專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種改變植物花器官形態(tài)的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種改變植物花器官形態(tài)的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。技術(shù)背景雖然通過(guò)輻射誘變能夠得到無(wú)花粉的不育系，通過(guò)雜交能夠得到重瓣花，但是這兩種方法卻都不能一次性達(dá)到去除花粉和增加花瓣的目的。輻射育種雖然達(dá)到了去除花粉的目的，但也會(huì)影響或改變植物的其他性狀，而且輻射產(chǎn)生的誘變呈多向性，多數(shù)的性狀改變是對(duì)植物不利的；雜交育種需要尋找自然界中存在的重瓣資源，然后需要較長(zhǎng)的育種周期才能培育出具有商業(yè)價(jià)值的觀賞植物品種?；òl(fā)育的分子生物學(xué)研究表明，花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊4輪花器官的發(fā)育，是由A、B、C三類(lèi)不同功能的具M(jìn)ADS-box的同源異型基因調(diào)控的，即花器官發(fā)育的ABC模型。隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，花發(fā)育的ABC模型又增加了兩類(lèi)基因D功能基因和E功能基因，其中D功能基因控制胚珠的發(fā)育，而E功能基因在葉片同源變異成花器官的過(guò)程中起著重要作用，參與各輪花器官的形態(tài)建成。其中C功能基因的突變，將產(chǎn)生雄蕊變瓣和臺(tái)閣花等重瓣花型的突變體。Z/細(xì)"57cDNA的片段長(zhǎng)846bp,包括編碼192個(gè)氨基酸的0RF的3，端和長(zhǎng)270bp的3，非編碼區(qū)(GenBank序列號(hào)AY829227)，該片段與玉米、水稻等多種單子葉植物的AG同源基因具有較高的同源性(張?jiān)?，劉青林，歐陽(yáng)青，蔡文啟.百合花發(fā)育相關(guān)MADSBox基因的克隆。園藝學(xué)報(bào)，2004，31(3):332—336)。Z/廁ZIS3cDNA片段長(zhǎng)797bp，編碼200個(gè)氨基酸，3，非編碼區(qū)長(zhǎng)197bp(GeneBank序列號(hào)AY826062)，與擬南芥的SEP組基因同源性較高(張?jiān)频龋?004)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種改變植物花器官形態(tài)的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體，是下述a)或b)的重組植物表達(dá)載體a)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入Z/鵬"57基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體；b)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入Z/J^"5^基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體。其中，所述Z/細(xì)"57基因片段的核苷酸序列具體可為GenBankAccessionNumberAY829227的自5'末端第249bp至745bp，含有部分K-box;所述Z/鵬"5^基因片段的核苷酸序列具體可為GenBankAccessionNumberAY826062的自5'末端第249bp至623bp，含有部分K-box?，F(xiàn)有的植物表達(dá)載體均可用來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體，如pBin438(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。其結(jié)構(gòu)見(jiàn)李太元、田穎川、秦曉峰等."高效抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草的研究".中國(guó)科學(xué)(B輯)，1994，24(3):276—282)。所述重組正義表達(dá)載體具體可為將Z/y^Z67基因片段插入pBin438的Sail和BamHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ/湖"57;所述重組反義表達(dá)載體具體可為將Z/i^"57基因片段插入pBin438的Sail和BaraHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ/湖Z57intisense,或?yàn)閷/F^95^基因片段插入pBin438的Sail和BamHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ^Mfl5"<~antisense。本發(fā)明所提供的改變植物花器官形態(tài)的方法，是將上述任一種用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到花器官形態(tài)改變的植物。