專利名稱：用于在微流體裝置中檢測分離的mRNA的緩沖液的制作方法
用于在微流體裝置中檢測分離的mRNA的緩沖液 相關(guān)申請的交叉引用
該申請要求提交于2006年3月2日的美國臨時申請No. 60/779， 312的權(quán)利，該申請作為參考引入此處。
背景技術(shù)：
目前已有用于從細胞裂解物中制備mRNA的緩沖液會裂解細胞核， 并且是高電導(dǎo)率的(參見，例如，美國專利公開2005/0053952 )。高 電導(dǎo)率使目前的緩沖液不適用于微流體裝置中或結(jié)合使用流體和電動 流動的微流體操作中，包括選擇性離子提取(SIE)。此外，細胞核的 破裂會導(dǎo)致在細胞裂解物中污染基因組DNA。
本發(fā)明通過提供電導(dǎo)率足夠低的、適用于微流體操作并且不破壞 細胞核的完整性的緩沖液解決了這些缺點。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了使用低電導(dǎo)率的緩沖液制備能直接用作mRNA檢測 模板的、沒有基因組DNA污染的細胞裂解物的方法和試劑盒。
相應(yīng)的，在第一個方面，本發(fā)明提供了在細胞中檢測mRNA方法。 在一些實施方案中，該方法包括
a) 使細胞和緩沖液接觸，由此生成包含完整細胞核的細胞裂解物， 其中所述緩沖液具有IO mS/cm或更低的電導(dǎo)率；
b) 從裂解物中分離細胞核，由此產(chǎn)生含有mRNA的上清；
c) 通過微流體分離，使上清中的mRNA從逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和DNA 聚合酶抑制劑中分離出來；和
d) 用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)擴增至少一個mRNA序列， 由此檢測細胞中的mRNA。
在一些實施方案中，微流體分離包括選擇性離子提取(SIE)。 在一些實施方案中，通過離心實行從裂解物中分離細胞核的步驟。 在實行本方法中，優(yōu)選的，基因組DNA(gDNA)是不可擴增檢出的。 在另一個方面，發(fā)明提供的試劑盒包含
i) 包含微流體通道的底板；和
ii) ii)具有10 mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。 在一些實施方案中，所述底板適用于選擇性離子提取(SIE)。 對于方法和試劑盒的實施方案，所述緩沖液可以具有大約9、 8、
7、 6、 5、 4、 3、 2、 1 mS/cm或者大約0. 5-10 mS/cm之間的任意值的 電導(dǎo)率。在一些實施方案中，所述緩沖液具有5 mS/cm或更低的電導(dǎo) 率。在一些實施方案中，所述緩沖液具有2 mS/cm或更低的電導(dǎo)率。
在一些實施方案中，所述緩沖液包含具有如下濃度的下述組分 至多50mM的氯化鈉，例如，10、 20、 30、 40、 50mM，或者5-20mMNaCl; 至多50 mM的生物學(xué)緩沖試劑，pH 6.0-8.3，例如10、 20、 30、 40、 50mM，或者5-20mM生物學(xué)緩沖試劑，pH為例如6. 0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.2、 7.4、 7.5、 7.7、 8.0、 8.3;至多15mM的氯化鎂，例如大約1-5 mM、 3、 5、 7、 10、 12、 15 mM MgCl2;至多5.0 % (v/v)的非離子型 去污劑，例如，0.2-5.0 %、 0. 5-2. 0°/。， 0.2、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0 %的非離子型去污劑。
所述緩沖液可以進一步包含RNA酶抑制劑。在一些實施方案中， 非離子型去污劑選自NP-40、 Triton-Xn (n - 100-500)、聚氧乙烯 嵌段共聚物(polyoxyalkylene block copolymer)、聚乙二醇月旨肪 酸酯、甘油酯。其它的非離子型表面活性劑列于(例如)美國專利 6， 383， 471中，此處被引用作為參照。在一些實施方案中，生物學(xué)緩 沖試劑選自于檸檬酸鹽、磷酸鹽、ACES、 BES、 EPPS、甘氨酸、組氨酸、 HEPES、 BIS-TRIS、 TRIS和MES。其它的生物學(xué)緩沖試劑可購于，例如， Sigma-Aldrich， St. Louis, M0。
在一個實施方案中，所述緩沖液包含如下濃度的如下組分、基本 上由如下濃度的如下組分組成或者由如下濃度的如下組分組成
10 mM氯化鈉；
10 mM TRIS， pH 7.4;
