專利名稱：：純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法相關(guān)申請本申請要求2005年6月17日提交的申請?zhí)枮?0/691821的臨時(shí)專利申請"純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法(METHODSOFPURIFYINGFcREGIONCONTAININGPROTEINS)"的優(yōu)先權(quán)。該申請的全部內(nèi)容并入本文。發(fā)明背景抗體是許多動(dòng)物，特別是人類的免疫系統(tǒng)的功能強(qiáng)大的組分。重組技術(shù)的最新進(jìn)展使得事實(shí)上針對(duì)任何靶，例如，癌細(xì)胞，細(xì)菌和病毒的抗體的產(chǎn)生成為可能。通常地，抗體用已被工程化成表達(dá)高水平的所述抗體的細(xì)胞系產(chǎn)生。隨后，工程化細(xì)胞系在包括糖，氨基酸和生長因子及各種蛋白，包括例如，血清蛋白的復(fù)雜混合物的培養(yǎng)物中生長。然而，從細(xì)胞副產(chǎn)物和培養(yǎng)物組分中分離完全抗體至足以用于研究或用作治療劑的純度形成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。如果準(zhǔn)備將抗體用作藥物向人類給藥，則抗體分子的純化尤為關(guān)鍵。傳統(tǒng)抗體純化方案(或系列)通常包括色譜步驟，所述色譜步驟利用了與多種雜質(zhì)的結(jié)合或截留相比，抗體分子優(yōu)先結(jié)合或被色譜柱的固相(或官能化固相)截留的能力。已建議或執(zhí)行的純化抗體的方案為首先將含有CH2/CH3區(qū)的蛋白結(jié)合在固相上所固定的A蛋白上，然后通過用疏水電解質(zhì)溶劑洗滌固相，除去固相上所結(jié)合的雜質(zhì)，接著從所述固相上回收含有CH2/CH3區(qū)的蛋白。然而，這些方案的限制在于用來優(yōu)先結(jié)合含有CH2/CH3區(qū)的蛋白的條件同樣支持雜質(zhì)(例如，具有不完全CH2/CH3區(qū)的抗體)的結(jié)合。在人用治療劑的開發(fā)過程中，這些雜質(zhì)是非常不希望有的。因此，存在著改進(jìn)對(duì)具有恒定區(qū)的蛋白或多肽，尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的具有FC區(qū)的蛋白(例如，抗體)的純化的需求。發(fā)明概述在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于將具有Fc區(qū)的蛋白從包括該蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中分離的方法。在本發(fā)明的方法中，將具有Fc區(qū)的蛋白(耙蛋白)吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)。接著在洗脫溶液中從Fc結(jié)合劑上回收該蛋白。本發(fā)明的方法對(duì)除去例如內(nèi)含子連讀變異體類(IRT)，二硫鍵缺失類(UDB)和/或低分子量變異體類(LMW)這樣的雜質(zhì)尤其有效。本發(fā)明的方法在除去例如宿主細(xì)胞蛋白(HCP)和DNA這樣的雜質(zhì)方面同樣有效。本發(fā)明的方法包括一個(gè)或多個(gè)色譜分離步驟，另外，還可以包括一個(gè)或多個(gè)過濾步驟。所述色譜分離步驟可以是連續(xù)或不連續(xù)的(例如，分批方法)，或者為兩者的組合。在多種實(shí)施方案中，本方法包括一個(gè)或多個(gè)過濾步驟，例如，以除去病毒，濃縮和緩沖含有靶蛋白的溶液，以及除去微生物污染物。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是抗原結(jié)合多肽(例如，抗體或其片段)或免疫粘附素(例如，TNF受體免疫粘附素)。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是抗體融合蛋白，鼠抗體，嵌合抗體或人源化抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是人或人源化抗IL-13抗體?；蛘?，在其它實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白可以結(jié)合例如CD3,CD52，VEGF,EGFR,CD33,CD20,HER-2，TNFa，CD25,RSV，IgE,gpIlb/IIIa,CD1la或a4整聯(lián)蛋白的抗原。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是重組產(chǎn)生的。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。在多種實(shí)施方案中，所述一種或多種雜質(zhì)包括一種或多種宿主細(xì)胞蛋白，宿主細(xì)胞DNA,細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白，具有Fc區(qū)的非所需種類的蛋白及其混合物。例如，在多種實(shí)施方案中，具有Fc區(qū)的非所需種類的蛋白包括一種或多種具有內(nèi)含子連讀序列的抗體鏈或其片段，一種或多種具有不正確二硫鍵的抗體鏈或其片段，半抗體或其片段，輕鏈二聚體或其片段和重鏈二聚體或其片段。在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法通過首先將具有Fc區(qū)的蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑上回收所述蛋白，從包括所述蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化具有Fc區(qū)的蛋白。在多種實(shí)施方案中，將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上的步驟和用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑的步驟在約2°C至約24°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在多種實(shí)施方案中，從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5的洗脫緩沖液洗脫所述蛋白。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)結(jié)合劑包括一種或多種A蛋白和G蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑被固定在固相上。該固相可以包括，例如，一種或多種珠，瓊脂糖基質(zhì)，二氧化硅及其混合物。用來洗滌Fc結(jié)合劑的緩沖液中所存在的二價(jià)陽離子鹽可以包括，例如，離液序列高的鹽。適用于制備所述洗滌緩沖溶液的二價(jià)陽離子鹽包括但不限于氯化鎂，氯化鈣，氯化鎳及其混合物。在多種實(shí)施方案中，適用于制備所述洗滌緩沖溶液的二價(jià)陽離子鹽包括但不限于二價(jià)II族(例如，鎂，鈣，鋇等)陽離子，二價(jià)過度金屬(例如，銅，鎳，錳等)陽離子的硫氰酸鹽(SCNO，高氯酸鹽(C104—)，硝酸鹽(N03.)，氯化鹽和溴化鹽及這些鹽的組合物。在多種實(shí)施方案中，含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液的pH值范圍為約4至約9，在某些實(shí)施方案中，為約4至約8，約4.5至約7.5，或約6至約8。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述二價(jià)陽離子鹽的pH值為約7.1至約7.9，約7.2至約7.9，約7.3至約7.7，約7.4至約7.6，約4至約5，約5至約6，約6至約7或約8至約9。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述二價(jià)陽離子鹽的pH為至少約(或約)4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5或8。在多種實(shí)施方案中，緩沖溶液所含有的二價(jià)陽離子鹽的濃度范圍為約0.1M至約5M，在某些實(shí)施方案，為約0.5M至約3M，約1.0M至約3M或約0.6M至約2.5M。例如，所述二價(jià)陽離子緩沖液可以包括至少約0.6M的CaCl2或至少約2M的MgCl2或至少約2M的CaCl2。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述緩沖溶液所含有的二價(jià)陽離子鹽的濃度為約0.5M至約0.75M，約0.5M至約0.8M，約0.5M至約0.9M，約0.5M至1.0M，約0.5M至2M，約1.5M至約2.0M，約1.5M至約2.5M，約1.5M至約3.0M或約2.5M至約3M。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述緩沖溶液所含有的二價(jià)陽離子鹽的濃度為至少約(或約)0.6M，1M，L5M，2M，2.5M或3M。在多種實(shí)施方案中，含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液的溫度范圍為約2°C至約24°C。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收蛋白的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5，優(yōu)選約2.0至約4.0，更優(yōu)選約2.5至約3.5的洗脫緩沖液洗脫所述蛋白。此處所述范圍內(nèi)所包括的值和范圍和/或中間值也希望在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述洗脫緩沖液的pH為約2至約3或約3至約4。此外，希望以此處所述值作為上限或下限的范圍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，所述洗脫緩沖液的pH為至少約(或約)2，2.5，3，3.5或4。在多種實(shí)施方案中，所回收的蛋白可以在所述Fc結(jié)合劑色譜步驟之前或之后進(jìn)行另外的純化步驟。例如，例示性的進(jìn)一步的純化步驟包括但不限于陰離子交換色譜，陽離子交換色譜，固定化金屬親和色譜，疏水相互作用色譜(HIC),羥基磷灰石色譜，透析，親和色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC),色譜聚焦，超濾，滲濾，微濾和凝膠過濾。在多種實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑色譜步驟后跟隨的是陰離子交換色譜和HIC步驟。在多種實(shí)施方案中，所述色譜步驟后還跟隨著病毒過濾步驟，超濾/滲濾步驟和/或微生物污染物過濾步驟。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有雜質(zhì)的溶液中純化抗體的方法。在多種實(shí)施方案中，所述方法包括，首先將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白，以產(chǎn)生第一洗脫池(el職tpool)。在多種實(shí)施方案中，所述純化過程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過使離子交換樹脂與所述第一洗脫池使靶蛋白不吸附到樹脂上的方式接觸，然后回收流過的靶蛋白，以產(chǎn)生第二洗脫池，而對(duì)所述第一洗脫池進(jìn)行離子交換色譜。