專利名稱：：用微生物純化粗萘二甲酸的方法和用該方法得到的結(jié)晶形式的2,6-萘二甲酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用微生物純化粗萘二曱酸的方法，以及通過此方法產(chǎn)生的結(jié)晶形式的2,6-萘二曱酸。更具體地，本發(fā)明涉及一種純化粗萘二曱酸的方法，通過使具有將2-甲酰基-6-萘?xí)跛徂D(zhuǎn)化為2,6-萘二曱酸的能力的微生物與粗萘二曱酸反應(yīng)以去除作為雜質(zhì)含在粗萘二曱酸中的2-曱?；?6-萘?xí)跛?，在特殊條件下向反應(yīng)液中添加酸性溶液，攪拌混合溶液使粗萘二曱酸結(jié)晶，洗滌結(jié)晶的粗萘二曱酸以去除其他包含在結(jié)晶的粗萘二曱酸中的雜質(zhì)，并且干燥洗滌過的產(chǎn)物從而得到純結(jié)晶形式的2,6-萘二曱酸。
背景技術(shù)：
：2,6-萘二曱酸(NDA)及其二酯(如2，6-萘二曱酸酯(NDC))是制備多種聚合材料(如聚酯和聚酰胺)的有用的單體。例如，NDA和NDC能與乙二醇縮合形成高性能聚酯材料聚2,6-萘二曱酸乙二酯(PEN)。由PEN制成的纖維和薄膜與由聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)制成的那些相比顯示出高強(qiáng)度和優(yōu)越的熱性能?；谶@些優(yōu)勢(shì)，PEN非常適用于商業(yè)制品(如能夠用于制造磁性錄音帶和電子元件的薄膜)的生產(chǎn)。另外，由于PEN的高抗氣體(特別是二氧化碳、氧氣和水蒸氣)擴(kuò)散性，由PEN制成的薄膜能用于制造食品容器，特別是熱裝食品容器。PEN還能用于生產(chǎn)可用于輪胎簾布的制造的增強(qiáng)纖維。NDC通常通過氧化^6-二甲基萘。^-DMN)以得到粗萘二甲酸(cNDA)并且使cNDA酯化來生成。目前，NDC用作合成PEN的主要原料。然而，當(dāng)NDC用作合成PEN的原料時(shí)，相比于應(yīng)用2,6-萘二曱酸(NDA)時(shí)，存在一些問題。首先，在NDA的縮合期間，形成副產(chǎn)物水，而在NDC的情況下形成副產(chǎn)物曱醇，因而有爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。其次，由于純NDC通過NDA的酯化和酯化產(chǎn)物的純化生成，相比于應(yīng)用NDA,包括一個(gè)額外的工序。第三，考慮到現(xiàn)有的PET生產(chǎn)設(shè)備的應(yīng)用，NDC的應(yīng)用是不適合的。盡管有這些與NDC的應(yīng)用相關(guān)的問題，NDC還是優(yōu)選用于生產(chǎn)PEN，因?yàn)樯a(chǎn)具有合成PEN所需的純度的純化的NDA更加困難。氧化2,6-二曱基萘(2,6-DMN)形成含有多種雜質(zhì)(如2-曱酰基一6-萘?xí)跛?FNA)、2-萘?xí)跛?NA)和偏苯三酸)的cNDA。特別地，在cNDA中FNA的存在會(huì)使用于產(chǎn)生PEN的聚合終止，導(dǎo)致低聚合度。此低聚合度不利地影響最終聚合物(即PEN)的物理性質(zhì)，并且導(dǎo)致聚酯的著色。因而去除存在于cNDA中的FNA是必要的，但是去除FNA存在困難。在這些情況下，已經(jīng)進(jìn)行了有關(guān)用于去除存在于cNDA中的FNA或純化NDA的各種化學(xué)方法的研究。例如，通過以下步驟來產(chǎn)生NDA:i)重結(jié)晶cNDA,ii)多次氧化cNDA,或iii)用曱醇處理cNDA以產(chǎn)生NDC并水解NDC。另夕卜，通過cNDA的氬化產(chǎn)生純化的NDA。除了這些化學(xué)方法外，如溶劑處理、熔融/結(jié)晶、高壓結(jié)晶和超臨界萃取等的許多方法已被用于純化NDA。例如，美國專利No.5,859,294公開了一種方法，用于萘二曱酸的生成，其包含將粗萘二曱酸溶于含有脂肪族胺或脂環(huán)族胺的水溶液中，去除作為雜質(zhì)的重金屬成分直到重金屬成分的含量基于粗萘二甲酸為100ppm或更低，和加熱含有萘二曱酸胺鹽的水溶液以通過蒸餾掉胺提供高純度的萘二曱酸。美國專利No.6,255,525公開了一種方法，用于制備具有改善的純度的芳香性羧酸，包括以下步驟在77~121kg/cm2的壓力和277~316。C的溫度下，在氫氣存在下，將包含不純的芳香性羧酸和水的混合物與不含氫化金屬成分的碳催化劑接觸；冷卻混合物形成結(jié)晶的芳香性羧酸；和從冷卻的混合物中去除結(jié)晶的芳香性羧酸。關(guān)于NDA的結(jié)晶反應(yīng)，美國專利No.6,087,531教示了一種用于回收萘二甲酸(NDA)晶體的方法，該方法包含以下步驟在125~40(TC下，在堿性水溶液(如堿金屬堿的水溶液、氬氧化物水溶液或堿金屬碳酸鹽的水溶液)中溶解聚萘二曱酸亞烷基二酯；在170-240。C下用酸中和水溶液；并回收NDA。例如，通過以下步驟回收NDA晶體在125~400。C下，將聚酯材料溶解于NaOH或KOH溶液中，用醋酸中和水溶液，并且回收NDA。美國專利No.6,426,431教示了一種將2，6-NDA純化產(chǎn)率提高了高達(dá)45%的方法，該方法包含在0~200psi的C02壓力和0~50°C的溫度下處理KrNDA水溶液形成KH-NDA,以高于1:8(KH-NDA:水)的重量比將KH-NDA懸浮在水中，并且進(jìn)而在高于100°C(140~160。C)的溫度和高于100psi(175~250psi)的〇02壓力下處理懸浮液。然而，由于這些方法需要高溫和高壓條件、耗時(shí)處理和大量昂貴材料的應(yīng)用以生成高純度NDA晶體，其在經(jīng)濟(jì)上是不利的。這些方法的其他劣勢(shì)在于非常低的純化產(chǎn)率和NDA純度，以及個(gè)體NDA晶體顆粒間發(fā)生凝聚，其使得方法難于在工業(yè)上實(shí)施。
