結(jié)合；將核酸酶-適配體復(fù)合物加入到樣品中；如果樣品中存在靶核苷酸序列，該序列即與適配體雜交；和檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。4.如權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其中，該方法包括同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的反應(yīng)，該方法包括提供多種核酸酶_適配體復(fù)合物，其中至少兩種核酸酶_適配體復(fù)合物包含(i)能與不同靶核苷酸序列雜交的適配體；和(ii)其活性能分別檢測(cè)的不同核酸酶。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，包括以下步驟提供一種核酸酶_適配體復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，該適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了核酸酶的活性；提供一種接頭核酸，其包含能與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交的第一部分，并包含該接頭核酸第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)能與適配體雜交的第二部分，其中適配體與接頭核酸第二部分之間的雜交修飾、減少或消除了適配體與核酸酶之間的結(jié)合；將核酸酶-適配體復(fù)合物加入到樣品中；將接頭核酸加入到樣品中；使接頭核酸第一部分與樣品中可能存在的靶核苷酸序列雜交；當(dāng)該接頭核酸第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)，使接頭核酸第二部分與適配體雜交；禾口檢測(cè)核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明樣品中存在該靶核苷酸序列。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述接頭核酸包含一莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且接頭第一部分的至少一部分包含在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，接頭第二部分的至少一部分包含在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干中。7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，該方法包括同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的反應(yīng)，該方法包括提供多種接頭核酸，其中至少兩種接頭核酸包含能與不同靶核苷酸序列雜交的不同的第一部分，并且還包含能與不同適配體雜交的不同的第二部分；和提供多種核酸酶_適配體復(fù)合物，其中至少兩種核酸酶_適配體復(fù)合物包含能與不同的接頭核酸第二部分優(yōu)先雜交的適配體，并且包含其活性能分別檢測(cè)的不同核酸酶。8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，該方法包括同時(shí)檢測(cè)樣品中多種靶核苷酸序列的方法，該方法包括提供多種接頭核酸，其中至少兩種接頭核酸包含能與不同靶核苷酸序列雜交的不同的第一部分，但該接頭核酸包含能與同一適配體雜交的第二部分；和提供含有能與該接頭核酸第二部分雜交的適配體的核酸酶_適配體復(fù)合物。9.如權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述的方法，其中，通過報(bào)告核酸被切割的速率或程度來檢測(cè)所述核酸酶的活性。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述核酸酶是限制性內(nèi)切核酸酶。11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，使一種熒光團(tuán)結(jié)合于所述報(bào)告核酸，能猝滅該熒光團(tuán)熒光的猝滅劑也結(jié)合于所述報(bào)告核酸，其中當(dāng)所述報(bào)告核酸被核酸酶切斷時(shí)即減少或消除了猝滅劑對(duì)熒光團(tuán)的猝滅作用。12.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述報(bào)告核酸結(jié)合有一多肽并且該報(bào)告核酸還結(jié)合于一種固定物，當(dāng)該報(bào)告核酸被切斷時(shí)使該多肽從固定物釋放，因而當(dāng)固定物固定后，未固定的多肽量可表明核酸酶的活性。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的固定物是磁珠，固定物的固定受施加磁場(chǎng)的影響。14.如附屬于權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的權(quán)利要求9-13任何一項(xiàng)所述的方法，其中，提供了多種報(bào)告核酸，其至少兩種包含有不同限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)。15.如附屬于權(quán)利要求11的權(quán)利要求14所述的方法，其中包含有不同限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的至少兩種報(bào)告核酸也包含從猝滅劑釋放時(shí)能被分別檢測(cè)的熒光團(tuán)。16.如附屬于權(quán)利要求12的權(quán)利要求14所述的方法，其中包含有不同限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的至少兩種報(bào)告核酸也包含從固定物釋放時(shí)能被分別檢測(cè)的多肽。17.—種篩檢生物體是否存在靶核苷酸序列的方法，該方法包括從生物體獲得核酸樣品，和按照權(quán)利要求1-16任何一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)該樣品中存在的靶核苷酸序列。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是生物體的非天然核苷酸序列。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是引入的核苷酸序列。