所述花器官形態(tài)改變具體可為花藥缺失，所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體為上述pBin力iMQ57"antisense。所述花器官形態(tài)改變具體還可為花萼瓣化，所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體為上述pBinZ/M4"57。所述花器官形態(tài)改變具體還可為雄蕊缺失，或苞葉瓣化；所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體可為上述pBin丄f鵬Z5^intisense。本發(fā)明改變植物花器官形態(tài)的方法適合于單子葉植物和雙子葉植物。和Z/i/^^J經(jīng)序列分析分別屬于C功能和E功能基因，根據(jù)花發(fā)育理論，將構(gòu)建的4個(gè)植物表達(dá)載體pBinZ/M"57、pBi"/廁Z5^、pBinZ/朋"57-antisence和pBinZ/細(xì)"^53-antisence轉(zhuǎn)化煙草后，發(fā)生的一系列花器官變異足以證明它們具有改變花型的功能。本發(fā)明能夠廣泛應(yīng)用于觀賞植物的花型育種，從而得到重瓣花等多種花器官變異。而且基因工程育種還具有受體廣泛，不受品種約束；育種時(shí)間短；只改變目的性狀而不影響其他性狀的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)是輻射育種和雜交育種所不具備的。圖1為pBinZf廁"57、pBi/2Z/廁"5^、pBinA/湖"57intisence禾口pBinZ/湖"5"J-antisence的結(jié)構(gòu)示意2為pBinZ/鵬"57、pBi刀Z/細(xì)"5^、pBinZ/M4"57intisence禾口pBinZ/細(xì)仍，-antisence的Sail和BamHI雙酶切鑒定圖譜圖3為轉(zhuǎn)基因煙草的抗性芽及愈傷組織照片圖4為轉(zhuǎn)pBinZ/掘"57或pBi/Z/JfA05^煙草的PCR檢測(cè)圖譜圖5為轉(zhuǎn)pBinZ/￥^"57~antisence或pBinZ/vMO^-antisence煙草的PCR檢測(cè)圖譜圖6為pBinZ/廁"57intisence或pBinZ/￥/^53-antisenceTl代煙草PCR-Southern檢測(cè)圖譜圖7為轉(zhuǎn)基因煙草花器官變異表型照片具體實(shí)施方式步驟l載體構(gòu)建本發(fā)明已構(gòu)建4個(gè)植物表達(dá)載體pBinZ/細(xì)"57、pBinZ/M4/5^、pBin^/湖Z57—an1:isence禾口pBin^/MlflS^—antisence。步驟2轉(zhuǎn)化目標(biāo)受體將上述植物表達(dá)載體通過(guò)電激法轉(zhuǎn)入具有利福平和卡那霉素抗性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404中(菌種可根據(jù)實(shí)際情況更換)，培養(yǎng)單菌落，接種到加入利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基上，于250rpm搖床上28"C過(guò)夜。次日，將菌液用共培養(yǎng)液稀釋30—50倍，浸染目標(biāo)受體，共培養(yǎng)若干天，然后用無(wú)菌水沖洗3次，洗掉殘余的根癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)移至含篩選抗生素Kan和抑菌抗生素Carb的篩選培養(yǎng)基上，每3周更換一次篩選培養(yǎng)基，最后誘導(dǎo)抗性苗生根。步驟3抗性植株的PCR檢測(cè)當(dāng)抗性植株長(zhǎng)至3—4cm高時(shí)進(jìn)行基因組DNA的PCR檢測(cè)。DNA的提取采用CTAB法。取農(nóng)桿菌落作陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株DNA和水作陰性對(duì)照，和抗性植株的DNA同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)。步驟4PCR-Southern檢測(cè)取PCR檢測(cè)陽(yáng)性的植株的DNA，如上所述設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，再次進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物稀釋103-105倍后，取lul滴于雜交膜上，UV交聯(lián)，然后進(jìn)行以地高辛標(biāo)記的Southern檢測(cè)，最終呈現(xiàn)陽(yáng)性的植株為轉(zhuǎn)基因植株。步驟5表型觀測(cè)移栽轉(zhuǎn)基因植株，待開(kāi)花后觀測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的花型變化。5、本發(fā)明的工作過(guò)程以4個(gè)植物表達(dá)載體pBinZ/y^必7、pBin^f廁"M、pBin乙/yJ^"57-antisence和pBinZ/M4"6^-antisence的構(gòu)建、煙草轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)為例來(lái)說(shuō)明該發(fā)明的工作過(guò)程。