專利名稱：：抗m3型受體蛋白多肽抗體測定在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及膽堿能M3型受體多肽的制備及其做為抗原在檢測干燥綜合征及其它疾病中的應(yīng)用。一
背景技術(shù)：
：千燥綜合征(Sjogren'sSyndrome,SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為特征的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現(xiàn)為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴系統(tǒng)、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區(qū)分布差異，可發(fā)生于任何年齡，以40-60歲，特別是絕經(jīng)后的女性居多，男女之比為1:9。在我國的患病率為0.77%，在老年人群中的患病率高達(dá)4%，全國有近800萬患者。干燥綜合征可分為原發(fā)性干燥綜合征(PrimarySjogren'ssyndrome)和繼發(fā)性干燥綜合征(SecondarySjogren'ssyndrome)兩類。該病單獨(dú)發(fā)生時(shí)，稱為原發(fā)性干燥綜合征；與其它診斷明確的自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,SLE)等合并存在時(shí)，稱為繼發(fā)性干燥綜合征。近年來，人們對干燥綜合征的病因及發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量研究，但至今無突破性進(jìn)展。目前在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)理想的血清學(xué)診斷方法，除臨床癥狀外，主要靠唇腺活檢及腮腺造影等有創(chuàng)檢査明確診斷，由于患者的醫(yī)從性差，常常延誤診斷，并喪失最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，尋找一種敏感性強(qiáng)、特異性高而又簡便易行的檢測方法，對干燥綜合征的早期診斷及治療具有重要意義。為此，本發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)了可以用于干燥綜合征早期診斷的血清學(xué)特異性抗原——膽堿能M3型受體多肽，該多肽可以特異性的識(shí)別干燥綜合征患者血清中的特異性抗體——抗膽堿能M3型受體多肽抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學(xué)檢測方法(如酶聯(lián)免疫吸附法)檢測出來。并且具有很高的敏感性和特異性。二、發(fā)明概述本發(fā)明的目的之一是提供能夠有效檢測干燥綜合征的特異性抗原——膽堿能M3型受體多肽。本發(fā)明的另一目的是提供所述的膽堿能M3型受體多肽在診斷干燥綜合征中的用途。最后，本發(fā)明提供了將含有所述膽堿能M3型受體多肽及類似物做為抗原用于檢測干燥綜合征的方法。本發(fā)明所用術(shù)語"膽堿能M3型受體多肽'，指具有共同序列KRTVPPGECFIQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu賴氨酸一精氨酸一色氨酸J氨酸一脯氨酸一脯氨酸一甘氨酸一谷氨酸一半胱氨酸一苯丙氨酸一異亮氨酸一谷氨酰胺一苯丙氨酸一亮氨酸一絲氨酸一谷氨酸)的氨基酸、多肽類似物及蛋白。膽堿能M3型受體是一種主要分布于外分泌腺及平滑肌的膽堿能受體，也是一種G-蛋白偶聯(lián)受體。它結(jié)合膽堿能神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿，激活磷脂酶C、A2、D通路，電壓依賴性鈣通道開放，使鈣內(nèi)流增加，細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度升高，cAMP增加，引起腺體分泌和平滑肌收縮。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SS患者血清中的抗膽堿能M3型受體抗體可以識(shí)別并激活M3型受體，該抗體與M3型受體的長期結(jié)合，不僅降低膽堿能M3型受體對乙酰膽堿的敏感性，還造成M3型受體的進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致受體的降解，進(jìn)而影響信號(hào)傳導(dǎo)通路、干擾水通道蛋白的分布，致使SS患者出現(xiàn)腺體分泌減少、膀胱逼尿肌收縮力減弱等膽堿能神經(jīng)功能異常的臨床表現(xiàn)。