發(fā)明內(nèi)容因此，考慮到現(xiàn)有技術(shù)的問題而產(chǎn)生了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種通過在常溫常壓條件下用能夠?qū)NA轉(zhuǎn)化為NDA的微生物純化和結(jié)晶萘二曱酸，從而以高產(chǎn)率有效地生成高純度NDA的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過本方法生成的均一尺寸的高純度NDA晶體。為了達(dá)到上述目的，依照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用微生物純化粗萘二曱酸的方法，此方法包含以下步驟(a)使具有將2-曱?；?6-萘甲酸轉(zhuǎn)化成2,6-萘二曱酸的能力的微生物與粗萘二曱酸反應(yīng)以去除包含在粗萘二曱酸中的2-曱?；?6-萘?xí)跛幔?b)向步驟(a)中制備的反應(yīng)液中加入酸性溶液以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH,并且通過攪拌使混合液反應(yīng)以使粗萘二甲酸結(jié)晶，(c)洗滌結(jié)晶的粗萘二曱酸以去除含在結(jié)晶的粗萘二曱酸中的雜質(zhì)，和(d)干燥洗滌后的產(chǎn)物以得到純的結(jié)晶形式的2,6-萘二甲酸。依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過純化方法生成的純的結(jié)晶形式的2，6-萘二曱酸。依據(jù)本發(fā)明的純化方法，由于粗萘二曱酸分別在適合的條件下用能夠?qū)NA轉(zhuǎn)化成NDA的微生物純化和結(jié)晶，所以能夠有利地在工業(yè)規(guī)模上以有利于環(huán)境的方式生產(chǎn)高純度的結(jié)晶2,6-萘二曱酸。通過以下的詳細(xì)說明連同隨附的附圖，將更清晰地理解本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和其他優(yōu)勢(shì)，其中圖1表示用于本發(fā)明方法的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌林HN-72的16SrDNA的部分序列；圖2是依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1第三步得到的結(jié)晶cNDA的顯微照片；圖3a、3b和3c是在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中，通過向純化的cNDA的反應(yīng)液中添加碌o酸溶液并分別以50rpm、200rpm和800rpm的不同速率攪拌混合液得到的cNDA晶體的顯微照片；圖4a、4b和4c是在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2中，通過向純化的cNDA的反應(yīng)液中添加A充酸溶液并分別在15°C、40。C和80。C的不同溫度下攪拌混合液得到的cNDA晶體的顯微照片；和圖5表示依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式用于實(shí)施純化粗萘二曱酸的方法的純化體系。具體實(shí)施例方式以下提供了依據(jù)本發(fā)明的方法的各個(gè)步驟的更詳細(xì)的解釋。(i)第一歩用微生物純化在此步驟中，使具有將2-曱酰基-6-萘甲酸轉(zhuǎn)化成2,6-萘二曱酸的能力的微生物與粗萘二曱酸反應(yīng)以將含在粗萘二曱酸中的2-曱?；?6-萘?xí)跛徂D(zhuǎn)化成2，6-萘二曱酸。第一步包括以下子步驟l)將微生物接種在液體培養(yǎng)基上，振搖培養(yǎng)接種體，通過離心收集培養(yǎng)的細(xì)菌，并在生理鹽水或蒸餾水中懸浮收集的細(xì)菌以使細(xì)菌活化，2)將作為基質(zhì)的粗萘二甲酸(cNDA)與緩沖液混合，通過添加堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH以制備用于隨后純化的反應(yīng)液，和3)將在l)中制備的活性細(xì)菌與在2)中制備的反應(yīng)液反應(yīng)以將含在粗萘二曱酸中的2-甲酰基-6-萘?xí)跛徂D(zhuǎn)化成2,6-萘二曱酸，從而2,6-萘二曱酸的純度提高。任何微生物(如果其具有分解2-曱?；?6-萘?xí)跛岬哪芰?都可以應(yīng)用而無需任何特別的限制。屬于芽孢桿菌屬或假單胞菌屬的微生物優(yōu)選應(yīng)用于本發(fā)明的方法。9最優(yōu)選的是芽孢桿菌(Bacillussp.)F-1(KCTC-10342BP)、芽孢桿菌(Bacillussp.)F陽3(KCTC陽10335BP)，或假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC-10819BP)。