實(shí)施例1、植物表達(dá)載體pBinLfMADSl、pBinLfMADS3、pBinLfMADS1-antisence和pBinLfMADS3-antisence的構(gòu)建以攜帶有Z/鵬"57基因(GenBankAccessionNumber:AY829227)的新鐵炮百合"7i咖X/bim^朋^(北京昌卉景觀園林有限公司)的花蕾中提取總RNA，然后以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用引物對(duì)Z1:CGGGATCCAGCAACATGAATCTTAGAG和Z2:CAGATTCAGCATAAAACCAC進(jìn)行PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建pBinL預(yù)ADSl的Z/細(xì)"57基因片段，利用引物對(duì)Fl和F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建pBinZ/#J"57-antisence的Z/湖"57基因片段。以攜帶有乙/v^/tt^基因(GenBankAccessionNumber:AY826062)的新鐵炮百合^7i咖X/b27zo2o;^0(北京昌丼景觀園林有限公司)的花蕾中提取總RNA，然后以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用引物對(duì)Z3CGGGATCCAAGGACAGTTGACTATCTG和Z4CCAGTCAATTACAAACACTC進(jìn)行PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建pBinLfMADS3的Z/朋"5^基因片段，利用引物對(duì)F3和F4進(jìn)行PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建pBinZ/M4"5^-antisence的Z/鵬Z5^基因片段。將電泳檢測(cè)確定正確后的Z/M^57基因片段和Z/t^"W基因片段PCR產(chǎn)物分別與pGEMT-Easy-Vector連接，連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在涂有X-gal和IPTG的加入50mg/L氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取白色單菌落提質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，獲得了具有自GenBankAccessionNumber:AY829227的5'末端第249位-745位脫氧核糖核苷酸的Z/湖"57基因片段，和具有自GenBankAccessionNumber:AY826062的5'末端第249bp位-623位脫氧核糖核苷酸的Z/細(xì)"5^基因片段。將含有用于構(gòu)建pBinZ/鵬"57的Z/湖/tt7基因片段的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-Z/鵬"57，將含有用于構(gòu)建pBinZ/#^57-antisence的Z/#^7基因片段的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-Z/朋"57-antisence，將含有用于構(gòu)建pBinZ/細(xì)"5^的Z/朋/AS^基因片段的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-Z/鵬ZK,將含有用于構(gòu)建pBinZ/廁"5^的丄/#力"5^基因片段的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-Z/v^/^J-antisence。將pGEMT-Z/M4"57、pGEMT-Z/#^7-antisence、pGEMT-Z/#y4Z5^和pGEMT-Z/細(xì)"5"J"antisence分別用Sail和BamHI雙酶切，按照回收試劑盒中的步驟回收500bp左右的片段，雙元植物表達(dá)載體pBin438(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。其結(jié)構(gòu)見(jiàn)李太元、田穎川、秦曉峰等."高效抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草的研究".中國(guó)科學(xué)(B輯)，1994，24(3):276—282.)用Sail和BamHI雙酶切，也按試劑盒中的步驟進(jìn)行回收。將回收的目的基因片段與雙元載體用T4連接酶在14-16'C下連接24小時(shí)，即得到植物表達(dá)載體pBinZ/￥AflS7、pBi"/朋/5^、pBinZ/M^A57intisence禾口pBinZ/湖"53-antisence(圖l)，將連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，在加有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落提質(zhì)粒，用Sail和BamHI雙酶切鑒定，得到了13kb和500bp左右的兩條帶，說(shuō)明目的基因片段已與雙元載體連接成功(圖2)。圖2中，M:GeneRulerTMDNALadderMix，1:pBinZ/y^"5！