專利名稱：：具有改進(jìn)形態(tài)發(fā)生的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有各種不同類型的改進(jìn)形態(tài)發(fā)生的植物，尤其涉及在形態(tài)發(fā)生上具有改進(jìn)莖、葉、花、子房(莢，果實(shí))和種子的植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這種植物的制備方法。
背景技術(shù)：
：植物適合根的各種不同類型的環(huán)境因子。例如，植物隨生長(zhǎng)和發(fā)育的環(huán)境具有變形能力。一旦植物落地生根，如果該地方的環(huán)境對(duì)此植物不適合，由于植物不能移動(dòng)，所以只能通過(guò)改變其自身的形狀來(lái)適合和繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育。變形能力對(duì)植物生存是必要條件。為了改進(jìn)各種不同類型的形態(tài)發(fā)生修飾，已經(jīng)實(shí)施了雜交，利用最近的遺傳工程技術(shù)進(jìn)行繁殖以及利用植物激素和植物調(diào)節(jié)劑功能的方法。為了了解植物形態(tài)發(fā)生和形態(tài)修飾的控制機(jī)理，利用阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)已經(jīng)進(jìn)行眾多研究。有報(bào)道LEAFY(LFY)，APETALA1(AP1)，AGAMOUS(AG)，SUPERMAN(SUP)和FIL(FIL)為參與花形成的基因。有報(bào)道TCH4和dbp等為參與莖形成的基因。有報(bào)道LAN1和MAC為參與葉形成的基因。有報(bào)道ttg，g12，CPC和IRE為參與根形成的基因。利用遺傳工程技術(shù)己經(jīng)創(chuàng)造了具有改進(jìn)形態(tài)修飾和形態(tài)發(fā)生的植物。有報(bào)道通過(guò)導(dǎo)入具有鋅指基元的轉(zhuǎn)錄因子(PetSPL3)帶來(lái)矮牽?；ǖ男螒B(tài)變化(日本未審專利公開(kāi)No.262390/1999)。有報(bào)道通過(guò)導(dǎo)入CPC基因或IRE基因帶來(lái)阿拉伯芥根的形態(tài)變化(日本未審專利公開(kāi)No.4978/1998和270873/2000)。然而，其中這些基因已被轉(zhuǎn)基因修飾的大多數(shù)植物實(shí)際上一直未獲得具有工業(yè)實(shí)用性的足夠效果，因此目前還未達(dá)到實(shí)用水平。多胺為具有2個(gè)或多個(gè)伯胺基團(tuán)的脂肪族烴的總稱，在生物體中是遍在的自然物質(zhì)，迄今已發(fā)現(xiàn)20多種。典型的多胺包括腐胺，亞精胺和精胺。已知多胺的主要生理作用包括(1)通過(guò)與核酸相互作用導(dǎo)致核酸穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)修飾；(2)促進(jìn)各種不同核酸合成系統(tǒng)；(3)活化蛋白合成系統(tǒng)；以及(4)穩(wěn)定細(xì)胞膜和增強(qiáng)物質(zhì)的細(xì)胞膜通透性。多胺在植物中的作用的報(bào)道包括在細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂過(guò)程中細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)核酸或蛋白生物合成。最近，多胺參與各種類型的環(huán)境應(yīng)激已引起關(guān)注。對(duì)形態(tài)修飾和多胺涉及體細(xì)胞胚胎發(fā)生和偶生的根形成有若干報(bào)道。例如，已經(jīng)證實(shí)多胺促進(jìn)下列植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生胡蘿卜(Planta，162,532,1984，Science,223,1433，1984)，燕麥(PlantGrowthReg"3,329，1985)，大白菜(PlantSci.，56，167,1988)，和矮牽?；?PlantSci.，62,123,1989)，并且促進(jìn)綠豆中偶生的根形成(Physiol.Plant"64,53,1985，PlantCellPhysiol"24，677，1983)。迄今為止，對(duì)多胺參與花，莖，葉和子房的形態(tài)發(fā)生幾乎沒(méi)有任何報(bào)道。已知多胺代謝相關(guān)的酶涉及植物多胺的生物合成，包括精氨酸脫羧酶(ADC)，鳥氨酸脫羧酶(ODC)，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)，亞精胺合酶(SPDS)和精胺合酶(SPMS)。若干編碼這種多胺代謝相關(guān)酶的多胺代謝相關(guān)酶基因已經(jīng)從植物中分離。ADC基因已經(jīng)從下列植物中分離燕麥(Mol.Gen.Genet"224，431-436(1990))，西紅柿(PlantPhysio.,103，829-834(1993))，阿拉伯芥(PlantPhysiol"111,1077-1083(1996))，和豌豆(PlantMol.Biol.,28,997-1009(1995));ODC基因已經(jīng)從曼陀羅中分離(Biochem.J"314，241-248(1996));SAMDC基因已經(jīng)從下列植物中分離土豆(PlantMol.Biol.，26，327-338(1994))，菠菜(PlantPhysiol.,107,1461-1462(1995))，以及煙草；SPDS基因已經(jīng)從阿拉伯芥中分離(PlantCellPhysiol.,39(1)，73-79(1998))。因此，本發(fā)明的目的是通過(guò)人工控制多胺代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)以及通過(guò)改變多胺的水平來(lái)制備具有各種類型的改進(jìn)形態(tài)發(fā)生的重組植物。附圖簡(jiǎn)述圖1示出含有多胺代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)；圖2示出黑子南瓜(CucurbitaficifoliaBouche)SPDS基因在轉(zhuǎn)化子中表達(dá)的結(jié)果。圖2中，1.野生型(WT);2.轉(zhuǎn)化子(TSP-14);3.轉(zhuǎn)化子(TSP-15);4.轉(zhuǎn)化子(TSP-16);5.轉(zhuǎn)化子(TSP-17);6.轉(zhuǎn)化子(TSP-19);圖3示出野生型植物和導(dǎo)入了多胺代謝相關(guān)酶基因的植物中莖的數(shù)目的比較；圖4的照片示出野生型植物和導(dǎo)入了多胺代謝相關(guān)酶基因的植物中莖、葉、花、子房和種子的數(shù)目的比較；圖5的圖表示出野生型植物和導(dǎo)入了多胺代謝相關(guān)酶基因的植物中主莖的數(shù)目的比較；圖6的圖表示出野生型植物和導(dǎo)入了多胺代謝相關(guān)酶基因的植物中側(cè)莖的數(shù)目的比較；圖7的圖表示出野生型植物和導(dǎo)入了多胺代謝相關(guān)酶基因的植物的花期的比較；圖8示出表達(dá)外源基因的每個(gè)單株的花朵數(shù)隨時(shí)間變化的測(cè)定結(jié)果；以及圖9示出表達(dá)外源基因的每個(gè)單株的花朵數(shù)隨時(shí)間變化的測(cè)定結(jié)果。發(fā)明公開(kāi)經(jīng)過(guò)廣泛研究，結(jié)果實(shí)現(xiàn)了上述目的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)參與多胺生物代謝的多胺代謝相關(guān)酶基因被分離，導(dǎo)入并在植物中過(guò)表達(dá)，從而通過(guò)操縱多胺代謝給多胺水平帶來(lái)變化時(shí)，形態(tài)發(fā)生的各種參數(shù)，諸如莖、葉、花、子房(莢，果實(shí))和種子(胚珠)得以改進(jìn)。多胺是每個(gè)分子含有許多胺的堿性物質(zhì)，典型的例子包括二胺腐胺，三胺亞精胺和四胺精胺。參與這種多胺的生物合成的多胺代謝相關(guān)酶的例子包括腐胺的ADC和ODC，亞精胺的SAMDC和SPDS，以及精胺的SAMDC和SPMS。編碼這種多胺代謝相關(guān)酶的多胺代謝相關(guān)酶基因已經(jīng)在若干植物中分離出來(lái)。此外，一些多胺代謝相關(guān)酶基因整合在植物中。然而，對(duì)所得轉(zhuǎn)基因植物的莖、葉、花、子房和種子的形態(tài)發(fā)生的改進(jìn)還沒(méi)有報(bào)道。如上所述，作為廣泛研究的結(jié)果是改進(jìn)植物的形態(tài)發(fā)生，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多胺亞精胺和精胺的含量對(duì)植物的形態(tài)發(fā)生是尤其重要的。本發(fā)明人真正從植物組織中分離和鑒定出了參與亞精胺和精胺生物合成的多胺代謝相關(guān)酶基因(SPDS，SAMDC，ADC)。本發(fā)明人在下列發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上實(shí)施了本發(fā)明在植物中導(dǎo)入和過(guò)表達(dá)這些基因通過(guò)操縱多胺代謝給多胺水平帶來(lái)了變化，導(dǎo)致莖、葉、花、子房(莢、果實(shí))和種子(胚珠)的各種形態(tài)發(fā)生參數(shù)的改進(jìn)。本發(fā)明旨在提供下列主要方面1.植物及其子代，其穩(wěn)定地保留至少一種核酸序列，所述核酸序列在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)一種或多種多胺的量，以及植物及其子代與缺乏所述核酸序列的植物比較具有至少一種改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生。22.植物的制備方法，所述植物穩(wěn)定地保留至少一種核酸序列，所述核酸序列在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)一種或多種多胺的量，以及所述植物與缺乏所述核酸序列的植物比較具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生，所述方法包括轉(zhuǎn)化缺乏所述核酸序列的植物細(xì)胞的步驟。24.植物的制備方法，所述植物與缺乏調(diào)節(jié)一種或多種多胺的量的核酸序列的植物比較具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生，所述方法包括用至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏所述核酸序列的植物細(xì)胞的步驟，所述表達(dá)載體含有至少一種所述核酸序列，所述核酸序列在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下。40.具有固定特征的植物的制備方法，所述植物是調(diào)節(jié)一種或多種多胺的量的核酸序列的純合體，以及所述植物與缺乏所述核酸序列的植物比較具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生，所述方法包括下列步驟(1)用至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏所述核酸序列的植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有至少一種所述核酸序列，所述核酸序列在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下；(2)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中再生與缺乏所述核酸序列的植物比較具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物；(3)從植物體收集通過(guò)授粉獲得的種子；以及(4)從植物體分析通過(guò)授粉獲得的種子中的核酸序列，所述植物體通過(guò)培育種子而獲得，以挑選核酸序列的純合體。41.具有固定特征的愈傷組織的制備方法，所述愈傷組織是調(diào)節(jié)一種或多種多胺的量的核酸序列的純合體，以及所述愈傷組織與缺乏所述核酸序列的植物比較具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生，所述方法包括下列步驟(1)用至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏所述核酸序列的植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有至少一種所述核酸序列的抑制劑，所述核酸序列在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下；以及(2)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中誘導(dǎo)愈傷組織。根據(jù)本發(fā)明，"器官"表示所有植物的器官(組織)，并且表示例如，莖、塊莖、葉、根、塊狀根、芽、花、花瓣、子房、果實(shí)、莢、孢蒴、種子、須根和胚珠等。涉及器官(組織)的形式的特征可屬于數(shù)量、生長(zhǎng)和發(fā)育周期、形狀、顏色、特性和特征等。因?yàn)槎喟返谋磉_(dá)量密切相關(guān)于器官的數(shù)量，多胺的增加促進(jìn)了葉、花、果實(shí)、根、塊莖、塊狀根、莢和孢蒴的開(kāi)始并延遲了上述器官的結(jié)束，這些特征可加以評(píng)價(jià)和享有一段延長(zhǎng)的期間。多胺在植物中通過(guò)本發(fā)明所獲得的表達(dá)量可增加，而不受生長(zhǎng)環(huán)境(例如環(huán)境壓力)的影響，并且可改進(jìn)形態(tài)發(fā)生。外源多胺代謝相關(guān)酶基因或內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑可被引作調(diào)節(jié)多胺量的核酸序列。外源多胺代謝相關(guān)酶基因增加多胺在植物中的量，而內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑減少多胺在植物中的量。對(duì)本發(fā)明而言，"不具有核酸序列調(diào)節(jié)多胺的量的植物"表示所有在基因組中不具有核酸序列(例如，外源多胺代謝相關(guān)酶基因或內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑)的植物。結(jié)果，除了野生型種以外，該術(shù)語(yǔ)包括通過(guò)普通雜交建立的栽培變種，天然或人工變體，以及其中已經(jīng)導(dǎo)入除了多胺代謝相關(guān)酶基因外的外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的"多胺"指的是在生物體中遍在的共同天然物質(zhì)，并且是含有兩個(gè)或多個(gè)伯胺基團(tuán)的脂肪族烴化合物。例子包括1，3-二氨基丙垸，腐胺，尸胺，去甲亞精胺，亞精胺，同型亞精胺，氨基丙基尸胺，thermine(去甲精胺)，精胺，熱精胺(thermospermine)，刀豆四胺(canavalmine)，氨基戊基去甲亞精胺，N,N-雙(氨基丙基)尸胺，同型精胺，caldopentamine，homocaldopentamine，caldohexamine禾口homocaldohexamine。多胺代謝相關(guān)酶基因如本發(fā)明所用，"多胺代謝相關(guān)酶基因"是編碼參與植物中多胺生物合成的酶的氨基酸的基因。據(jù)認(rèn)為涉及并且是限速的例子包括典型的多胺腐胺的精氨酸脫羧酶(ADC)和鳥氨酸脫羧酶(ODC)基因，亞精胺的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)和亞精胺合酶(SPDS)基因，以及精胺的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)和精胺合酶(SPMS)基因。精氨酸脫羧酶(ADC:EC4丄1.19.)催化從L-精氨酸生產(chǎn)agmatine和二氧化碳的反應(yīng)。鳥氨酸脫羧酶(ODC:EC4丄1.17.)催化從L-鳥氨酸生產(chǎn)尸胺和二氧化碳的反應(yīng)。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC:EC4丄1.50.)催化從S-腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)腺苷甲基硫代丙胺的反應(yīng)。亞精胺合酶(SPDS:EC2.5丄16.)催化從腐胺和腺苷甲基硫代丙胺生產(chǎn)亞精胺和甲基硫代腺苷的反應(yīng)。這些基因中任何都可能被衍生，可從各種植物中分離。具體的例子包括雙子葉植物，諸如葫蘆科植物；茄科植物；蕓苔科植物(Brassicaceae)，諸如阿拉伯芥；蝶形花科植物(Papilionaceae)，諸如苜蓿和豇豆(Vignaunguiculata);錦葵科植物；紫菀科植物；藜科植物和旋花科植物；或單子葉植物，諸如禾本科植物，包括水稻，小麥，大麥禾B玉米。耐旱仙人掌或松葉菊(Mesembryanthemumcrystallinum)也包括在內(nèi)。優(yōu)選葫蘆科植物，并且尤其優(yōu)選黑子南瓜。從中分離本發(fā)明的植物衍生的多胺代謝相關(guān)酶基因的植物組織可以以種子的形式或處于生長(zhǎng)過(guò)程中?；蚩蓮牟糠只蛉可L(zhǎng)植物的組織中分離。任何部分可用來(lái)分離基因，但是優(yōu)選整個(gè)植物，芽，花，子房，果實(shí)，葉，莖，根等。本發(fā)明所用的多胺代謝相關(guān)酶基因的優(yōu)選的例子包括亞精胺合酶基因，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因和精氨酸脫羧酶基因。具體的例子包括DNA，其具有由SEQIDNO.l中第77-1060位堿基代表的堿基序列；DNA，其具有由SEQIDN0.3中第456-1574位堿基代表的堿基序列；以及DNA，其具有由SEQIDNO.5中第541-2661位堿基代表的堿基序列。