芽孢桿菌F-l和芽孢桿菌F-3描述于韓國專利申請(qǐng)No.2002-0087819中，而假單胞菌菌林HN-72于2005年6月21日寸呆藏在4乍為國際寸呆藏才幾構(gòu)的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因庫中，保藏編號(hào)為KCTC-10819BP。在25~45"C的寬的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選28~35°C,這些微生物能夠容易地在液體培養(yǎng)基(如LB或M9培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。緩沖液的種類不特別限制。作為緩沖液，可以用例如，水、碳酸鈉緩沖液(Na203/NaHC03)、甘氨酸緩沖液(甘氨酸/NaOH)、磷酸鉀緩沖液(KH2P04/KOH)、磷酸鈉緩沖液(Na2HP04/NaH2P04)、丁二酸緩沖液(丁二酸/NaOH)、醋酸鈉緩沖液(醋酸鈉/醋酸)、檸檬酸緩沖液(檸檬酸/擰檬酸鈉)、焦磷酸鈉緩沖液(Na4P207/HCl)、硼酸緩沖液(硼酸/NaOH)、或硼酸鈉緩沖液(硼酸鈉/HCl)。優(yōu)選磷酸鉀緩沖液(KH2P04/K0H)和硼酸鈉緩沖液(硼酸鈉/HC1),其pH范圍為6.0-9.0。優(yōu)選緩沖液的濃度為0.01~100mM。堿性溶液優(yōu)選NaOH或KOH溶液，但是不限制于此?；旌先芤旱膒H優(yōu)選調(diào)節(jié)到6~10。在第二子步驟中，為了溶解cNDA,可以向混合液中另外添加有機(jī)溶劑。優(yōu)選的有機(jī)溶劑的實(shí)例包括二曱基亞砜(DMSO)、N，N-二曱基曱酰胺(DMF)、N，N-二曱基乙酰胺(DMA)和四氫呋喃(THF)。在這些里，考慮到酶的活性，二甲基亞砜是最優(yōu)選的。有機(jī)溶劑優(yōu)選以0.01~10%的濃度添加。更優(yōu)選地，不添加有才幾溶劑。超過10%濃度的有機(jī)溶劑的添加導(dǎo)致微生物的細(xì)胞膜被溶解破壞，從而阻礙反應(yīng)。在第三子步驟中，反應(yīng)優(yōu)選在25~50。C下進(jìn)行1分鐘到2小時(shí)，更優(yōu)選在35~40。C進(jìn)行25~40分鐘。當(dāng)反應(yīng)溫度低于25。C或高于50。C時(shí)，會(huì)導(dǎo)致不期望的細(xì)菌活性的顯著降低。另一方面，在cNDA中的FNA含量、反應(yīng)液中的cNDA濃度和完全去除FNA所需要的細(xì)菌的量之間有密切的關(guān)系。即，隨著cNDA中的FNA含量和反應(yīng)液中的cNDA濃度的增加，需要更大量的細(xì)菌以去除FNA。(ii)第二歩結(jié)晶在此步驟中，酸性溶液被添加到在第一步中制備的反應(yīng)液中以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH,而后在攪拌下與反應(yīng)液反應(yīng)以使粗萘二曱酸結(jié)曰曰曰c更具體地，在一個(gè)配有攪拌器的反應(yīng)器中，適量的酸性溶液被添加到在第一步中制備的反應(yīng)液中以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至期望的范圍，而后保持混合液的溫度在恒定水平下，混合液在持續(xù)攪拌下反應(yīng)，從而將存在于無FNA的反應(yīng)液中的無定形形式的cNDA在常溫常壓條件下結(jié)晶出來。由于此結(jié)晶過程能夠在常溫常壓條件下生成具有100pm或更大的均一尺寸的cNDA晶體，本發(fā)明的純化方法在生產(chǎn)成本和工藝過程方面在經(jīng)濟(jì)上是有優(yōu)勢(shì)的。另外，由于在各個(gè)cNDA晶體顆粒之間沒有凝聚發(fā)生，本發(fā)明的純化方法是適于實(shí)際應(yīng)用的并且在最終產(chǎn)物的高回收率方面是有優(yōu)勢(shì)的。作為酸性溶液，可以應(yīng)用例如，碌b酸、鹽酸、冰醋酸或硝酸。硫酸或硝酸的應(yīng)用是優(yōu)選的，因?yàn)槠鋵?dǎo)致cNDA晶體的大尺寸和高產(chǎn)率。也就是，硫酸或硝酸的添加能夠以高產(chǎn)率生成具有100nm或更大的均一尺寸的cNDA晶體。反應(yīng)液的pH優(yōu)選調(diào)節(jié)到1~4以增加最終產(chǎn)物的回收率。隨著反應(yīng)液的pH降低，最終產(chǎn)物的回收率趨于從約92%增加到約99.9%。結(jié)晶過程在約4"C至約80。C下進(jìn)行，優(yōu)選25°C~60°C。結(jié)晶進(jìn)行約l分鐘到約12小時(shí)，考慮到連續(xù)處理，更優(yōu)選230分鐘。太短的結(jié)晶時(shí)間會(huì)導(dǎo)致cNDA的低結(jié)晶度，引起各個(gè)cNDA晶體顆粒之間通過聚合而發(fā)生的凝聚。同時(shí)，太長(zhǎng)的結(jié)晶時(shí)間導(dǎo)致不必要的能量損失。進(jìn)行cNDA結(jié)晶所需要的攪拌通常在0~1000rpm的速率下進(jìn)行，優(yōu)選0~400rpm。