的Sail和BamHI雙酶切圖譜；2:pBinZ/湖"53的Sail和BamHI雙酶切圖譜；3:pBin乙/鵬"51-antisence的Sail和BamHI雙酶切圖譜；4:pBinZ/￥A0S3-antisence的Sail和BamHI雙酶切圖譜。表1引物序列Z15'CGGGATCCAGCATGAATCTTAACAGAG3，Z25'CAGATTCAGCATAAAACCAC3，；Z35'CGGGATCCAAGGACAGTTGACTATCTG3'Fl5，GCGTCGACTAGACTAGCTGAAACAAC3，F(xiàn)35，GCGTCGACTGCTCTAGTCAGCACAAAG3'Z45'CCAGTCAATTACAAACACTC3'F25'CGGGATCCAGATTCAGCATAAAACCAC3'F45，CGGGATCCTCAAGAGCCTCATTACATC3，實(shí)施例2、培育花器官形態(tài)改變的煙草1、轉(zhuǎn)化煙草pBinZ/i"57、pBi/Z/掘"6^、pBinZ/掘"57intisence禾口pBinZ/朋"5^-antisence分別電激轉(zhuǎn)化具有利福平和卡那霉素抗性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂抹在加入20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP平板培養(yǎng)基上，28"培養(yǎng)3天后，長(zhǎng)出單菌落，選擇利用表l中相應(yīng)的引物PCR，鑒定陽(yáng)性的單菌落重新劃到Y(jié)EP平板培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。挑取長(zhǎng)出的單菌落接種到加入20mg/L利福平和和50mg/L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基上，于250rpm搖床上28。C搖菌過(guò)夜。次日，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)液用共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+BA1.Omg/L+NAAO.Olmg/L)稀釋30—50倍。以無(wú)菌培養(yǎng)的煙草(yw'co"s朋f^ac咖'SR1，)組培苗葉片為外植體。將幼嫩葉片切去邊緣，并用刀片在葉片表面劃一些傷口，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，侵染5分鐘。取出葉片，用無(wú)菌濾紙吸干剩余的菌液，放入不含抗生素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+瓊脂7g/L的平板上，使葉片邊緣切口與培養(yǎng)基充分接觸，然后用Parafilm膜封口，25"C光培養(yǎng)3天。當(dāng)葉片邊緣出現(xiàn)白色的菌落時(shí)，將共培養(yǎng)的外植體取出，用無(wú)菌水沖洗3次，洗掉殘余的根癌農(nóng)桿菌，無(wú)菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)移至含100mg/LKan(卡那霉素)和100mg/LCarb(羧芐青霉素)的YEP培養(yǎng)基上，25"光照培養(yǎng)。外植體在培養(yǎng)1周一2周后見(jiàn)愈傷組織發(fā)生，2周一4周后愈傷組織上再生抗性小芽體。每3周在選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次。將叢生芽分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L+Kanl00mg/L+Carb200mg/L+瓊脂7g/L)誘導(dǎo)生根。轉(zhuǎn)基因煙草的抗性芽及愈傷組織如圖3所示。同時(shí)，將含有pBin438的轉(zhuǎn)入煙草(Mco^"ara6acwmcv'SR1')，作為對(duì)照。2、轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)當(dāng)再生苗長(zhǎng)至3—4cm高時(shí)進(jìn)行基因組DNA的PCR檢測(cè)。煙草基因組DNA的提取采用CTAB法，取煙草葉片約50mg，在200uLCTAB提取液中研磨，再加入300uL提取液，輕輕打勻后，65。C水浴30min，然后加入500wL4。C預(yù)冷的氯仿，輕微打勻并振蕩。10000rpm離心5min，吸取上清至另一離心管中，加入等體積4。C預(yù)冷的異丙醇，輕微顛倒直至DNA沉淀。10000rpm離心5min，棄上清，加入4'C預(yù)冷的70%乙醇，用槍頭輕輕打散沉淀。10000rpm離心5min，棄上清。待管內(nèi)液體徹底干燥后，用20—50nLddH20溶解DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置于-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆?。提取的基因組DNA用ddH20稀釋10倍，取0.5uL(約25ng)作為PCR反應(yīng)的模板。