專利名稱：一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能工業(yè)化地從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的工藝方法。
背景技術(shù)：
桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.、素花黨參 Codonopsis pilosula Nannf.var. modesta (Nannf.) L. T. Shen或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根為歷版藥典收載品種。因產(chǎn)地、種類不同而有多種商品, 比如潞黨參、臺黨參、東黨參及文黨參等，都具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺等功效，他 們都共同含有其活性成分黨參炔苷，2005版藥典已經(jīng)由黨參多糖作為特征成分 改為采用黨參炔苷作為薄層鑒定的特征成分，為了更好地控制黨參的內(nèi)在質(zhì)量， 對黨參炔苷的需求將會越來越大，而目前市場上僅有少數(shù)幾家提供毫克級量的廠 家。目前文獻(xiàn)報道的黨參炔苷的含量很低，為萬分之三到千分之一，且黨參炔苷 不穩(wěn)定，見光受熱易分解。目前文獻(xiàn)報道(賀慶等人)的黨參炔苷的方法為分 部位萃取后反復(fù)柱層析，包括硅膠柱層析和葡聚糖層析等，此方法耗時長，溶劑 消耗大，回收溶劑繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能中藥材黨參中工業(yè)化地、快速地、低成本地分離高 純度黨參炔苷單體的方法。
完成本發(fā)明的任務(wù)包括如下步驟
一種從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25X:—58'C條件 下，最好是在55'C條件下進(jìn)行以下步驟
A.冷浸提取:用黨參干燥塊根粉與乙醇或甲醇混合浸泡24小時一36小時， 冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇或甲醇獲得濃浸膏；混合比例是黨
參體積與乙醇或甲醇體積比為1: 3;乙醇濃度為95%—100%，甲醇濃度為100%。 B.樹脂粗分用水稀釋上步所得濃浸膏作為樣品，在大孔樹脂上樣之前， 用200目左右的細(xì)紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質(zhì)，再上樣到經(jīng)過活化處理的
大孔吸附樹脂柱，用50%--70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除去乙醇；大孔吸附樹選用D131或者D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星樹 脂有限公司提供的D131或者D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至 幾乎沒有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質(zhì)，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇洗脫，進(jìn)一步除去雜質(zhì)而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用50%—70% 乙醇洗脫，黨參炔苷主要集中在50%—70%乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品， 純度為60%左右，見圖l。這種三步法洗脫使其能保證大部分極性比黨參炔苷大 的雜質(zhì)被除去，大大提高了提取物中的黨參炔苷的含量，這是本發(fā)明的要點(diǎn)之一。
C. 色譜分離用丙酮溶解C18 (十八烷基鍵合硅膠，購自日本Fuji公司) 填料攪拌均勻使其成勻漿狀后，采用動態(tài)軸向壓縮法裝柱，柱規(guī)格為 25cm*5cm—25cm*30cm。將黨參炔苷粗品用乙腈-水的流動相稀釋后進(jìn)樣， 一次制 備色譜分離循環(huán)大約持續(xù)30min，分段收集流出液即流分,用分析型高效液相色 譜儀對各餾分進(jìn)行純度檢測，純度為98%以上的流分為本步驟的合格品，純度低 于95%的流分重復(fù)上述步驟，純度98%以上的流分回收產(chǎn)品后，得到黃色油狀物， 然后進(jìn)入下一個步驟。
本步驟中，乙腈-水的流動相中乙腈占水的體積比例為15%-30%，高壓輸液 泵和UV (紫外-可見光)檢測器由北京創(chuàng)新通恒科技有限公司和成都普思生物科 技有限公司聯(lián)合提供。檢測波長為267nm，流速為250ml/min，進(jìn)樣量為50ml， 色譜柱為成都普思生物科技有限公司自主研制，C18反相填料裝柱，C18粒徑為 10nm-25iim，孔徑為100 A。
本步驟的樣品回收方法由于流動相中含大量水，在55'C的溫度下很難濃 縮除去水。所以濃縮過程采取減壓回收乙腈后，用D101大孔吸附樹脂富集，用 95%的乙醇洗脫，減壓回收乙醇的方法，可以快速地，且保證黨參炔苷不會因?yàn)?溫度過高和長久受熱而分解。制備分離的在線監(jiān)測圖譜見圖2。