其他例子包括DNA，其具有在嚴(yán)格條件下能夠與上述任何序列雜交的堿基序列，并且編碼與這些序列具有等同的多胺代謝相關(guān)酶活性的多肽。其他例子還包括DNA，其包括具有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失，替換，插入或添加的上述任何堿基序列，并且編碼與這些序列具有等同的多胺代謝相關(guān)酶活性的多肽。本發(fā)明所指的"嚴(yán)格條件"表示在此條件下，只有編碼與多胺代謝相關(guān)酶等同的多胺代謝相關(guān)酶活性的多肽的堿基序列(由特定多胺代謝相關(guān)酶基因序列編碼)，才能與特定序列形成雜合體(稱為特異雜合體)，而編碼沒(méi)有這種等同活性的多肽的堿基序列不與特定序列形成雜合體(稱作非特異雜合體)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)改變?cè)陔s交反應(yīng)和清洗過(guò)程中的溫度，雜交反應(yīng)和清洗過(guò)程中的鹽濃度等，可容易選擇這種條件。具體的例子包括但是不限于雜交條件為在42"C，6XSSC(0.9MNaCl,0.09M擰檬酸三鈉)或6XSSPE(3MNaC1，0.2MNaH2P04，20mMEDTA-2Na，pH7.4)，以及產(chǎn)物用0.5XSSC在42"C下清洗。一般而言，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員眾所周知，在具有生物活性蛋白的氨基酸序列中替換，缺失，插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸仍可保持這些生理活性。在本發(fā)明所述的"具有1個(gè)或多個(gè)堿基缺失，替換，插入或添加的堿基序列"包括具有這種修飾并且編碼多胺代謝相關(guān)酶的基因，這樣的基因包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，polyA尾或5',3'端非翻譯區(qū)可被"缺失"，而堿基可"缺失"至一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失的程度。堿基還可被替換，只要不產(chǎn)生讀碼框位移。堿基還可被"添加"到氨基酸被添加的程度。然而，重要的是這種修飾不會(huì)導(dǎo)致多胺代謝相關(guān)酶活性的喪失。優(yōu)選"具有一個(gè)或若干個(gè)堿基缺失，替換或添加的基因"。這種修飾的DNA可通過(guò)修飾本發(fā)明的DNA堿基序列而獲得，從而特定位點(diǎn)處的氨基酸例如，通過(guò)位點(diǎn)特異性突變而被替換，缺失，插入或添加(NucleicAcidResearch,Vol.10,No.20,6487-6500(1982))。在本發(fā)明中，"反義基因"是指具有與多胺代謝相關(guān)酶基因的堿基序列互補(bǔ)的序列的基因。反義DNA例如是互補(bǔ)于SEQIDNOS.l,3或5的堿基序列。反義RNA從此制備。內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑抑制劑抑制基因的表達(dá)，但并不具體限制，并且例如包括反義DNA，或雙鏈RNA(dsRNA)或選自上游或下游的基因或序列的RNAi。反義DNA可能互補(bǔ)于5'上游一側(cè)的調(diào)節(jié)區(qū)，包括基因的內(nèi)含子或外顯子，或互補(bǔ)于基因的啟動(dòng)子，或終止密碼子的下游一側(cè)的區(qū)域，其影響基因表達(dá)。反義DNA的長(zhǎng)度為至少20個(gè)堿基，優(yōu)選至少100個(gè)堿基，更優(yōu)選至少300個(gè)堿基，更尤其至少500個(gè)堿基。將反義DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的mRNA雜交，或雜交于內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的非編碼區(qū)(例如啟動(dòng)子，內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄終止因子)或其上游或下游序列。RNAi包括具有與靶基因有關(guān)的有義序列和與靶基因有關(guān)的反義序列的RNA，以及所述有義序列和反義序列可分別包括在RNA的兩條鏈上，并且用作雙鏈RNA，或可包括在RNA的單鏈上，并且用作具有雙鏈部分的單鏈RNA分子和連接有義和反義序列的環(huán)序列。具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物及其子代如上所述，本發(fā)明中的"器官"表示所有植物的器官(組織)，例如包括莖，塊莖，葉，根，塊狀根，芽，花，花瓣，子房，果實(shí)，莢，孢蒴，種子，須根和胚珠等。涉及器官(組織)形式的特征可屬于數(shù)量，生長(zhǎng)和發(fā)育期，形狀，顏色，特性和特征等。本發(fā)明的"形態(tài)發(fā)生已得以改進(jìn)的植物"和"已經(jīng)改進(jìn)形態(tài)發(fā)生的植物"指的是一種植物，其中導(dǎo)入了外源多胺代謝相關(guān)酶基因或內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑以得到涉及形態(tài)發(fā)生的特征，與導(dǎo)入前比較，所述特征增強(qiáng)，改進(jìn)或抑制數(shù)量，生長(zhǎng)和發(fā)育期，形狀，顏色，特性或特征。例如，通過(guò)把多胺代謝相關(guān)酶基因或其抑制劑導(dǎo)入植物中，與沒(méi)有外源多胺代謝相關(guān)酶基因或抑制劑的植物比較，涉及莖，葉，花或種子形成的特征得以改進(jìn)。然而，本發(fā)明并不限于此。具體而言，通過(guò)調(diào)節(jié)多胺量的基因序列，"莖數(shù)改進(jìn)的植物"是一種植物莖(包括主莖，側(cè)莖，花柄，軀干，枝條等)數(shù)增加的植物，以及一種基于抑制劑植物莖(包括主莖，側(cè)莖，花柄，軀干，枝條等)數(shù)降低或減少的植物。"具有改進(jìn)的葉子數(shù)的植物"是一種植物葉子數(shù)增加或降低或減少的植物。"具有改進(jìn)的花朵數(shù)或花期的植物"是一種植物花朵數(shù)增加或降低或減少的植物，或一種具有植物花期提前或花期延長(zhǎng)的植物。"具有改進(jìn)的子房數(shù)或子房發(fā)育期的植物"是一種植物子房，果實(shí)，莢和孢蒴數(shù)增加或降低或減少的植物，或者一種從子房，果實(shí)，莢和孢蒴的結(jié)實(shí)到成熟的生長(zhǎng)或發(fā)育期增加或降低或減少的植物。"具有改進(jìn)的種子數(shù)的植物"是一種植物種子(包括子房)數(shù)增加或降低或減少的植物。以此方式，植物(器宮和組織等)的產(chǎn)品質(zhì)量，生產(chǎn)率和收率以及產(chǎn)品特征的改進(jìn)是可以預(yù)計(jì)的。此外，在可食用植物諸如蔬菜和水果中，減少可食用部分(葉，果實(shí)，塊莖，塊狀根等)的多胺量可以在諸如產(chǎn)品質(zhì)量的特征方面具有有益效果。因此，通過(guò)在這些可食用部分表達(dá)抑制劑而在其他部分表達(dá)多胺代謝相關(guān)酶基因來(lái)試圖改進(jìn)收率同時(shí)改進(jìn)質(zhì)量是可能的。此外，通過(guò)改進(jìn)形態(tài)發(fā)生和改變植物的形狀和形成，對(duì)各種環(huán)境壓力適應(yīng)性(抗性)的改進(jìn)也是可以預(yù)計(jì)的。具體而言，似乎葉數(shù)和基于葉綠素的葉的綠色可以增加，根(包括塊狀根和塊莖)可以延長(zhǎng)，莖的數(shù)目和厚度可以增加，因此，植物的環(huán)境適應(yīng)性可以增加。在一種本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在植物生長(zhǎng)期間，植物外觀的差異是小的(葉子是深綠色的)，但是諸如葉子，花和莖的器官的顯著改進(jìn)在增殖生長(zhǎng)期是更明顯的，并且這揭示植物的潛在能力(潛力)得以改進(jìn)。本發(fā)明的植物不僅包括植物整體(整個(gè)植物)，還包括愈傷組織，種子，所有植物組織，葉子，莖，塊莖，根，塊狀根，芽，花，花瓣，子房，果實(shí)，莢，胚珠和須根。它們的子代也包括在本發(fā)明的植物中。本發(fā)明中的"從植物及其子代中獲得的有用物質(zhì)"表示由植物及其子代產(chǎn)生的有用物質(zhì)，其中外源多胺代謝相關(guān)酶基因的導(dǎo)入提供形態(tài)發(fā)生或與導(dǎo)入基因前比較改進(jìn)形態(tài)發(fā)生。有用物質(zhì)的例子包括氨基酸，油和脂，淀粉，蛋白，酚，烴，纖維素，天然膠，色素，酶，抗體，疫苗，藥用品以及生物可降解塑料。本發(fā)明的植物是沒(méi)有外源多胺代謝相關(guān)酶基因的植物，但其中通過(guò)基因工程導(dǎo)入了這種外源多胺代謝相關(guān)酶基因，并且以穩(wěn)定的方式保留。如本發(fā)明所用的"以穩(wěn)定的方式保留"表示多胺代謝相關(guān)酶基因在至少已導(dǎo)入多胺代謝相關(guān)酶基因的植物中表達(dá)，并且在植物細(xì)胞中保留足夠長(zhǎng)的時(shí)間以導(dǎo)致形態(tài)發(fā)生的改進(jìn)。所以，多胺代謝相關(guān)酶基因優(yōu)選整合在宿主植物的染色體上。一種或多種多胺代謝相關(guān)酶基因甚至應(yīng)該更優(yōu)選地保留在隨后的后代中。如本發(fā)明所用的"外源"表示對(duì)植物不是內(nèi)源性的，而是從外部導(dǎo)入的。因此，"外源多胺代謝相關(guān)酶基因"可以是同源于宿主植物的多胺代謝相關(guān)酶基因(即，衍生自宿主植物)，其是通過(guò)基因操作從外部導(dǎo)入的。根據(jù)密碼子用法的同一性，優(yōu)選使用宿主衍生的多胺代謝相關(guān)酶基因。采用任何基因工程的方法，可將外源多胺代謝相關(guān)酶基因?qū)胫参镏?。例子包括與具有多胺代謝相關(guān)酶基因的異種植物細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體融合，用具有病毒基因組的植物病毒感染，所述病毒基因組經(jīng)遺傳操作后表達(dá)多胺代謝相關(guān)酶基因，或者利用含有多胺代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞。本發(fā)明的植物優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因植物，其制備方法是用含有在啟動(dòng)子控制下的外源多胺代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏外源多胺代謝相關(guān)酶基因的植物細(xì)胞，所述啟動(dòng)子能夠在植物中起作用。能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子的例子包括在植物細(xì)胞中組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，仙人掌合酶基因(NOS)啟動(dòng)子，章魚堿合酶基因(OCS)啟動(dòng)子，苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)基因啟動(dòng)子，以及查耳酮合酶(CHS)基因啟動(dòng)子。其他眾所周知的植物啟動(dòng)子也是可用的，不限于上述這些啟動(dòng)子。不僅在整個(gè)器官中組成型表達(dá)的啟動(dòng)子諸如35S啟動(dòng)子，而且特異于器官或組織的啟動(dòng)子都可用來(lái)僅在靶器官或組織中表達(dá)靶基因，從而在特異器官或組織中改進(jìn)形態(tài)發(fā)生。例如，多胺代謝相關(guān)酶基因和能夠特異于花器官起作用的啟動(dòng)子(諸如W099/43818，日本未審專利公開(kāi)178572/1999，日本未審專利公開(kāi)316582/2000)可用來(lái)改進(jìn)花朵數(shù)和花期。此外，子房和果實(shí)的生長(zhǎng)和發(fā)育的持續(xù)時(shí)間通過(guò)采用特異于子房和果實(shí)的啟動(dòng)子可得以改進(jìn)(PlantMol.Biol"11，651-662,1988)。如果使用時(shí)間特定啟動(dòng)子，靶基因僅在特定時(shí)間可得以表達(dá)，并且形態(tài)發(fā)生僅在特定時(shí)期可得以改進(jìn)。例如，通過(guò)采用多胺代謝相關(guān)酶基因和在植物生產(chǎn)期間有效的啟動(dòng)子，形態(tài)發(fā)生僅在植物生長(zhǎng)期間可得以改進(jìn)。根據(jù)生存環(huán)境，通過(guò)低溫，高溫，壓力，干旱，光，熱，激素，損傷等調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可用來(lái)表達(dá)靶基因。例如，多胺代謝相關(guān)酶基因和僅當(dāng)植物接觸低溫時(shí)能夠轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(諸如BN115啟動(dòng)子PlantPhysiol.,106，917-928(1999))可用來(lái)僅在低溫下控制植物的多胺代謝以及改進(jìn)形態(tài)發(fā)生。多胺代謝相關(guān)酶基因和僅當(dāng)植物接觸干旱時(shí)能夠轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(諸如Atmyb2啟動(dòng)子ThePlantCell,5，1529-1539,1993)可用來(lái)在干旱期間控制植物的多胺代謝以及改進(jìn)形態(tài)發(fā)生。外源多胺代謝相關(guān)酶基因在本發(fā)明的表達(dá)載體中的位置處于啟動(dòng)子的下游，從而轉(zhuǎn)錄受到能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子的控制。能夠在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(終止區(qū))也應(yīng)加到多胺代謝相關(guān)酶基因的下游。例子是終止子NOS(仙人掌合酶)基因。本發(fā)明的表達(dá)載體也可含有諸如增強(qiáng)子序列的順式調(diào)節(jié)元件。表達(dá)載體也可含有用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因，諸如藥物抗性基因標(biāo)記，其例子包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因，膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PAT)，以及glyophosate抗性基因。由于整合的基因在缺乏選擇壓力下有時(shí)會(huì)丟失，因此有利的是確保除草劑抗性基因也存在于載體上，以便在培育過(guò)程中使用除草劑總會(huì)導(dǎo)致涉及選擇壓力的條件。為了利于規(guī)模生產(chǎn)和純化，表達(dá)載體也應(yīng)該含有在大腸桿菌(E.coli)中的選擇標(biāo)記基因(諸如氨芐青霉素抗性基因或四環(huán)素抗性基因)和能夠在大腸桿菌中自動(dòng)復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。本發(fā)明的表達(dá)載體的構(gòu)建方法可以簡(jiǎn)單方式將目的選擇標(biāo)記基因和多胺代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)盒插入到大腸桿菌載體(pUC或pBR系列)的克隆位點(diǎn)。當(dāng)外源多胺代謝相關(guān)酶基因通過(guò)感染有根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)而導(dǎo)入，多胺代謝相關(guān)酶基因表達(dá)盒可插入在細(xì)胞的Ti或Ri質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)(轉(zhuǎn)移到植物染色體的區(qū)域)中。目前，二元載體系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的標(biāo)準(zhǔn)方法中。T-DNA轉(zhuǎn)移的必需功能獨(dú)立地由T-DNA本身和Ti(或Ri)質(zhì)粒所提供，這些結(jié)構(gòu)元件被劃分在單獨(dú)的載體上。二元質(zhì)粒具有25bp的邊緣序列，其兩端對(duì)切割和組合T-DNA是必需的，并且去除了誘導(dǎo)冠癭病(或發(fā)根)的植物激素基因，同時(shí)提供插入外源基因的余地。可商購(gòu)的二元載體的例子包括pBI101和pBI121(兩者均來(lái)自Clontech)。參與整合T-DNA的Vir區(qū)對(duì)稱作輔助質(zhì)粒的單獨(dú)Ti(或Ri)質(zhì)粒具有反式作用。各種常規(guī)已知的方法可用于轉(zhuǎn)化植物。例子包括PEG方法，其中通過(guò)用細(xì)胞壁降解的酶諸如纖維素酶或半纖維素酶處理從植物細(xì)胞中分離原生質(zhì)體，并將聚乙二醇加到原生質(zhì)體和含有上述多胺代謝相關(guān)酶基因表達(dá)盒的表達(dá)載體的懸浮液中，以通過(guò)諸如內(nèi)吞作用的方法將表達(dá)載體整合到原生質(zhì)體；脂質(zhì)體方法，其中表達(dá)載體通過(guò)超聲處理等導(dǎo)入諸如磷脂酰膽堿的脂質(zhì)膜囊泡，并將囊泡在PEG存在下與原生質(zhì)體融合；利用微團(tuán)以類似方式融合的方法；以及電穿孔法，其中把電脈沖施加給原生質(zhì)體和表達(dá)載體的懸浮液從而將外部溶液中的載體整合到原生質(zhì)體中。然而，這些方法的復(fù)雜性在于它們對(duì)原生質(zhì)體再分化成植株需要培養(yǎng)技術(shù)。將基因?qū)刖哂屑?xì)胞壁的完整細(xì)胞的方法包括諸如微注射的直接注射，其中微吸管插入到細(xì)胞中從而將吸管中的載體DNA在水壓或氣壓下注射到細(xì)胞中，或者粒子槍方法，其中包被有DNA的金屬微粒通過(guò)爆炸物爆炸或氣壓被加速，并因此導(dǎo)入細(xì)胞中，以及涉及使用農(nóng)桿菌感染的方法。