專(zhuān)利名稱(chēng)：一種熒蒽包被原fl-ova及制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬熒蒽的多克隆抗體領(lǐng)域，特別是涉及一種熒蒽包被原FL-OVA及制備和用途。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)指兩個(gè)以上苯環(huán)連在一起 的化合物，如萘、蒽、菲、熒蒽、苯并芘等。近年來(lái)，海上石油開(kāi)采，輪船運(yùn)輸、海損 溢油，工業(yè)、生活燃燒廢氣排放等使得多環(huán)芳烴等有機(jī)污染日益嚴(yán)重，大量調(diào)査研究表 明，空氣、土壤、水體及生物體等都受到了多環(huán)芳烴的污染。多環(huán)芳烴是最早發(fā)現(xiàn)且數(shù) 量最多的致癌物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致癌性多環(huán)芳烴及其衍生物已超過(guò)400種，每年排放 到大氣中的多環(huán)芳烴約幾十萬(wàn)噸，因其毒性、生物蓄積性和半揮發(fā)性以及在環(huán)境中的持 久存在，已經(jīng)受到國(guó)際科學(xué)界的廣泛關(guān)注。1976年美國(guó)環(huán)保局提出129種"優(yōu)先控制 污染物"中，多環(huán)芳烴類(lèi)化合物就有16種；歐盟最新有害物質(zhì)禁令中也列入了 16種多 環(huán)芳烴；1990年我國(guó)提出的水中優(yōu)先控制的68種污染物中，多環(huán)芳烴類(lèi)化合物就占7 種，在這些多環(huán)芳烴中檢出率最高的是苯并[b]熒蒽、熒蒽和苯并[k]熒蒽，檢出率分別 為59%, 48%和46%。
熒蒽是多環(huán)芳烴中較常見(jiàn)的物質(zhì)，存在于煤焦油的蒽油餾份中，經(jīng)分餾精制而得， 可用做非磁性金屬表面探傷熒光劑，也可用于制造合成染料和藥物等。純品熒蒽為白色 或黃綠色針狀或片狀結(jié)晶，能溶于乙醇、二硫化碳及苯等有機(jī)溶劑中。目前對(duì)熒蒽的檢 測(cè)主要采用高效液相色譜和氣相色譜等分析方法，這些方法雖然準(zhǔn)確可靠，可是由于對(duì) 樣品的預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)且需要大量有機(jī)溶劑萃取，并且在之后的檢測(cè)過(guò)程中要用到精 密昂貴的檢測(cè)儀器而不適于推廣使用，也不利于當(dāng)環(huán)境污染事故發(fā)生在野外時(shí)的現(xiàn)場(chǎng)快 速檢測(cè)。因而尋求一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法成為當(dāng)前研究的主要方 向。
20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫分析(Immmunoassay , IA)是基于抗原與抗體的 特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫反應(yīng)涉及抗原與抗體分子間的立體化學(xué)、電 荷、氫鍵和偶極間的綜合應(yīng)用，具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和高靈敏度， 非常適宜于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析。因此，免疫分析具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方 便快捷、分析容量大、檢測(cè)成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，滿(mǎn)足簡(jiǎn)單、快速、靈敏地檢測(cè)環(huán) 境激素的要求。1985年美國(guó)Cetus公司的K. B. Mullis和R. K. Saiki等發(fā)明了一種特異性DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，這個(gè)方法實(shí)質(zhì)是體外酶促合成特異性DNA片斷，又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子 克隆系統(tǒng)，將這一技術(shù)稱(chēng)為Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱(chēng)PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 1992年Sano等將免疫分析技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，新研究出來(lái)的免疫PCR技術(shù)由于兼 具了免疫分析技術(shù)特異性強(qiáng)和PCR技術(shù)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，因而將在環(huán)境微量痕量污染物 的檢測(cè)中會(huì)有很好的應(yīng)用前景。