19%年，Bacman等報(bào)道〖"了SS患者血清中存在著抗膽堿能M3型受體抗體，并進(jìn)一步指出該抗體對于SS的診斷具有較高的特異性。該文獻(xiàn)中選用的是大鼠腮腺的膜蛋白提取物，是一種混合的蛋白成分。該文獻(xiàn)中通過測定一種可以結(jié)合所有M型受體的已知標(biāo)記蛋白的含量，來間接計(jì)算M3受體的含量；而且大鼠M3受體用于檢測SS患者的特異性較差。國外至今也沒有這方面大樣本的臨床研究，而且國內(nèi)外都沒有建立切實(shí)可行的該抗體的臨床檢測方法。本小組經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)了可以用于干燥綜合征診斷的血清學(xué)特異性抗原——抗膽堿能M3型受體，該蛋白可以特異性的識(shí)別干燥綜合征患者血清中的特異性抗^~~抗膽堿能M3型受體抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學(xué)檢測方法(如免疫印跡法)檢測出來，并且具有很高的敏感性和特異性。本發(fā)明目的是提供有效檢測干燥綜合征特異性抗原的檢測方法，并應(yīng)用于干燥綜合征的診斷?；谝陨涎芯?，本發(fā)明人將M3受體序列213-228之間的16個(gè)氨基酸的多肽KRTVPPGECFIQFLSE(艮卩Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu賴氨酸一精氨酸一色氨酸一纈氨酸一脯氨酸一脯氨酸一甘氨酸一谷氨酸一半胱氨酸一苯丙氨酸一異亮氨酸一谷氨酰胺一苯丙氨酸一亮氨酸一絲氨酸一谷氨酸)做為抗原，用ELISA的方法檢測干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人血清中的抗膽堿能M3型受體多肽抗體，從而達(dá)到通過血清學(xué)的方法診斷干燥綜合征的目的，為干燥綜合征的臨床診斷提供客觀的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本發(fā)明的抗膽堿能M3型受體多肽及其類似物可通過多種方法(例如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、金標(biāo)記法等)對干燥綜合征患者進(jìn)行檢測，其檢測方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。同時(shí)，檢測的M3型受體多肽抗體類型可為IgG型、IgA型或其它類型的免疫球蛋白。本發(fā)明所述的抗膽堿能M3型受體可以用本領(lǐng)域人員所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表達(dá)純化法等。圖1.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測原理示意圖圖2.抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體在不同疾病中的滴度水平由圖可見，ELISA方法檢測抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、SLE及正常對照組中的平均值分別為0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在SS患者組中抗體吸光度平均水平明顯高于其它結(jié)締組織病和正常人對照組(P均0.05或<0.01)。圖3.抗M3型受體蛋白多肽抗體在不同疾病的陽性率由圖可見抗膽堿能M3型受體多肽抗體在原發(fā)性和繼發(fā)性干燥綜合征中的陽性率均明顯高于SLE、RA及正常對照(P均<0.05或<0.01)。在干燥綜合征患者中，抗ct-胞襯蛋白多肽抗體的敏感性明顯高于SSA、SSB及抗核抗體，其特異性略低于抗SSB抗體(P均<0.01)。較SSA抗體，抗核抗體明顯增高(PO.Ol)。因此，抗a-胞襯蛋白多肽抗體在干燥綜合征血清學(xué)診斷中具重要價(jià)值。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1抗膽堿能M3型受體蛋白多肽的設(shè)計(jì)及合成前述的研究工作(1—4)已經(jīng)證明，從sigma公司購進(jìn)s細(xì)胞真核表達(dá)的人膽堿能M3型受體蛋白能夠特異性的結(jié)合干燥綜合征患者體內(nèi)的膽堿能M3型受體蛋白抗體，然后通過特定的方法可以將其檢出。本發(fā)明的試驗(yàn)中首先利用Flechsler等(5)報(bào)道的固相合成法合成了一條共16個(gè)氨基酸的膽堿能M3型受體蛋白多肽，其序列如下KRTVPPGECHQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu)研究表明上述膽堿能M3型受體蛋白多肽具有能特異性的識(shí)別干燥綜合征患者血清中的特異性抗體的作用，對干燥綜合征的診斷具有重要的意義。