以特異性引物Z1和Z2;Z3和Z4;F1和F2;F3和F4(表1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積均為10yL，同時(shí)設(shè)水對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照(pBinZ/M^157、pBi/3Z/iZ^J、pBinZ/鵬"^57intisence或pBinZil^A5^-antisence)和轉(zhuǎn)pBin438的煙草對(duì)照各一個(gè)。PCR的反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min;94匸變性lmin，53。C退火lrain30s，72。C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°。延伸10min。PCR反應(yīng)完成后，取8nL產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠上電泳檢測(cè)。轉(zhuǎn)pBi"/鵬"57、pBi刀Z/湖AS^、pBinZ/#^67intisence或pBinZf掘"53-antisence植株在500bp左右處有條帶出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)pBin438的煙草沒(méi)有條帶出現(xiàn)(圖4、5)。圖4中，M:200bpladder分子量標(biāo)記，8:水對(duì)照，7:轉(zhuǎn)pBin438的煙草對(duì)照。左側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZ/i^"67煙草；6為pBinZ/廁"57陽(yáng)性對(duì)照；1-5為轉(zhuǎn)pBinZ/y^"57煙草，將其分別命名為Z/廁"57-厶Z/鵬Z67-么Z/廁"57-J、Z/細(xì)A57-^和Z/廁"57-5。右側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZ/鵬Z5^煙草；6為pBinZ/鵬ZK陽(yáng)性對(duì)照；1-5為轉(zhuǎn)pBinZ/M4"5^煙草，將其分別命名為ZiM"5"<-厶Z/鵬"5"J-么Z/鵬"5^-3、Z/M"5^-4和Z/朋"5^-5。圖5中，M:200bpladder分子量標(biāo)記，8:水對(duì)照，7:轉(zhuǎn)pBin438的煙草對(duì)照。左側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZ/淑"Wintisence煙草；6為pBin丄/鵬"57intisence;l-5為轉(zhuǎn)pBinZ/#AftS7intisence煙草，將其分別命名為Z/#y^S7intisence-1、Z/層57mtisence-2、Z/層67，tisence-3、Z滿"57mtisence-4禾口Z/廁"57"antisence-5。右側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZ/#^96^^intisence煙草；6為pBi"/掘"5^;1-5為轉(zhuǎn)pBinZ/鵬"5^intisence煙草，將其分別命名為Z/層5"hntisence-l、Z/磨5"hntisence-2、爐藩hntisence-3、Lf層5^ntisence-4禾卩Z扁脂，tisence-5。3、PCR-Southern檢測(cè)收獲植株L預(yù)ADS1-1、L預(yù)ADS1-2、LfMADSl-3、LfMADSl-4、L預(yù)ADS1-5、LfMADS3-1、LfMADS3-2、LfMADS3-3、LfMADS3-4、L預(yù)ADS3-5、LfMADSl-antisence-1、Lf膽S卜antisence-2、LfMADSl-antisence-3、LfMADSl-antisence-4、L預(yù)ADS1-antisence-5、LfMADS3-antisence-l、LfMADS3-antisence-2、LfMADS3-antisence-3、LfMADS3-antisence-4和LfMADS3-antisence-5的種子，播種于不添加任何激素和抗生素的MS培養(yǎng)基上，l個(gè)月后，取不同植株上的葉片，采用CTAB法提取煙草基因組DNA，取煙草葉片約50mg，在200uLCTAB提取液中研磨，再加入300uL提取液，輕輕打勻后，65。C水浴30rain，然后加入500uL4°C預(yù)冷的氯仿，輕微打勻并振蕩。10000rpm離心5min，吸取上清至另一離心管中，加入等體積4X:預(yù)冷的異丙醇，輕微顛倒直至DNA沉淀。10000rpm離心5min，棄上清，加入4。C預(yù)冷的70。/o乙醇，用槍頭輕輕打散沉淀。10000rpm離心5min，棄上清。待管內(nèi)液體徹底干燥后，用20—50uLddH20溶解DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置于-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆?。按照如下方法利用Southern雜交袋(購(gòu)自鼎國(guó)公司)，DigHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII(購(gòu)自Roche公司)Hybond-N+尼龍膜(AmersharaBiosciences)和X-光片(Kodak)進(jìn)行以地高辛標(biāo)記的PCR-Southern檢測(cè)將提取的煙草基因組DNA用ddH20稀釋10倍，作為PCR的模板。