目前尚未見(jiàn)有用免疫分析方法檢測(cè)熒蒽的報(bào)道，更沒(méi)有見(jiàn)用免疫PCR技術(shù)檢測(cè)熒蒽 的相關(guān)報(bào)道。而合格的熒蒽抗原是免疫得到合格熒蒽抗體的前提，合格的熒蒽抗體是建 立熒蒽免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵，有關(guān)熒蒽抗原抗體的制備，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種熒蒽包被原FL-OVA及制備和用途，以克服現(xiàn)有 檢測(cè)技術(shù)中對(duì)熒蒽樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，以及在檢測(cè)過(guò)程 中要用到精密昂貴的檢測(cè)儀器而不適于推廣使用和不利于當(dāng)環(huán)境污染事故發(fā)生在野外 時(shí)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等缺點(diǎn)。
技術(shù)方案 '
本發(fā)明的一種熒蒽包被原FL-OVA,其結(jié)構(gòu)式如下-
其中OVA是卵清蛋白。 本發(fā)明的一種熒蒽包被原FL-0VA的制備，采用混合酸酐法合成熒蒽人工包被原，其 反應(yīng)方程式如下
<formula>complex formula see original document page 5</formula><formula>complex formula see original document page 6</formula>
本發(fā)明的一種熒蒽包被原FL-OVA的制備方法，包括以下步驟
(1)熒蒽半抗原的合成將丁二酸酐、熒蒽、無(wú)水三氯化鋁三者按摩爾比1:1:2.2 投料，并溶解于硝基苯中，得到無(wú)色溶液，冰浴下攪拌反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在0-4'C冰浴下 進(jìn)行7-8小時(shí)后，加入稀鹽酸終止反應(yīng)；將燒瓶中的液體倒出，加稀鹽酸水解，分離出 的有機(jī)層用大量稀鹽酸水洗后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯，得到黃色固體粉末；在甲醇-乙
醚中重結(jié)晶獲得黃色晶體狀的熒蒽半抗原，干燥后得純品。
(2)熒蒽人工包被原的合成取一定量溶有熒蒽半抗原的有機(jī)溶劑，依次加入正丁 胺與氯甲酸異丁酯，室溫或4'C下攪拌反應(yīng)2-4小時(shí)；將上述反應(yīng)液逐滴滴入用PBS溶 解的蛋白質(zhì)溶液中，4'C反應(yīng)l-4小時(shí)，其中所述的半抗原、正丁胺、氯甲酸異丁酯、 蛋白質(zhì)四者摩爾比為1:1-4:1-3:0.005-0.05;反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用蒸餾 水或pH6. 8-7. 4 PBS緩沖溶液或0. 9%的生理鹽水透析5d;透析后離心分出上清液，即 得免疫原FL-OVA偶聯(lián)物，經(jīng)過(guò)柱提純后，加入等量甘油-2(TC下凍干保存。
所述步驟(1)中的熒蒽的分子結(jié)構(gòu)式為<formula>complex formula see original document page 6</formula>
所述步驟(1)中的熒蒽半抗原的化學(xué)名稱(chēng)為熒蒽丁酸-Y-氧，分子量是302，分 子結(jié)構(gòu)式如下<formula>complex formula see original document page 6</formula>
所述步驟(2)中的有機(jī)溶劑是N' N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO)e
本發(fā)明的一種的熒蒽包被原FL-OVA的用途，利用上述方法合成的熒蒽人工包被原,
通過(guò)免疫動(dòng)物制備成熒蒽特異性抗體，它是能與熒蒽發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白 IgG，可用于檢測(cè)水體、土壤及大氣中的痕量的熒蒽，便于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。