在多種實(shí)施方案中，所述離子交換色譜步驟進(jìn)一步包括用緩沖洗滌液洗滌所述離子交換樹脂，以回收至少一部分任何被吸附的靶蛋白。在多種實(shí)施方案中，所述純化過程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過將所述耙蛋白吸附到疏水相互作用樹脂(例如，經(jīng)疏水配體官能化的固相)上，用離子強(qiáng)度幾乎不洗脫所述靶蛋白的緩沖洗滌液洗滌所述疏水相互作用樹脂，然后回收純化的靶蛋白(通常用離子強(qiáng)度低至足以使所述靶蛋白從所述疏水相互作用樹脂上解吸附的洗脫緩沖液)，而對(duì)所述第二洗脫池進(jìn)行疏水相互作用色譜。在本發(fā)明的多個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑被固定在固相上，其優(yōu)選在與源液接觸之前先用適宜的緩沖液平衡。所述固相優(yōu)選為包括固定所述FC結(jié)合劑的瓊脂糖的柱。在多種實(shí)施方案中，所述柱涂覆有試劑，例如甘油，以減少或防止柱的非特異性附著。在多種實(shí)施方案中，經(jīng)本發(fā)明的方法純化的蛋白可以配制在藥學(xué)上可接受的載體中，并用于各種診斷，治療或其它己知的這類分子的用途。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從包括含F(xiàn)c區(qū)蛋白及其內(nèi)含子連讀變異體(IRT)的溶液中將含F(xiàn)c區(qū)蛋白純化的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來降低蛋白制品，例如，抗體制品中的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體種類的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的內(nèi)含子連讀變異體水平比源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少5倍，在某些實(shí)施方案中，比源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約1.0%，0.8%，0.5%，0.2%或0.1%的所述蛋白的種類。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從包括含F(xiàn)c區(qū)蛋白及其低分子量變異體(LMW)的溶液中純化Fc區(qū)蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來降低蛋白制品，例如，抗體制品中的一種或多種低分子量變異體類的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的低分子量變異體水平比源液中的低分子量變異體水平小至少5倍，在某些實(shí)施方案中，比源液中的低分子量變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述低分子量變異體包括小于約1.0%，0.8%，0.5%，0.2%或0.1%的所述蛋白的種類。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從包括含F(xiàn)c區(qū)蛋白及其二硫鍵缺失變異體(UDB)的溶液中純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來降低蛋白制品，例如，抗體制品中的一種或多種二硫鍵缺失變異體類的水平。在多種實(shí)施方案中，從Fc結(jié)合劑回收的蛋白的二硫鍵缺失變異體水平比源液中的二硫鍵缺失變異體水平小至少5倍，在某些實(shí)施方案中，比源液中的二硫鍵缺失變異體水平小至少10倍。在多種實(shí)施方案中，在含有所述回收自Fc結(jié)合劑的蛋白的溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約20%，15%，10%，5%，2%或1%的所述蛋白的種類。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法純化的含F(xiàn)c區(qū)的蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了適用于實(shí)施任何方法的系統(tǒng)，所述方法至少包括首先將蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟。在其它方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)施任何方法的純化系列，所述方法至少包括首先將蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟。在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征還在于用于實(shí)施本發(fā)明的一種或多種方法的試劑盒。在多種實(shí)施方案中，所述試劑盒包括至少一種試劑和所述試劑盒的使用說明書。例如，試劑盒可以包括一種或多種試劑，例如，F(xiàn)c結(jié)合劑，二價(jià)陽離子鹽和用于制備含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖洗滌液的試劑，以及所述試劑盒的使用說明書。發(fā)明詳述在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，對(duì)本文將要使用的特定術(shù)語的定義進(jìn)行闡述有助于對(duì)本發(fā)明的理解。將本文所述定義分組只是為了方便參考而不是為了限制。蛋白相關(guān)定義在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了從包含含F(xiàn)c區(qū)蛋白及其一種或多種連讀變異體，例如，內(nèi)含子連讀變異體的溶液中純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白的方法。在特征方面，本發(fā)明的方法被用來降低蛋白制品，例如，抗體制品中一種或多種內(nèi)含子連讀(IRT)變異體類的水平。本文中，術(shù)語"內(nèi)含子連讀變異體"和"內(nèi)含子連讀變異體類"可以互換使用，指在感興趣的含F(xiàn)c區(qū)蛋白(例如，靶蛋白)的合成中，多肽鏈延伸在編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄之前被編碼區(qū)前的內(nèi)含子中的終止密碼子終止的過程的產(chǎn)物。結(jié)果是感興趣的蛋白的具有一個(gè)或多個(gè)不完全或缺失結(jié)構(gòu)域的變異體(即，內(nèi)含子連讀變異體)。這種內(nèi)含子可以包含一個(gè)以上的終止密碼子，從而導(dǎo)致了產(chǎn)生數(shù)個(gè)不同內(nèi)含子連讀變異體的可能性。術(shù)語"二硫鍵缺失變異體"或"UDB"是指任何缺失至少一個(gè)二硫鍵的種類。缺失的二硫鍵可以是鏈間二硫鍵或鏈內(nèi)二硫鍵或這兩者的組術(shù)語"低分子量種類"或"LMW"類是指含F(xiàn)c區(qū)蛋白的變異體，其包括由游離重鏈，游離輕鏈，IRT類，半分子和四分之三分子或其混合物組成的蛋白種類。A蛋白是在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株中發(fā)現(xiàn)的約42kD的細(xì)胞壁蛋白，其以高親和力(與人IgG的親和力約為IO.8M)與抗體的Fc區(qū)結(jié)合。本文所用術(shù)語"A蛋白"包括從其天然來源獲得的A蛋白，合成產(chǎn)生的A蛋白(例如，通過肽合成，通過重組技術(shù)等)及其保留了結(jié)合具有CH2/CH3區(qū)的蛋白的能力的變異體。G蛋白是G組鏈球菌的細(xì)胞壁蛋白。G蛋白是以高親和力與抗體，尤其IgG抗體的Fc區(qū)結(jié)合的III型Fc受體。本文所用術(shù)語"G蛋白"包括從其天然來源獲得的G蛋白，合成產(chǎn)生的G蛋白(例如，通過肽合成，通過重組技術(shù)等)及其保留了結(jié)合具有Fc區(qū)的蛋白的能力的變異體。術(shù)語"抗體"或"免疫球蛋白"(本文中可以互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四肽多鏈基本結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合蛋白，所述鏈通過例如，鏈間二硫鍵而被穩(wěn)定化，所述抗原結(jié)合蛋白具有特異性結(jié)合抗原的能力。重鏈和輕鏈都折疊成結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"是指包括肽環(huán)(例如，包括3-4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的球形區(qū)，所述肽環(huán)通過例如，/5-折疊片和/或鏈內(nèi)二硫鍵而被穩(wěn)定化。本文中，根據(jù)在"恒定"結(jié)構(gòu)域的情況下，多類成員的結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列變異的相對(duì)缺乏，或在"可變"結(jié)構(gòu)域的情況下，多類成員的結(jié)構(gòu)域內(nèi)的顯著變異，結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步被稱為"恒定"結(jié)構(gòu)域或"可變"結(jié)構(gòu)域。輕鏈上的"恒定"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱為"輕鏈恒定區(qū)"，"輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域"，"CL"區(qū)或"CL"結(jié)構(gòu)域。重鏈上的"恒定"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱為"重鏈恒定區(qū)"，"重鏈恒定結(jié)構(gòu)域"，"CH"區(qū)或"CH"結(jié)構(gòu)域。輕鏈上的"可變"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱為"輕鏈可變區(qū)"，"輕鏈可變結(jié)構(gòu)域"，"VL"區(qū)或"VL"結(jié)構(gòu)域。重鏈上的"可變"結(jié)構(gòu)域可以互換地稱為"重鏈可變區(qū)"，"重鏈可變結(jié)構(gòu)域"，"VH"區(qū)或"VH"結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"片段"是指抗體或抗體鏈的一部分，其包括比完整或完全抗體或抗體鏈少的氨基酸殘基。片段可以通過化學(xué)或酶處理完整或完全抗體或抗體鏈而獲得。片段也可以通過重組方法獲得。例示性片段包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)abc和/或Fv片段。術(shù)語"抗原結(jié)合片段"是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其結(jié)合抗原，或與其衍生自的完整抗體競爭特異性抗原結(jié)合。術(shù)語"抗體融合蛋白"和"抗體融合"是指融合蛋白，其包括與至少一種非抗體蛋白部分或多肽融合的抗體的全部或一部分。融合通常通過編碼所述蛋白的基因的基因工程化而完成。