實(shí)施例2抗膽堿能M3型受體蛋白多肽對干燥綜合征患者血清中抗體的檢測本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(即ELISA法)對干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清中的抗M3型受體蛋白多肽抗體進(jìn)行檢測，以評(píng)價(jià)該多肽抗體在各種疾病中的分布。首先將M3型受體蛋白多肽包被于酶聯(lián)免疫吸附微孔板上，與待測血清一起孵育，如果血清中存在的抗M3型受體蛋白多肽抗體，該抗體就會(huì)與包被的固相抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。將未結(jié)合的抗體及其它成分沖洗干凈后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(IgG-HRP)—起孵育，此時(shí)1gG-HRP就會(huì)與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的成分，加入底物，若血清中含有M3型受體蛋白多肽抗體，則會(huì)顯出特定的顏色，且抗體滴度越高顏色越深。加終止液后在450mn波長下測定OD值。檢測原理示意圖見圖1。本研究共檢測78例原發(fā)干燥綜合征(pSS)，16例繼發(fā)干燥綜合征(sSS)，80例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA),80例系統(tǒng)性紅斑狼疫，17例系統(tǒng)性硬化及200例正常人血清中的抗M3受體多肽抗體。采用待測標(biāo)本OD值(A值)>正常人平均OD值(X)±2X標(biāo)準(zhǔn)差(2s)為陽性閾值。本實(shí)施例主要通過以下幾個(gè)方面闡明本發(fā)明多肽在干燥綜合征患者診斷中的意義1、M3型受體蛋白多肽抗體陽性率在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其他結(jié)締組織病及正常人的比較。本研究用ELISA方法檢測了M3型受體蛋白多肽抗體在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人的陽性率，見表l。應(yīng)用u檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，M3型受體蛋白多肽抗體在原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征的陽性率顯著高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其他結(jié)締組織病和正常人，p值均0.05。原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征的M3型受體蛋白多肽抗體的陽性率相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而M3型受體蛋白多肽抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的陽性率顯著高于正常人(p<0.05)。表1.抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體在各風(fēng)濕免疫病中的陽性準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注P值為各組抗M3型受體蛋白多肽抗體的靈敏性與原發(fā)性SS組靈敏性的比較2、抗M3型受體蛋白多肽抗體在不同疾病中的滴度比較ELISA方法檢測抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、SLE及正常對照組中的平均值分別為0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在SS患者組中抗體吸光度平均水平明顯高于其它結(jié)締組織病和正常人對照組(圖2)。3、抗M3型受體蛋白多肽-IgG，IgA，IgM抗體三種亞型在SS中陽性率的比較為了驗(yàn)證以合成的多肽抗原檢測SS患者自身抗體的方法能否應(yīng)用于區(qū)分不同亞型抗M3受體多肽自身抗體的檢測，我們同時(shí)測定了33例pSS患者和7例sSS患者的抗M3型受體蛋白多肽-lgG，IgA和IgM抗體的水平(見表2),在pSS和sSS中抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體的陽性率均明顯的高于抗M3型受體蛋白多肽-IgA和抗M3型受體蛋白多肽-lgM的陽性率(PO.Ol)。此外，在pSS患者中抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體陽性的患者IgG的平均水平為28.23g/L，明顯高于陰性患者的11.25g/L(P<0.05)。