由于熒蒽是小分子物質(zhì)，只具有免疫反應(yīng)性而不具有免疫原性，而且該分子上沒(méi)有 能與蛋白質(zhì)分子直接結(jié)合的氨基，羥基，羧基等基團(tuán)，故本發(fā)明先通過(guò)Friedel-Crafts ?；磻?yīng)使熒蒽分子帶上一個(gè)四個(gè)碳鏈長(zhǎng)的羧基，然后用活化酯法和混合酸酐法將這 個(gè)含羧基的半抗原分子與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)制備出熒蒽的人工抗原，再利用此抗原對(duì)新西 蘭大白兔進(jìn)行免疫，獲得對(duì)應(yīng)的高效價(jià)、高特異性的的熒蒽多克隆抗體，此抗體將應(yīng)用 于建立免疫PCR分析方法以檢測(cè)環(huán)境中熒蒽。 有益效果
本發(fā)明所制備的熒蒽特異性抗體具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1) 實(shí)用性強(qiáng)熒蒽的多克隆抗體制備技術(shù)具有重要的使用價(jià)值和實(shí)際意義，制備 的抗體特異性好、效價(jià)高，以抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)可用于樣品測(cè)定；此抗體及其 制備方法為免疫PCR法測(cè)定環(huán)境中痕量的熒蒽提供保障，也為多環(huán)芳烴熒蒽快速檢測(cè)試 劑盒的研制解決了一大技術(shù)難點(diǎn)。
(2) 穩(wěn)定性好本發(fā)明制備的熒蒽抗體具有較好的穩(wěn)定性。
(3) 抗體制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行抗體整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需特殊儀器設(shè)備，成本低廉，容 易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是熒蒽人工包被原的紫外光譜圖
其中OVA為卵清蛋白，F(xiàn)L為熒蒽半抗原，F(xiàn)L-OVA為熒蒽人工包被原。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū) 所限定的范圍。
實(shí)施例1
(1)熒蒽半抗原的合成
稱(chēng)取1.0g (lOmmol) 丁二酸酐溶于30mL的硝基苯中，得到無(wú)色溶液，另稱(chēng)取3 g (22 mmol)無(wú)水三氯化鋁和2. 02 g (10 ramol)的熒蒽置于裝有20 mL硝基苯的三口 燒瓶中，冰浴下攪拌溶解，得到血紅色的絡(luò)合物溶液，將丁二酸酐溶液用滴液漏斗慢慢滴加入上述絡(luò)合物溶液中，30 min內(nèi)加入完畢；反應(yīng)液顏色逐漸變成棕褐色，整個(gè)反 應(yīng)在0-4'C冰浴下進(jìn)行8小時(shí)后，加入稀鹽酸終止反應(yīng)，將燒瓶中的液體倒出；加稀鹽 酸水解，分離出的有機(jī)層用大量稀鹽酸水洗后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯得到黃色固體粉末; 在甲醇-乙醚中重結(jié)晶獲得黃色晶體狀的熒蒽半抗原，熔點(diǎn)為196-200°C。
(2) 熒蒽半抗原的鑒定
取上述合成的熒蒽半抗原少許，用溴化鉀壓片后紅外光譜掃描，結(jié)果如下[" (cnf1)]: 2660 (w 0-H)， 1710(s C=0) ， 1610， 1490， 1430(s C=C)， 812(s Ar-H)。 與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的熒蒽的紅外光譜比較，半抗原的紅外光譜圖中有明顯的羰基(-C00H)吸 收峰，說(shuō)明熒蒽分子上已經(jīng)引入了羧基，它可以與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)。
將熒蒽半抗原用二甲亞砜(DMSO)溶解，測(cè)定樣品的核磁共振氫譜('HNMR),結(jié) 果如下(S，DMS0):2.66(t， 2H， CH2—H) ， 3.40(t， 2H， CH2-H) ， 7.44-8.72(m， 9H， Ar-H)， 12.18(s， 1H， C00H-H)，氫譜鑒定的結(jié)果表示在熒蒽分子結(jié)構(gòu)中成功引入了羧基，可 與蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成人工抗原。
熒蒽半抗原的質(zhì)譜峰(MS, 70ev) m/z出現(xiàn)在302 (59 M+) 229 (100)， 201 (44), 100 (25)處，也與目的產(chǎn)物半抗原結(jié)構(gòu)相符合。
(3) 熒蒽包被原的合成