分別以LfMADSl-antisence-l、Lf膽Sl-antisence-2、LfMADSl-antisence-3、LfMADSl-antisence-4和LfMADSl-antisence-5煙草的基因組DNA為模板，用引物Fl和F2PCR擴(kuò)增Z/yl/^757基因片段。分別以LfMADS3-antisence-1、Lf腸S3-antisence-2、LfMADS3-antisence-3、LfMADS3-antisence-4禾口L預(yù)ADS3-antisence-5煙草的基因組DNA為模板，用引物F3和F4PCR擴(kuò)增基因片段。同時(shí)設(shè)質(zhì)粒陽(yáng)性、野生型煙草和水作為對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為在冰上向0.5ml離心管中依次加入，混勻后以20ul礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)體系組成如下ddH2010XPCRbufferdNTP(10mmol/L)上游引物(10umol/U下游引物(10umol/L)模板(煙草基因組DNA)7.6u11.0u10.2u14.0ul0.4u10.3y1TaqDNAPolymerase(5U/y1)0.1y1總體積10.0y1PCR反應(yīng)參數(shù)如表2所示:表2PCR反應(yīng)參數(shù)程序溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)194。C4min1294°C30s3057°C30s72°C30s372'C10min14_￡2_^_1將pBinZ/#J"67intisence或pBinZ/湖"5^-antisence質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶SalI禾nBamHI切下500bp左右的ZiM^67基因片段或Z/y^"5^基因片段，將該Z/細(xì)"57基因片段或Z/湖"5^基因片段進(jìn)行變性并用地高辛標(biāo)記，作為探針。將探針?lè)謩e與上述相應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果表明外源基因Z/M4"57和ZiW^5^確實(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草基因組DNA，并在基因分離的基礎(chǔ)上能夠穩(wěn)定遺傳(圖6)。因?yàn)槲刺砑涌股?，不含外源基因的T1代煙草部分植株也能正常存活。所以在檢測(cè)結(jié)果中也出現(xiàn)了陰性植株。圖6中，2、10水對(duì)照；3、11為轉(zhuǎn)pBin438的Tl代煙草。左側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZ/朋"57intisenceTl代煙草；9為pBinZ/#^57intisence;4-8分別為株系Z/#^057nitisence-2中的一株Tl代植株、丄/細(xì)"57"antisence-3中的一株Tl代植株、Z/y^"57intisence-l中的一株T1代植株、Z/#y4"57intisence-4中的一株Tl代植株和Z/;M"57intisence-5中的一株Tl代植株。右側(cè)圖片為轉(zhuǎn)pBinZi￥^5^^ntisenceTl代煙草；1為pBinZ/i^"5^;12-16分別為株系Z/#J"5>antisence-1中的一株T1代植株、Zi￥^05^~antisence-2中的一株T1代植株、Z/i^"5"Jintisence-3中的一株T1代植株、ZiM^S^intisence-4中的一株Tl代植株和Z/M4"5^intisence-5中的一株Tl代植株。4、轉(zhuǎn)基因煙草花器官的表型變化表3Z/鵬"W,3基因?qū)煵莸霓D(zhuǎn)化率及其變異率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分別將￡/細(xì)"67-antisene，Z/蒯Z^7,antisence，Z/細(xì)"5^株系的當(dāng)代植株(TO代)植株的組培苗42、48、36、33株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天26t:，夜間2(TC，光照16小時(shí)。觀察轉(zhuǎn)基因煙草開(kāi)花時(shí)間、花器官及植株其他性狀的表型變異。結(jié)果表明，在42株轉(zhuǎn)pBinZ/湖"57-antisene的T。代Z/MZ57intisence株系植株中，共有1株的1朵花中雄蕊變的極短，并且花藥缺失；在48株轉(zhuǎn)pBi"/#/^S7的T。代Z/J/^57株系植株中，共有1株的1個(gè)花萼與花瓣嵌合的花朵，嵌合體部分具有花瓣的特征；在36株轉(zhuǎn)pBi/i/:/湖flS3-antisence的T。代株系Z/掘/5^intisence植株中，共有1株的1枚雄蕊完全缺失，另外有1株的苞葉部分瓣化，花柄變短；在48株轉(zhuǎn)pBin438的T。代植株中，沒(méi)有一朵花的花器官發(fā)生變異(圖7)。這些結(jié)果表明構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBinZ/F^K7、pBinZ/i^Z57-antisence和pBinZ/廁Z5^-antisence轉(zhuǎn)化植物后能夠有效干擾內(nèi)源基因的表達(dá)，從而改變花器官的形態(tài)。