微注射的缺陷是需要相當(dāng)多的培訓(xùn)以及少量的處理細(xì)胞。所以，較理想的是采用諸如農(nóng)桿菌方法和粒子槍方法的更方便的方法轉(zhuǎn)化植物。粒子槍方法在基因可被直接導(dǎo)入培育的植物的頂端分生組織中是有用的。在農(nóng)桿菌方法中，諸如西紅柿金色花葉病毒(TGMV)或另一二價(jià)染色體病毒的植物病毒的基因組DNA同時(shí)在邊緣序列間插入到二元載體中，以便病毒感染可通過(guò)整個(gè)植株擴(kuò)散，以及靶基因簡(jiǎn)單地通過(guò)在培育植株的任何位置處用病毒細(xì)胞懸浮液接種細(xì)胞可被同時(shí)導(dǎo)入整個(gè)植株中。獲得多胺代謝相關(guān)酶基因的方法以及利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入靶基因以制備轉(zhuǎn)化子的方法的具體例子如下給出。關(guān)于內(nèi)源多胺代謝相關(guān)酶基因的抑制劑，本領(lǐng)域那些專業(yè)人員參照下列說(shuō)明書可制備轉(zhuǎn)基因植物。1.獲得多胺代謝相關(guān)酶基因(1)用于PCR的cDNA文庫(kù)的制備Poly(A)+RNA以常用方式從黑子南瓜的根組織中提取出來(lái)，所述根組織在18'C日間/14'C夜間的低溫處理下己進(jìn)行了3天。利用市場(chǎng)上可用的MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)等從分離的poly(A)+RNA中制備cDNA文庫(kù)用于PCR。分離的poly(A)+RNA用作模板，以及反轉(zhuǎn)錄酶和在3'端修飾有兩個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸位置的鎖對(duì)接oligo(dT)引物用于合成第一鏈cDNA。雙鏈cDNA通過(guò)聚合酶反應(yīng)獲得。雙鏈cDNA用T4DNA聚合酶鈍化，并且連接MarathoncDNA接頭，給出添加有接頭的雙鏈cDNA的文庫(kù)。(2)PCR引物的設(shè)計(jì)SPDS基因，SAMDC基因，ADC基因，和ODC基因可分離成多胺代謝相關(guān)酶基因。SPDS基因可從黑子南瓜或天仙子(Hyoscyamusniger)中分離，SAMDC基因可從土豆，菠菜或煙草中分離，ADC基因可從大豆，豌豆，或西紅柿中分離，以及ODC基因可從曼陀羅中分離。堿基序列已經(jīng)確定。因此，通過(guò)比較已知的堿基序列，可選擇極度保守區(qū)，以及可合成DNA寡聚體以設(shè)計(jì)PCR用的引物。(3)通過(guò)PCR獲得SPDS基因，SAMDC基因以及ADC基因片段上述(1)中制備的用于PCR的cDNA文庫(kù)用作模板，而上述(2)中設(shè)計(jì)的引物用于進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分離，并且用玻璃奶等純化。將純化的PCR產(chǎn)物連接到諸如TA載體的克隆載體上?？寺DNA的堿基序列的確定方法有Maxam-Gilbert,雙脫氧法等。利用市場(chǎng)上可用的試劑盒可實(shí)施任一方法，以及全自動(dòng)測(cè)序儀可用于自動(dòng)測(cè)序。(4)分離全長(zhǎng)基因以常用方式通過(guò)噬斑雜交，RACE(快速擴(kuò)增cDNA末端)，MarathonRACE等，可獲得全長(zhǎng)基因。如此獲得的基因?yàn)閰⑴c多胺生物合成的基因，并且利用這些基因，通過(guò)在分子生物學(xué)水平上控制基因的表達(dá)可以控制多胺水平，以及制備具有各種類型的形態(tài)發(fā)生改進(jìn)的植物。2.利用農(nóng)桿菌將靶基因?qū)氚⒗嬷?，以及制備轉(zhuǎn)基因植物上述1中獲得的基因可導(dǎo)入植物宿主中以制備各種類型的形態(tài)發(fā)生改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因植物，所述各種類型的形態(tài)發(fā)生尤其諸如莖，葉，花，子房，果實(shí)，莢和種子的形態(tài)發(fā)生。(1)制備表達(dá)構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌表達(dá)構(gòu)建體的制備方法是用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钌鲜?中獲得的多胺代謝相關(guān)酶基因，從而包括所有的可讀框，然后視需要連接合適的接頭，以及將所述基因插入植物轉(zhuǎn)化載體中?？捎玫闹参镛D(zhuǎn)化載體的例子包括pBI101和pBI121。將得到的表達(dá)構(gòu)建體在大腸桿菌中擴(kuò)增，然后通過(guò)三重接合(NucleicAcidResearch,12,8711(1984))，凍融，電穿孔等法用根癌農(nóng)桿菌C58，LBA4404，EHA101等轉(zhuǎn)化所述表達(dá)構(gòu)建體。三重接合例如包括在含有抗生素(諸如rifampicillin,卡拉霉素或潮霉素)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)具有含靶基因的表達(dá)構(gòu)建體的大腸桿菌，具有輔助質(zhì)粒(諸如pRK2013)的大腸桿菌，以及農(nóng)桿菌，以獲得轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。(2)制備轉(zhuǎn)基因植物在本發(fā)明中可導(dǎo)入基因的植物部分包括整個(gè)植物，植物器官(諸如葉，莖，根，花器官，無(wú)性點(diǎn)和種子)，植物組織(諸如表皮層，韌皮部，薄壁組織，木質(zhì)部和維管束)，以及植物培養(yǎng)的細(xì)胞。例如，在用(1)中制備的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感染植物后，通過(guò)愈傷組織再生可導(dǎo)入靶基因(PlantCellReports,12,7-11(1992))。即，以無(wú)菌培養(yǎng)的常規(guī)方式，MSO平板(4.6gMurashige-Skoog無(wú)機(jī)鹽，10g蔗糖，lmL/L的1000X維生素儲(chǔ)液，pH6.2)可用阿拉伯芥的種子接種。生根后，根的切片可在CIM平板(MSO平板補(bǔ)充有2，4-二氯酚氧乙酸至終濃度0.5ug/mL以及激動(dòng)素至終濃度0.05ug/mL)上用于培養(yǎng)愈傷組織。培養(yǎng)用含有連接到啟動(dòng)子的靶基因，卡拉霉素和潮霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，稀釋的樣品以等份試樣分裝到試管中，以及將其上形成愈傷組織的根的切片浸泡若干天，在CIM平板上共培育。當(dāng)植株長(zhǎng)到足以肉眼可見(jiàn)時(shí)，將它們?cè)赟IMC平板(MSO平板補(bǔ)充有N6-[2-異戊烯基]腺嘌呤至終濃度5iig/mL，吲哚乙酸(IAA)至終濃度0.15ug/mL，以及凱福隆(claforan)至終濃度500ug/mL)上培養(yǎng)若干天消毒。切片最終培養(yǎng)在SIMCS平板(平板含有卡拉霉素和潮霉素)上，并且每周重復(fù)移植至新鮮平板上。轉(zhuǎn)化的切片繼續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致愈傷組織。沒(méi)有轉(zhuǎn)化的切片會(huì)變成棕色，因?yàn)檫x擇是基于抗生素。轉(zhuǎn)化子約5mm，培養(yǎng)直到形成蓮座葉。當(dāng)完整的蓮座形式明顯時(shí)，用解剖刀切開(kāi)轉(zhuǎn)化子的根，留下愈傷組織，并且移植到RIM平板(MSO平板補(bǔ)充有IAA至終濃度0.5ug/mL)上。當(dāng)大的愈傷組織相連時(shí)，通過(guò)愈傷組織顯示根，即使它們已經(jīng)生根，而維管束不會(huì)經(jīng)常與蓮座叢連接。約8-10天后，它們種植在浸泡有無(wú)機(jī)鹽(5mMKN03，2.5mM磷酸鉀緩沖液(pH5.5)，2mMMgS04，2mMCa(N03)2，50(iMFe-EDTA，IOOOX微量元素(70mMH3B03，14mMMnCl2，0.5mMCuS04，1mMZnS04，0.2mMNaMo04，10mMNaCl，0,01mMCoCl2)1mL/L)的礦毛絕緣纖維上。將已經(jīng)開(kāi)花和形成莢的植株移植到浸泡有無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的土壤中，獲得種子。將種子消毒，并使之在接種MSH(MSO平板補(bǔ)充有潮霉素至終濃度5U/mL)后發(fā)芽，由此得到轉(zhuǎn)化子。通過(guò)在減壓下浸潤(rùn)(ThePlantJournal,19(3),249-257(1999))，植物可感染有(1)中制備的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌以導(dǎo)入靶基因。即，市售盆栽育苗土(諸如Metromix)接種阿拉伯芥的種子，所述種子在22'C、長(zhǎng)白晝(諸如日間16小時(shí)和夜間8小時(shí))的條件下培育。在大約3-4周后，切下延長(zhǎng)的主軸(花柄)以開(kāi)始誘導(dǎo)側(cè)芽。在大約1周的頂部修枝后，將阿拉伯芥浸泡在培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的懸浮液中，并放置在干燥器中，所述干燥器用真空泵抽吸至-0.053MPa(400mmHg)，然后在室溫下放置IO分鐘。將感染的盆轉(zhuǎn)移至深底碟子并在其一側(cè)翹起以讓少量的水滴到碟的底部，將透明蓋放在其上，然后在潮濕條件下放置大約1天。接著栽培被感染的盆，以及在22'C的長(zhǎng)白晝的條件下開(kāi)始培育以收集種子。收集種子大約2-4周，將收集的種子通過(guò)茶過(guò)濾器等過(guò)濾，以去除碎片和外殼，并且干燥和保存在干燥器中。轉(zhuǎn)基因植物的選擇包括以常規(guī)方式使收集的種子消毒，并且懸浮于大約9mL的0.iy。瓊脂水溶液，然后在選擇培養(yǎng)基(諸如1XMS鹽，1XGamborgB5維生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.8%瓊脂，100mg/L羧芐青霉素，50mg/L卡拉霉素，40mg/L潮霉素)上涂鋪懸浮液，于22X:下無(wú)菌培養(yǎng)。對(duì)抗生素具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株會(huì)生長(zhǎng)良好，并且可在大約l-2周內(nèi)得以鑒定。將具有大約4-6片真葉的轉(zhuǎn)基因植株移植至含有市售盆栽育苗土的盆中以在22。C、長(zhǎng)白晝期間開(kāi)始培育。以常規(guī)方式從所得轉(zhuǎn)基因植物中抽提DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈頓NA，以及多胺代謝相關(guān)酶基因可用作Southern雜交中的探針以確定基因是否被導(dǎo)入。以常規(guī)方式從轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物中抽提RNA，以制備帶有多胺代謝相關(guān)酶基因有義序列或反義序列的探針，以及探針可用于Northern雜交中以研究靶基因的表達(dá)。從所得轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)愈傷組織以產(chǎn)生愈傷組織。由減壓浸潤(rùn)獲得轉(zhuǎn)基因植物(Tl)，通過(guò)自授粉產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的子代T2的比例一般會(huì)遵循Mendel定律。例如，當(dāng)多胺代謝相關(guān)酶基因雜合地整合在基因座位上時(shí)，T2子代中轉(zhuǎn)化子的比例為3:1。根據(jù)T2子代培育后通過(guò)自授粉產(chǎn)生的T3子代，當(dāng)轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)在所有子代中時(shí)，T2轉(zhuǎn)基因植物將是純合的，而當(dāng)轉(zhuǎn)化子以3:1的比例分離時(shí)，T2轉(zhuǎn)基因植物對(duì)導(dǎo)入的多胺代謝相關(guān)酶基因而言，將是雜合的。如此選擇的植物對(duì)導(dǎo)入的多胺代謝相關(guān)酶基因是純合的，在種子工業(yè)領(lǐng)域中作為固定了改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的獨(dú)立品系是非常有用的。其基因表達(dá)分析多胺代謝相關(guān)酶基因通過(guò)Southern分析或Northern分析進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物可評(píng)價(jià)多胺含量和各種類型的形態(tài)發(fā)生。在多胺測(cè)定的情況下，例如，將5%過(guò)氯酸水溶液添加到0.05-1g樣品中以抽提多胺。抽提的多胺的測(cè)定包括通過(guò)苯甲酰作用，丹磺酰作用等熒光標(biāo)記，接著利用高效液相色譜(HPLC)通過(guò)UV檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器以內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析。例如，有方法評(píng)價(jià)各種類型的形態(tài)發(fā)生。通過(guò)下列步驟可評(píng)價(jià)莖形成播種在合適的培養(yǎng)基中或?qū)⒂赊D(zhuǎn)基因植物的自授粉獲得的T2或T3種子盆栽在土壤中，在20-25。C、長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗16小時(shí)/8小時(shí))下生長(zhǎng)，并且研究莖的數(shù)目和形狀(例如，主花柄，側(cè)花柄，枝等)。通過(guò)下列步驟可評(píng)價(jià)葉形成播種在合適的培養(yǎng)基中或?qū)⒂赊D(zhuǎn)基因植物的自授粉獲得的T2或T3種子盆栽在土壤中，在20-25°C、長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗16小時(shí)/8小時(shí))下生長(zhǎng)，并且研究葉的數(shù)目和形狀(例如，蓮座葉，真葉等)。通過(guò)下列步驟可評(píng)花葉形成在合適的培養(yǎng)基中發(fā)芽或?qū)⒂赊D(zhuǎn)基因植物的自授粉獲得的T2或T3種子盆栽在土壤中，在20-25'C、長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗16小時(shí)/8小時(shí))下生長(zhǎng)，并且研究花朵的數(shù)目，開(kāi)花時(shí)間，花期，形狀和顏色等。通過(guò)下列步驟可評(píng)價(jià)子房形成在合適的培養(yǎng)基中發(fā)芽或?qū)⒂赊D(zhuǎn)基因植物的自授粉獲得的T2或T3種子盆栽在土壤中，在20-25'C、長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗16小時(shí)/8小時(shí))下生長(zhǎng)，并且研究子房的數(shù)目，形狀，顏色和從坐果到成熟的發(fā)育期(例如，莢和果實(shí)等)。通過(guò)下列步驟可評(píng)價(jià)種子形成在合適的培養(yǎng)基中發(fā)芽或?qū)⒂赊D(zhuǎn)基因植物的自授粉獲得的T2或T3種子盆栽在土壤中，在20-25t:、長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗16小時(shí)/8小時(shí))下生長(zhǎng)，并且研究種子的數(shù)目和形狀以及收獲后的發(fā)芽率等。在本發(fā)明中可被轉(zhuǎn)化的植物的例子包括，但不限于，雙子葉植物，單子葉植物，草本植物，和灌木。例子包括甘薯，西紅柿，黃瓜，南瓜，甜瓜，西瓜，煙草，阿拉伯芥，柿子椒，茄子，蠶豆，芋頭，菠菜，胡蘿卜，草莓，白馬鈴薯，水稻，玉米，苜蓿，小麥，大麥，大豆，油菜籽或改良油菜(canola)，高梁，桉樹(shù)，白楊，洋麻，杜仲(Eucommiaulmoides)，甘蔗或糖用甜菜，藜(Chenopodiumalbum)，百合，蘭花，康乃馨，玫瑰，矮牽?；ǎ{(lán)豬耳(Toreniafournieri)，金魚草(Antirrhinummajus)，仙客來(lái)(Cyclamenpersicum)，霞草(Gypsophilaelegans)，天竺葵(Pelargoniumgraveolens)，向日葵，結(jié)縷草(Zoisiajaponica)，棉花，松鶯菌燕(matsutakemushrooms)，椎茸(shiitakemushrooms)，蘑菇，人參，柑橘類水果，香蕉以及獼,兆(kiwifruit)，木薯(Manihotutilissima)，西谷椰子(MetroxylonsaguRoxb)。優(yōu)選甘薯，白馬鈴薯，西紅柿，黃瓜，水稻，玉米，大豆，小麥，矮牽牛花，藍(lán)豬耳，桉樹(shù)和棉花。根據(jù)本發(fā)明，在植物中改進(jìn)各種類型的形態(tài)發(fā)生是可能的，并且可以預(yù)見(jiàn)植物器官和組織的質(zhì)量，價(jià)值，產(chǎn)率和收率可得以改進(jìn)，或者通過(guò)矮化等抗倒伏可得以改進(jìn)。具體而言，可以預(yù)見(jiàn)，當(dāng)通過(guò)增加莖，葉，花，子房，果實(shí)，莢和種子的數(shù)目產(chǎn)生作為農(nóng)產(chǎn)品的器官時(shí)，質(zhì)量，產(chǎn)率和收率增加是可預(yù)計(jì)的。例如，可以預(yù)計(jì)增加每棵水稻植物的種子數(shù)會(huì)提高可收獲的水稻收率?？梢灶A(yù)計(jì)增加每棵玉米植株的雌穗數(shù)會(huì)提高粒數(shù)?？梢灶A(yù)計(jì)增加每棵大豆植株的莢數(shù)會(huì)提高豆的收率?？梢灶A(yù)計(jì)增加每棵植株的棉鈴數(shù)會(huì)提高棕的收率?？