其它例示性抗體融合蛋白包括結(jié)合與另一可溶或細(xì)胞生物蛋白的全部或一部分，例如，受體(細(xì)胞受體或可溶受體)或其部分，細(xì)胞因子或其部分，酶或其部分等融合的抗體的一部分(包括FC區(qū))的細(xì)胞受體。這種包括與另一蛋白融合的抗體的Fc區(qū)的抗體融合蛋白在本領(lǐng)域中也被稱為Fc融合蛋白。術(shù)語"Fc結(jié)合劑"是指能與抗體(例如，IgG抗體)的Fc區(qū)結(jié)合的分子，其包括但不限于補(bǔ)體蛋白，F(xiàn)c受體或由細(xì)菌衍生的對(duì)抗體的Fc區(qū)具有高親和力的蛋白，如A蛋白或G蛋白。術(shù)語"Fc區(qū)"是指IgG抗體的C末端區(qū)，尤其指所述IgG抗體的重鏈的C末端區(qū)。盡管IgG重鏈的Fc區(qū)的邊界可以細(xì)微地變化，但Fc區(qū)通常被定義為約從IgG重鏈的氨基酸殘基Cys226跨越到羧基端。色譜相關(guān)定義本文所用術(shù)語"源液"是指包含至少一種希望從其它同樣存在的物質(zhì)中純化出來的耙物質(zhì)的液體。源液可以是，例如，水溶液，有機(jī)溶劑系統(tǒng)或水/有機(jī)溶劑混合物或溶液。源液常常為含有許多生物分子(如蛋白，抗體，激素和病毒)，小分子(如鹽，糖，脂質(zhì)等)甚至顆粒物質(zhì)的復(fù)雜混合物或溶液。雖然生物起源的典型源液以水溶液或懸浮液開始，但其也可以含有在例如溶劑沉淀，提取等早期分離步驟中所使用的有機(jī)溶劑。包含能通過本發(fā)明的多種實(shí)施方案純化的有價(jià)值的生物物質(zhì)的源液的例子包括但不限于來自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)上清液，勻化的細(xì)胞懸液，血槳，血漿組分和牛乳。本文中，術(shù)語"靶物質(zhì)"或"靶蛋白"是指期望從源液中純化出來的一種或多種含F(xiàn)c區(qū)蛋白。靶物質(zhì)可以存在于為懸浮液的源液或溶液中。術(shù)語"雜質(zhì)"是指源液中的不同于靶物質(zhì)，并且希望從最終的靶物質(zhì)產(chǎn)品中除去的物質(zhì)。典型的雜質(zhì)包括核酸，蛋白(包括內(nèi)含子連讀類，低分子量種類和二硫鍵缺失類)，肽，內(nèi)毒素，病毒和小分子。本文所用術(shù)語"固相"是指在純化過程中與靶物質(zhì)相互作用，或Fc結(jié)合劑可以附著其上的非水基質(zhì)。適宜的固相材料包括但不限于玻璃，二氧化硅(例如，硅膠)，多糖(例如，多糖基質(zhì))，如瓊脂糖和纖維素，有機(jī)聚合物，如聚丙烯酰胺，甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，例如，AmberliteTM樹脂(可購自Rohm&HaasChemicalCo.,Philadelphia,Pa.)。固相可以選自通常被描述為親和樹脂，離子交換樹脂和離子俘獲樹脂的樹脂中的任何一種。固相可以是，例如，純化柱，離散顆粒的非連續(xù)相或其組合。固相可以具有多孔或無孔特性，并且可以是可壓縮或不可壓縮的。在多種實(shí)施方案中，固相是聚合物基質(zhì)或瓊脂糖顆?；蛑椤Ｔ诙喾N實(shí)施方案中，固相可以涂覆有試劑(如甘油)，以防止例如雜質(zhì)在固相上的非特異性附著。Fc結(jié)合固相只需要具有允許Fc結(jié)合劑附著到所述固相表面的化學(xué)物或結(jié)合的配體。優(yōu)選固相材料對(duì)純化過程，包括抽濾和錯(cuò)流過濾中所采用的條件和所用液體的溫度，pH以及其它方面將具有物理和化學(xué)可恢復(fù)性。"親和配體"是指通過與源液組分的結(jié)合位點(diǎn)的特異性相互作用而與所述組分選擇性或優(yōu)先結(jié)合的分子。在本發(fā)明中，親和配體(例如，F(xiàn)c結(jié)合劑)通常被固定在固定相，如樹脂上?？梢越Y(jié)合至樹脂載體上，以提供可用于本發(fā)明的過程的色譜用樹脂的親和配體的例子包括但不限于A蛋白，G蛋白及其選擇性結(jié)合蛋白Fc區(qū)的類似物。使親和配體與固體載體材料結(jié)合的方法是純化
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。參見，例如，參考書AffinitySeparations:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),PaulMatejtschuk(Editor),IrlPr:1997;禾BAffinityChromatography,HerbertSchott，MarcelDekker,NewYork:1997。"親和色譜用樹脂"或"親和樹脂"是指包括具有結(jié)合在固相或底物表面的親和配體的固相或底物的色譜用樹脂。"離子交換色譜用樹脂"或"離子交換樹脂"是指與帶有正或負(fù)電荷的配體共價(jià)結(jié)合，因而具有可用于與所述離子交換樹脂所接觸的溶液中的離子進(jìn)行交換的游離平衡離子的固體載體。"陽離子交換樹脂"是指與帶負(fù)電荷的配體共價(jià)結(jié)合，因而具有用于與所述樹脂所接觸的溶液中的陽離子進(jìn)行交換的游離陽離子的離子交換樹脂。本領(lǐng)域已知有很多種陽離子交換樹脂，例如，其中共價(jià)結(jié)合基團(tuán)是羧酸鹽或磺酸鹽的陽離子交換樹脂。市場上可以買到的陽離子交換樹脂包括CMC-纖維素，SP-SephadexTM和FastS-SepharoseTM(后兩者可購自Pharmacia)。"陰離子交換樹脂"是指與帶正電荷的基團(tuán)，如季銨基共價(jià)結(jié)合的離子交換樹脂。市場上可以買到的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素，TMAE，QAESephadexTM禾口FastQSepharose(后兩者可購自Pharmacia)0本文所用術(shù)語"離液序列高的鹽"是指包括一種或多種感膠離子序列低，能滲透蛋白水化層，并與其表面直接結(jié)合的離子組分的鹽。這破壞了共水合締合(cohydrativeassociation)，從而有利于蛋白的增溶。離液序列高的鹽的例子包括但不限于II族元素的鹵化鹽(例如，氯化鈣，氯化鎂，氯化鋇，溴化鈣，溴化鎂，溴化鋇，碘化鈣，碘化鎂，碘化鋇)。適宜二價(jià)陽離子鹽的例子包括但不限于Mn2、N產(chǎn)或Cu2+，Mg2+，Ca2lDBa2+與硫氰酸根(SCN.)，高氯酸根(C104.)，硝酸根(N03.)，氯離子(CI.)和溴離子(Br.)的鹽及其組合物。在某些實(shí)施方案中，二價(jià)陽離子鹽包括二價(jià)陽離子(例如，Mg2+，Ca2+，N產(chǎn)或B^+)。優(yōu)選用于特征過程的離液序列高的鹽有MgCl2，NiCh和CaCl2。在二價(jià)陽離子鹽洗滌步驟之后，靶蛋白從親和色譜基質(zhì)上洗脫下來。"緩沖劑"是其存在于溶液中時(shí)增加導(dǎo)致pH的單位變化所必須加入的酸或堿的量的物質(zhì)。緩沖液通過其酸-堿軛合物組分的作用而抵抗pH的變化。與生物試劑一起使用的緩沖液通常能維持恒定濃度的氫離子，以使溶液的pH在生理范圍內(nèi)。術(shù)語"生理pH"是指哺乳動(dòng)物血液的pH(即，7.38或約7.4)。因此，生理pH范圍是約7.2-7.6。傳統(tǒng)緩沖劑組分包括但不限于有機(jī)和無機(jī)鹽，酸和堿。用于生物分子(例如，蛋白分子)純化的例示性緩沖劑包括兩性離子或"Good"緩沖劑，參見，例如，Goodetal.(1966)Biochemistry5:467禾口GoodandIzawa(1972)MethodsEnzymol.24:62。例示性緩沖劑包括但不限于TES，MES，PIPES,HEPES，MOPS，MOPSO，TRIC腿禾卩BICINE。本文中的"平衡緩沖液"是用來制備Fc結(jié)合試劑，固相或此兩者，用于含有耙蛋白的源液的上樣的緩沖液。平衡緩沖液優(yōu)選是等滲的，并且pH通常在約6至約8的范圍內(nèi)。"上樣緩沖液"是用來將含有含F(xiàn)c區(qū)蛋白和雜質(zhì)的源液上樣到Fc結(jié)合劑被固定于其上的固相上的緩沖液。通常，平衡和上樣緩沖液是相同的。"洗脫緩沖液"是用來從被固定的Fc結(jié)合劑上洗脫含F(xiàn)c區(qū)蛋白的緩沖液。優(yōu)選洗脫緩沖液具有較低的pH，從而破壞Fc結(jié)合劑與感興趣的蛋白間的相互作用。優(yōu)選低pH的洗脫緩沖液的pH在約2至約5，更優(yōu)選在約3至約4的范圍內(nèi)。將pH控制在該范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括甘氨酸，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽和銨緩沖液及其組合物。優(yōu)選的這類緩沖液是檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液，最優(yōu)選的是檸檬酸鈉或醋酸鈉緩沖液。涵蓋的其它洗脫緩沖液包括用于洗脫感興趣的蛋白的高pH緩沖液(例如，pH為9或9以上的緩沖液)或包括例如MgCl2(2mM)的化合物或組合物的緩沖液。本文用到的"洗滌液"或"洗滌緩沖液"在本文中都是指用來將雜質(zhì)從結(jié)合了耙物質(zhì)的色譜用樹脂上帶走的液體。可以相繼使用一種以上的洗滌液，例如，設(shè)計(jì)依次用具有不同特性，如pH，導(dǎo)電率，溶劑濃度等的洗滌液離解和除去與所述色譜用樹脂非特異性締合的不同類型的雜質(zhì)。本文中的"洗脫液"或"洗脫緩沖液"是指用來從已經(jīng)一種或多種洗滌液洗滌過的色譜用樹脂上離解靶物質(zhì)的液體。洗脫液在不使靶物質(zhì)不可逆變性的條件下將其離解。典型的洗脫液是色譜
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的，其可以具有較高濃度的鹽，游離親和配體或類似物，或其它促進(jìn)所述耙物質(zhì)從所述色譜用樹脂離解的物質(zhì)。"洗脫條件"是指加在被靶物質(zhì)結(jié)合的色譜用樹脂上的，從所述色譜用樹脂上離解所述靶物質(zhì)的處理?xiàng)l件，例如，使被所述靶物質(zhì)結(jié)合的色譜用樹脂與洗脫液或洗脫緩沖液接觸，以產(chǎn)生這種離解。本文中的"清洗液"或"清洗緩沖液"是指用來在純化過程完成之后洗滌色譜用樹脂的液體。清洗液可以含有洗滌劑，病毒滅活劑或相對(duì)高濃度的鹽，其pH可以比純化過程中所使用的液體高或低。其目的是凈化色譜用樹脂，以使其隨時(shí)可以再使用。典型的清洗液是色譜
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。本文中的"保存液"或"保存緩沖液，'是指色譜用樹脂在兩次使用之間懸浮于其中的液體。除了緩沖離子外，保存液還含有殺微生物劑或其它防腐劑。這類保存液在色譜
技術(shù)領(lǐng)域：