nm第三歩洗滌在此步驟中，洗滌在第二步中得到的結(jié)晶的粗萘二曱酸以去除含在其中的雜質(zhì)。盡管通過使用微生物的純化反應(yīng)和結(jié)晶反應(yīng)，將FNA轉(zhuǎn)化成NDA并將其完全去除，但包括2-萘?xí)跛?NA)、曱基萘?xí)跛?MNA)和偏苯三酸(TLMA)在內(nèi)的其他雜質(zhì)還未去除。當(dāng)結(jié)晶的cNDA分散在水中，在給定條件下洗滌若干次，可完全去除殘留的雜質(zhì)。雜質(zhì)的完全去除基于在水中cNDA和雜質(zhì)的溶解度的差別。此時(shí)，用于純化cNDA的孩i生物也通過洗滌;故去除。在此步驟中，期望在反應(yīng)副產(chǎn)物溶解于溶劑中和NDA沉淀盡可能多的狀況下實(shí)現(xiàn)分離。分離的溫度范圍是100~250°C,優(yōu)選150~230°C。在高于250°C下溶劑的分離導(dǎo)致純化的NDA的損失增加，引起產(chǎn)率相當(dāng)大的下降。同時(shí)，在低于IOO"C下溶劑的分離不利地導(dǎo)致雜質(zhì)(包括NA、MNA和TLMA)的低溶解度。更特別地，結(jié)晶的cNDA分散在水中，在1~28kg/cm2的壓力和100~250。C的溫度下攪拌IO分鐘到1小時(shí)，過濾除去水。此工序可以重復(fù)若干次以去除雜質(zhì)。此時(shí)，溶劑優(yōu)選用量為結(jié)晶的cNDA的重量的5~204咅。(iv)第四歩干燥在此步驟中，在特定溫度下將NDA晶體(其中通過洗滌將雜質(zhì)從結(jié)晶的cNDA中去除)干燥以得到純的結(jié)晶形式的NDA。此時(shí)，干燥優(yōu)選在30~200。C下進(jìn)行。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的傳統(tǒng)-技術(shù)進(jìn)行干燥而無需限制。本發(fā)明的方法還可以包含在第一步后和第二步前去除在第一步中使用的微生物的步驟。在cNDA純化后和cNDA結(jié)晶前先去除孩i生物能夠?qū)Ω纳芅DA晶體的純度和回收率有貢獻(xiàn)。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的傳統(tǒng)技術(shù)完成微生物的去除而無需限制。例如，微量過濾器系統(tǒng)、連續(xù)型離心分離器或潷析器可以用于去除微生物。微量過濾器系統(tǒng)使用具有0.1-0.5nm孔徑的過濾器，由選自陶瓷、不銹鋼、聚丙烯和聚對(duì)苯二曱酸乙二酯(PET)的材料制成。另一方面，本發(fā)明提供通過純化方法生成的純的結(jié)晶形式的2,6-萘二曱酸。本發(fā)明的純化方法能夠以99.8%或更高的高產(chǎn)率生成高純度的2,6-萘二甲酸。依據(jù)期望的應(yīng)用和需要，可以改變處理?xiàng)l件以生成規(guī)則的或無規(guī)的結(jié)晶形式的2,6-萘二甲酸。規(guī)則結(jié)晶形式的2,6-萘二曱酸可以具有晶格結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的2,6-萘二曱酸晶體具有不小于100pm的平均粒徑和均一的顆粒外形。因此，本發(fā)明的2,6-萘二曱酸晶體與乙二醇聚合生成PEN時(shí)非常適于與乙二醇形成低粘度漿液。平均粒徑小于100pm的2,6-萘二曱酸晶體很難處理，當(dāng)其與乙二醇混合制備PEN時(shí)，顯示出弱的與乙二醇形成漿液的能力，導(dǎo)致增加了能量消耗。本發(fā)明的2,6-萘二曱酸晶體優(yōu)選的平均粒徑為100~150pm。圖5表示依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式用于實(shí)施純化粗萘二曱酸的方法的純化體系。參考圖5,依據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的純化方法將更詳細(xì)地解釋如下。首先，將特定量的緩沖液引入反應(yīng)器A，在其中粗萘二曱酸用微生物純化。將cNDA加入到反應(yīng)器中，隨后，攪拌下將堿性溶液加入反應(yīng)器中以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH。將特定量的水加入反應(yīng)器以制備反應(yīng)液用于隨后的純化。將活性菌加入反應(yīng)液以-使其與反應(yīng)液反應(yīng)，同時(shí)保持反應(yīng)液溫度在恒定水平。通過此工序，在反應(yīng)器A中，含在cNDA中的FNA轉(zhuǎn)化為NDA,并能夠被最終去除。當(dāng)反應(yīng)完成后，反應(yīng)液通過單元B,在此除去用于去除FNA的微生物。如果需要，可以省略應(yīng)用單元B的微生物的去除，因?yàn)槲⑸锏娜コ茉谙掠蔚倪^濾/清洗單元F完成。將去除了微生物的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到結(jié)晶反應(yīng)器C。在攪拌下將酸性溶液添加到結(jié)晶反應(yīng)器C中，以進(jìn)行結(jié)晶反應(yīng)。在結(jié)晶反應(yīng)后得到含有結(jié)晶的cNDA的漿液。該漿液用預(yù)熱器D加熱至約100至約250°C,而后加入到過濾/清洗單元F(在此提供一個(gè)加熱器以保持漿液的溫度在100-250。