稱(chēng)取步驟(1)中所合成的熒蒽半抗原60.4 mg (0.2 mmol)置于潔凈干燥的小錐 形瓶中，加入200 nL DMF溶解，依次加入等摩爾20叱(0.2 mmol)正丁胺與25叱 (0.2 mmol)氯甲酸異丁酯，4。C磁力攪拌反應(yīng)2 h;稱(chēng)取60 mg OVA溶于5 mL CBS， 將上述反應(yīng)液200 uL慢慢滴入小錐形瓶中，4 。C反應(yīng)4h;反應(yīng)完畢，用蒸餾水透析 2 d，生理鹽水透析3 d,離心分出上清液，即得到熒蒽人工全抗原FL-OVA;加入等量 的甘油-2(TC下保存，或-2(TC凍干保存。
(4) 熒蒽包被原的鑒定 常用的鑒定人工包被原結(jié)合比的方法是紫外光譜法，按常規(guī)來(lái)說(shuō)，只要人工包被原
的紫外光譜圖與原蛋白載體和半抗原的紫外圖譜相比發(fā)生了變化，即可間接說(shuō)明人工包 被原成功合成。
由紫外光譜圖可知，半抗原熒蒽FL在298 nm處有特征吸收峰，蛋白質(zhì)0VA在278 nm處有最大吸收峰，而所合成的熒蒽包被原FL-OVA的特征吸收峰在280 nm處，與蛋 白質(zhì)OVA和半抗原FL比較都發(fā)生了移動(dòng)，具備有半抗原和蛋白質(zhì)的吸收特征。
根據(jù)朗伯-比爾定律，波長(zhǎng)一定時(shí)混合物的紫外吸收具有加合性。采用全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)對(duì)半抗原、載體蛋白及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，根據(jù)吸收峰可確定偶聯(lián)是否成功。 結(jié)合比計(jì)算公式如下
<formula>complex formula see original document page 9</formula>
計(jì)算合成的熒蒽包被原的結(jié)合比分別為12.8，該結(jié)合比值在文獻(xiàn)所建議的范圍之 內(nèi)，證明合成的熒蒽包被原比較理想。
實(shí)施例2
(1) 熒蒽抗血清的制備
制備成年的雄性新西蘭白每組三只(編號(hào)I、 n和m)，體重約2-2.5Kg，飼養(yǎng)于 標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房(由上海松江農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)校動(dòng)物房詞養(yǎng))，每只兔子單籠飼養(yǎng)，觀 察一周后免疫。
將實(shí)施例1中所合成的熒蒽包被原慢慢解凍，用0.9%生理鹽水或PBS稀釋至 lmg/mL，按免疫劑量吸入5mL消毒注射器中，首次免疫加入等量弗氏完全佐劑(CFA)， 用聚氟乙烯塑膠管連接另一支5mL注射器，對(duì)推至充分乳化，形成油包水(W/0)狀態(tài)， 按免疫方案注射免疫。
首次注射免疫采用由等量弗氏完全佐劑乳化的免疫原，于兔頸部皮下多點(diǎn)注射免 疫。首次注射免疫后，間隔四周，以后每隔兩周用由弗氏不完全佐劑乳化的免疫原，于 兔背部、頸下多點(diǎn)及腿部肌肉注射加強(qiáng)免疫，免疫劑量為每公斤兔體重2mg。從第三次 開(kāi)始，每次免疫后7天，于兔耳緣靜脈采lmL血，分離血清，測(cè)定抗體效價(jià)；當(dāng)達(dá)到一 定效價(jià)后，采全血。本試驗(yàn)采用兔頸動(dòng)脈采血法，每只兔子可采血約60mL左右，采血 后，收集在100mL的三角燒瓶中，待血液凝固后，用針頭將三角燒瓶邊緣的血塊與三角 燒瓶分離，置于37。C培養(yǎng)箱中30min;再放于4'C冰箱中3-4小時(shí)，等血塊收縮后，用 吸管將血清吸入離心管中，以4000rpm離心15min，分離出血清，于-2(TC保存；I號(hào) 兔得血清23mL， n號(hào)兔得血清23mL， III號(hào)兔得血清23mL。
(2) 熒蒽抗體效價(jià)的測(cè)定 將免疫原按制定的免疫方案免疫3只兔子，從加強(qiáng)免疫第三次開(kāi)始，在每次免疫后
第七天于兔耳緣靜脈采lmL血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用試管凝集法、瓊脂雙向擴(kuò)散法和 熒光免疫法測(cè)定抗體效價(jià)；待第五次免疫，有兔子獲得了較高的效價(jià)，試管凝集實(shí)驗(yàn)測(cè) 得的效價(jià)分別為1:320， 1:640， 1:640;瓊脂雙向擴(kuò)散法測(cè)得的效價(jià)分別為1:32， 1:64， 1:64;熒光免疫法測(cè)得效價(jià)分別是1:25600， 1:51200， 1:51200。
(3)熒蒽抗體的純化和鑒定
熒蒽抗體的純化采用辛酸一飽和硫酸銨二步鹽析法(辛酸在偏酸性的條件下能將血 清中除免疫球蛋白IgG外的蛋白質(zhì)都沉淀下來(lái)，上清液中只有IgG)，經(jīng)葡聚糖凝膠柱 除鹽和二乙基氨基乙基纖維素柱反相吸附純化血清，純化熒蒽抗體凍干后于-2(TC保存。