是公知的。在多個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于通過將具有Fc區(qū)的蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以去除一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的過程，從包括所述蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化具有Fc區(qū)蛋白的方法。適宜的Fc結(jié)合劑包括但不限于A蛋白和G蛋白。本發(fā)明的特征在于純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白，例如，抗體的過程。例示性純化過程包括親和色譜步驟。所述親和色譜步驟可以是連續(xù)的，不連續(xù)的，或?yàn)閮烧叩慕M合。例如，親和色譜步驟可以不連續(xù)過程，例如，分批過程來進(jìn)行。親和色譜是靶化合物與固定配體發(fā)生生物選擇性吸附，隨后從固定配體上回收的過程。該過程允許靶化合物的高度特異性和有效的純化。該過程需要使用具有適當(dāng)選擇性，在允許在溫和條件下回收的條件下，通常以10—4-10—s的離解常數(shù)范圍結(jié)合靶化合物(例如，含F(xiàn)c區(qū)蛋白)的配體(例如，F(xiàn)c結(jié)合劑)。所述配體通常被固定在珠狀和多孔基質(zhì)上，所述基質(zhì)可以是柱填料或分批吸附介質(zhì)。優(yōu)選結(jié)合劑是A蛋白。A蛋白結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)。A蛋白由6個(gè)區(qū)組成，其中5個(gè)區(qū)結(jié)合IgG。其以高親和力與人IgG^IgG2禾卩IgG4及小鼠IgG^，IgGa和IgG3結(jié)合。A蛋白以中等親和力與人IgD，IgM，IgA和IgE及小鼠IgGj吉合。作為親和配體，A蛋白被使這些區(qū)可以自由結(jié)合的方始固定在基質(zhì)上。一分子的固定化A蛋白可以結(jié)合至少兩分子的IgG。天然和重組形式的A蛋白對(duì)IgG的Fc區(qū)共有類似的特異性。重組A蛋白(rProteinA)可以被工程化成包括，例如，C末端半胱氨酸，并且可以通過硫酯偶聯(lián)固定至固相基質(zhì)上。這種偶聯(lián)導(dǎo)致A蛋白的結(jié)合容量增加。其它結(jié)合劑有G蛋白。G蛋白對(duì)IgG具有特異性，其以高親和力與人IgGt，IgG2，IgG3和IgG4及小鼠IgGi和IgG3結(jié)合。G蛋白PLUS對(duì)人IgG4和小鼠IgG2a，IgG化和IgG3具有中度親和力。重組G蛋白(rProteinG)可以工程化成缺失天然蛋白的白蛋白結(jié)合區(qū)。重組G蛋白含有2個(gè)Fc結(jié)合區(qū)。其它結(jié)合劑有A/G蛋白。A/G蛋白是兼?zhèn)銩蛋白和G蛋白的IgG結(jié)合特性的基因工程蛋白。A/G蛋白是由非病原形式的芽胞桿菌分泌的基因融合產(chǎn)物。A/G蛋白含有4個(gè)來自A蛋白和2個(gè)來自G蛋白的Fc結(jié)合域。A/G蛋白并不象A蛋白一樣具有pH依賴性，然而在別的方面卻具有A蛋白和G蛋白的累加特性。A/G蛋白與所有人IgG亞類結(jié)合，尤其適合亞類未確定的多克隆或單克隆IgG抗體的純化。另外，A/G蛋白還與IgA，IgE，IgM禾B(在較小程度上)IgD結(jié)合。A/G蛋白還與所有小鼠IgG亞類結(jié)合良好，尤其適合IgG亞類小鼠單克隆抗體的純化，而不受到IgA，IgM和鼠血清白蛋白的干擾(參見，例如，Sikkema.(1989)Amer.Biotech.Lab7，42.)。個(gè)別小鼠單克隆抗體亞類對(duì)嵌合A/G蛋白的親和力大于對(duì)A蛋白或G蛋白的親和力(參見，例如，Eliassonetal.(1988)J.Biol.Chem.263，4323-4327.)。在本發(fā)明中，固定化Fc結(jié)合劑(例如，A蛋白)用二價(jià)陽離子鹽溶液洗滌，以除去雜質(zhì)。尤其是，我們發(fā)現(xiàn)，作為重組抗體表達(dá)技術(shù)的結(jié)果產(chǎn)生的非預(yù)期雜質(zhì)可以通過二價(jià)陽離子鹽洗滌步驟除去。本發(fā)明的方法在親和色譜和二價(jià)陽離子洗滌步驟之后可以任選地包括純化步驟。隨后的純化步驟可以包括離子交換色譜步驟和/或疏水相互作用色譜(HIC)步驟。隨后的色譜步驟可以是連續(xù)的，不連續(xù)的(例如，分批過程)，或者為兩者的組合。離子交換色譜根據(jù)蛋白總電荷的不同而分離分子。為了結(jié)合，靶蛋白必須帶有與樹脂上所連官能團(tuán)相反的電荷。例如，通常帶有總正電荷的抗體將與含有帶負(fù)電荷官能團(tuán)的陽離子交換劑結(jié)合良好。由于這種相互作用是離子性的，因此結(jié)合必須在低離子強(qiáng)度條件下進(jìn)行。洗脫通過增加離子強(qiáng)度以破壞所述離子相互作用，或通過改變所述蛋白的pH而完成。離子交換色譜依靠蛋白的電荷而將其分離，而疏水相互作用色譜則利用了一些蛋白的疏水特性。蛋白上的疏水基團(tuán)與柱上的疏水基團(tuán)結(jié)合。蛋白的疏水性越強(qiáng)，其與柱的結(jié)合就越強(qiáng)。HIC步驟除去了，例如，由宿主細(xì)胞衍生的雜質(zhì)(例如，DNA及其它高和低分子量產(chǎn)物相關(guān)種類)。如本文所述，進(jìn)一步的純化步驟可以包括病毒去除步驟及超濾和/或滲濾步驟。在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白是具有與Fc結(jié)合劑的Fc受體結(jié)合的Fc區(qū)的抗體或抗體融合蛋白。用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌Fc結(jié)合劑使得雜質(zhì)，例如，感興趣的蛋白(例如，源液中的靶物質(zhì))的連讀變異體和含有恒定區(qū)的片段(包括LMW和UDB類)被大量去除。本發(fā)明的方法包括一個(gè)或多個(gè)色譜分離步驟，另外，還可以包括一個(gè)或多個(gè)過濾步驟，用于從源液的雜質(zhì)中分離具有Fc區(qū)的蛋白("靶蛋白")。例如，在源液與Fc結(jié)合劑接觸前，可以將所述源液過濾，離心或以其它方式處理，以除去顆粒碎屑等。例如，采用重組技術(shù)，蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)，壁膜間隙中產(chǎn)生，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果蛋白在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，則可以通過例如，離心或超濾除去顆粒碎屑，艮卩，宿主細(xì)胞或溶解的碎片。在蛋白分泌入培養(yǎng)基的情況下，重組宿主細(xì)胞可以通過例如，切向流過濾從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。在多種實(shí)施方案中，含有靶蛋白的源液與Fc結(jié)合劑(優(yōu)選固定在固相上，并用適宜緩沖液平衡)接觸以使得所述靶蛋白吸附到所述Fc結(jié)合劑(例如，固定化Fc結(jié)合劑)上。源液與Fc結(jié)合劑(例如，固定化Fc結(jié)合劑)在上樣緩沖液中接觸，所述上樣緩沖液可以與平衡緩沖液相同。當(dāng)含有雜質(zhì)的源液流過固相時(shí)，靶蛋白被吸附到Fc結(jié)合劑上，而其它多種雜質(zhì)(如所述靶蛋白在重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)的宿主細(xì)胞蛋白，或由其它過程衍生的雜質(zhì))則流過或非特異性地結(jié)合在固相上。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑是A蛋白，并且平衡緩沖液可以是含0.15MNaCl的20mMTris(pH7.5)。其它適宜的平衡緩沖液包括，例如，具有生理濃度，如范圍為約0.5mM至約100mM(例如，10mM，20mM，50mM等)的濃度和生理鹽濃度(例如，約0.15mMNaCl)及5.0-9.0的pH的BIS，HEPES等。固相優(yōu)選為用于固定Fc結(jié)合劑的瓊脂糖(例如，Sepharose)珠或顆粒。在多種實(shí)施方案中，柱被涂覆以試劑，如甘油，以減少或防止柱的非特異性附著。在多種實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)合劑是A蛋白?？少徸訟mershamBiosciences的rmpA蛋白SepharoseTM快速(FF)柱是用于本特征方法的適宜A蛋白柱的例子。然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖洗滌液洗滌Fc結(jié)合劑，以除去固相或Fc結(jié)合劑上結(jié)合的蛋白變異體類。尤其是，我們發(fā)現(xiàn)，二價(jià)陽離子鹽洗滌步驟的應(yīng)用可以除去大量的非預(yù)期雜質(zhì)。具體地說，我們發(fā)現(xiàn)，耙蛋白的內(nèi)含子連讀變異體，低分子量變異體和二硫鍵缺失變異體可以用二價(jià)陽離子鹽洗滌除去。此外，宿主細(xì)胞蛋白(HCP)和DNA也可以用二價(jià)陽離子鹽洗滌除去。在多種實(shí)施方案中，洗滌液中的二價(jià)陽離子鹽包括離液序列高的鹽。適宜的離液序列高的鹽的例子包括但不限于氯化鈣(CaCl2)，氯化鎳(NiCl2)和氯化鎂(MgCl2)。雖然在洗滌液中可以僅存在單一的二價(jià)陽離子鹽，但在多種實(shí)施方案中，可以使用兩種或兩種以上的二價(jià)陽離子鹽。在多種實(shí)施方案中，采用除含有二價(jià)陽離子鹽的洗滌液之外的洗滌液除去雜質(zhì)。例如，在多種實(shí)施方案中，在用含有二價(jià)陽離子鹽的洗滌液洗滌Fc結(jié)合劑之前，之后或之前和之后都用含有20-50mMTris，0.75-2.0MNaCl，pH為5.0-9.0的溶液和/或含有10mMTris，pH為7.5的溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑。在多種實(shí)施方案中，二價(jià)陽離子鹽優(yōu)選以約0.5M至約2.5M的濃度加入到pH范圍為約5至約9，優(yōu)選約7至約8的pH緩沖液中。二價(jià)陽離子鹽的優(yōu)選濃度包括但不限于0.6M，2.0M和2.5M。適于該目的的緩沖液包括但不限于濃度為20-50mM的Tris或醋酸鹽緩沖液。在洗滌步驟之后，靶蛋白從Fc結(jié)合劑上回收。這通常用適宜的洗脫緩沖液完成。靶蛋白可以用例如，低pH，例如，范圍為約2至約6.5，優(yōu)選約2.5至約3.5的洗脫緩沖液從柱上洗脫。在多種實(shí)施方案中，這樣回收的靶蛋白可以在藥學(xué)上可接受的載體中進(jìn)行配制，并用于各種診斷，治療或其它已知的這類分子的用途。在多種實(shí)施方案中，被洗脫的靶蛋白制品在Fc結(jié)合劑色譜步驟之后可以進(jìn)行其它純化步驟。例如，例示性的進(jìn)一步的純化步驟包括但不限于陰離子交換色譜，陽離子交換色譜，疏水相互作用色譜(HIC)，磷灰石色譜，透析，親和色譜(包括固定化金屬親和色譜)，分子排阻色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)，色譜聚焦，超濾，滲濾和凝膠過濾。在多種實(shí)施方案中，所述Fc結(jié)合劑色譜步驟后跟隨有陰離子交換色譜和HIC步驟。在多種實(shí)施方案中，所述色譜步驟后還跟隨著病毒過濾步驟，超濾/滲濾步驟和/或微生物污染物過濾步驟。在多種實(shí)施方案中，這些另外的色譜步驟可以在所述Fc結(jié)合劑色譜步驟之前進(jìn)行。在多個(gè)方面，本文中的方法涉及通過A蛋白色譜從雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白。在多種實(shí)施方案中，純化含F(xiàn)c區(qū)蛋白(靶蛋白)的方法從將所述耙蛋白吸附到包括固定在固相上的A蛋白的Fc結(jié)合劑上開始，然后用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑，以除去一種或多種雜質(zhì)，隨后從所述A蛋白上回收所述蛋白，以產(chǎn)生第一洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述純化過程這樣繼續(xù)進(jìn)行，即，通過陰離子交換樹脂與所述第一洗脫池以使得雜質(zhì)被吸附在所述樹脂上，而所述靶蛋白不吸附至樹脂上的方式接觸，而對(duì)所述第一洗脫池進(jìn)行陰離子交換色譜。