C)中。過濾/清洗單元F的壓力保持在l~25kg/cm2。過濾/清洗單元F配有過濾器(孔徑10~100,)。過濾/清洗單元F與高壓過濾收集單元G連4妄。濾液從過濾/清洗單元F進(jìn)入高壓濾液收集單元G,固體成分用包括在過濾/清洗單元F中的過濾器過濾。將在溶劑加熱/供應(yīng)單元E中預(yù)熱的水(IOO~250。C)提供至過濾/清洗單元F。當(dāng)在過濾/清洗單元F中持續(xù)攪拌給定的時(shí)間后，將二級(jí)濾液加進(jìn)高壓濾液收集單元G中。如果需要，清洗步驟重復(fù)一次或兩次。清洗后保留的純的NDA與預(yù)熱的水(IOO~250。C)混合以形成漿液。將所述漿液經(jīng)過漿液流出線路送至高壓漿液收集單元H。當(dāng)高壓漿液收集單元H的壓力降至常壓后，含有純的NDA的漿液被轉(zhuǎn)移至粉末分離單元I，在此將溶劑從漿液中去除，隨后在干燥單元J中干燥從而只收集純的NDA。在下文中，參考下述實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明的構(gòu)成和效果進(jìn)行詳細(xì)解釋。然而，這些實(shí)施例的目的是舉例說明，不解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1第一步微生物篩選(l)菌株的分離土壤采樣自位于韓國京畿道的廢水處理廠、儲(chǔ)油庫和加油站。將每個(gè)土壤樣品5g添加至50ml的0.85%生理鹽水溶液中，振搖并過濾得到濾液。濾液稀釋到適當(dāng)?shù)乃?，涂在含有cNDA的LB固體培養(yǎng)基上，在3(TC的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果，分離出200種微生物。依據(jù)如下工序，首先僅篩選出能分解與FNA在相同位置上有曱?；?-萘?xí)跞┑奈⑸?。首先，?00種微生物各自接種到lml的LB液體培養(yǎng)基上，在200rpm和30。C下振搖培養(yǎng)16小時(shí)。離心分離培養(yǎng)物收集相應(yīng)的細(xì)菌。將收集到的細(xì)菌懸浮在lml的0.85%生理鹽水中。分別地，將0.2ml的2-萘?xí)跞┤芤?50pg/ml于DMSO中)加入到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的樣品試管中，并且將0.2ml的DMSO添力口到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的空白試管中。將試管分別置于分光光度計(jì)中，穩(wěn)定3分鐘。當(dāng)分別添加0.05ml微生物懸浮液于樣品試管中后5分鐘，在340nm處測(cè)定混合物的吸收度。比較樣品試管中的混合物的吸收度值與空白試管的吸收度值以確定2-萘?xí)跞┑臅貂；紧然难趸?。結(jié)果，分離出四種具有最小吸收度差異為0.1的微生物。將四種首先篩選出的微生物各自接種在LB液體培養(yǎng)基上，在200rpm和3(TC下振搖培養(yǎng)16小時(shí)。離心分離培養(yǎng)物收集相應(yīng)的細(xì)菌，用0.85%生理鹽水洗滌，并與具有表1中所示組成的溶液在30°C的反應(yīng)浴中反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用高效液相色i普(HPLC)分析以最終篩選具有高的去除FNA能力的菌抹。HPLC分析在表2所示的條件下進(jìn)行。HPLC分析顯示被稱為HN-72的菌抹具有高的分解FNA妙+B匕刀o表1:用于最終篩選的反應(yīng)液<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)微生物的鋈別對(duì)在(l)中分離的菌;f朱的16SrDNA進(jìn)行部分測(cè)序用以鑒別菌林。結(jié)果顯示于圖l(SEQIDNO:1)依據(jù)此結(jié)果，鑒別出菌抹為屬于假單胞菌屬的細(xì)菌。菌抹被稱為假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72并于2005年6月21日保藏在4乍為國際1呆藏才幾才勾的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因庫中，保藏編號(hào)為KCTC-10819BP。確定出菌抹(假單胞菌HN-72)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，其結(jié)果概述于表3和表4。表3:脅I單月包菌(Pseudomonassp.)HN-72的凈爭(zhēng)4正試驗(yàn)特征革蘭氏染色陰性細(xì)胞形態(tài)學(xué)桿狀最佳生長(zhǎng)溫度25~30。C氧化酶陽性脫硝作用陰性明膠降解陰性淀粉降解陰性兒茶酚降解陰性表4:l艮單月包菌(Pseudomonassp.)HN-72對(duì)石友源的應(yīng)用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>第二步用樣t生物純化cNDA將在第一步中篩選的假單胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72接種在300ml的LB液體培養(yǎng)基上，并在30。