D. 脫色純化將純度達(dá)98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚酰胺樹脂 后，用水洗脫聚酰胺樹脂得水洗脫液；為回收產(chǎn)品，將水洗脫液加入大孔吸附樹 脂，再用95%的乙醇洗脫大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最
后得到純度高達(dá)98.5%以上的黨參炔苷產(chǎn)品。聚酰胺樹脂可選上海摩速科學(xué)器材 有限公司的120目的聚酰胺樹脂。見圖3。


圖1是D101大孔吸附樹脂粗分后的HPLC圖譜； 圖2是制備型液相色譜分離黨參炔苷的在線監(jiān)測圖譜； 圖3是黨參炔苷純品的HPLC圖譜。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、B.樹脂粗分步驟中，三步法洗脫使其能保證大部分極性比黨參炔苷大的 雜質(zhì)被除去，大大提高了提取物中的黨參炔苷的含量，這是本發(fā)明的要點(diǎn)之一。
2、 能工業(yè)化的大量分離獲得黨參炔苷產(chǎn)品傳統(tǒng)用直徑5cm的硅膠柱分離 一次分離量小，僅為10mg左右，分離效率低，本方法用制備型高效液相色譜分離， 一次可上樣500mg以上,故可以工業(yè)化生產(chǎn)分離獲得黨參炔苷產(chǎn)品。
3、 得率高100kg黨參原藥材含黨參炔苷50g左右，本技術(shù)最后可得到黨參 炔苷純品45g，得率達(dá)到卯％以上。
3、 產(chǎn)品純度高，純度可達(dá)98.5%以上，為黨參炔苷的含量檢測和黨參的質(zhì)量 控制打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
4、 溶劑消耗少，可回收利用采用常規(guī)方法的溶劑用量大，且用氯仿-甲醇, 氯仿-甲醇-水等的混合體系，回收步驟繁瑣，本方法主要用乙腈-水的體系，乙腈 能有效回收再利用。
5、 成本低本發(fā)明需消耗材料包括黨參原藥材，溶劑(乙醇、乙腈、水等)， 而現(xiàn)有的常規(guī)方法方法分離需消耗黨參原藥材，溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇、氯仿、甲醇、水等)、聚酰胺等?？梢姳景l(fā)明工藝步驟簡潔，傳統(tǒng)的方法經(jīng)歷 了萃取，硅膠柱層析，葡聚糖層析，ODS(反相硅膠)層析等步驟，消耗大量溶劑成 本和人力成本，而本方法僅經(jīng)過大孔樹脂粗分，制備型高效液相色譜分離和聚酰 胺脫色三個步驟，耗費(fèi)溶劑和人力成本都少，工藝周期短。
6、具有較高的學(xué)術(shù)價值:本發(fā)明用制備型高效液相色譜為主要設(shè)備進(jìn)行分離，
制備高效液相在國內(nèi)外天然產(chǎn)物的分離純化中應(yīng)用得越來越廣，對普及這一先進(jìn) 的技術(shù)是一種強(qiáng)有力的推動，而現(xiàn)有技術(shù)分部位萃取后反復(fù)柱層析，包括硅膠柱 層析和葡聚糖層析等。
具體實(shí)施例
實(shí)例1
一種從山西產(chǎn)黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在55'C條件 下進(jìn)行以下步驟
A.冷浸提取用黨參干燥塊根粉碎過60目篩后與乙醇混合浸泡24小時小 時，冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參 粉體積與乙醇或甲醇體積比為1: 3。乙醇濃度為95%。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏后，在上大孔樹脂之前，用200目左右 的細(xì)紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質(zhì)，再通入經(jīng)過活化處理的大孔吸附樹脂柱， 用50%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃浸膏用 水稀釋倍數(shù)以2倍水為宜，大孔吸附樹選用D131大孔吸附樹脂，用安徽三星樹 脂有限公司提供的D131大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒有 顏色，除去大部分多糖等大極性雜質(zhì)，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進(jìn)一步除去雜質(zhì)而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用50%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。