梢灶A(yù)計(jì)增加白馬鈴薯和甘薯的塊莖和塊狀根的數(shù)會(huì)提高土豆的收率。對(duì)果樹(shù)而言，可以預(yù)計(jì)增加坐果(子房)數(shù)以及延長(zhǎng)發(fā)育期會(huì)改進(jìn)產(chǎn)率。對(duì)觀賞植物而言，可以預(yù)計(jì)增加莖，葉尤其是花朵的數(shù)目，以及推遲花期和通過(guò)小型化使視覺(jué)效果更吸引人，會(huì)提高商品價(jià)值。此外，可以預(yù)計(jì)通過(guò)改變植物的形狀和形成，各種環(huán)境適應(yīng)性可得以改進(jìn)，培育的穩(wěn)定性和產(chǎn)率可得以改進(jìn)，以及耕種土地可得以擴(kuò)大。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明以下列實(shí)施例更詳細(xì)加以說(shuō)明，但這些實(shí)施例僅僅是示例性的，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:植物誘導(dǎo)的多胺代謝相關(guān)酶基因的克隆(1)Poly(A)+RNA的制備蛭石用黑子南瓜接種，并在子葉發(fā)育期將植物移植到裝滿了可商購(gòu)的細(xì)土(Sansan土，Takii&Co.,Ltd.)的盆中。把盆栽的黑子南瓜放置在培養(yǎng)箱(空氣溫度日間26°。/夜間22°C，13小時(shí)長(zhǎng)白晝)中用于植物培育。在兩個(gè)葉階段，培養(yǎng)箱溫度降低到日間18'C/夜間14x:以開(kāi)始低溫處理。3天低溫處理后，將植物分成采樣用的根，莖和葉。樣品存儲(chǔ)在-80'C冷凍器中直到RNA提取。使大約4g的黑子南瓜根組織快速冷凍在液氮中，并在液氮存在下用臼和槌細(xì)磨。然后添加10mL的0.2MTris乙酸緩沖液(5M異氰酸胍，0.7%3-巰基乙醇，1%聚乙烯吡咯垸酮(分子量360,000)，0.62%N-月桂酰肌氨酸鈉鹽，pH8.5)抽提，利用Polytron勻漿機(jī)(Kinematica)在冰上冷卻的同時(shí)研磨組織2分鐘。僅用前加入巰基乙醇和聚乙烯吡咯垸酮。然后，研磨的產(chǎn)物以17，000Xg離心20分鐘，并且回收上清液。上清液通過(guò)mira布過(guò)濾，過(guò)濾液輕輕地分層在放置于超離心管的1.5mL的5.7M氯化銫溶液中，內(nèi)容物以155，000Xg離心20小時(shí)，然后丟棄上清液，并且回收RNA沉淀。將沉淀溶解在3mL的10mMTris-HCl，lmMEDTA-2Na，pH8.0(稱作TE緩沖液)，進(jìn)一步加入等當(dāng)量的苯酚:氯仿:異戊醇(體積比為25:24:1)，混合成分然后離心，并回收上水層。向水層中加入1/10倍3M乙酸鈉(用冰醋酸調(diào)節(jié)至pH6.2)和2.5倍乙醇，混合成分，并讓混合物在-2(TC中放置過(guò)夜。接著以17,000Xg離心混合物20分鐘，并用70%乙醇洗滌所得的沉淀，以及減壓下干燥。將干燥的沉淀溶解在500uL的上述TE緩沖液中，得到總RNA溶液。把RNA溶液在65。C下溫育5分鐘，然后在冰上猝滅。向RNA溶液中加入等量的2X結(jié)合緩沖液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，1MNaCl，0.5%SDS，pH7.5)，并將溶液分層在用平衡緩沖液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，0.5MNaCl，0.5%SDS，pH7.5)平衡的oligodT纖維素柱(Clontech)上。接著用大約IO倍的上述平衡緩沖液沖洗柱子，并且用洗脫緩沖液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，pH7.5)洗脫poly(A)+RNA。向所得洗脫液中加入上述的1/10倍3M乙酸鈉水溶液和2.5倍乙醇，混合成分，并且讓混合物放置在-7(TC。然后以10，000Xg離心混合物20分鐘，用70%乙醇洗滌所得的沉淀，并且減壓下干燥。將干燥的沉淀再次溶解在500uLTE緩沖液中，并且在oligodT纖維素柱上反復(fù)純化。從低溫處理的黑子南瓜的根中獲得的poly(A)+RNA用于制備PCR用的cDNA文庫(kù)以及分離全長(zhǎng)基因的cDNA文庫(kù)。(2)PCR用的cDNA文庫(kù)的制備cDNA文庫(kù)的制備方法是利用MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)。從黑子南瓜的根中獲得的poly(A)+RNA用作模板，而逆轉(zhuǎn)錄酶和在3'端用兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸位置修飾的鎖一對(duì)接oligo(dT)引物用于合成雙鏈cDNA，上述方法依據(jù)Gubler,Hoffman等(Gene,25，263-269(1983))。將MarathoncDNA接頭(5，端磷酸化利于用T4DNA連接酶結(jié)合到雙鏈cDNA的兩端)連接到所得cDNA的兩端。所得接頭連接的cDNA用作黑子南瓜根衍生的PCR用cDNA文庫(kù)。(3)PCR引物的設(shè)計(jì)將已分離自植物或哺乳動(dòng)物的精氨酸脫羧酶，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶以及亞精胺合酶基因的堿基序列進(jìn)行比較。極度高保守同源性的區(qū)域被選擇來(lái)合成DNA寡聚體(序列引物I-VI)。SPDS引物I(SEQIDN0.7):5，-GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3'SPDS引物II(SEQIDN0.8):5，-GTGAATCTCAGCGTTGTA陽(yáng)3'SAMDC弓l物III(SEQIDN0.9):5，-TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3'SAMDC弓l物IV(SEQIDNO.10):5，陽(yáng)GCTAAACCCATCTTCAGGGGT-3'ADC弓l物V(SEQIDNO.ll):5，-GGGCT(T/G)GGA(G/A)T(G/C)GACTA(C/T)陽(yáng)3，ADC弓l物VI(SEQIDNO.12):5，陽(yáng)(T/C)CC(A/G)TC(A/G)CTGTC(G/A)CA(G/C)GT-3，(4)PCR擴(kuò)增(2)中獲得的PCR用cDNA文庫(kù)用作模板，而(3)中設(shè)計(jì)的序列引物用于PCR。PCR步驟包括5個(gè)循環(huán)94°C、30秒，45°C、l分鐘，以及72。C、2分鐘，接著30個(gè)循環(huán)94°C、30秒，55°C、1分鐘，以及72'C、2分鐘。(5)瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上電泳，接著對(duì)電泳凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色，并且在UV透射儀上檢測(cè)擴(kuò)增的條帶。(6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證和回收檢測(cè)的擴(kuò)增條帶得到驗(yàn)證，并從瓊脂糖中用剃須刀切出。膠條轉(zhuǎn)移至1.5mL微管，以及利用QIAEXII凝膠抽提試劑盒(QIAGEN)從凝膠中分離和純化出DNA片段。將回收的DNA片段亞克隆到pGEMT克隆載體(Promega)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)，然后以常規(guī)方式用于制備質(zhì)粒DNA。(7)測(cè)序插入到質(zhì)粒中的序列通過(guò)雙脫氧法(Messing,MethodsinEnzymol.:101,20-78(1983))進(jìn)行測(cè)序。三種SPDS基因，一種SAMDC基因以及兩種ADC基因得以分離。(8)同源性的檢測(cè)這些基因的堿基序列對(duì)已知基因堿基序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索揭示出SPDS基因與已知植物衍生的SPDS基因具有70%的同源性，SAMDC基因與已知植物衍生的SAMDC基因具有至少70%的同源性，而ADC基因與已知植物衍生的ADC基因具有至少67%的同源性。(9)獲得全長(zhǎng)基因通過(guò)噬斑雜交獲得全長(zhǎng)基因。利用ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene)制備cDNA文庫(kù)。(1)中獲得的來(lái)自黑子南瓜根的poly(A)+RNA用作模板，以及oligo(dT)引物用于合成雙鏈cDNA，方法根據(jù)Gubler，Hoffman等(Gene,25,263-269(1983))。將EcoRI接頭(具有內(nèi)Xhol和Spel位點(diǎn))連接到所得cDNA用Xhol消化后的兩端，把片段連接到入噬菌體載體(入ZAPII)臂的EcoRI和XhoI位點(diǎn)，然后利用體外包裝試劑盒(GigapackGold,Stratagene)進(jìn)行包裝，感染大腸桿菌SURE株(OD660=0.5)，得到眾多的重組入噬菌體。這些用作黑子南瓜根衍生的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)大小為8.0X106。為了制備探針，從(6)中制備的SPDS，SAMDC和ADC基因的質(zhì)粒DNA中分離和純化插入cDNA，所得cDNA用作模板，以及隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(USB)用于制備32P標(biāo)記的探針。所得32P標(biāo)記的cDNA用作探針。用于構(gòu)建黑子南瓜根衍生的cDNA文庫(kù)的噬菌體用于感染在LB瓊脂培養(yǎng)基上增殖的大腸桿菌，以及大約50,000個(gè)拷貝的噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(HyBond-N，Pharmacia)。其上轉(zhuǎn)移噬菌體DNA的尼龍膜轉(zhuǎn)移至含有堿變性溶液(0.5MNaOH，1.5MNaCl)的濾紙上，讓膜放置4分鐘，然后將它們轉(zhuǎn)移到含有中和溶液(0.5MTris-HCl，1.5MNaCl，pH8.0)的濾紙上，并放置5分鐘。膜用2XSSC(0.3MNaCl，0.03M檸檬酸三鈉)洗滌，然后利用Stratalinker(Stratagene)將DNA固定到膜上。把其上已固定DNA的尼龍膜放置在雜交溶液(50%甲酰胺，0.5%SDS，6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA-2Na,pH7.4)，5XDenhardt氏溶液(0.1%Ficoll，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，0.1%牛血清白蛋白)，50ixg/mL變性鮭魚精子DNA)中，在42。C預(yù)雜交3小時(shí)，加入已制備的cDNA探針，并在42"C下雜交18小時(shí)。然后取出膜，在42'C用含有2XSSC，1XSSC，0.5XSSC和0.1XSSC的溶液洗滌1-2小時(shí)。干燥膜，然后放置在X-線膠巻上，曝光過(guò)夜。因此，可以選擇雜交有獲自SPDS，SAMDS和ADC基因片段的探針的陽(yáng)性克隆。帶有cDNA插入的質(zhì)?？寺⊥ㄟ^(guò)從陽(yáng)性克隆的噬菌體DNA中體內(nèi)切除而制備。體內(nèi)切除之后是ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagen)的方法。將200yL分別含有SPDC，SAMDC和ADC基因的各個(gè)噬菌體溶液，200uL大腸桿菌XL1-Blue懸浮液以及1wL輔助噬菌體R408懸浮液混合，使混合物在37。C下溫育15分鐘，加入3mL的2XYT培養(yǎng)基，在37'C振蕩培養(yǎng)物2小時(shí)，7(TC下處理培養(yǎng)物20分鐘，離心(4,000Xg,IO分鐘)以及回收上清液。將30uL所得上清液和30nL大腸桿菌SURE懸浮液混合，使混合物在37。C下溫育15分鐘，并把數(shù)UL用于接種含有50ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，在37。C下培養(yǎng)過(guò)夜。大腸桿菌形成菌落含有cDNA插入的質(zhì)粒。對(duì)插入序列在質(zhì)粒中的堿基序列通過(guò)雙脫氧法(Messing,MethodsinEnzymol.，101，20-78(1983))進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示質(zhì)粒含有起始密碼子。所得來(lái)自黑子南瓜的全長(zhǎng)亞精胺合酶基因命名為FSPD1(SEQIDNOs.l和2)，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因命名為FSAM24(SEQIDNOs.3禾[34)，而精氨酸脫羧酶基因命名為FADC76(SEQIDNOs.5和6)。所得FSPD1的氨基酸與已知植物衍生的亞精胺合酶基因進(jìn)行比較(表1)。表1結(jié)果顯示來(lái)自黑子南瓜根的FSPD1在氨基酸水平上與其他植物衍生的SPDS基因具有高同源性。表l黑子南瓜FSPD1基因與其他SPDS基因的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>所得FSAM24的氨基酸與已知植物衍生的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因進(jìn)行比較(表2)。表2結(jié)果顯示來(lái)自黑子南瓜根的FSAM24在氨基酸水平上與其他植物衍生的SAMDC基因具有高同源性。表2黑子南瓜FSAM24基因與其他SAMDC基因的比較植物起源氨基酸同源性(％)阿拉伯芥66.3Spinacia秧苗63.3Solanumtuberosum68.2Pisumsativum未分化的愈傷組織65.2所得FADC76的氨基酸與已知植物衍生的精氨酸脫羧酶基因進(jìn)行比較(表3)。表3結(jié)果顯示來(lái)自黑子南瓜根的FADC76在氨基酸水平上與其他植物衍生的ADC基因具有高同源性。表3黑子南瓜FADC76基因與其他ADC基因的比較植物起源氨基酸同源性(％)Lycopersiconesculentum果實(shí)77.1Nicotianasylvestris75.4阿拉伯芥70.7Pisumsativum果實(shí)70.6實(shí)施例2:轉(zhuǎn)基因阿拉伯芥的制備(1)表達(dá)構(gòu)建體的制備FSPD1多胺代謝相關(guān)酶基因示于SEQIDNO.l中，用Xhol切害l]，其切割方式包括堿基序列的整個(gè)閱讀框，并且通過(guò)玻璃奶方法純化片段。然后，用XhoI切割pGEM-7Zf(Promega)，并以有義和反義方向亞克隆FSPD1片段。FSPD1片段再次用Xbal和Kpnl限制性酶在pGEM-7Zf的多克隆位點(diǎn)處切割，并以有義和反義方向亞克隆到已連接有35S啟動(dòng)子的二元載體pBI101-Hm2。所得質(zhì)粒命名為pBI35S-FSPDl。這種表達(dá)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示于圖1中。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pBI35S-FSPDl+/-。多胺代謝相關(guān)酶基因FSAM24示于SEQIDN0.3，用Notl切害ij，其切割方式包括堿基序列的整個(gè)閱讀框，并把末端鈍化。將片段亞克隆到已連接有(鈍化)35S啟動(dòng)子的二元載體pBI101-Hm2。所得質(zhì)粒命名為pBI35S-FSAM24+/-。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pBI35S-FSAM24+/-。多胺代謝相關(guān)酶基因FADC76示于SEQIDN0.5,用Notl切割，其切割方式包括堿基序列的整個(gè)閱讀框，并把末端鈍化。將片段亞克隆到已連接有(鈍化)35S啟動(dòng)子的二元載體pBI101-Hm2。所得質(zhì)粒命名為pBI35S-FADC76+/-。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌雇09/pBI35S-FADC76+/-。(2)質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌將(1)中獲得的大腸桿菌pBI35S-FSPDl+/-，大腸桿菌pBI35S-FSAM24+/-，或大腸桿菌pBI35S-FADC76+/-和含有輔助質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌HB101株在37。C下、含有50mg/L卡拉霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)l夜，而將農(nóng)桿菌C58株在37'C下、含有50mg/L卡拉霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2夜。從1.5mL各個(gè)Eppendorf管的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，然后用LB培養(yǎng)基洗滌。將細(xì)胞懸浮于lmL的LB培養(yǎng)基中，分別把100uL的三種細(xì)胞混合后接種到LB瓊脂培養(yǎng)基中，并在28°C培養(yǎng)以讓質(zhì)粒與農(nóng)桿菌結(jié)合(三重結(jié)合)。l或2天后，用鉑環(huán)刮一部分，并涂抹在含有50mg/L卡拉霉素，20mg/L潮霉素和25mg/L氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。28'C培養(yǎng)2天后，挑選單菌落。所得轉(zhuǎn)化子命名為C58/pBI35S-FSPDl+/陽(yáng)，C58/pBI35S-FSAM24+/-和C58/pBI35S-FADC76+/-。通過(guò)減壓過(guò)濾(下文(3)至(6))或愈傷組織再生(下文(7)至(12))制備轉(zhuǎn)基因阿拉伯芥。