3 mM氯化鎂；
0. 5 % (v/v) NP-40;以及 任選地，RNA酶抑制劑。 附圖簡要說明
圖l圖示了經(jīng)受緩沖液E處理的HeLa細胞的完整細胞核。格A: 未用緩沖液E裂解的完整細胞核的相差成像。格B:細胞的完整細胞 核的熒光成像，裝載Hoechst 33258染料，并且未用緩沖液E裂解細 胞。格C:用緩沖液E裂解細胞的細胞完整細胞核的相差成像。格D: 用緩沖液E裂解細胞的細胞完整細胞核的熒光成像。在用緩沖液E裂 解的細胞中，細胞核仍然是完整的，并且基因組DNA未被釋放到裂解 物中。所有的成像都釆用40X放大。
圖2圖示了從新鮮的HeLa細胞從基因組DNA ( gDNA )中擴增凝結(jié) 因子5基因的結(jié)果。藍色曲線Ambion的Cells-to-cDNATM裂解緩沖 液。黑色曲線gDNA陽性對照。紅色曲線緩沖液E。從使用緩沖液 E制備的裂解物中沒有擴增出基因組DNA擴展子。該數(shù)據(jù)和顯示于

圖1 中的數(shù)據(jù)一致。
圖3圖示了使用利用Cells-to-cDNATM試劑盒(Ambion)或者本發(fā) 明的緩沖液E產(chǎn)生的mRNA進行的微管蛋白mRNA序列的實時逆轉(zhuǎn)錄酶 聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)。兔藍色曲線Ambion的CelIs-to-cDNATM 裂解緩沖液。綠色曲線緩沖液E。緩沖液E的所有稀釋液的循環(huán)閾 值(Ct)都和Cells-to-cDNATM裂解緩沖液的Ct值相同。因此，對于兩 種緩沖液，從細胞中提取的HeLa mRNA的量是相等的。緩沖液E在對 目標mRNA序列的擴增中的表現(xiàn)和市場銷售的緩沖液相當。
發(fā)明詳述 介紹
本發(fā)明提供了用于制備細胞裂解物的方法和試劑盒，所述裂解物
適用于微流體分離技術(shù)，可被直接用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR) 擴增混合物中用于擴增mRNA序列，沒有不想要的基因組DNA的擴增。 提供的用于裂解真核細胞的方法和試劑盒帶有低電導(dǎo)率的緩沖液，該 緩沖液裂解胞外細胞膜，不破壞細胞核的完整性。 定義
術(shù)語"微流體(microfluidic)"指的是裝置或底板以及使用裝 置或底板的方法，所述裝置或底板具有一個或多個通道，所述通道具 有至少一個小于1 mm內(nèi)部交叉截面尺寸，并且有時小于500 pm,例 如，0.1-500 pm。
短語"微流體分離"指的是使用微流體裝置或底板分離兩種或兩 種以上的分子。
"微流體底板"是一種適用于微流體分離過程的底板?？梢杂萌?意合適的材料制備微流體底板，包括，例如，塑料或玻璃。
術(shù)語"選擇性離子提取"或"SIE"指的是在微流體裝置中聯(lián)合利用 流體流動和電動流動控制的一種分離技術(shù)。在應(yīng)用選擇性離子提取中， 根據(jù)電泳遷移率，被運送到微流體底板中的T形接頭(即，微流體芯 片)中的化合物或分子的混合物能被完全分離到不同的通道中。參加， 例如，Kerby等人，Anal Chem (2002) 74:5175。并參見，美國專利 號10/386， 900和10/744, 915;國際轉(zhuǎn)錄公開號WO 03/076052，在此
處上述每個公開都被整體引用僅作為參考。
術(shù)語"電導(dǎo)率，，或"電導(dǎo)系數(shù)"指的是材料或溶液引導(dǎo)電流的能 力?？梢砸詥挝籗iemens每米(S/m)或mhos (ohms的倒數(shù))/m來度量電 導(dǎo)率或電導(dǎo)系數(shù)。
實施例
方法
本方法適合于檢測任意真核細胞中的信使核糖核酸(mRNA)，包括， 例如，酵母細胞、昆蟲細胞、爬蟲細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞和 哺乳動物細胞?？梢詮慕M織培養(yǎng)中制備細胞，或者可以從取自受試者 的組織樣品中直接制備細胞。例如，可以從個體的活組織切片或血液
組織獲得細胞。可以從例如美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)， Manassas, VA 獲得通過組織培養(yǎng)制備的細胞系。
如果需要，可以將低電導(dǎo)率裂解緩沖液制備為濃縮儲備液(例如， 5X、 IOX、 20X)，在使用前可以將所述濃縮儲備液稀釋。在一些實施 方案中，在裂解緩沖液和細胞接觸來裂解細胞之前在其中加入巰基乙 醇I3-(BME)，或者其它還原試劑，和/或RNA酶抑制劑。