C下在培養(yǎng)箱中以200rpm振搖培養(yǎng)16小時(shí)。離心分離培養(yǎng)物以收集細(xì)菌。收集到的細(xì)菌用0.85%的生理鹽水溶液洗滌，并懸浮在5ml的0.85%生理鹽水溶液中以活化細(xì)菌。將50L的50mM磷酸鉀緩沖液添加入反應(yīng)器A中，在此cNDA用微生物純化。將1~10kg的cNDA添加至反應(yīng)器A中，而后在攪拌下向其中添加KOH或NaOH以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至8.0。將水添加至混合溶液中以制備用于隨后純化的反應(yīng)液(cNDA濃度1~10%,cNDA中的FNA含量0.01~4%)。將0.2-10kg/L的活性細(xì)菌添加至反應(yīng)液中以4吏其與反應(yīng)液在40。C下反應(yīng)10分鐘到2小時(shí)，其間保持反應(yīng)液溫度在40°C。反應(yīng)結(jié)果，在反應(yīng)器A中，含在cNDA中的FNA被轉(zhuǎn)化為NDA。第三步純化的cNDA的結(jié)晶將100L在第二步中制備的純化的cNDA溶液轉(zhuǎn)移到配有攪拌器的結(jié)晶反應(yīng)器C中。在將硫酸溶液添加入結(jié)晶反應(yīng)器中以調(diào)節(jié)純化的cNDA的溶液的pH至3.0后，結(jié)晶反應(yīng)在50rpm的速率下攪拌進(jìn)行30分鐘，同時(shí)保持反應(yīng)溫度為40°C。當(dāng)結(jié)晶完成后，結(jié)晶的cNDA的分析用顯微鏡和粒度分析儀進(jìn)行。分析結(jié)果顯示cNDA令人滿意地發(fā)生了結(jié)晶而沒有任何個(gè)別的晶體顆粒間的凝聚。測(cè)得結(jié)晶的cNDA具有的平均粒度為約160.7pm。圖2顯示結(jié)晶的cNDA的顯微照片。第四歩結(jié)晶的cNDA的洗滌和千燥在第三步中制備的結(jié)晶的cNDA的漿液用預(yù)熱器D加熱至超過220°C,加入到過濾/清洗單元F中，在24.7kg/cm2的壓力和225°C的溫度下攪拌30分鐘，而后過濾。濾液(即水)排入高壓濾液收集單元G。將來自溶劑加熱/供給單元E的225。C的100L的水添加至過濾/清洗單元F中，在與上述相同條件下攪拌30分鐘，而后過濾。濾液(即水)排入高壓濾液收集單元G。此工序總共重復(fù)兩次。將100L來自溶劑加熱/供給單元E的225。C的水添加至過濾/清洗單元F中，攪拌30分鐘以使純的NDA均勻地分散。含有純的NDA的漿液被轉(zhuǎn)移到高壓漿液收集單元H中。當(dāng)高壓漿液收集單元H的壓力降到常壓后，所述漿液被轉(zhuǎn)移到粉末分離單元I(即潷析器)中，在此從漿液中去除水，隨后在干燥單元J中在120。C干燥以收集純的結(jié)晶形式的NDA。實(shí)施例2用與實(shí)施例1相同的方式收集純的結(jié)晶形式的NDA,不同之處在于微生物在第二步后和第三步前先從在第二步中制備的純化的cNDA溶液中用聚丙烯過濾器(孔徑0.2pm)去除。實(shí)施例3和4用與實(shí)施例1相同的方式收集純的NDA結(jié)晶，不同之處在于分別用芽孢桿菌(Bacillussp.)F-l(KCTC-10342BP)和芽孢桿菌(Bacillussp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC-10819BP)。實(shí)施例5和6用與實(shí)施例2相同的方式收集純的NDA結(jié)晶，不同之處在于分別用芽孢桿菌(Bacillussp.)F-l(KCTC-10342BP)和芽孢桿菌(Bacillussp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假單胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC國10819BP)。分析未純化的cNDA、第二步(純化步驟)后得到的純化的cNDA的溶液和在實(shí)施例1中第四步(洗滌/干燥步驟)后得到的純的結(jié)晶形式的NDA中的各組分的含量。分析結(jié)果見表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從表5的結(jié)果看，能夠確定用微生物的純化方法能夠基本上完全去除含在cNDA中的雜質(zhì)。特別地，以100%的產(chǎn)率把FNA轉(zhuǎn)化為NDA。因此，生成了高純度的2,6-萘二曱酸，其純度為99.9%或更高。為了確定用微生物純化cNDA的最佳反應(yīng)條件，特別是純化的cNDA的溶液的結(jié)晶條件，在表6-8所示的不同反應(yīng)條件下進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，比較和分析在依據(jù)不同反應(yīng)條件的各自的結(jié)晶反應(yīng)后得到的cNDA晶體的平均粒徑和回收率。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:不同種類的酸和攪拌速率下的結(jié)晶反應(yīng)將100ml在實(shí)施例1的第二步中制備的純化的cNDA的溶液添加到反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器都配有攪拌器，而后將硫酸、鹽酸、冰醋酸和硝酸溶液添加至反應(yīng)器中以調(diào)節(jié)純化的cNDA的溶液的pH至3.0。