(3)培育阿拉伯芥將盆栽的市售育苗土Metromix(HyponexJapan)放置在塑料盆中，表面覆蓋有格篩，通過(guò)格篩間隙接種2-5粒阿拉伯芥(下文稱為"哥倫比亞株"或"野生型")種子(由NaraInstituteofScienceandTechnologyGraduateUniversity的TakayukiKohchi教授饋贈(zèng))。將盆在低溫室中4'C下放置2天發(fā)芽，然后轉(zhuǎn)移培育在22"C的長(zhǎng)晝條件(16小時(shí)長(zhǎng)日間/8小時(shí)夜間)下。大約4-6周后，通過(guò)從頂部修剪植物誘生側(cè)芽，其中主軸花柄延伸至5-10cm。頂部修剪大約l-2周后，用農(nóng)桿菌感染植物。(4)農(nóng)桿菌懸浮液的制備感染前2天，上述(2)中制備的農(nóng)桿菌用于接種10mL含有抗生素(50iig/mL卡拉霉素，20ug/mL潮霉素)的LB培養(yǎng)基，并在28。C下振蕩培養(yǎng)物24小時(shí)。將一部分培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1000mL含有抗生素(50ug/mL卡拉霉素，20ug/mL潮霉素)的LB培養(yǎng)基，并在28。C下另振蕩培養(yǎng)物大約24小時(shí)(至OD6Q()介于1.2-1.5)。室溫下從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，并重懸浮于過(guò)濾用懸浮培養(yǎng)基(0.5XMS鹽，0.5XGamborgB5維生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.44uM芐基氨基嘌呤，0.02%Silwet-77)中至OD6oo介于0.8-1。(5)農(nóng)桿菌感染給上述(3)中制備的阿拉伯芥盆里的盆栽土灑水以防止盆栽土吸收上述(4)中制備的農(nóng)桿菌懸浮液。近200-300mL的農(nóng)桿菌懸浮液放置在1000mL燒杯中，并把盆栽的阿拉伯芥頭朝下讓植物浸泡在懸浮液中。其中已放置盆的燒杯轉(zhuǎn)移到干燥器中，用真空泵抽吸至大約-0.053Mpa(400mmHg)，然后讓植物放置約10分鐘。負(fù)壓逐漸釋放，從農(nóng)桿菌懸浮液中取出植物，過(guò)量的農(nóng)桿菌懸浮液用手巾(Kimtowel)拭去，將盆放置在深底盤的側(cè)面上。引入少量的水，并用莎綸覆蓋物(saranwrap)覆蓋植物。讓植物以這種方式放置大約1天。接著去除莎綸覆蓋物，把盆豎直放置，停止?jié)补嗉s1周。然后，將盆栽的市售育苗土逐漸灑水，從成熟的莢中收集種子大約3-5周。使收集的種子通過(guò)茶濾器過(guò)濾以消除碎片和外殼，并且將種子置于干燥器中充分干燥。(6)獲得轉(zhuǎn)化的植物將上述(5)中獲得的100yL(約2000粒)種子轉(zhuǎn)移到1.5mLEppendorf管中，并浸沒(méi)在70%乙醇中2分鐘，以及浸沒(méi)在5%次氯酸鈉溶液中15分鐘，最終用無(wú)菌水洗滌種子5次消毒。把消毒的種子轉(zhuǎn)移到15mLfalcon管，加入約9mL的0.1%無(wú)菌瓊脂溶液，劇烈混合內(nèi)容物。將0.1%種子的瓊脂混合物如涂鋪噬菌體一樣均勻地涂在選擇培養(yǎng)基(1XMS鹽，1XGamborgB5維生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.8%瓊脂，100mg/L羧芐青霉素，50mg/L卡拉霉素，40mg/L潮霉素，8g/L植物瓊脂(Phytagar)，pH5.7)上。平板在潔凈臺(tái)上干燥約30分鐘，4'C下低溫處理2天，將平板轉(zhuǎn)移到22'C的生長(zhǎng)室中，挑選具有抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子。把長(zhǎng)有約3-5片真葉的植物再次轉(zhuǎn)移到新鮮選擇培養(yǎng)基中，并且培育一直長(zhǎng)成4-6片真葉。具有抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子(Tl)種植在填充有市售育苗土的盆中，并且在潮濕條件下適應(yīng)約5-7天。水土適應(yīng)后，將植物培育在23"C、長(zhǎng)白晝條件下(16小時(shí)長(zhǎng)日間/8小時(shí)夜間)。對(duì)所得轉(zhuǎn)基因植物(Tl)和從獲自轉(zhuǎn)基因植物的種子中生長(zhǎng)出的植物(T2)的導(dǎo)入基因通過(guò)PCR或Southern雜交進(jìn)行分析，并且通過(guò)Northern雜交分析其表達(dá)水平，從而確認(rèn)靶多胺代謝相關(guān)酶基因以一致的方式已被摻入，以及轉(zhuǎn)化子已得以表達(dá)。種子T3也從植物T2中收集，以及進(jìn)行了抗生素抗性測(cè)試(分異分析)，從而根據(jù)轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的比例獲得純合體(T2)。種子T2和從純合體獲得的種子T3(T3純合細(xì)胞系)用于下列測(cè)試。(7)無(wú)菌阿拉伯芥培育將阿拉伯芥Wassilewskija株(下文稱作WS株)的10粒種子(由NaraInstituteofScienceandTechnologyGraduateUniversity的AtsuhikoShinmyo教授饋贈(zèng))引入1.5mL管中，加入lmL的70%乙醇，讓種子放置3分鐘。然后把種子浸在消毒溶液(5%次氯酸鈉，0.02%TritonX-100)中3分鐘，用無(wú)菌水洗滌5次，接著種植在MSO平板(4.6gMurashige-Skoog無(wú)機(jī)鹽，10g蔗糖，lmL/L1000X維生素儲(chǔ)液，pH6.2)中。使平板在4'C放置2天，進(jìn)行低溫處理，然后在植物溫育箱(MLR-350HT，Sanyo)中、22。C的長(zhǎng)晝(16小時(shí)長(zhǎng)日間，8小時(shí)夜間)以及光強(qiáng)度為6000勒克斯的條件下培養(yǎng)21天。為了提高感染效率，植物再次無(wú)菌拔出，將根展開(kāi)在新鮮MSO平板的表面上，另繼續(xù)培養(yǎng)2天。(8)農(nóng)桿菌感染將上述培養(yǎng)21天的WS株的幾個(gè)根排列，用解剖刀切成大約1.5-2.0cm，并把它們彼此并排放置在CIM平板(MSO平板補(bǔ)充有2,4-二氯苯氧基乙酸至終濃度0.5ug/mL以及激動(dòng)素至終濃度0.05"g/mL)上。在光強(qiáng)度為3000勒克斯、16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的條件下已培養(yǎng)2天的樣品，用MS稀釋液(6.4g/LMurashige-Skoog無(wú)機(jī)鹽，pH6,3)稀釋3倍后，以lmL份等分到試管中，將其上長(zhǎng)有愈傷組織的根的切片浸泡在試管中10分鐘。切片放置在雙倍消毒的濾紙上，去除過(guò)量的水份，并將切片排列在新鮮CIM平板上，在同樣條件下共培育2天。(9)消毒將其上株已長(zhǎng)成足以肉眼可見(jiàn)的切片轉(zhuǎn)移到消毒溶液(MS稀釋溶液補(bǔ)充有凱福隆至終濃度200ug/mL)，輕輕振蕩洗滌60分鐘。這些操作重復(fù)5次，用無(wú)菌濾紙去除水份，并將切片放置在SIMC平板(MSO平板補(bǔ)充有2-ip至終濃度5"g/mL，IAA至終濃度0.15ug/mL，以及凱福隆至終濃度500yg/mL)上以光強(qiáng)度為6000勒克斯、16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的條件培養(yǎng)2天。(10)轉(zhuǎn)化子的挑選將上述培養(yǎng)2天的切片轉(zhuǎn)移至SIMCS平板(SIMC平板補(bǔ)充有潮霉素B至終濃度4.6U/mL)，在光強(qiáng)度為6000勒克斯、16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的條件下培養(yǎng)。隨后每周把切片轉(zhuǎn)移至新鮮SIMCS平板。轉(zhuǎn)化的切片繼續(xù)生長(zhǎng)，形成圓頂形狀的愈傷組織，但是沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的切片變成棕色。約2周后，轉(zhuǎn)化子的愈傷組織變成綠色。約1月后，葉子形成，其后形成蓮座葉叢。(11)轉(zhuǎn)化子的再生將具有蓮座葉的植物的根用刀或手術(shù)刀切割，留下愈傷組織，并經(jīng)插入后輕輕漂浮在RIM平板上。8-10天后，用鑷子種植那些其上已形成若干約l-2cm的根的愈傷組織，并培育在浸泡有無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(5mMKN03，2.5mM磷酸鉀緩沖液(pH5.5)，2mMMgS04，2mMCa(N03)2，50uMFe-EDTA，IOOOX微量元素(70mMH3B03，14mMMnCl2，0.5mMCuSO4，lmMZnS04，0.2mMNaMoO4，10mMNaCl，0.01mMCoCl2)lmL/L)的石絨小型盆(NittoBoseki)中。開(kāi)花和形成莢后，將植物移植到通過(guò)以1:1比例混合珍珠巖和蛭石(TES)而制成的土中，然后用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基浸泡。約1月后，獲得各株的幾百粒種子。下文稱這些種子為T2種子。(12)獲得抗生素抗性株將約100粒T2種子以與(7)中相同的方式滅菌，用于接種MSH平板。潮霉素B抗性株以約3:1的比例發(fā)芽。(13)DNA提取和Southern雜交用鑷子將上述發(fā)芽的T2種子移植到浸泡有無(wú)機(jī)鹽的石絨小型盆中，并在光強(qiáng)度為6000勒克斯、22'C及16小時(shí)亮和8小時(shí)暗的條件下培養(yǎng)。2周后，用解剖刀切掉頂層土，以讓石絨的表面用刀劃線，和用液氮立即冷凍樣品。樣品在液氮存在下用臼和槌細(xì)磨，每克加入3mL的DNA提取緩沖液(200mMTris-HCl(pH8.0)，100mMEDTA-2Na，1。/。N-月桂酰肌氨酸鈉，100ug/mL蛋白酶K)，并充分混合成分。在60。C下溫育混合物1小時(shí)，然后離心(10，000Xg，10分鐘)，以及上清液通過(guò)mira布過(guò)濾，并轉(zhuǎn)移至新鮮試管中。用酚:氯仿異戊醇(25:24:1)抽提3次，然后沉淀在乙醇中。沉淀物溶解于TE緩沖液中。從約2.0g的各個(gè)植物中獲得20ug的各個(gè)基因組DNA。用EcoRI和HindIII限制性酶切割1ug的DNA用于1%瓊脂糖電泳和Southern雜交。未轉(zhuǎn)化的WS株的種子發(fā)芽和生長(zhǎng)，DNA以相同方式從植物中提取，并用EcoRI和Hindlll限制性酶消化用于1%瓊脂糖電泳和Southern雜交。FSPD1，F(xiàn)SAM24和FADC76基因片段用作雜交探針。依據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作指南》(MolecularCloning,aLaboratoryManual)(第9章，第31陽(yáng)58頁(yè)(ColdSpringHarbor(1989)))中的方法進(jìn)行Southern雜交。具體而言，DNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，接著堿變性和在尼龍膜(Hybond-N，Amersham)上Southern印跡過(guò)夜。通過(guò)用UV透射儀照射(254nm)3分鐘固定DNA。膜在50°C下、5mL預(yù)雜交緩沖液(5XDenhardt氏，6XSSC，0.1%SDS，10ug/mL鮭魚精子DNA)中預(yù)雜交2小時(shí)。加入探針在5(TC下雜交過(guò)夜。雜交后，膜用含有2XSSC和0.1%SDS的洗滌溶液洗滌兩次共10分鐘，然后用同樣溶液在5(TC下洗滌兩次共30分鐘。干燥膜，并在-8(TC下在裝有X-線膠巻(Kodak)的暗盒中曝光過(guò)夜自顯影拍照。通過(guò)Southern雜交檢測(cè)的信號(hào)模式與未轉(zhuǎn)化的株(1)，含有FSPDl,FSAM24，和FADC76的轉(zhuǎn)化子(2)以及僅含有載體的轉(zhuǎn)化子(3)進(jìn)行比較。除了(1)，(2)和(3)共享的內(nèi)源信號(hào)以外，在(2)的EcoRI消化物和HindlII消化物中觀察到了特定的信號(hào)，證實(shí)靶基因已整入(2)中。實(shí)施例3:Northern印跡分析為了確認(rèn)耙基因是否真正表達(dá)在實(shí)施例2所獲得的T2轉(zhuǎn)化子中，以下列方式進(jìn)行了Northern印跡。從未轉(zhuǎn)化的野生型(WT)和T2轉(zhuǎn)化子(細(xì)胞系TSP-14,15，16，17，19)的蓮座葉中提取總RNA。以實(shí)施例2相同的方式提取RNA。將10"g的所得總RNA在1.5%甲醛瓊脂糖凝膠上電泳，并在HyBondN尼龍膜上印跡過(guò)夜。用UV交聯(lián)劑固定RNA，然后在預(yù)雜交緩沖液(50%甲醛，5XSSPE，5XDenhardt氏，0.1%SDS，80yg/mL鮭魚精子DNA,pH7.0)中42t:下預(yù)雜交2小時(shí)。用32P-dCTP和隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(Amersham)從轉(zhuǎn)化的黑子南瓜SPDS基因片段的cDNA中制備探針。向預(yù)雜交混合物中加入探針，用于在42'C下雜交過(guò)夜。雜交后，膜在55。C下洗滌兩次共30分鐘，開(kāi)始用含有2XSSC和0.1%SDS的洗滌溶液洗滌，結(jié)束用含有0.1XSSC和0.1%SDS的洗滌溶液洗漆。用X-線膠巻(Kodak)對(duì)膜進(jìn)行放射自顯影拍照。Northern印跡的結(jié)果示于圖9中。圖9的結(jié)果顯示在野生型(WT)中未檢測(cè)到內(nèi)源黑子南瓜SPDS基因的表達(dá)，但在所有的T2轉(zhuǎn)化子中黑子南瓜SPDS基因(FSPD1)的表達(dá)水平極高。實(shí)施例4:多胺含量的評(píng)價(jià)(1)篩選含有靶基因的細(xì)胞系通過(guò)PCR(或Southern分析)和Northern分析實(shí)施例3中制備的轉(zhuǎn)化子，在確認(rèn)靶基因已被導(dǎo)入后選擇細(xì)胞系，挑出細(xì)胞系TSP-114，115，116，117，119，131，132，151,152,221和222。針對(duì)導(dǎo)入FSPD1的TSP-114禾卩115，導(dǎo)入FSAM24的TSP-131和132，導(dǎo)入FADC76的TSP151和152以及反義方向?qū)隖SPD1的TSP-221和222，確定多胺含量。(2)多胺含量的分析大約0.1-0.3g來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物(TSP)和同時(shí)培育的野生型植物(WT)的蓮座葉(或真葉)采樣，冷凍和存儲(chǔ)在可被密封的塑料瓶中。向采集的樣本中加入稀釋內(nèi)標(biāo)溶液(1,6-己二胺，內(nèi)標(biāo)含量二7.5nmo1)和5%高氯酸水溶液(每l.Og樣本鮮重為5-10mL)，并利用全能混合器在室溫下充分研磨和抽提。研磨溶液4"C下35,000Xg離心20分鐘，收集上清液，并用作游離多胺溶液。將400uL游離多胺溶液，200"L飽和碳酸鈉水溶液和200uL丹磺酰氯/丙酮溶液(10mg/mL)加入到帶有螺帽的微管中，輕輕混合。在用管塞緊緊封閉和用鋁箔覆蓋后，在60。C水浴中加熱1小時(shí)進(jìn)行丹磺酰化作用。讓試管冷卻后，加入200yL脯氨酸水溶液(100mg/mL)并混合。試管用鋁箔覆蓋后，再次在水浴中加熱30分鐘。放置冷卻后，通過(guò)噴霧氮?dú)馊コ?，然后加?00uL甲苯，劇烈混合。使試管靜置分成2相，將上層300yL甲苯分離到微管中。通過(guò)噴霧氮?dú)馔耆コ妆?。向微管中加?00-200uL甲醇，溶解丹磺?；挠坞x多胺。利用與熒光檢測(cè)儀(激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，而發(fā)射波長(zhǎng)為510nm)的高效液相色譜，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法，對(duì)腐胺，亞精胺和精胺的游離多胺含量進(jìn)行分析。^BondapakC18(由Waters,Co.生產(chǎn)，027324，3.9X300mm，粒度10um)用作HPLC柱。樣本中的多胺含量的計(jì)算方法是從標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本的HPLC圖中推出多胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積。結(jié)果示于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表4顯示其中以有義方向?qū)攵喟反x相關(guān)酶基因的細(xì)胞系TSP-114,115，116，117，119，131，132，151和152比野生型(WT)具有顯著高水平的腐胺，亞精胺和精胺含量，以及總多胺含量同樣也顯著高于野生型(WT)。具體而言，亞精胺和精胺含量明顯增加。此外，其中以反義方向?qū)攵喟反x相關(guān)酶基因的TSP-221和222比野生型(WT)具有顯著低的水平，尤其是亞精胺和精胺含量，以及總多胺含量同樣也顯于野生型(WT)。結(jié)果顯示多胺代謝相關(guān)酶基因以有義或反義方向?qū)胫参镏惺沟枚喟泛刻岣呋蚪档?。結(jié)果顯示多胺代謝相關(guān)酶基因?qū)胫参锸沟枚喟泛客ㄟ^(guò)操縱多胺代謝得以控制。實(shí)施例5:各種形態(tài)發(fā)生的評(píng)價(jià)(1)莖、葉、花和莢的數(shù)目的評(píng)價(jià)將實(shí)施例2中獲得的T3轉(zhuǎn)基因植物(細(xì)胞系TSP-16-1，16-2，其中以有義方向?qū)隖SPD1)和野生型植物(WT:哥倫比亞株)的種子種植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4"低溫下種植和處理約2天后，將盆放置在塑料桶中，并開(kāi)始在23'C下以長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗的長(zhǎng)度16小時(shí)/8小時(shí))培育。