圖7中，1、轉(zhuǎn)pBin438煙草；2、轉(zhuǎn)pBinZ/掘"57花萼瓣化；3、轉(zhuǎn)pBinZ/M^57-antisene花藥缺失；4、轉(zhuǎn)pBi/Z/J^i05^-antisence雄蔬部分缺失；5、轉(zhuǎn)pBi"Z/崩仍3-antisence複葉瓣化正面圖；6、轉(zhuǎn)pBi"Z/湖ZZ53-antisence苞葉瓣化反面圖。權(quán)利要求1、一種用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體，下述a)或b)的重組植物表達(dá)載體a)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入LfMADS1基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體；b)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入LfMADS3基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述ZiM^67基因片段的核苷酸序列為GenBankAccessionNumberAY829227的自5'末端第249bp至745bp，；所述^/#^95^基因片段的核苷酸序列為GenBankAccessionNumberAY826062的自5'末端第249bp至623bp。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體為pBin438;所述重組正義表達(dá)載體為將Z/M4"57基因片段插入pBin438的Sail和BamHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ/湖/^7;所述重組反義表達(dá)載體為將Z/vM"57基因片段插入pBin438的Sail和BamHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ/v^iOS7intisense，或?yàn)閷/鵬/^基因片段插入pBin438的Sail和BamHI位點(diǎn)間得到的重組表達(dá)載體pBinZ/y^"5^intisense。4、一種改變植物花器官形態(tài)的方法，是將權(quán)利要求1至3中任一所述的用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到花器官形態(tài)改變的植物。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述花器官形態(tài)改變?yōu)榛ㄋ幦笔А?、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體為權(quán)利要求3所述的pBinZ/鵬"57intisense。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述花器官形態(tài)改變?yōu)榛ㄝ喟昊?、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體為權(quán)利要求3所述的pBir^/￥ym57。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述花器官形態(tài)改變?yōu)樾廴锶笔?，或苞葉瓣化；進(jìn)一步，所述用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體可為權(quán)利要求3所述的pBinLfiW"5"J"antisense。10、根據(jù)權(quán)利要求4至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種改變植物花器官形態(tài)的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的用于改變植物花器官形態(tài)的表達(dá)載體，下述a)或b)的重組植物表達(dá)載體a)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入LfMADS1基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體；b)在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入LfMADS3基因片段得到的重組正義或反義表達(dá)載體。本發(fā)明能夠廣泛應(yīng)用于觀賞植物的花型育種，從而得到重瓣花等多種花器官變異。而且基因工程育種還具有受體廣泛，不受品種約束；育種時(shí)間短；只改變目的性狀而不影響其他性狀的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)是輻射育種和雜交育種所不具備的。文檔編號(hào)C07H21/04GK101130784SQ20071011943公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月24日發(fā)明者劉青林,云張,彌志偉,趙印泉申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)