緩沖液的合適體積依賴于待裂解細胞的數(shù)量和大小。在一些實施 方案中，向大約100000個細胞中加入大約100 juL的裂解緩沖液。也 可以采用更大體積的裂解緩沖液，例如，對于細胞大小較大的100， 000 個細胞(例如，上皮細胞、成纖維細胞) 也可以采用更小體積的裂 解緩沖液，例如，對于細胞大小較小的100，000個細胞(例如，淋巴 細胞，包括B或T細胞)。
通過將細胞樣品加入到發(fā)明的緩沖液中，細胞的胞外膜被裂解， 所述緩沖液具有大約10mS/cm或更低的電導(dǎo)率。細胞在裂解緩沖液中、 在足以有效裂解胞外膜并同時保持細胞核膜完整的條件下孵育?？梢?br> 在體溫(37x:)、室溫(25t:)或冷藏溫度(4x:)、或其它適當溫度 下將細胞暴露于裂解緩沖液中。在一個實施方案中，細胞和裂解緩沖 液接觸，并隨后置于水上。通常在半小時或更短時間內(nèi)完成細胞裂解，
例如，在大約30、 20、 10、 5或更少的分鐘內(nèi)。細胞暴露于裂解緩沖
液中的、足以裂解胞外膜的時間長短依賴于幾種因素，包括細胞大小、 單位體積的裂解緩沖液中的細胞數(shù)量、孵育溫度等等。可以進一步機 械裂解細胞來促進裂解，例如，利用數(shù)次通過吸管操縱器，或者利用
旋渦振蕩。
在裂解胞外膜之后，從裂解物中分離完整的細胞核。可以通過， 例如，細胞裂解物離心來實現(xiàn)。隨后分離沉淀和上清，沉淀中含有細 胞核。
隨后通過對上清進行微流體分離操作，從上清中的其它分子中移
出或分離出mRNA，所述其它分子包括逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的抑制劑。 將上清加載到合適的、微流體底板的泵或通道中，例如，通過注射或 毛細管攝取。隨后對底板和細胞上清施加電流和/或正或負電壓，直到 分離充分完成。進行微流體分離操作的裝置和底板可購于，例如，
Caliper Life Sciences, Hopkinton， MA; 和Agilent Technologies, Palo Alto, CA。
在一個實施方案中，微流體分離操作為選擇性離子提取(SIE)。在 SIE中，通過正流體壓力和電場一起驅(qū)動微流體底板中的通道區(qū)段中 的流體，并且通過改變在通道網(wǎng)絡(luò)中的不同通道區(qū)段所釆用的壓力和 電場來分離流體填充物中的多種物質(zhì)。還可參見美國專利申請 10/386, 900和10/744, 915;以及國際專利公開WO 03/076052,在此
處上述每個公開都被整體引用僅作為參考。
隨后，分離的含mRNA的上清部分可用于任何的需要mRNA的目的。 在一些實施方案中，含mRNA的上清部分不經(jīng)進一步的處理(可選的) 就被直接用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)中或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中。上清 部分可按照所需直接用于一步或兩步RT-PCR反應(yīng)中。使用反應(yīng)進行的 RNA或DNA模板的擴增是人們所熟知的(參見美國專利4， 683，195和 4,683,202， PCR操作流程A Guide to Methods and Applications (Innis et al， eds， 1990))。優(yōu)選在熱循環(huán)儀中進行該反應(yīng)來便于 在所需溫度下進行孵育周期。參見，例如，PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach， ed. 2003)冷泉港出版。典型的，能使擴增子 擴增的示例性的PCR反應(yīng)條件包括2或3步循環(huán)。
2步循環(huán)具有一個變性步驟，隨后進行一個雜交/延長步驟。3步 循環(huán)包括一個變性步驟，隨后進行一個雜交步驟，隨后進行一個單獨 的延長步驟。如所需，可以擴增一種或多種mRNA序列。在一些實施方 案中，產(chǎn)生一個cDNA庫，并且隨意克隆到合適的載體中，用于進一步 的處理、表達等等。
試劑盒
發(fā)明進一步提供了試劑盒，包括發(fā)明的低電導(dǎo)率裂解緩沖液和具 有一個或多個微流體通道的微流體底板(即，微流體芯片)，如上所 述，用于所述方法?？蛇x的，該試劑盒可以進一步包括一種對照核酸，