_表2抗M3型受體蛋白多肽自身抗體在SS中的陽性率橋,M3想孕汰雖內(nèi)名pSSfa-3Ti_sSS(n=7)_自身抗體類型陽性例數(shù)陽性率％陽性例數(shù)陽性率％IgG2884.8*571.4*igA618.2116.71gM26.10-陽--注*表示為抗M3型受體蛋白多肽-lgG抗體的陽性率與抗M3型受體蛋白多肽-IgA和IgM抗體陽性率相比P〈0.014抗M3型受體蛋白多肽抗體與其他自身抗體在SS檢測中的陽性率的比較抗M3型受體蛋白多肽抗體在pSS患者中的敏感性為84.6%，明顯的高于抗a-胞襯蛋白抗體，抗SSA抗體，抗SSB抗體及抗ANA(P<0.01，見表3)。此外在抗a-胞襯蛋白抗體陰性，抗SSA抗體陰性，抗SSB抗體陰性和抗ANA陰性的pSS患者中抗抗M3型受體蛋白多肽抗體的陽性率分別為85%，89.3%，88.9%和95.2%(見表4)。表3自身抗體在SS中的敏感性比較抗體類型_pSS(n=7ii)__sSS<n=16、抗體陽性例數(shù)陽性率(％)抗體陽性例數(shù)陽性率(％)抗M3RP抗體6684.61381.3抗a-胞襯蛋白抗體5874.443.8抗SSA抗體5064.1850.0抗SSB抗體3443.6531.3ANA5773.11062.5表4抗M3RP抗體在抗a-胞襯蛋白抗體，抗SSA抗體，抗SSB抗體和抗ANA陰性的pSS患者中的陽性率組別例數(shù)抗M3RP陽性例數(shù)陽性率(％)抗a-胞襯蛋白抗體(-)201785.0抗SSA抗體(-)282589.3抗SSB抗體(-)363288.9抗ANA(-)212095.25、抗M3型受體蛋白多肽-IgG抗體與SS患者臨床表現(xiàn)及與其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性在SS中抗M3RP抗體陽性與患者肺間質(zhì)纖維化，腎小管酸中毒，血小板減少，肝功能損害的發(fā)生率無顯著相關(guān)性(PX).05)。此外，免疫循環(huán)復(fù)合物(CIC),血沉(ESR)，白細(xì)胞和紅細(xì)胞水平在兩組間也無顯著性差異(結(jié)果未顯示)。6、抗M3型受體蛋白多肽抗體等自身抗體在干燥綜合征的敏感性和特異性的比較。表5顯示了抗M3型受體蛋白多肽抗體、SSA抗體、SSB抗體及ANA在千燥綜合征中的敏感性和特異性。SSB抗體的特異性明顯高于or胞襯蛋白多肽抗體、SSA抗體和ANA，但敏感性僅為17.9%，顯著低于cc-胞襯蛋白多肽等抗體。因此，結(jié)合敏感性和特異性，a-胞襯蛋白多肽抗體在診斷中的意義可能優(yōu)于其他自身抗體。表5自身抗體在SS中的敏感性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表<110>北京大學(xué)人民醫(yī)院<120>抗M3型受體蛋白多肽抗體測定在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用<140><141>2002-08-06<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>16(氨基酸)<213>人工序列<223>合成<400>1LysArgTrpGluValProProGlyPheCysGinPhelieGinPheLeuSerGlu權(quán)利要求1.具有膽堿能M3型受體多肽序列KRTVPPGECFIQFLSE(即Lys-Arg-Trp-Glu-Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Cys-Gln-Phe-Ile-Gln-Phe-Leu-Ser-Glu賴氨酸-精氨酸-色氨酸-纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-絲氨酸-谷氨酸)的氨基酸、多肽類似物及蛋白。2.權(quán)利要求1的膽堿能M3型受體多肽及其類似物的制備。3.權(quán)利要求l的膽堿能M3型受體多肽及其類似物在用不同檢測方法(如ELISA、Westernblot、金標(biāo)記法等)制備診斷試劑盒(IgG、IgA型等)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種M3型受體蛋白多肽及其類似物用于干燥綜合征的檢測。這種多肽抗原可特異性的結(jié)合干燥綜合征患者體內(nèi)的特異性抗體，具有很高的敏感性和特異性。文檔編號(hào)C07K7/00GK101186635SQ20071017658公開日2008年5月28日申請日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日發(fā)明者栗占國申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院