20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述靶核苷酸序列是基因組核苷酸序列、等位基因核苷酸序列、突變的核苷酸序列、單個(gè)核苷酸多態(tài)性、轉(zhuǎn)座子核苷酸序列或病毒核苷酸序列。21.如權(quán)利要求17-20任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述的生物體是植物。22.如附屬于權(quán)利要求19的權(quán)利要求21所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包括以下之一種或幾種花椰菜鑲嵌病毒35S(CaMV35S)啟動(dòng)子序列、根癌土壤桿菌胭脂堿合酶(nos)終末子序列或5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶(EPSPS)編碼核苷酸序列。23.一種核酸酶結(jié)合性適配體，其中所述適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了該核酸酶的活性。24.如權(quán)利要求23所述的適配體，其中所述核酸酶是限制性內(nèi)切核酸酶。25.如權(quán)利要求24所述的適配體，其中所述適配體包含修飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列。26.如權(quán)利要求23-25任何一項(xiàng)所述的適配體，其中所述適配體能結(jié)合EcoRI并且與之結(jié)合時(shí)抑制了EcoRI的活性。27.如權(quán)利要求26所述的適配體，其中所述適配體包含SEQIDNO:1所示的核酸苷序列基序和/或SEQIDNO2所示的核酸苷序列基序。28.如權(quán)利要求26或27所述的適配體，還包含以下所示修飾的EcoRI識(shí)別序列5，-GAGT-TC-3，3，-CT-AAG-5，其中，粗體表示的G殘基是形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的不成對(duì)核苷酸殘基。29.如權(quán)利要求23-28任何一項(xiàng)所述的適配體，其中所述適配體包含SEQIDNO:3所示的核酸苷序列；或保留了結(jié)合和抑制EcoRI活性能力的所述適配體的變體。30.一種核酸酶-適配體復(fù)合物，包含結(jié)合于一適配體的核酸酶，其中適配體與核酸酶的結(jié)合抑制了所述核酸酶_適配體復(fù)合物中核酸酶的活性。31.如權(quán)利要求30所述的核酸酶-適配體復(fù)合物，其中所述的核酸酶是限制性內(nèi)切核酸酶。32.如權(quán)利要求31所述的核酸酶-適配體復(fù)合物，其中所述的核酸酶是EcoRI。33.如權(quán)利要求30-32任何一項(xiàng)所述的核酸酶-適配體復(fù)合物，其中所述適配體是權(quán)利要求23-29任何一項(xiàng)所述的適配體。34.如權(quán)利要求1-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核酸酶-適配體復(fù)合物是權(quán)利要求30-33任何一項(xiàng)所述的核酸酶-適配體復(fù)合物。35.一種接頭核酸，其包含能與靶核苷酸序列雜交的第一部分，和當(dāng)該接頭核酸第一部分與靶核苷酸雜交時(shí)能與核酸酶_適配體復(fù)合物中的適配體雜交的第二部分，其中，適配體與接頭核酸基序第二部分之間的雜交減少或消除了該核酸酶-適配體復(fù)合物中適配體與核酸酶之間的結(jié)合。36.如權(quán)利要求35所述的接頭核酸，其中所述的接頭核酸包含一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該接頭第一部分中的至少一部分包含在此莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)中，而該接頭第二部分中的至少一部分包含在此莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖干中。37.如權(quán)利要求36所述的接頭核酸，其中當(dāng)所述接頭的第一部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)，所述第二部分可與權(quán)利要求23-29任何一項(xiàng)所述的適配體雜交。38.如權(quán)利要求36所述的接頭核酸，其中所述接頭的第二部分包含SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。39.如權(quán)利要求36-38任何一項(xiàng)所述的接頭核酸，其中所述接頭分子的第一部分適合于與花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子的核苷酸序列的一個(gè)區(qū)域雜交。40.如權(quán)利要求39所述的接頭核酸，其中所述接頭核酸的第一部分包含SEQIDNO5所示的核苷酸序列。41.如權(quán)利要求36-38任何一項(xiàng)所述的接頭核酸，其中所述接頭分子的第一部分適合于與結(jié)核分枝桿菌衍生的核苷酸序列雜交。42.如權(quán)利要求41所述的接頭核酸，其中所述接頭核酸的第一部分包含SEQIDNO6所示的核苷酸序列。43.如權(quán)利要求5-22任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述接頭核酸包括權(quán)利要求35-42任何一項(xiàng)所述的接頭核酸。44.一種實(shí)施權(quán)利要求1_22、34或43任何一項(xiàng)所述方法的試劑盒，所述試劑盒裝有權(quán)利要求23-29任何一項(xiàng)所述的一種或多種適配體；權(quán)利要求30-33任何一項(xiàng)所述的核酸酶_適配體復(fù)合物；和/或權(quán)利要求35-42任何一項(xiàng)所述的接頭核酸。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及利用核酸酶-適配體(aptamer)復(fù)合物檢測(cè)樣品中靶核苷酸序列的方法。本發(fā)明還提供可用于本發(fā)明方法的核酸酶結(jié)合適配體、核酸酶-適配體復(fù)合物和接頭分子。文檔編號(hào)C07H21/04GK101809164SQ200880018421公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2008年4月4日優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日發(fā)明者A·S·米利根,S·J·弗萊徹申請(qǐng)人:來普利澳大利亞控股有限公司