大孔吸附樹脂活化處理的方法為在層析柱中加入高于樹脂層10 CM的乙 醇浸漬4小時，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁時為止。 最后用水反復(fù)洗滌至乙醇含量小于1%或無明顯乙醇?xì)馕逗蠹纯伞?br> C. 色譜分離用丙酮溶解C18 (十八烷基鍵合硅膠，購自曰本Fuji公司) 填料攪拌均勻使其成勻漿狀后，采用動態(tài)軸向壓縮法裝柱，柱規(guī)格為25Cm*5cm。 將黨參炔苷粗品用乙腈-水的流動相稀釋后進(jìn)樣，主峰出峰時間為25.66min，從 25.00min開始，至25.86min以及29.08min以后，分為前段，中段，后段三個 部分分別收集流出液，由于前段和后段流出液的黨參炔苷粗品(HPLC)達(dá)不到 純度為98%，則將前段和后段流出液再次進(jìn)樣。中段黨參炔苷粗品(HPLC) — 般能到達(dá)到純度為98%，所以將中段流出液分別減壓濃縮，得到黃色油狀物，含 黨參炔苷粗品(HPLC)達(dá)到純度為98%的濃縮收集液才進(jìn)行下述步驟。
本步驟中，乙腈-水的流動相中乙腈占水的體積比例為15%，高壓輸液泵和 UV (紫外-可見光)檢測器由北京創(chuàng)新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有 限公司聯(lián)合提供。檢測波長為267nm，流速為250ml/min，進(jìn)樣量為50ml，色譜柱為成都普思生物科技有限公司自主研制，C18小顆粒球形反相硅膠裝柱，C18 粒徑為10um-30um,孔徑為100A。
本步驟的產(chǎn)品濃縮方法由于流動相中含大量水，在55'C的溫度下很難濃 縮除去水。所以去水濃縮過程采取回收乙腈后，用D101大孔吸附樹脂富集，用 95。％的乙醇洗脫，減壓回收乙醇的方法，可以快速地濃縮，且保證黨參炔苷不會 因?yàn)闇囟冗^高和長久受熱而分解。制備色譜的分析圖譜見圖2。
D.脫色純化將純度達(dá)98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚酰胺樹脂 后，用水洗脫聚酰胺樹脂；洗脫液用D101大孔樹脂富集，再用95%的乙醇洗脫 大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最后得到高純度達(dá)到98.5%的 黨參炔苷產(chǎn)品。聚酰胺樹脂可選上海摩速科學(xué)器材有限公司的120目的聚酰胺樹 脂。見圖3。 實(shí)例2
一種從山西產(chǎn)黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25'C條件 下進(jìn)行以下步驟
A.冷浸提取用黨參干燥塊根粉與乙醇混合浸泡36小時，冷浸過濾除渣， 所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇體積比 為h 3;乙醇濃度為100%，黨參干燥塊根粉的粒度為40目。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏后，在上大孔樹脂之前，用200目左右 的細(xì)紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質(zhì)，再通入經(jīng)過活化處理的大孔吸附樹脂柱， 用60%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇；濃浸膏用 水稀釋倍數(shù)以3倍水為宜，大孔吸附樹選用D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星 樹脂有限公司提供的D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒 有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質(zhì)，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進(jìn)一步除去雜質(zhì)而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用60%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。
大孔吸附樹脂活化處理的方法同于實(shí)例1。
C. 色譜分離本步驟所有步驟和材料同于實(shí)例l，僅乙腈-水的流動相中乙 腈占水的體積比例為30%。
D. 脫色純化將純度達(dá)98%以上的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚酰胺樹脂 后，用水洗脫聚酰胺樹脂得水洗脫液，洗脫液用D101大孔樹脂富集，再用95% 的乙醇洗脫大孔吸附樹脂上的黨參炔苷，減壓回收除去乙醇，最后得到高純度達(dá) 到98.5%的黨參炔苷產(chǎn)品。聚酰胺樹脂可選上海摩速科學(xué)器材有限公司的120目 的聚酰胺樹脂。見圖3。 實(shí)例3
一種從山西產(chǎn)黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在58'C條件
下進(jìn)行以下步驟
A.冷浸提取用黨參干燥塊根粉與乙醇混合浸泡30小時，冷浸過濾除渣， 所得液體用減壓回收除去乙醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇體積比
為l: 3;乙醇濃度為100%，黨參干燥塊根粉的粒度為100目。
B. 樹脂粗分用水稀釋上步濃浸膏后，在上大孔樹脂之前，用200目左右