例如， 一種對照mRNA序列。此外，該試劑盒可以包括擴增試劑，包括 核苷酸(例如，A、 C、 G和T) ， DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，引物(例 如，寡聚dT、隨機的或特異性的)以及合適的緩沖液、鹽和其它試劑 來方便進行擴增反應(yīng)。該試劑盒還可以包括書面的、使用試劑盒進行 擴增并控制目標mRNA序列擴增的使用說明書。參見，例如，Au s ube 1等 人，Current Protocols in Molecular Biology, 1995-2006， John Wiley & Sons, 或 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第三版，2001，冷泉港實驗室出版。
實施例
實施例1
下面的實施例表明，當使用"緩沖液E"進行細胞裂解時，基因 組DM未被釋放到溶液中，因為細胞核未被裂解。 材料
議新鮮的HeLa細胞系，生長于加入10 %胎牛血清(FBS) 、 1 mM丙 酮酸鈉和非必需氨基酸的DMEM中。 "磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS) 國胰蛋白酶
■HeLa S3 RNA (Ambion) 國人gDNA
"Script cDNA合成試劑盒 ■iQ Sybrgreen Supermix ■iQ Supermix
"用于從mRNA中擴增人微管蛋白基因的引物 "基因組DNA中擴增凝結(jié)因子5基因的引物
"重組RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promega ^^司的產(chǎn)品目錄號 N2511)
■Cells-to-cDNA II (Ambion) "Aurum總RNA迷你試劑盒
國緩沖液E: 10 mM NaCl， 10 mM Tris， pH 7.4， 3 mM MgCl2，和
0. 5 % NP40。 裝置-.
"旋渦振蕩器 ■iCycler /MyCycler
國細胞培養(yǎng)箱 "血細胞計數(shù)器
操作 細胞培養(yǎng)
將HeLa細胞接種到75 cm2的矩形瓶中并使細胞生長到90-95%會 合。隨后通過胰蛋白酶處理來收集細胞。細胞計數(shù)后，按照大約 100， 000個細胞進行分裝。
細胞核染色
也將HeLa細胞接種到24-孔粘附細胞培養(yǎng)板中，使其生長到90-95 °/。會合。首先，用Hoechst 33258染料染色24孔板中的細胞，使能夠 在顯微鏡下使用UV光目檢到細胞核。完整的細胞核是容易辨認的，因 為當染料結(jié)合到DNA雙鏈上后細胞核發(fā)射出藍色的熒光。隨后向平板 中的孔中加入緩沖液E。漩渦振蕩平板來進一步促進裂解。在顯微鏡 下觀察裂解物來研究細胞核是否被緩沖液所裂解。
細胞裂解
從10x儲備液制備緩沖液E，并且加入1 % BME和核糖核酸酶抑 制劑。向分裝的100， 000個HeLa細胞中加入100 的每種裂解緩沖 液(緩沖液E和Ambion CelIs-to-cDNA II緩沖液("C-to-C buffer"))。使細胞裂解物數(shù)次通過吸管操縱器，并漩渦振蕩來進一 步打破細胞。按照說明書，使用熱循環(huán)儀在75匸下孵育 Cells-to-CdnaTM裂解物10分鐘。在室溫下以5, 000 x g離心所有的 細胞裂解物10分鐘，來去除細胞碎片。離心旋壓后，每份裂解物中的 上清都被轉(zhuǎn)移到一些新管中，并置于冰上。采用緩沖液E裂解細胞的 完整的細胞核顯示于圖1。
對于每種緩沖液并對于50 pL的PCR反應(yīng)，使用2pL的細胞裂
解物進行實時PCR來從人gDM中擴增出凝結(jié)因子5基因。該反應(yīng)進行 兩份。結(jié)果顯示于圖2。
從細胞裂解物中制備10倍系列稀釋。從每個稀釋樣品中取2 jaL 來用于使用逆轉(zhuǎn)錄酶的40jjL的cDM合成。合成cDNA后，使用10 p L的cDNA釆用100 jiL PCR反應(yīng)進行實時PCR來擴增微管蛋白基因。 該反應(yīng)進行三份。結(jié)果顯示于圖3中。
結(jié)論
使用緩沖液E，我們裂解了HeLa細胞，并將部分細胞裂解物直接 用于RT-PCR反應(yīng)中。和市場銷售的試劑盒一樣，緩沖液E也能用于目 標mRNA序列的擴增，但是不破壞細胞核，因此避免了或者最小化了基 因組DNA污染的引入。
提供上面的實施例來說明發(fā)明但不對其范圍進行限制。對于本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員，發(fā)明的其它變通是非常明顯的，并且被包括在附加 的權(quán)利要求中。此處引用的所有的出版物、數(shù)據(jù)庫、Genbank序列、 專利和專利申請都被引入作為參考。
權(quán)利要求