因此，所述靶蛋白可以從流過的液體中回收，以產(chǎn)生第二洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述陰離子交換色譜步驟進(jìn)一步包括用緩沖洗滌液洗滌所述陰離子交換樹脂，以回收至少一部分被吸附的靶蛋白，然后將其與所述第二洗脫池合并?；蛘?，所述第一洗脫池可以與陰離子交換樹脂以抗體被吸附，卻允許任何雜質(zhì)流過這樣一種方式接觸，然后任選地進(jìn)行洗滌和洗脫被吸附的抗體。在多種實(shí)施方案中，所述純化過程這樣繼續(xù)進(jìn)行，S卩，通過將所述耙蛋白吸附至疏水相互作用樹脂(例如，經(jīng)疏水配體官能化的固相)上，用離子強(qiáng)度幾乎不洗脫所述靶蛋白的緩沖洗漆液洗滌所述疏水相互作用樹脂，然后在第三洗脫池上回收所述靶蛋白(通常用離子強(qiáng)度低至足以使所述靶蛋白從所述疏水相互作用樹脂上解吸附的洗脫緩沖液)，而對(duì)所述第二洗脫池進(jìn)行疏水相互作用色譜(HIC)。或者，所述第二洗脫池可以與所述HIC柱以所述靶蛋白不被吸附的方式接觸，從而回收流過的靶蛋白作為第三洗脫池。在多種實(shí)施方案中，所述純化過程包括一個(gè)或多個(gè)過濾步驟，例如，為了除去病毒，濃縮和緩沖含有靶蛋白的溶液，以及去除微生物污染物的過濾步驟。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括具有Fc區(qū)的蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述蛋白的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種IRT變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了源液中IRT變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選IRT變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選IRT變異體水平降低至少IO倍。例如，在含有約3-5。/。IRT抗體變異體(為總的IRT抗體變異體類占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，IRT抗體變異體類可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，IRT變異體類被降低至小于1。/。，小于0.8%,小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過程中，IRT變異體被降低至總IRT變異體類占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%,小于0.2%和/或小于0.1%。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括具有Fc區(qū)的蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述蛋白的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種LMW變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了源液中LMW變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選LMW變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選LMW變異體水平降低至少10倍。例如，在具有約20y。UDB抗體變異體(為總的UDB抗體變異體類占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，UDB抗體變異體類可以降低至約10%至約2%。在多種實(shí)施方案中，UDB變異體類被降低至小于20%,小于15%,小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過程中，UDB變異體被降低至總UDB變異體類占所述源液的百分比小于20。/c)，小于15%，小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。例如，在具有約3-5%LMW抗體變異體(為總的LMW抗體變異體類占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，LMW抗體變異體類可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，LMW變異體類被降低至小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%和/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過程中，LMW變異體被降低至總LMW變異體類占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%和/或小于0.1%。在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包括具有Fc區(qū)的蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述蛋白的方法，其中所述雜質(zhì)包括一種或多種UDB變異體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了源液中UDB變異體水平約2倍至約20倍的降低。優(yōu)選UDB變異體水平降低至少5倍，更優(yōu)選UDB變異體水平降低至少IO倍。例如，在具有約2(P/。UDB抗體變異體(為總的UDB抗體變異體類占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，UDB抗體變異體類可以降低至約10%至約2%。在多種實(shí)施方案中，UDB變異體類被降低至小于20%，小于15%，小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過程中，UDB變異體被降低至總UDB變異體類占所述源液的百分比小于20。/。，小于15%,小于10%，小于5%，小于2%或小于1%。同樣，例如，在含有約3-5。/。UDB抗體變異體(為總的UDB抗體變異體類占所述源液的百分比)的源液(起始樣品)中，UDB抗體變異體類可以降低至約0.3%至約0.5%。在多種實(shí)施方案中，UDB變異體類被降低至小于1。/o，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。優(yōu)選在用于制備蛋白的源液的純化過程中，UDB變異體被降低至總UDB變異體類占所述源液的百分比小于1%，小于0.8%，小于0.5%，小于0.3%，小于0.2%禾口/或小于0.1%。用于本發(fā)明的純化方法的蛋白本文所述將根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的具有Fc區(qū)的蛋白采用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括例如，合成技術(shù)(如重組技術(shù)和肽合成或這些技術(shù)的組合)制備，或者分離自所述蛋白的內(nèi)生性來源。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，具有Fc區(qū)的蛋白是抗原結(jié)合多肽，更優(yōu)選為抗體。所述抗體可以是，例如，多克隆抗體制品，單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人源化抗體或人抗體。產(chǎn)生抗原結(jié)合多肽，尤其是抗體的技術(shù)在下文中描述?；蛘?，具有Fc區(qū)的蛋白可以是抗體的改良形式，如雙特異性抗體，抗體軛合物或抗體融合蛋白(例如，F(xiàn)c融合蛋白)。產(chǎn)生這種抗體的改良形式和抗體融合蛋白的技術(shù)也在下文中描述。多克隆抗體多克隆抗體可以通過用免疫原免疫適宜的受試者來制備。免疫受試者的抗體效價(jià)可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)用固定化靶抗原，隨著時(shí)間的推移進(jìn)行監(jiān)測。如果需要，可以將針對(duì)所述耙抗原的抗體分子從哺乳動(dòng)物(例如，從血液)中分離出來，并通過公知技術(shù)，如A蛋白瓊脂糖色譜進(jìn)一步純化，以獲得所述抗體，例如，IgG，部分。在免疫后適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，例如，當(dāng)抗抗原抗體的效價(jià)最高時(shí)，可以從所述受試者獲取產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如最初由Kohler和Milstein((1975)Nature256:495-497)描述的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體(也參見，Brownetal.(1981)J.Immunol.127:539-46;B薩netal.(1980;>J.Biol.Chem.255:4980-83;Yehetal.(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:2927-31;和Yehetal.(1982)Int.J.Cancer29:269-75)。嵌合多克隆抗體的制備請參見Buechler等的美國專利No.6,420,113。單克隆抗體許多用于融合淋巴細(xì)胞和無限增殖化細(xì)胞系的公知方案中的任何一種都可以應(yīng)用于產(chǎn)生單克隆抗體的目的(參見，例如，G.Galfreetal.(1977)Nature266:55052;Gefteretal.SomaticCellGenet,上文已引用；Leraer,YaleJ.Biol.Med.,上文已弓l用；Kenneth,MonoclonalAntibodies:上文已引用)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，這些方法的許多變體也將是有用的。通常，無限增殖細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)由與所述淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物種類衍生而來。例如，鼠雜交瘤可以通過用無限增殖化小鼠細(xì)胞系融合經(jīng)本發(fā)明的免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞而制得。優(yōu)選無限增殖細(xì)胞系是對(duì)含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基("HAT培養(yǎng)基")敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。許多骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種都可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伴侶，例如，P3-NSl/l-Ag4-l，P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可獲自ATCC。通常，用聚乙二醇("PEG")將對(duì)HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合至小鼠脾細(xì)胞。