以0、50、100、200、400、800和1000rpm的不同速率攪拌混合溶液。此時(shí)，混合溶液的溫度保持在25°C。在這些反應(yīng)條件下，結(jié)晶反應(yīng)進(jìn)行30分鐘以得到cNDA晶體。當(dāng)結(jié)晶完成后，用顯微鏡和粒度分析儀進(jìn)行cNDA晶體的分析。分析結(jié)果顯示cNDA令人滿意地產(chǎn)生結(jié)晶而未有任何個(gè)別晶體顆粒間的凝聚。圖3a、3b和3c顯示通過添加硫酸溶液至純化的cNDA的反應(yīng)液并且分別以50rpm、200rpm和800rpm的不同速率攪拌下得到的cNDA晶體的顯微照片。在各自條件下測(cè)定得到的cNDA晶體的平均粒徑，結(jié)果見表6。由表6所示的數(shù)據(jù)可見，當(dāng)添加硫酸或鹽酸溶液并在0~400rpm的速率下攪拌后得到的cNDA晶體顯示更好的結(jié)果。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2:不同種類的酸和溫度下的結(jié)晶反應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的工序，不同之處在于混合溶液以50rpm的速率在4、15、25、40、60和80。C的不同反應(yīng)溫度下攪拌。當(dāng)結(jié)晶完成后，用顯微鏡和粒度分析儀進(jìn)行cNDA晶體的分析。分析結(jié)果顯示cNDA令人滿意地結(jié)晶而未有任何個(gè)別晶體顆粒間的凝聚。圖4a、4b和4c顯示通過添加石克酸溶液至純化的cNDA的反應(yīng)液并分別在15°C、40。C和80。C的不同反應(yīng)溫度攪拌下得到的cNDA晶體的顯微照片。測(cè)定在各自條件下得到的cNDA晶體的平均粒徑，結(jié)果見表7。由表7所示的數(shù)據(jù)可見，當(dāng)添加硫酸或鹽酸溶液并在40。C的反應(yīng)溫度下攪拌后得到的cNDA晶體顯示更好的結(jié)果。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>值下的回收率重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例l的工序，不同之處在于混合溶液在50rmp、40。C的反應(yīng)溫度和1、2、3、4、5和6的不同pH值下攪拌。當(dāng)結(jié)晶反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后，等量的反應(yīng)液分別從各個(gè)反應(yīng)器中取出。測(cè)定cNDA晶體的回收率，結(jié)果見表8。表8顯示cNDA晶體的回收率在pH不高于3時(shí)高于99%。cNDA晶體的回收率顯示了隨著pH降低而升高的趨勢(shì)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>工業(yè)應(yīng)用由于在各個(gè)適合的條件下用能將FNA轉(zhuǎn)化為NDA的微生物純化粗萘二曱酸，因此能在工業(yè)規(guī)模上以有利于環(huán)境的方式有利地生成高純度的結(jié)晶2,6-萘二曱酸。權(quán)利要求1.一種用微生物純化粗萘二甲酸的方法，該方法包含以下步驟(a)使具有將2-甲?；?6-萘甲酸轉(zhuǎn)化成2，6-萘二甲酸的能力的微生物與粗萘二甲酸反應(yīng)以去除包含在粗萘二甲酸中的2-甲?；?6-萘甲酸；(b)向步驟(a)中制備的反應(yīng)液中加入酸性溶液以調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH，并且通過攪拌使混合液反應(yīng)以使粗萘二甲酸結(jié)晶；(c)洗滌結(jié)晶的粗萘二甲酸以去除含在結(jié)晶的粗萘二甲酸中的雜質(zhì)；和(d)干燥洗滌后的產(chǎn)物以得到純的結(jié)晶形式的2，6-萘二甲酸。2.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括以下子步驟1)將微生物接種在液體培養(yǎng)基上，振搖培養(yǎng)接種體，通過離心收集培養(yǎng)的細(xì)菌，并在生理鹽水或蒸餾水中懸浮收集的細(xì)菌以使細(xì)菌活化；2)將作為基質(zhì)的粗萘二甲酸(cNDA)與緩沖液混合，通過添加堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH以制備用于隨后純化的反應(yīng)液；和3)將在l)中制備的活性細(xì)菌與在2)中制備的反應(yīng)液反應(yīng)以將含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘?xí)跛徂D(zhuǎn)化成2,6-萘二曱酸，從而提高2,6-恭二甲酸的純度。3.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物是屬于芽孢桿菌屬或假單胞菌屬的細(xì)菌。4.