種植后將植物生長(zhǎng)15周。生長(zhǎng)后，對(duì)各個(gè)品系的單株植物研究莖(花柄)的數(shù)目。各個(gè)品系研究30株單個(gè)植物。結(jié)果示于圖3中。圖3的結(jié)果表明，與野生型植物相比，每個(gè)T3轉(zhuǎn)基因植物(TSP-16-1，16-2)在莖數(shù)上顯著增加約7-8個(gè)莖。此外，還表明每個(gè)植物的莖數(shù)，葉(莖生葉)數(shù)，花和莢(子房)數(shù)也顯著增加。野生型和TSP-16-1的植物習(xí)性示于圖4中。(2)主莖和側(cè)莖的數(shù)目的評(píng)價(jià)從(1)中的結(jié)果可以證實(shí)，與野生型植物相比T3轉(zhuǎn)基因植物中的莖數(shù)顯著增加。然后，由于阿拉伯芥的莖可分成主莖(主花柄)和側(cè)莖(側(cè)花柄)，因此決定對(duì)主莖和側(cè)莖的數(shù)分別進(jìn)行研究。T3轉(zhuǎn)基因植物(細(xì)胞系TSP-161B，162B，其中以有義方向?qū)隖SPD1)和野生型植物(WT:哥倫比亞株)的種子種植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4。C低溫下種植和處理約2天后，將盆放置在塑料桶中，并開(kāi)始在23'C下以長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗的長(zhǎng)度16小時(shí)/8小時(shí))培育。種植后將植物生長(zhǎng)7周，從第7周(第49天)到第13周(第91天)每周一次對(duì)各個(gè)品系中的每株單個(gè)植物的主莖(主花柄)和側(cè)莖(側(cè)花柄)的數(shù)目分別進(jìn)行研究。各個(gè)品系研究32株單個(gè)植物。結(jié)果示于圖5和6中。圖5的結(jié)果顯示，自第49天開(kāi)始，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物的主花柄數(shù)顯著增加，以及在第70天，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物中每個(gè)植株增加約1個(gè)莖。T3轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物的主花柄的增加程度持續(xù)大致相同直至第91天，而T3轉(zhuǎn)基因植物中最終的主花柄數(shù)高于野生型植物。圖6的結(jié)果顯示，自第49天開(kāi)始，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物的側(cè)花柄數(shù)顯著增加，以及在第70天，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物中每株植物增加約4個(gè)莖。在第91天，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物中每株植物增加大約5-6個(gè)莖，而T3轉(zhuǎn)基因植物中最終的側(cè)花柄數(shù)顯著高于野生型植物。(3)葉、花和莢的數(shù)目的評(píng)價(jià)從(1)的結(jié)果證實(shí)，與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物中的葉、花和莢(子房)的數(shù)目顯著增加。接著對(duì)各種器官的數(shù)目進(jìn)行詳細(xì)研究。T3轉(zhuǎn)基因植物(細(xì)胞系TSP-15-3，16-1，其中以有義方向?qū)隖SPD1)和野生型植物(WT:哥倫比亞株)的種子種植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4'C低溫下種植和處理約2天后，將盆放置在塑料桶中，并開(kāi)始在23t:下以長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗的長(zhǎng)度16小時(shí)/8小時(shí))培育。種植后將植物生長(zhǎng)67天，并在第67天，對(duì)各個(gè)品系中每株單個(gè)(植物)的葉(莖生葉)、帶有白花瓣的花，和莢(莢長(zhǎng)度5mm或以上)的數(shù)目加以研究。各個(gè)品系研究30株單個(gè)植物。結(jié)果示于表5中。表5(<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表5的結(jié)果表明，與野生型植物相比，每株T3轉(zhuǎn)基因植物的真葉、花和莢的數(shù)目顯著增加。在此研究后，讓所有品系的莢成熟和裂口，并且收集成熟的種子。對(duì)每個(gè)莢的種子數(shù)而言，T3轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物之間揭示出非顯著差異，但證實(shí)了在T3轉(zhuǎn)基因植物中每株植物收集的種子的總數(shù)顯著增加，其結(jié)果是每株植物的莢數(shù)增加了約1.6-2.0倍。當(dāng)利用野生型的種子和收集自T3轉(zhuǎn)基因植物的T4種子進(jìn)行發(fā)芽率比較試驗(yàn)時(shí)，T4種子和野生型種子的發(fā)芽率均為95-100%。(4)花期和子房(莢)發(fā)育期的評(píng)價(jià)實(shí)施例2中獲得的T3轉(zhuǎn)基因植物(細(xì)胞系TSP-15-3，16-1，其中以有義方向?qū)隖SPD1)和野生型植物(WT:哥倫比亞株)的種子種植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4。C低溫下種植和處理約2天后，將盆放置在塑料桶中，并開(kāi)始在23。C下以長(zhǎng)白晝條件(日光/黑暗的長(zhǎng)度16小時(shí)/8小時(shí))培育。在所有各種品系的植物中研究初始篩分(bolting)的天數(shù)和開(kāi)花(第一株花)的天數(shù)，并從第一株花開(kāi)花的天數(shù)一直到莢(子房)成熟的天數(shù)(開(kāi)始裂口日)對(duì)植物進(jìn)行研究。各個(gè)品系研究30株單個(gè)植物。開(kāi)花天數(shù)結(jié)果示于圖7中，而莢(子房)發(fā)育期的結(jié)果示于表6。圖7的結(jié)果表明T3轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)花天數(shù)早于野生型。平均而言，T3轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物早大約6-7天。表6(<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表6的結(jié)果表明與野生型植物相比，T3轉(zhuǎn)基因植物的莢(子房)發(fā)育期顯著增加。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǖ脑u(píng)價(jià)(1)轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǖ漠a(chǎn)生利用氯化l丐法(例如，HandbookofNewBiochemistryExperiment3，KagakuDojinpage121-122,1996)將pBI101-35S-FSPDl+禾口pBI101-35S-FSAM24+導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AglO株(Lazo等，BioTechnology9:963-967(1991))中。將如此獲得的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌分別傳播到衍生自矮牽?；?種間雜交矮牽?；?品種SafiniaPurpleMini(SuntoryFlowersCo.,Ltd.)的葉盤上，通過(guò)挑選對(duì)潮霉素顯示抗性的植物細(xì)胞以及再分化獲得轉(zhuǎn)基因矮牽?；?。采用眾所周知的方法(Horsch等，Science227:1229-1231(1985))對(duì)矮牽?；ㄟM(jìn)行轉(zhuǎn)化。以pBI101-35S-FSPDl+和pBI101-35S-FSAM24+轉(zhuǎn)化的各種不同的矮牽?；ㄟM(jìn)行試驗(yàn)PT144和試驗(yàn)PT146。在PT144中獲得23株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植物，而在PT146中獲得43株植物。(2)導(dǎo)入基因表達(dá)的分析分別利用DNeasy植物小型試劑盒和RNeasy植物小型試劑盒(QiagenCo.,Ltd.,Tokyo)制備來(lái)自這些植物的染色體DNA和RNA。PT144和PT146矮牽?；òl(fā)現(xiàn)是基于采用染色體DNA作為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)分別保留SPDS(FSPD1)和SAMDC(FSAM24)基因的轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)PT144而言，PCR反應(yīng)利用引物FSPD1F(5，-TAGTAGAGGGATTATTATGTCTGCGGA-3，)和FSPD1R(5，-ATGACGCTGATCACAATATAAAGCGAC-3，)進(jìn)行，而對(duì)PT146而言，利用引物FSAM24F(5'-TGAAGGCTATGAAAAGAGGCTTGAAGTA-3，)和FSAM24R(5'-TCATGAGGATTGACCTTGGGATGACG-3')進(jìn)行。95。C維持1分鐘后，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95'C、l分鐘，52°C、2分鐘，72°C、3分鐘，然后72'C另維持1分鐘。此外，利用從這些轉(zhuǎn)基因矮牽牛花葉中提取的總RNA，基于RT-PCR分析各種不同個(gè)體的基因表達(dá)，其中利用TR-PCR的superscript快速鏈合成系統(tǒng)(InvitrogenCo.:Ltd.,Tokyo)和oligo(dT)12-18引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以及其中利用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板通過(guò)同樣的引物和涉及染色體DNA的循環(huán)進(jìn)行PCR。在PT144植物中證實(shí)有9個(gè)個(gè)體表達(dá)外源基因(SPDS)，而在PT146植物中證實(shí)有27個(gè)個(gè)體表達(dá)外源基因(SAMDC)。(3)多胺含量的評(píng)價(jià)在表達(dá)最多的轉(zhuǎn)基因植物的個(gè)體(細(xì)胞系)中分析游離多胺含量。將大約0.3-0.6g來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物(PT144,PT146)和同時(shí)培育的野生型植物(原始株P(guān)T144-C，PT146-C)的葉采樣，冷凍和存儲(chǔ)。向采集的樣本中加入稀釋內(nèi)標(biāo)溶液(1，6-己二胺，內(nèi)標(biāo)含量二7.5nmo1)和5%高氯酸水溶液(每l.Og樣本鮮重為5-10mL)，并利用全能混合器室溫下充分研磨和抽提。研磨溶液4'C下以35，000Xg離心20分鐘，收集上清液，并用作游離多胺溶液。將400uL游離多胺溶液，200uL飽和碳酸鈉水溶液和200uL丹磺酰氯/丙酮溶液(10mg/mL)加入到帶有螺帽的微管中，輕輕混合。在用管塞緊緊封閉和用鋁箔覆蓋后，在60。C水浴中加熱1小時(shí)進(jìn)行丹磺?；饔?。讓試管冷卻后，加入200"L脯氨酸水溶液(100mg/mL)并混合。試管用鋁箔覆蓋后，再次在水浴中加熱30分鐘。放置冷卻后，通過(guò)噴霧氮?dú)馊コ?，然后加?00PL甲苯，劇烈混合。使試管靜置分成2相，將上層甲苯分離到300UL微管中。通過(guò)噴霧氮?dú)馔耆コ妆健Ｏ蛭⒐苤屑尤?00-200uL甲醇，溶解丹磺?；挠坞x多胺。利用與熒光檢測(cè)儀相連的高效液相色譜，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)腐胺，亞精胺和精胺的游離多胺含量進(jìn)行分析。uBondapakC18(由Waters,Co.生產(chǎn)，027324，3.9X300mm，粒度10um)用作HPLC柱。樣本中的多胺含量的計(jì)算方法是從標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本的HPLC圖中推出多胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積。結(jié)果示于表7中。野生型植物(144-C，146-C)中游離腐胺含量的平均值為29.46nmol/gFW(FW:鮮重)，而轉(zhuǎn)基因植物(144，146)中的平均值為38.67nmol/gFW。野生型植物中游離亞精胺含量的平均值為37.03nmol/gFW(FW:鮮重)，而轉(zhuǎn)基因植物中的平均值為50.40nmol/gFW。游離腐胺和游離亞精胺的量均增加。采用5%顯著性水平對(duì)野生型植物和轉(zhuǎn)基因植物之間的t-檢驗(yàn)分析的結(jié)果揭示出在游離亞精胺方面的差異，以及表明尤其是亞精胺的量在轉(zhuǎn)基因植物中增加。進(jìn)一步證實(shí)與野生型植物(146-C)相比，PT146轉(zhuǎn)基因植物中的游離精胺含量顯著增加。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>146-547.4232.66146-1036.7629.12146-1129.9966.14146-1239.4232146-1530.2631.89146-1655.4833.79146-1864.2551.85146-1949.8750.96146-2052.5550.23146-2152.5568.67146-2545.1544.6146-2724.0261.25146-3427.0162.67146-3737.6940.55146-3938.943.16146-4160.0277.8(4)轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǖ男螒B(tài)修飾的評(píng)價(jià)將矮牽?；ㄅ囵B(yǎng)在空氣溫度為約25'C和用人工光補(bǔ)充自然光使周期為16小時(shí)亮、8小時(shí)暗的密封系統(tǒng)溫室中。隨時(shí)間測(cè)量每株單個(gè)植物的花朵數(shù)從表達(dá)外源基因的各株植物修剪后立即到第60天之間的變化。結(jié)果示于表8，圖8和9中。表8，圖8和9中的結(jié)果清楚地揭示出與原始母株(野生型植物)相比，轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǖ闹l和花朵數(shù)增加。在測(cè)量期間，原始母株SafiniaPurpleMini的花朵數(shù)不超過(guò)10朵，但在PT144植物中有6株(67%)和在PT146植物中有18株(67%)的花朵數(shù)超過(guò)10朵。此外，在許多原始母株的植物中，每個(gè)枝條的花朵數(shù)為0-3，而幾乎沒(méi)有觀察到任何枝條上的花超過(guò)5朵。然而，高百分比的轉(zhuǎn)基因植物的枝條上具有5朵以上的花，包括PT144植物中的3株(33%)和PT146植物中的5株(19%)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了矮牽?；ㄖ卸喟妨吭黾优c花朵數(shù)和枝條數(shù)增加之間的相關(guān)性，并且業(yè)已證實(shí)導(dǎo)入的基因增加了多胺的量以及帶來(lái)了花朵數(shù)和枝條數(shù)的增加。為了研究在此觀察的花朵數(shù)的增加是否由延長(zhǎng)單個(gè)花朵的花期引起，或是否由同時(shí)開(kāi)花的花芽數(shù)的增加引起，花期長(zhǎng)度在每個(gè)枝條上具有最多花朵的單個(gè)植株(PT144中有5個(gè)植株，PT146中有9個(gè)植株)中進(jìn)行研究，其中從開(kāi)花后立即一直到花瓣凋謝的期間稱為花期；測(cè)量每株單個(gè)植物的5朵花；以及比較平均值。原始母株的花期的平均值為8.34天，而轉(zhuǎn)基因植物的花期的平均值為9.35天，因此花期在轉(zhuǎn)基因植物中趨于增加了。