權(quán)利要求
1.一種熒蒽包被原FL-OVA，其結(jié)構(gòu)式如下其中OVA是卵清蛋白。
2. —種熒蒽包被原FL-OVA的制備方法，包括以下步驟(1)熒蒽半抗原的合成將丁二酸酐、熒蒽、無(wú)水三氯化鋁按摩爾比1:1:2. 2投料, 并溶解于硝基苯中，得到無(wú)色溶液，冰浴下攪拌反應(yīng)，在0-4'C冰浴下，7-8小時(shí)，加 入稀鹽酸終止反應(yīng)；將燒瓶中的液體倒出，加稀鹽酸水解，分離出的有機(jī)層用大量稀鹽 酸水洗后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯，得到黃色固體粉末；在甲醇-乙醚中重結(jié)晶獲得黃色 晶體狀的熒蒽半抗原，干燥后得純品。(2)熒蒽人工包被原的合成取溶有熒蒽半抗原的有機(jī)溶劑，依次加入正丁胺與氯 甲酸異丁酯，室溫或4'C下攪拌反應(yīng)2-4小時(shí)；將上述反應(yīng)液逐滴滴入用PBS溶解的蛋 白質(zhì)溶液中，4'C反應(yīng)1-4小時(shí)，反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用蒸餾水或pH6.8-7.4 PBS緩沖溶液或0.9X的生理鹽水透析5d;透析后離心分出上清液，即得免疫原FL-OVA 偶聯(lián)物，經(jīng)過(guò)柱提純后，加入等量甘油-2(TC下凍干保存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒蒽包被原FL-OVA的制備方法，其特征在于，所述步驟 (1)中的熒蒽的分子結(jié)構(gòu)式為
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒蒽包被原FL-0VA的制備方法，其特征在于，所述步驟 (1)中的熒蒽半抗原的化學(xué)名稱(chēng)為熒蒽丁酸-Y-氧，分子量為302，分子結(jié)構(gòu)式如下:
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒蒽包被原FL-0VA的制備方法，其特征在于，所述步驟 (2)中的有機(jī)溶劑是N' N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMS0)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒蒽包被原FL-OVA的制備方法，其特征在于，所述步驟 (2)中所述的半抗原、正丁胺、氯甲酸異丁酯、蛋白質(zhì)摩爾比1:1-4:1-3:0.005-0.05。
7. —種熒蒽包被原FL-OVA的用途，通過(guò)免疫動(dòng)物制備成熒蒽特異性抗體，能與熒蒽發(fā) 生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白IgG，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體、土壤及大氣中的痕量的熒蒽。<formula>complex formula see original document page 3</formula>
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒蒽包被原FL-OVA及制備和應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)式如下，制備包括(1)將丁二酸酐、熒蒽、無(wú)水三氯化鋁按摩爾比1∶1∶2.2投料，溶解于硝基苯中，冰浴反應(yīng)，加入稀鹽酸終止，分離出的有機(jī)層用稀鹽酸水洗后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯，重結(jié)晶干燥。(2)取溶有熒蒽半抗原的有機(jī)溶劑，依次加入正丁胺與氯甲酸異丁酯，室溫或4℃下攪拌反應(yīng)2-4小時(shí)；將上述反應(yīng)液逐滴滴入用PBS溶解的蛋白質(zhì)溶液中，4℃反應(yīng)1-4小時(shí)，透析后離心分出上清液，即得免疫原FL-OVA偶聯(lián)物，柱提純，加入等量甘油-20℃下凍干保存。本發(fā)明制備簡(jiǎn)便，成本低，容易工業(yè)化生產(chǎn)；熒蒽人工包被原，通過(guò)免疫動(dòng)物制備成熒蒽特異性抗體，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體、土壤及大氣中痕量的熒蒽。
文檔編號(hào)C07K14/77GK101195658SQ20071017088
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者純 周, 莊惠生 申請(qǐng)人:東華大學(xué)