然后用HAT培養(yǎng)基對(duì)該融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇，所述HAT培養(yǎng)基殺死未融合及非生產(chǎn)性己融合骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在數(shù)天后由于其未轉(zhuǎn)化而死亡)。采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析法，通過從所述雜交瘤培養(yǎng)上清液中篩選結(jié)合耙抗原的抗體而檢測產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。重組抗體除了制備分泌單克隆抗體的雜交瘤外，單克隆抗體還可以通過用耙抗原篩選重組免疫球蛋白組合文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)，以由此分離結(jié)合所述靶抗原的免疫球蛋白文庫成員而得到鑒定和分離。產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可以在市場上買到(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體洗脫，目錄號(hào)27-9400-01;禾BStratageneSurf2APTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。另外，尤其經(jīng)得起檢驗(yàn)的用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的例子可以在，例如，Ladneretal.美國專利No.5,223,409;Kangetal.PCT國際公開No.WO92/18619;Doweretal.PCT國際公開No.WO91/17271;Winteretal.PCT國際公開WO92/20791;Marklandetal.PCT國際公開No.WO92/15679;Breitlingetal.PCT國際公開WO93/01288;McCaffertyetal.PCT國際公開No.WO92/01047;Garrardetal.PCT國際公開No.WO92/09690;Ladneretal.PCT國際公開No.WO90/02809;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)H亂Antibod.Hybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Griffithsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMol.Biol.226:889-896;Clarksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580;Garradetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)Nuc.AcidRes.19:4133-4137;Barbasetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982;禾口McCaffertyetal.Nature(1990)348:552-554中找至lj。嵌合和人源化抗體另外，重組抗體，如可以采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備的包括人和非人部分的嵌合和人源化單克隆抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"是指包括至少一條人源化免疫球蛋白或抗體鏈(即，至少一條人源化輕鏈或重鏈)的免疫球蛋白或抗體。術(shù)語"人源化免疫球蛋白鏈"或"人源化抗體鏈"(即，"人源化免疫球蛋白輕鏈"或"人源化免疫球蛋白重鏈")是指具有包括基本上來自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本上來自非人免疫球蛋白或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)(例如，至少1個(gè)CDR，優(yōu)選2個(gè)CDRs，更優(yōu)選3個(gè)CDRs)的可變區(qū)，并進(jìn)一步包括恒定區(qū)(例如，在輕鏈的情況下，至少l個(gè)恒定區(qū)或其部分，及在重鏈的情況下，3個(gè)恒定區(qū))的免疫球蛋白或抗體鏈(分別即，輕鏈和重鏈)。術(shù)語"人源化可變區(qū)"(例如，"人源化輕鏈可變區(qū)"或"人源化重鏈可變區(qū)")是指包括基本上來自人免疫球蛋白或抗體的可變框架區(qū)和基本上來自非人免疫球蛋白或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)。術(shù)語"基本上來自人免疫球蛋白或抗體"或"基本上人的"的意思是，當(dāng)為了對(duì)比的目的而與人免疫球蛋白或抗體氨基酸序列比對(duì)時(shí)，該區(qū)與人框架或恒定區(qū)序列享有至少80-90%，90-95%或95-99%的同一性(即，局部序列同一性)，從而允許例如，保守置換，共有序列置換，種系置換，回復(fù)突變等。保守置換，共有序列置換，種系置換，回復(fù)突變等的引入通常被稱為人源化抗體或鏈的"最優(yōu)化"。術(shù)語"基本上來自非人免疫球蛋白或抗體"或"基本上非人的"表示具有與非人生物，例如，非人哺乳動(dòng)物的同一性為至少80-95%，優(yōu)選至少90-95%，更優(yōu)選96%，97%，98%或99%的免疫球蛋白或抗體序列。因此，人源化免疫球蛋白或抗體或人源化免疫球蛋白或抗體鏈的所有區(qū)或殘基，除CDRs外，都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)區(qū)或殘基基本同一。術(shù)語"相應(yīng)區(qū)"或"相應(yīng)殘基"是指當(dāng)?shù)谝缓偷诙蛄袨榱藢?duì)比的目的而進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，與所述第一氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基占有相同(即，相等)位置的所述第二氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)或殘基。術(shù)語"明顯同一"表示兩個(gè)多肽序列通過例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省間隙權(quán)重(defaultgapweights)進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，享有至少50-60%的序列同一性，優(yōu)選至少60-70%的序列同一性，更優(yōu)選至少70-80%的序列同一性，更優(yōu)選至少80-90%的序列同一性，更優(yōu)選至少90-95%的序列同一性，更優(yōu)選至少95%的序列同一性或更高(例如，99%的序列同一性或更高)。術(shù)語"基本同一"表示兩個(gè)多肽序列通過例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省間隙權(quán)重進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，享有至少80-90%的序列同一性，優(yōu)選至少90-95%的序列同一性，更優(yōu)選至少95%的序列同一性或更髙(例如，99%的序列同一性或更高)。為了序列對(duì)比，通常將一個(gè)序列作為參考序列，與測試序列進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)采用某種序列比對(duì)算法時(shí)，將測試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果需要，指定序列運(yùn)算程序參數(shù)。然后序列比對(duì)算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計(jì)算測試序列相對(duì)于參考序列的百分序列同一性。用于對(duì)比序列的最優(yōu)比對(duì)可以通過例如，Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，Needleman和Wunsch的同源比對(duì)算法法(J.Mol.Biol.48:443(1970))，Pearson和Lipman的相似性搜索法(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988))，這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(Wisconsin基因軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)，或目檢(參見Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology)進(jìn)行。適于確定百分序列同一性和序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST法，其在Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403(1990)中有描述。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)中心(可通過美國國家衛(wèi)生研究院NCBI互連網(wǎng)服務(wù)器公開進(jìn)入)公開獲得。盡管也可以使用用戶參數(shù)，但進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)通常使用缺省程序參數(shù)。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序所使用的缺省值是字長(W)為3，期望值(E)為10及BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。優(yōu)選不同一的殘基位置是因保守氨基酸置換而不同。為了將氨基酸置換分為保守或非保守置換的目的，將氨基酸分類如下I類(疏水側(cè)鏈)leu，met，ala，val，leu，ile;II類(中性親水側(cè)鏈)cys，ser，thr;III類(酸性側(cè)鏈):asp，glu;IV類(堿性側(cè)鏈):asn，gln，his,lys，arg;V類(影響鏈取向的殘基)gly，pro;和VI類(芳香族側(cè)鏈)trp，tyr，phe。保守置換涉及同類氨基酸間的置換。非保守置換通過某一類氨基酸的成員與另一類氨基酸的成員交換來構(gòu)成。優(yōu)選人源化免疫球蛋白或抗體結(jié)合抗原的親和力在相應(yīng)非人源化抗體親和力的為3，4或5的因數(shù)內(nèi)。例如，如果非人源化抗體的結(jié)合親和力為10-9M，人源化抗體將具有至少3xl0-8M，4x10-8M，5xl(T8M或10力M的結(jié)合親和力。當(dāng)免疫球蛋白鏈賦予完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)特異性結(jié)合特性或結(jié)合親和力時(shí)，則認(rèn)為其"直接結(jié)合抗原"。