1. 檢測細胞中的mRNA的方法，所述方法包括a)讓細胞和緩沖液接觸，由此生成包含完整細胞核的細胞裂解物，其中所述緩沖液具有10mS/cm或更低的電導(dǎo)率；b)從裂解物中分離細胞核，由此產(chǎn)生含有mRNA的上清；c)通過微流體分離使上清中的mRNA從逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和DNA聚合酶抑制劑中分離出來；和d)用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)擴增至少一種mRNA序列，由此檢測細胞中的mRNA。
2. 權(quán)利要求1的方法， (SIE)。
3. 權(quán)利要求1的方法
4. 權(quán)利要求1的方法 導(dǎo)率。
5. 權(quán)利要求1的方法 導(dǎo)率。
6. 權(quán)利要求1的方法 組分至多50 mM的氯化鈉； 至多50 mM的生物緩沖試劑，pH 6.0-8.3; 至多15 mM的氯化鎂； 至多5.0 % (v/v)的非離子型去污劑。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述緩沖液進一步包含RNA酶抑制劑。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中所述非離子型去污劑是NP-40。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中所述生物緩沖試劑選自于檸檬酸鹽、 砩酸鹽、TRIS和MES。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述緩沖液包含具有如下濃度的如 下組分其中所述微流體分離包括選擇性離子提取，其中分離步驟b)包括離心。，其中所述緩沖液具有5mS/cm或更低的電，其中所述緩沖液具有2mS/cm或更低的電 ，其中所述緩沖液包含具有如下濃度的如下 10 mM氯化鈉；10 mM TRIS， pH 7.4;3 mM氯化鎂；0. 5 % (v/v) NP-40;和RNA酶抑制劑。11. 權(quán)利要求l的方法，其中基因組DNA是不能擴增檢測出的。12. 試劑盒，包括i )包含微流體通道的底板；和ii)一種具有10 mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。13. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液具有5mS/cm或更低 電導(dǎo)率的緩沖液。14. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液具有2mS/cm或更低電導(dǎo)率的緩沖液。15. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液包含下面的組分 至多50 mM的氯化鈉；至多50 mM的生物緩沖試劑，pH 6.0-8.3;至多15 mM的氯化鎂；至多5.0 % (v/v)的非離子型去污劑。16. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述緩沖液進一步包含RNA酶抑制劑。17. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述非離子型去污劑是NP-40。18. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述生物緩沖試劑選自于檸檬酸 鹽、磷酸鹽、TRIS和MES。19. 權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述緩沖液包含下面的組分10 mM氯化鈉；10 mM TRIS， pH 7, 4; 3 mM氯化鎂； 0. 5 % (v/v) NP-40;和 RNA酶4中制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用低電導(dǎo)率的緩沖液在微流體裝置中檢測從細胞裂解物中分離的mRNA的方法和試劑盒。緩沖液不影響細胞核的完整性，因此能夠產(chǎn)生不含有基因組DNA的、能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增反應(yīng)中直接用作模板的細胞裂解物。
文檔編號C07H21/00GK101395169SQ200780007477
公開日2009年3月25日 申請日期2007年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者L·尤戈佐利 申請人:Bio-Rad實驗室公司