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>teaattccaaaccccaaaaaggttetcgttateggtggaggagacggc448SerlieProAsnProLysLysValLeuVallieGlyGlyGlyAspGly110115120ggtgttttgcgagaggtggetcgccatteatctgttgagcagatagat496GlyValLeuArgGluValAlaArgHisSerSerValGluGinlieAsp125130135140atetgtgaaategacaagatggtagttgatgtttecaaagaatttttc544lieCysGlulieAspLysMetValValAspValSerLysGluPhePhe145150155cctcgcgtagetgtcgggtttgaggatcctcgtgtcactcttcatatt592ProArgValAlaValGlyPheGluAspProArgValThrLeuHislie160165170ggtgatggcgtcgcatttctgaaggetgttcctgaaggcacttatgat640GlyAspGlyValAlaPheLeuLysAlaValProGluGlyThrTyrAsp175180185gcagtgatagtggattcttctgatcctattggtcctgcacaagagetc688AlaVallieValAspSerSerA印ProlieGlyProAlaGinGluLeu190195200tttgagaagcctttttttgetteagttgccaaagetcttcgaccagga736PheGluLysProPhePheAlaSerValAlaLysAlaLeuArgProGly205210215220ggcgttgtgtgtactcaagcagagageatttggcttcacatgcatate784GlyValValCysThrGinAlaGluSerlieTrpLeuHisMetHislie225230235attgaagacattgtaacaaactgccgccaaatattcaaaggctctgtc832lieGluA印lieValThrAsnCysArgGinliePheLysGlySerVal240245250aactatgcatggactacagttcctacatatccaageggagtgattggg880AsnTyrAlaTrpThrThrValProThrTyrProSerGlyVallieGly255260265tttatgetctgcteaactgaggggcctcctcttgatttcaagcatcca928PheMetLeuCysSerThrGluGlyProProLeuAspPheLysHisPro270275280gtcaacccagtagaggtgaacggtategacaccgtgaagagtccgetc976ValAsnProValGluValAsnGlylieAspThrValLysSerProLeu285290295300aagttttacaacteggagattcatacagcagetttctgtttgccttct1024LysPheTyrAsnSerGlulieHisThrAlaAlaPheCysLeuProSer305310315tttgcgaagaagateategatteaaaagcaaaatgaaaaggtttcc1070PheAlaLysLyslielieAspSerLysAlaLys320325cccacagcgttgaagaagcagaaattggcggtcttggagtgtgccaatgtaataagtgga1130ggcttaaattagagtcgaaatggtcgctttatattgtgatcagegtcataaagtttcttg1190agatgttatgagtagtagaaatagcttttgttttcctccccaaaattttccccgtccttt1250ttcattgaaaagtgacatctggtgttctagcttctataaataaatatgetaaataaatat1310atttagecaaaaaaaaaa1328〈210>2<211>327〈212〉PRT〈213>Cucurbitaficifolia<400>2MetSerAlaGluHislieValGlySerAlaAlaAspAlaAlaAlaLys151015LysProGlulieGluAsnGlyValSerAlaSerGinProAspSerlie202530SerSerVallieProGlyTrpPheSerGlulieSerProMetTrpPro354045GlyGluAlaHisSerLeuLysValGluLysValLeuPheGinGlyLys505560SerAspTyrGinAsnValLeuValPheGinSerSerThrTyrGlyLys65707580ValLeuValLeuA印GlyVallieGinLeuThrGluArgAspGluCys859095AlaTyrGinGluMetlieThrHisLeuProLeuCysSerlieProAsn100105110ProLysLysValLeuVallieGlyGlyGlyAspGlyGlyValLeuArg115120125GluValAlaArgHisSerSerValGluGinlieAsplieCysGlulie130135140AspLysMetValValAspValSerLysGluPhePheProArgValAla145150155160<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>cgtaaaccatcctgagttctgctgaattccgtttttcctgcgcaccgagatccttagttt360tctataatttttactgtgtcttttttctttagtactctactttcctcgttctctcgttca420atctctcaacattagtaacttccttttaagaa犯gatgacgtttcctacctct473MetThrPheProThrSer15gcaateggatttgaaggctatgaaaagaggcttgaagtateattcttt521AlaHeGlyPheGluGlyTyrGluLysArgLeuGluValSerPhePhe101520gagcccggcatttttgetgacccaaggggcatgggccttcgtgetttg569GluProGlyliePheAlaAspProArgGlyMetGlyLeuArgAlaLeu253035tecaaggcacaaetagatgaaattctgacattagccgagtgcaccatt617SerLysAlaGinLeuAspGlulieLeuThrLeuAlaGluCysThrlie404550gttgattctttgtecaatgactatcttgatteatatgtccttteggag665ValAspSerLeuSerAsnAspTyrLeuAspSerTyrValLeuSerGlu55606570tegageetctttgtctacccatacaagttcateateaaaacttgcggc713SerSerLeuPheValTyrProTyrLysPhelielieLysThrCysGly758085actactaagctgcttctgtctattccagetctgataaagttggetgat761ThrThrLysLeuLeuLeuSerlieProAlaLeulieLysLeuAlaAsp9095100tctetateccttaatgtgaaatctgtgaggtacactcgtggaagettt809SerLeuSerLeuAsnValLysSerValArgTyrThrArgGlySerPhe105110115atetttcctggtgcccagtcttttccccatcgcagettctctgaggaa857liePheProGlyAlaGinSerPheProHisArgSerPheSerGluGlu120125130gttgetgttcttgatggctacttggccaagcttggcetccatggctct905ValAlaValLeuAspGlyTyrLeuAlaLysLeuGlyLeuHisGlySer135140145150gettatgtgatgggaagtcctgatgagacaagga犯tggcacgtttac953AlaTyrValMetGlySerProAspGluThrArgLysTrpHisValTyr155160165tctgcctgtgccaaaatgggtagecgaagetacaatcccgtctatact1001SerAlaCysAlaLysMetGlySerArgSerTyrAsnProValTyrThr170175180ctggagatgtgcatgactggcttagacaaggagaaggcgtctgtcttc1049LeuGluMetCysMetThrGlyLeuAspLysGluLysAlaSerValPhe185190195ttcaaaacagacacaagttctgetgetgcaatgactgaaaactecggt1097PheLysThrAspThrSerSerAlaAlaAlaMetThrGluAsnSerGly200205210ateaggaagatecttccgaaatctgatatatgcgactttgagtttgac1145lieArgLyslieLeuProLysSerAsplieCysAspPheGluPheAsp215220225230ccatgtgggtattecatgaatgetattgaaggagatgcggagtctacc1193ProCysGlyTyrSerMetAsnAlalieGluGlyAspAlaGluSerThr235240245atecatgtcactccagaagaagggtttagetatgcaagetttgaagca1241lieHisValThrProGluGluGlyPheSerTyrAlaSerPheGluAla250255260getggttatgaaUggacgacctggacctgtgtaaggtgattgggagg1289AlaGlyTyrGluLeuAspAspLeuAspLeuCysLysVallieGlyArg265270275gtgctggcatgcttccagccatctgatttctctgttgccetccactea1337ValLeuAlaCysPheGinProSerAspPheSerValAlaLeuHisSer280285290gatgtggtcggtgaggatctgaaagatttactgtgcctggacctgaag1385AspValValGlyGluAspLeuLysAspLeuLeuCysLeuAspLeuLys295300305310gggtacgagggtggagagaagagetgtgaaatgcttggggaaaatgga1433GlyTyrGluGlyGlyGluLysSerCysGluMetLeuGlyGluAsnGly315320325tecgtcatetatcagagetttaagaatagaggagattatgcgteatct1481SerVallieTyrGinSerPheLysAsnArgGlyAspTyrAlaSerSer330335340cca鄉(xiāng)teaateetcatgaaatgctgttggagagaggacgaggcggac1529ProArgSerlieLeuMetLysCysCysTrpArgGluAspGluAlaAsp345350355gaggaagttgagaagtagtagtagttacttactttcaacttttgctgc1577GluGluValGluLys36056gttttatcttttaatactatagtatcttcggggtcgttctgttctgtgctgttctgttct1637ttcattatgtccttttgtgttgtttcctttgcgaataataattcccaggtggggatggta1697ggctgtcgtgtcctgtcctggagagtcta/tcgtctgatgttattatgatcatcaaactat1757ataatgataatatcgtatttccttatttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1814〈210〉4<211>363<212>PRT<213〉Cucurbitsficifolia<400>4MetThrPheProThrSerAlalieGlyPheGluGlyTyrGluLysArg151015LeuGluValSerPhePheGluProGlyliePheAlaAspProArgGly202530MetGlyLeuArgAlaLeuSerLysAlaGinLeuAspGlulieLeuThr354045LeuAlaGluCysThrlieValAspSerLeuSerAsnAspTyrLeuAsp505560SerTyrValLeuSerGluSerSerLeuPheValTyrProTyrLysPhe65707580lielieLysThrCysGlyThrThrLysLeuLeuLeuSerlieProAla859095LeulieLysLeuAlaAspSerLeuSerLeuAsnValLysSerValArg100105110TyrThrArgGlySerPheliePheProGlyAlaGinSerPheProHis115120125ArgSerPheSerGluGluValAlaValLeuAspGlyTyrLeuAlaLys130135140LeuGlyLeuHisGlySerAlaTyrValMetGlySerProA印GluThr145150155160ArgLysTrpHisValTyrSerAlaCysAlaLysMetGlySerArgSer165170175TyrAsnProValTyrThrLeuGluMetCysMetThrGlyLeuAspLys180185190<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>cggtgggatattgg卿tgtataggggagcgcggtggatttgacggtggaaatagctact360ttttttgcttcttttgagggggtagccggggcctcggcctcggcgggttttaaagccccc420acttggacgaactctggatttaccattcctttctcttaacaatttctctaactaatcttt480tcgttttttaaattttccgtctccattttcttattcttttcttgatccgtcgtcggagag540atgMet1ccgProgccAlaetaLeugetAla5tatTyrtgcCysgtgValg犯GlugetAla10getAlagcagetAlaAlacctcctcctProProPro15588ggcGlytgcCysgetAlatttPhe20getAlagggGlygatAsp3gcSertctSer25cttLeuccgProtegccgSerProgtcttatttValLeuPhe30636tecSerggcGlyGly35cctProccgProGluactThraccThr40ateliettcPhe3CCThrtctcccSerPro45getgetgetAlaAlaAla684cccProattlie50tctSerg肌Glu肪tAsncccProtctSer55tggTrptctSercctProtctSerctgtctLeuSer60tecteccttSerSerLeu732tacTyr6533gLysataliegatAspGlytggTrp70ggtGlygccAlacctProtatTyrttcPhe75tctgtcSerVal犯tggctctAsnGlySer80780gggGly83tAsn3tgMetgccAlagttVal85eggArgcctProtacTyrggtGlyacaThr90gccAlaaccttgThrLeuccccatcagProHisGin95828gagGluattlieg3tAspetcLeu100ttgLeuLysattliegtgVal犯gLys105a恥LysgetAlateagatSerAspccgattageProlieSer110876tctSerggtGlygggGly115cttLeuggcGlyttgLeuC8gGincttLeu120cctProcttLeuattliegtgcgcValArg125cttcctgatLeuProAsp924gtgValcttLeu130犯gLys肌cAsncgtArgttgLeuGlu135tctSeretcLeuc肪GintegSergcatttAlaPhe140gattgtgetAspCysAla972attlie145c犯GintctSerC8gGinggaGlytatTyr150gggGlytctSercatHistacTyrc恥Gin155ggcgttGlyValtatccggtcTyrProVal1601020aaatgcaaccaggacaggttcgttgttgaagacategtgaaattcggt1068LysCysAsnGinAspArgPheValValGluAsplieValLysPheGly165170175tctcctttccgtttcggtetcgaggetggategaaaccggagetcetc1116SerProPheArgPheGlyLeuGluAlaGlySerLysProGluLeuLeu180185190ctggcaatgagetgtttgtgcaaagggaatagagatgcccttttggtg1164LeuAlaMetSerCysLeuCysLysGlyAsnArgAspAlaLeuLeuVal195200205tgtaatggtttcaaggatgcggagtacatttctctggetcttattget1212CysAsnGlyPheLysAspAlaGluTyrlieSerLeuAlaLeulieAla210215220aggaagetcgetttgaacactgtgattgtgcttgaacaagaggaagag1260ArgLysLeuAlaLeuAsnThrVallieValLeuGluGinGluGluGlu225230235240cttgatttggttategatttgagtaaaacgetcttcgttcgccctgtg1308LeuAspLeuVallieAspLeuSerLysThrLeuPheValArgProVal245250255ateggcatgcgtgcgaagetaagaaccaagcattctggtcattttggg1356lieGlyMetArgAlaLysLeuArgThrLysHisSerGlyHisPheGly260265270tctacateaggcgagaaagggaaatttggtcttacgaccacacaaatt1404SerThrSerGlyGluLysGlyLysPheGlyLeuThrThrThrGinlie275280285cttcgtgtggttaggaagcttaaacaggetgatatgcttgattgtctt1452LeuArgValValArgLysLeuLysGinAlaAspMetLeuAspCysLeu290295300caattgetccattttcatattggtteccagateccctecaccgtgtta1500GinLeuLeuHisPheHislieGlySerGinlieProSerThrValLeu305310315320etcaccgatggcattagegaggetgetcaaatetattgtgaattggtt1548LeuThrAspGlylieSerGluAlaAlaGinlieTyrCysGluLeuVal325330335cgtetcggtgccaacatgetagttattgacattggaggtggtcttggt15%ArgLeuGlyAlaAsnMetLeuVallieAsplieGlyGlyGlyLeuGly340345350ategactatgacgggtegaagteaggggattctgagttatctgttget1644lieAspTyrAspGlySerLysSerGlyAspSerGluLeuSerValAla355360365tatgaaetcggagagtatgcctctacggttgttgatgcagtccgctgt1692TyrGluLeuGlyGluTyrAlaSerThrValValAspAlaValArgCys370375380gtatgcgaccgtagggccgttaagcacccgataatttgcagtgaaagt1740ValCysAspArgArgAlaValLysHisProlielieCysSerGluSer385390395400ggccgagcaategtctctcatcactctgttctgatatttgaggetgtt1788GlyArgAlalieValSerHisHisSerValLeuliePheGluAlaVal405410415tctgetagttcttatgaggtcccatecatgagetegattgaacgtcag1836SerAlaSerSerTyrGluValProSerMetSerSerlieGluArgGin420425430tatcttgtcgatggaetaaccgacgatgetcgtattgattatcagaac1884TyrLeuValAspGlyLeuThrAspAspAlaArglieAspTyrGinAsn435440445cttttgactgcagettatatgggtgagtacaaggcgtgcttgetatat1932LeuLeuThrAlaAlaTyrMetGlyGluTyrLysAlaCysLeuLeuTyr450455460gcagatcaattgaagcaatgctgtgttgagaaattcaaggatgggtgt1980AlaAspGinLeuLysGinCysCysValGluLysPheLysAspGlyCys465470475480ttgggaatggaagaaetagetgcggtagatgggctttgtgcccttgtt2028LeuGlyMetGluGluLeuAlaAlaValAspGlyLeuCysAlaLeuVal485490495teaaaggcaattggagagttggatgetgta柳acttaccatgtgaac2076SerLysAlalieGlyGluLeuAspAlaValArgThrTyrHisValAsn500505510etctecattttcacctctateccagatttctggggtattgaccagctg2124LeuSerliePheThrSerlieProAspPheTrpGlylieAspGinLeu515520525tttccaattgtccctattcatcgtetcgatc犯agaccgteagtgagg2172PheProlieValProlieHisArgLeuAspGinArgProSerValArg530535540ggcattetatecgatetaacctgtgacagtgacggtaagategatagg2220GlylieLeuSerAspLeuThrCysAspSerAspGlyLyslieAspArg545550555560tttateaatggcgagtegagettgccgttgcatgagetcaaaggcaac2268PhelieAsnGlyGluSerSerLeuProLeuHisGluLeuLysGlyAsn565570575ageagtttateaggtggaggtgggcgatactatcttgggatgttteta2316SerSerLeuSerGlyGlyGlyGlyArgTyrTyrLeuGlyMetPheLeu580585590ggtggggettatgaggaggetetcggtggtgttcacaacctgtttggg2胸GlyGlyAlaTyrGluGluAlaLeuGlyGlyValHisAsnLeuPheGly595600605a_gcccgagegtg3ttegggtaatgc兆agegatggaccgcatagettt2412SerProSerVallieArgValMetGinSerAspGlyProHisSerPhe610615620gcggtgactcgcactgtgcctgggccateatgtgcggatateetccga2460AlaValThrArgThrValProGlyProSerCysAlaAsplieLeuArg625630635640gtgatgcagtacgagcccgagetcatgtttgagaccetcaagcatcga2508ValMetGinTyrGluProGluLeuMetPheGluThrLeuLysHisArg645650655getgaggagUtgggcaggaggaggaggatgatgttggaggcattgcc2556AlaGluGluPheGlyGinGluGluGluAspAspValGlyGlylieAla660665670aatagettggccatgtecttccgcaacatgccttatttggetagegca2604AsnSerLeuAlaMetSerPheArgAsnMetProTyrLeuAlaSerAla675680685tcttectgcgccaatggtgetggcgatgccgagcagtggacttactgc2652SerSerCysAlaAsnGlyAlaGlyAspAlaGluGinTrpThrTyrCys690695700tatgettgatgaataatgtttgaaggtttagtcgttagccacatcccta2701TyrAla705aataagctattggtctgttttcgttgtcgtggtcgtcgtcgtcgtaggtccgtcaacctt2761tttttttttcttctttggcttgttgcaaagggttatgagagcacagcaacageagecaag2821ctcctcttcctttggctttatttttgtttagataggagaggggattagtagaacaccgaa2881tccacccttttgttaattcgggatcttgatctctcttggttatatcatggtgtacaactt2941ttaagaageegtcaatggctgtttttcttttagatctcaactttggatggctcaacccca3001cttcgaatt3ta^犯3aaaaa3a^a犯8犯3犯犯a3037<210〉6〈211〉706〈212〉PRT<213>Cucurbitaficifolia<400〉6MetProAlaLeuAlaTyrCysValGluAlaAlaAlaAlaProProPro151015GlyCysAlaPheAlaGlyAspSerSerLeuProSerProValLeuPhe202530SerGlyGlyProProGluThrThrliePheThrSerProAlaAlaAla354045ProlieSerGluAsnProSerTrpSerProSerLeuSerSerSerLeu505560TyrLyslieAspGlyTrpGlyAlaProTyrPheSerValAsnGlySer65707580GlyAsnMetAlaValArgProTyrGlyThrAlaThrLeuProHisGin859095GlulieAspLeuLeuLyslieValLysLysAlaSerAspProlieSer100105110SerGlyGlyLeuGlyLeuGinLeuProLeulieValArgLeuProAsp115120125ValLeuLysAsnArgLeuGluSerLeuGinSerAlaPheAspCysAla130135140lieGinSerGinGlyTyrGlySerHisTyrGinGlyValTyrProVal145150155160LysCysAsnGinAspArgPheValValGluAsplieValLysPheGly165170175SerProPheArgPheGlyLeuGluAlaGlySerLysProGluLeuLeu180185190LeuAlaMetSerCysLeuCysLysGlyAsnArgAspAlaLeuLeuVal195200205CysAsnGlyPheLysAspAlaGluTyrlieSerLeuAlaLeulieAla210215220ArgLysLeuAlaUuAsnThrVallieValLeuGluGinGluGluGlu225230235240LeuAspLeuVallieAspLeuSerLysThrLeuPheValArgProVal245250255lieGlyMetArgAlaLysLeuArgThrLysHisSerGlyHisPheGly260265270SerThrSerGlyGluLysGlyLysPheGlyLeuThrThrThrGinlie275280285LeuArgValValArgLysLeuLysGinAlaAspMetLeuAspCysLeu290295300GinLeuLeuHisPheHislieGlySerGinlieProSerThrValLeu305310315320LeuThrAspGlylieSerGluAlaAlaGinlieTyrCysGluLeuVal325330335ArgLeuGlyAlaAsnMetLeuVallieAsplieGlyGlyGlyLeuGly340345350lieAspTyrAspGlySerLysSerGlyAspSerGluLeuSerValAla355360365TyrGluLeuGlyGluTyrAlaSerThrValValAspAlaValArgCys370375380ValCysAspArgArgAlaValLysHisProlielieCysSerGluSer385390395400GlyArgAlalieValSerHisHisSerValLeuliePheGluAlaVal405410415SerAlaSerSerTyrGluValProSerMetSerSerlieGluArgGin420425430TyrLeuValAspGlyLeuThrAspAspAlaArglieAspTyrGinAsn435440445LeuLeuThrAlaAlaTyrMetGlyGluTyrLysAlaCysLeuLeuTyr450455460AlaAspGinLeuLysGinCysCysValGluLysPheLysAspGlyCys465470475480LeuGlyMetGluGluLeuAlaAlaValAspGlyLeuCysAlaLeuVal485490495SerLysAlalieGlyGluLeuAspAlaValArgThrTyrHisValAsn500505510LeuSerliePheThrSerlieProAspPheTrpGlylieAspGinLeu515520525PheProlieValProlieHisArgLeuAspGinArgProSerValArg530535540GlylieLeuSerAspLeuThrCysAspSerAspGlyLyslieAspArg545550555560PhelieAsnGlyGluSerSerLeuProLeuHisGluLeuLysGlyAsn565570575SerSerLeuSerGlyGlyGlyGlyArgTyrTyrLeuGlyMetPheLeu580585590GlyGlyAlaTyrGluGluAlaLeuGlyGlyValHisAsnLeuPheGly595600605SerProSerVallieArgValMetGinSerAspGlyProHisSerPhe610615620AlaValThrArgThrValProGlyProSerCysAlaAsplieLeuArg625630635640ValMetGinTyrGluProGluLeuMetPheGluThrLeuLysHisArg645650655AlaGluGluPheGlyGinGluGluGluAspAspValGlyGlylieAla660665670AsnSerLeuAlaMetSerPheArgAsnMetProTyrLeuAlaSerAla675680685SerSerCysAlaAsnGlyAlaGlyAspAlaGluGinTrpThrTyrCys690695700TyrAla705<210>7<211>20<212〉腿〈213〉人工序列<220〉<223>人工序列描述引物<400>7gttttggatggagtgattca〈210〉8<211〉18<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列描述引物〈400〉8gtgaatctcagcgttgta<210>9〈211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>人工序列描述引物<400>9tatgtgctgtctgagtcgagc〈210>10〈211〉21〈212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列描述引物<400〉10gctaaacccatcttcaggggt21〈210>11<211〉18<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列描述引物〈400〉11gggctkggaxtsgactay18<210>12<211>18〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列描述引物<400>12yccrtcrctgtcrcasgt18權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)植物的方法，所述植物穩(wěn)定地保持在一種或多種能夠在植物內(nèi)起作用的啟動(dòng)子的控制下的外源亞精胺合酶基因，并且所述植物具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生。2.—種生產(chǎn)與缺乏外源亞精胺合酶基因的植物相比具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物的方法，包括用至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏所述外源亞精胺合酶基因的植物細(xì)胞的步驟，所述表達(dá)載體含有在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子的控制下的外源亞精胺合酶基因。3.—種生產(chǎn)具有固定特性的植物的方法，所述植物對(duì)于外源亞精胺合酶基因而言是純合體，并且所述植物與缺乏所述外源亞精胺合酶基因的植物相比具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生，所述方法包括下列步驟(1)用至少一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏外源亞精胺合酶基因的植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有在一種或多種能夠在植物中起作用的啟動(dòng)子控制下的外源亞精胺合酶基因；(2)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中再生與缺乏所述外源亞精胺合酶基因的植物相比具有形態(tài)發(fā)生改進(jìn)的植物；(3)從植物體收集通過(guò)授粉獲得的種子；以及(4)從植物體分析通過(guò)授粉獲得的種子中的外源亞精胺合酶基因，所述植物體通過(guò)培育種子以挑選對(duì)于外源亞精胺合酶基因而言是純合體而已獲得。4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中的外源亞精胺合酶基因是植物來(lái)源的。5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中與缺乏所述外源亞精胺合酶基因的植物相比，在轉(zhuǎn)化的植物中多胺的含量增加。6.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中的外源亞精胺合酶包括編碼與SEQIDNO:2具有至少82%同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。7.權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)基因植物中再生植物的步驟。8.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源亞精胺合酶基因包含下列(a)，(b)或(c)的堿基序列(a)由SEQIDNO.l所示堿基序列中第77-1060位堿基代表的堿基序列；(b)編碼具有亞精胺合酶活性的蛋白并且在嚴(yán)格條件下與上述(a)的堿基序列雜交的堿基序列；以及(c)編碼具有亞精胺合酶活性的蛋白的堿基序列，包括上述(a)或(b)的堿基序列，所述(a)或(b)的堿基序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失，替代，插入或添加。9.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的器官選自莖，塊莖，葉，根，塊狀根，花芽，花朵，花瓣，子房，果實(shí)，莢，孢蒴，種子，棕和胚珠。10.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中形態(tài)發(fā)生的改進(jìn)在生殖生長(zhǎng)期多于在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。11.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為具有莖數(shù)改進(jìn)的植物。12.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為具有葉數(shù)改進(jìn)的植物。13.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為花朵數(shù)和/或花期(初始開(kāi)花的時(shí)間或花盛開(kāi)的時(shí)期)改進(jìn)的植物。14.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為子房數(shù)和/或子房發(fā)育期改進(jìn)的植物。15.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為具有種子數(shù)改進(jìn)的植物。16.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，包括具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物為雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明涉及在多種器官中具有改進(jìn)的形態(tài)發(fā)生的植物及其子代；涉及一種生產(chǎn)植物的方法；以及涉及生產(chǎn)愈傷組織的方法。文檔編號(hào)C07K14/415GK101333535SQ20081009301公開(kāi)日2008年12月31日申請(qǐng)日期2003年4月8日優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日發(fā)明者春日部芳久,松井啟祐,橘昌司,水谷正子,豬原泉申請(qǐng)人:東洋紡織株式會(huì)社