如果與包括無突變的等效鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)相比，所述突變(例如，回復(fù)突變)以至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的程度影響(例如，降低)包括所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親和力時(shí)，則認(rèn)為所述突變大大影響了重或輕鏈直接結(jié)合抗原的能力。如果突變對(duì)包括所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親和力的影響(例如，降低)僅為包括無所述突變的等效鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)的親和力的為2，3或4的因數(shù)時(shí)，則認(rèn)為其"幾乎不影響(例如，降低)鏈直接結(jié)合抗原的能力"。術(shù)語"嵌合免疫球蛋白"或抗體是指可變區(qū)衍生自第一物種，并且恒定區(qū)衍生自第二物種的免疫球蛋白或抗體。嵌合免疫球蛋白或抗體可以通過例如基因工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建。如下文定義的那樣，術(shù)語"人源化免疫球蛋白"或"人源化抗體"不希望包括嵌合免疫球蛋白或抗體。盡管人源化免疫球蛋白或抗體在其結(jié)構(gòu)上是嵌合的(即，包括來自一種以上蛋白的區(qū))，但如本文所述，其包含在嵌合免疫球蛋白或抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的其它特征(即，包括供體CDR殘基和受體框架殘基的可變區(qū))。這種嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如，采用Robinsonetal.國際專利申請No.PCT/US86/02269;Akira，etal.歐洲專利申請184,187;Taniguchi,M.，歐洲專利申請171,496;Morrisonetal.歐洲專利申請173,494;Neubergeretal.PCT國際公開No.WO86/01533;Cabillyetal.美國專利No.4,816,567;Cabillyetal.歐洲專利申請125,023;Betteretal.(1988)Science240:1041-1043;Liuetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443;Uuetal.(1987)J.Immunol.139:3521-3526;Simetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218;Nishimuraetal.(1987)Cane.Res.47:999-1005;Woodetal.(1985)Nature314:446-449;及Shawetal.(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559;Morrison,S.L.(1985)Science229:1202-1207;Oietal.(1986)BioTechniques4:214;Winter,美國專利5,225,539;Jonesetal.(1986)Nature321:552-525;Verhoeyanetal.(1988)Science239:1534;禾BBeidleretal.(1988)J.Immunol.141:4053-4060中所描述的方法。來自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和噬菌體展示的人抗體或者，在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，現(xiàn)在可能產(chǎn)生經(jīng)免疫后能產(chǎn)生組成完全的人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)。例如，已有人描述，嵌合和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致了對(duì)內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移在抗原攻擊后導(dǎo)致了人抗體的產(chǎn)生。參見，例如，美國專利6,150,584;6,114,598;和5,770,429。完全人抗體也可以衍射自噬菌體展示文庫(Hoogenboometal.，J.Mol.Biol"227:381(1991);Marksetal.,J.Mol.Biol"222:581-597(1991))。嵌合多克隆抗體也可以獲自噬菌體展示文庫(Buechler等，美國專利6,420,113)雙特異性抗體和抗體軛合物雙特異性抗體(BsAbs)是對(duì)至少2個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。這種抗體可以衍生自全長抗體和抗體片段(例如，F(xiàn)(ab)'2雙特異性抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)的全長雙特異性抗體的產(chǎn)生以兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)為基礎(chǔ)，其中所述兩條鏈具有不同的特異性(Millsteinetal.，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤)產(chǎn)生不同抗體分子的可能混合物(參見，WO93/08829和Trauneckeretal.,EMBOJ.，10:3655-3659(1991))。雙特異性抗體還包括交聯(lián)和"異軛對(duì)配合物(heteroconjugate)"抗體。例如，異共軛對(duì)配合物中的一個(gè)抗體可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一個(gè)與生物素或其它有效負(fù)載偶聯(lián)。異共軛對(duì)配合物抗體可以用任何合適的交聯(lián)方法制備。適宜的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，并在美國專利No.4,676,980中與許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以以化學(xué)方法或基因方法與有效負(fù)載，如反應(yīng)性，可檢測性或官能性分子，例如，免疫毒素軛合，產(chǎn)生抗體軛合物。這種有效負(fù)載包括，例如，免疫毒素，化學(xué)治療劑和放射性同位素，所有這些都是本領(lǐng)域公知的?？贵w融合蛋白用于本發(fā)明的具有Fc區(qū)的蛋白可以是至少含有與非抗體蛋白和多肽融合的抗體的Fc部分的融合蛋白。例如，F(xiàn)c區(qū)可以與受體配體融合，以便產(chǎn)生能結(jié)合所述受體，并且具有Fc相關(guān)功能(如血清穩(wěn)定性，F(xiàn)c受體結(jié)合性等)的可溶性融合蛋白?；蛘?，F(xiàn)c區(qū)可以與受體的胞外域融合，以便產(chǎn)生能結(jié)合所述受體的配體(從而與天然受體競爭)，并且具有Fc相關(guān)功能的可溶性融合蛋白。這種Fc融合蛋白的非限制性例子有依那西普(Embrel)，其包括與人IgGl的Fc部分融合的人TNFa受體的胞外配體結(jié)合域?？贵w融合蛋白(本領(lǐng)域中也稱作Fc融合蛋白和Ig融合蛋白)可以采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備，并且在本領(lǐng)域中已有描述，參見，例如，美國專利No.5,116,964，美國專利No.5,225,538，美國專利No.5,336,603和美國專利No.5，428，130，這些都是Capon等人的專利?？笽L-13抗體在優(yōu)選實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的具有Fc區(qū)的蛋白是抗IL-13抗體?？笽L-13抗體在標(biāo)題均為"抗人IL-13抗體及其應(yīng)用"的，于2004年6月9日提交的美國臨時(shí)申請No.60/578,473和2004年6月22日提交的美國臨時(shí)申請No.60/581,375中有描述。這些申請的內(nèi)容均引入本文作為參考。優(yōu)選抗IL-13抗體在本文中以不同方式稱為"IMA"。能結(jié)合，中和和/或抑制一種或多種IL-13相關(guān)活性，尤其是IL-13的信號(hào)功能活性的抗體可用于治療由IL-13介導(dǎo)的疾病，如過敏性哮喘，非過敏性哮喘及哮喘相關(guān)病理，如纖維化，嗜曙紅細(xì)胞增多和粘液產(chǎn)生。為IL-13拮抗劑，包括抗體及其抗原結(jié)合片段的IL-13結(jié)合劑與IL-13,尤其人IL-13以高親和力和特異性結(jié)合。本公開內(nèi)容的抗體及其抗原結(jié)合片段在本文中也分別被稱作"抗IL-13抗體"和"其片段"。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗IL-13抗體或其片段降低，中和和/或拮抗至少一種IL-13相關(guān)活性。例如，抗IL-13抗體或其片段可以與IL-13,例如，IL-13的表位結(jié)合，并干擾相互作用，例如，IL-13與IL-13受體復(fù)合物("IL陽13R")，例如，包括IL-13受體("IL-13Rcd")和白細(xì)胞介素-4受體a鏈("IL-4Ro;")的復(fù)合物或其亞基之間的結(jié)合。因此，這里所述抗體及其片段可以用來干擾(例如，抑制，阻斷或以其它方式減少)相互作用，例如，IL-13與IL-13受體復(fù)合物或其亞基之間的結(jié)合，從而干擾功能性信號(hào)復(fù)合物的形成。其它優(yōu)選含F(xiàn)c區(qū)蛋白在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行純化的具有Fc區(qū)的蛋白是抗A/3抗體?？笰/3抗體在標(biāo)題均為"識(shí)別/5淀粉樣肽的人源化抗體"的PCT公開No.WO2002/46237和美國專利公開No.20050118651中有描述。這些申請的內(nèi)容均引入本文作為參考。優(yōu)選抗A/3抗體在本文中以不同方式被稱為"AAB"和"12A11"。其它優(yōu)選的含F(xiàn)c區(qū)蛋白包括已批準(zhǔn)人用治療用途的抗體。這種抗體包括與腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體，與細(xì)胞因子結(jié)合的抗體，與細(xì)胞因子受體結(jié)合的抗體和與粘著蛋白結(jié)合的抗體。因此，在多種實(shí)施方案中，含F(xiàn)c區(qū)蛋白可以是結(jié)合選自CD3(例如，OKT3)，CD52(例如，阿侖單抗；Campath⑧)，VEGF(例如，貝伐單抗；Avastin)，EGFR(例如，西妥昔單抗；Erbitux)，CD33(例如，吉姆單抗；Mylotarg)，CD20(例如，利妥昔單抗；Rituxan;托西莫單抗；Bexxar;替伊莫單抗；Zevalin)，HER-2(例如，曲妥珠單抗；Herceptin)，TNFo;(例如，阿達(dá)木單抗；Humira,英夫利昔單抗；Remicade;etanercept;Embrel)，CD25(例如，達(dá)克珠單抗；Zenapax;巴利昔單抗；Simulect)，RSV(例如，帕利珠單抗；Synagis)，IgE(例如，奧馬佐單抗；Xolair)，gpIlb/IIIa(例如，阿昔單抗；Reopro)，CDlla(例如，依法利珠單抗；Raptiva)禾Ba4整聯(lián)蛋白(例如，那他珠單抗；Tysabri)的抗原的抗體或Fc融合蛋白。