依據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述微生物是芽孢桿菌F-l(KCTC-10342BP)、芽孢桿菌F-3(KCTC-10335BP)或假單胞菌HN-72(KCTC-10819BP)。5.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述緩沖液從由水、碳酸鈉緩沖液(Na203/NaHC03)、甘氨酸緩沖液(甘氨酸/NaOH)、磷酸鉀緩沖液(KH2P04/KOH)、磷酸鈉緩沖液(Na2HP04/NaH2P04)、丁二酸緩沖液(丁二酸/NaOH)、醋酸鈉緩沖液(醋酸鈉/醋酸)、檸檬酸緩沖液(檸檬酸/杼檬酸鈉)、焦磷酸鈉緩沖液(Na4P207/HCl)、硼酸緩沖液(硼酸/NaOH)、硼酸鈉緩沖液(硼酸鈉/HC1)以及它們的混合物組成的組中選出；并且所述緩沖液的濃度為0.01~100mM。6.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述堿性溶液為NaOH或KOH溶液。7.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述混合液還包含有機(jī)溶劑。8.依據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述有機(jī)溶劑從由二曱基亞砜、N,N-二甲基曱酰胺、N,N-二曱基乙酰胺、四氬呋喃以及它們的混合物組成的組中選出；并且所述有機(jī)溶劑以0.01~10%的濃度添力口。9.依據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述反應(yīng)在25~50"C下進(jìn)行1分鐘~2小時(shí)。10.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酸性溶液從由硫酸、鹽酸、冰醋酸、硝酸以及它們的混合物組成的組中選出。11.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)液的pH調(diào)節(jié)到1~4。12.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)在4。C80。C下進(jìn)行1分鐘~12小時(shí)。13.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述攪拌以0-1000rpm的速率進(jìn)行。14.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)通過將結(jié)晶的cNDA分散在水中，在1~28kg/cm2的壓力和100~250。C的溫度下攪拌10分鐘-l小時(shí)，過濾結(jié)晶的cNDA以除去水，并重復(fù)上述工序來進(jìn)行。15.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述干燥在3020(TC下進(jìn)行。16.依據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包含在步驟(a)后和步驟(b)前除去在步驟(a)中使用的微生物的步驟。17.依據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中微生物的去除通過微量過濾器系統(tǒng)、連續(xù)型離心分離器或潷析器完成。18.依據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中微量過濾器系統(tǒng)使用具有0.1~0.5pm孔徑的并且由選自陶瓷、不銹鋼、聚丙烯和聚對(duì)苯二曱酸乙二酯(PET)的材料制成的過濾器。19.依據(jù)權(quán)利要求1的方法生成的純的結(jié)晶形式的2,6-萘二曱酸。20.依據(jù)權(quán)利要求19的2,6-萘二甲酸，其中該2,6-萘二曱酸是規(guī)則的或無規(guī)的結(jié)晶形式。21.依據(jù)權(quán)利要求19的2,6-萘二甲酸，其中規(guī)則的結(jié)晶形式為晶格結(jié)構(gòu)。22.依據(jù)權(quán)利要求19的2,6-萘二甲酸，其中該2，6-萘二曱酸晶體的平均粒徑不小于100|im。全文摘要本發(fā)明公開了一種用微生物純化粗萘二甲酸的方法和用該方法得到的結(jié)晶形式的2，6-萘二甲酸。依據(jù)此純化方法，粗萘二甲酸通過使具有將2-甲?；?6-萘甲酸轉(zhuǎn)化為2，6-萘二甲酸的能力的微生物與粗萘二甲酸反應(yīng)，在特定條件下向反應(yīng)液中添加酸性溶液，攪拌此混合溶液使粗萘二甲酸結(jié)晶，洗滌結(jié)晶的粗萘二甲酸，并且干燥洗滌后的產(chǎn)物來純化，從而得到純的結(jié)晶形式的2，6-萘二甲酸。該純化方法能有利地在工業(yè)規(guī)模上以環(huán)境友好的形式生產(chǎn)高純度的結(jié)晶2，6-萘二甲酸。文檔編號(hào)C07C51/42GK101321718SQ200680045659公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年2月14日優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日發(fā)明者崔龍福,權(quán)益鉉,李鐘桓,金東誠,金成均申請(qǐng)人:株式會(huì)社曉星