的細(xì)紗布過濾，以除去沙塵等固體雜質(zhì)，再通入經(jīng)過活化處理的大孔吸附樹脂柱，
用70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇；濃浸膏用 水稀釋倍數(shù)以3倍水為宜，大孔吸附樹選用D101大孔吸附樹脂，可用安徽三星
樹脂有限公司提供的D101大孔吸附樹脂。洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒
有顏色，除去大部分多糖等大極性雜質(zhì)，第二步用兩個柱體積的(2BV) 30%乙醇 洗脫，進(jìn)一步除去雜質(zhì)而使黨參炔苷保留在樹脂上，第三步用70%乙醇洗脫，黨 參炔苷主要集中在這部分乙醇洗脫液中，得到黨參炔苷粗品，純度為60%左右。 大孔吸附樹脂活化處理的方法同于實(shí)例1。
C. 色譜分離本步驟所有步驟和材料同于實(shí)例l，僅乙腈-水的流動相中乙 腈占水的體積比例為20%。
D. 脫色純化本步驟所有步驟和材料同于實(shí)例1，所得黨參炔苷精品純度 為98. 5%。
實(shí)例4、所有步驟和材料同于實(shí)例1，僅是A.冷浸提取中，用100%濃度的 甲醇代替95%濃度的乙醇。
實(shí)例5、所有步驟和材料同于實(shí)例2，僅是A.冷浸提取中，用100%濃度的 甲醇代替100%濃度的乙醇。
權(quán)利要求
1.一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在25℃--58℃條件下進(jìn)行以下步驟A.冷浸提取用黨參干燥塊根粉與乙醇或甲醇混合浸泡24小時-36小時，冷浸過濾除渣，所得液體用減壓回收除去乙醇或甲醇獲得濃浸膏；混合比例是黨參粉體積與乙醇或甲醇體積比為1∶3；乙醇濃度為95％--100％，甲醇濃度為100％；B.樹脂粗分用水稀釋A步驟所得的濃浸膏后，上樣進(jìn)入經(jīng)過活化處理的大孔吸附樹脂柱，用50％--70％乙醇洗脫大孔吸附樹脂，將乙醇洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到黨參炔苷粗品；C.色譜分離將B步驟黨參炔苷粗品用乙腈-水作流動相稀釋后，進(jìn)樣，分段收集制備色譜儀流出的液體；將純度能達(dá)到98％的流出液體即流分濃縮后進(jìn)行下述D步驟；將純度沒有達(dá)到98％的流分重復(fù)本步驟；乙腈-水的流動相中乙腈占水的體積比例為15％-30％；D.脫色純化將上步驟達(dá)98％純度的黃色油狀黨參炔苷浸膏加入聚酰胺樹脂后，用水洗脫聚酰胺樹脂得水洗脫液；濃縮水洗脫液的水，最后得到98.5％高純度的黨參炔苷產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在 B樹脂粗分步驟中，洗脫分三步第一步用水洗至幾乎沒有顏色，除去大部 分多糖等大極性雜質(zhì)，第二步用30%乙醇洗脫，進(jìn)一步除去雜質(zhì)而使黨參炔 苷保留在樹脂上，第三步用50%--70%乙醇洗脫，黨參炔苷主要集中在 50%—70%乙醇洗脫液中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，在 B步驟中，大孔吸附樹脂是D131或者D101型大孔吸附樹脂。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，其 特征在于在C步驟中，色譜柱裝填的填料用C18 (十八烷基鍵合硅膠)球 形反相填料裝柱，粒徑為10pm-25um,孔徑為100 A，用丙酮稀釋為勻漿后 采用動態(tài)軸向壓縮法裝柱。色譜柱規(guī)格為25cm*5cm-25cm*30cm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，其 特征在于在D.脫色純化步驟中，所用聚酰胺為120目。 6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藥材黨參中快速分離純化黨參炔苷單體的方法，C和D步驟濃縮產(chǎn)品的方法為減壓回收乙腈后，用D101樹脂富集和用95%的乙醇洗脫后，濃縮除去乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從黨參藥材中快速分離純化黨參炔苷單體的方法。它包括四步驟，1.冷浸提取乙醇或甲醇冷浸；2.樹脂粗分上樣進(jìn)入經(jīng)過活化處理的大孔吸附樹脂柱，用水、30％乙醇、50％-70％乙醇分三步分別洗脫吸附有黨參炔苷的大孔樹脂；3.色譜分離用乙腈-水的流動相稀釋樣品后，進(jìn)樣，分段收集流出液；4.脫色純化上樣到聚酰胺樹脂中，濃縮水洗脫液，回收得98.5％高純度的黨參炔苷產(chǎn)品。本方法簡單快速，溶劑消耗少，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，且得率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和學(xué)術(shù)價值。
文檔編號C07H15/203GK101177440SQ20071005022
公開日2008年5月14日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者丁 劉, 黎 張, 兵 楊, 董維珍 申請人:成都普思生物科技有限公司