應(yīng)該了解的是，任何前述單獨(dú)或組合形式的多肽分子都適合作為根據(jù)本發(fā)明的含F(xiàn)c區(qū)蛋白制品。本發(fā)明的多個(gè)方面和實(shí)施方案將通過下列實(shí)施例進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例只是為了例證而不是為了限制而提供。實(shí)施例下列實(shí)施例僅為了說明性的目的而提供。實(shí)施例用3種不同單克隆抗體(稱作AAB，12A11和IMA)提供。描述了8個(gè)各自代表抗體與雜質(zhì)去除的組合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。材料和方法除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施通常采用化學(xué)，分子生物學(xué)，重組DNA技術(shù)，免疫學(xué)(特別是，例如，免疫球蛋白技術(shù))的常規(guī)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)。參見，例如，Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),510，Paul,S.，HumanaPr(1996);AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169)，McCafferty,Ed.，IrlPr(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,Harlowetal.，C.S.H丄.Press,Pub.(1999);CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal"JohnWiley&Sons(1992);Bousseetal"ProteinSizingonaMicrochip,Anal.Chem.73,1207-1212(2001);Knappetal.,CommercializedandEmergingLab-on-a-ChipApplications;In:ProceedingsofthepTAS2001Symposium,Ramsey,J.M.&vandenBerg,A.,7-10(2001);禾口Mhatreetal.，Strategiesforlocatingdisulfidebondsinamonoclonalantibodyviamassspectrometry,RapidCommim.MassSpectrom，13(24)2503-2510(1999)。靶蛋白的產(chǎn)生含F(xiàn)c靶蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)方法，例如，用懸浮培養(yǎng)中生長的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生。包含所感興趣的含F(xiàn)c蛋白的條件培養(yǎng)基在生產(chǎn)用生物反應(yīng)器中產(chǎn)生。收集所得產(chǎn)物，并用任何適當(dāng)?shù)某吻宀襟E，例如，微濾和0.22/mi膜過濾或離心，襯墊過濾和0.22/mi膜過濾使之澄清。靶蛋白的純化這里所例示的靶單克隆抗體(AAB，12A11和IMA)的純化由A蛋白親和色譜上靶分子的俘獲組成。這可以由rmpA蛋白SepharoseT快速流色譜，A蛋白SepharoseTM快速流色譜或MabSelectA蛋白色譜組成。然后如各實(shí)驗(yàn)所述洗滌樹脂，洗脫產(chǎn)物并測試雜質(zhì)水平。靶蛋白的分析用反相HPLC(RP-HPLC)測定AAB單克隆抗體樣品中存在的IRT的量，用ProAHPLC法測定IMA單克隆抗體的IRT水平。用分子排阻色譜法(SEC-HPLC)測定單體蛋白(單體IgG)，高分子量(HMW)和低分子量(LMW)類的百分比。進(jìn)行變性SEC-HPLC分析，以確定樣品中二硫鍵缺失(UDB)類的相對(duì)量。供試樣品中的HCP水平用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定。分析測定IRT禾卩UDB反相HPLC(AABIRT分析)如下法進(jìn)行RP-HPLC。各樣品在4(TC于2.5mMDTT存在下孵育60min，使二硫化物還原。在室溫于5.5mM碘乙酸存在下孵育，完成垸基化。還原和垸基化之后，所有樣品均用5/illM的DTT淬滅。該測定法的定量限是0.5%。將約40pg的各還原，垸基化后的樣品注入POROSRl/HRP-HPLC柱，在下列條件下運(yùn)行70min:柱PorosRl/HRP-HPLC柱溫50。C流動(dòng)相A:0.1%(w/v)TFA的水溶液流動(dòng)相B:0.1。/。(w/v)TFA的95。/。乙腈溶液流速1.0mL/min檢測波長217nm運(yùn)行時(shí)間70minutes進(jìn)樣重復(fù)3次，每次40/ig梯度時(shí)間表列于表1中。表l:RP-HPLC法的梯度時(shí)間表梯度時(shí)間%A%B0-1952703054604055.1-70955A蛋白HPLC(IMAIRT分析)A蛋白-HPLC如下法進(jìn)行。每次在POROSProA柱上的進(jìn)樣總量為100/ig，在下列條件下室溫運(yùn)行35min:柱PorosProA4.6x50mm柱溫室溫流動(dòng)相A:50mM甲酸銨，pH6.0流動(dòng)相B:lOmM甲酸銨，0.8%甲酸流速2.0mL/min檢測波長280nm運(yùn)行時(shí)間35minutes進(jìn)樣重復(fù)3次，每次100梯度時(shí)間表列于表2中。表2:ProA柱的梯度時(shí)間表梯度時(shí)間%A%B0-5100025-30554530.5-351000dSEC-HPLC(AABUDB分析)變性SEC-HPLC如下法進(jìn)行。用于變性SEC測定的樣品的預(yù)處理涉及最終濃度為200ptg/mL蛋白，3M胍鹽酸鹽和100mMpH7.4的Tris的試劑/樣品混合物。樣品在80°C加熱20min，同時(shí)在整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中混合。對(duì)于本試驗(yàn)，采用了2個(gè)對(duì)照來確定UDB水平。用具有低和高水平UDB的內(nèi)標(biāo)作為對(duì)照。色譜/分析條件如下柱TosohBioSepG3000SWxl柱溫室溫流動(dòng)相3M胍鹽酸鹽，25mMNaP04，pH6.8梯度等梯度流速0.5mL/min檢測波長280nm運(yùn)行時(shí)間50min進(jìn)樣50/iL(10/ig)，重復(fù)3次實(shí)施例l:用于去除IRT的洗滌緩沖液的對(duì)比(AAB)在本實(shí)施例中，含有單克隆抗體AAB的不純?nèi)芤和ㄟ^吸附到A蛋白柱上，然后用含有CaCl2，MgCl2，NaCl或丙二醇的洗滌緩沖液進(jìn)行第一次洗滌而得到純化。含有單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的rmpA蛋白SepharoseFF柱(8.9mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。試驗(yàn)1中所述所有rmpA蛋白SepharoseFF色譜步驟均采用下列條件(例外情況在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)說明中指出)。柱尺寸-1.0cmxll.4cm操作流速-150cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(l倍柱體積)洗滌1-可變(見表3)，但1號(hào)運(yùn)行除外，其未進(jìn)行洗滌1洗滌2-20mMTris，1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(7倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化1-20mM枸櫞酸鈉，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8。CrmpA蛋白SepahroseFF柱用5倍體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。以約10mg產(chǎn)物/mL樹脂的量向該柱上樣。上樣后，用1倍體積的平衡緩沖液沖洗和5倍體積的洗滌1的溶液洗滌。所測試的所有洗滌1的溶液都在表3中概述。除1號(hào)運(yùn)行外，所有運(yùn)行都包括洗滌1。洗滌1之后，用5倍體積的pH7.5，含l.OMNaCl的20mMTris和7倍體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.9-8.1。然后將柱凈化，洗滌和保存。表3列出了由不同運(yùn)行得到的產(chǎn)物池中所存在的IRT類和LMW的水平。表3:不同洗滌1的緩沖液的IRT和LMW值<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>而氯化鈉和丙二醇洗滌未減少IRT或LMW類。實(shí)施例2:用A蛋白色譜結(jié)合CaCl2洗滌去除IRT在本實(shí)施例中，用A蛋白色譜和CaCl2洗滌進(jìn)行了大規(guī)模的抗體純化，以除去IRT類。含有單克隆抗體的培養(yǎng)物用與MilliporeK-Prime400色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(2.4L)進(jìn)行中試規(guī)模的純化。如下文所述完成兩次MabSelect運(yùn)行。柱尺寸-13cmxl8cm操作流速-150cm/hr，300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(2倍柱體積)洗滌1-1號(hào)運(yùn)行，50mMTris，2MCaCl2，pH7.5;2號(hào)運(yùn)行無洗滌1洗滌2-20mMTris，1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，25mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化l-50mM甘氨酸，0.5MNaCl，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約10mg產(chǎn)物/mL樹脂的量上樣。然后用2倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，5倍柱體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1，該洗滌1的溶液由50mMTris，2.0MCaCl2組成，pH為7.5，對(duì)于運(yùn)行2，則將此步完全刪去。洗滌1之后，用5倍柱體積的pH7.5，含1.0MNaCl的50mMTris和5倍柱體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含25mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.8-8.2。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見表4。表4:有或無氯化鈣洗滌的中試規(guī)模運(yùn)行的％IRT水平<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>結(jié)果顯示，在中試規(guī)模下，氯化鈣洗滌從產(chǎn)物池中去除了IRT。實(shí)施例3:IRT的去除(IMA)本實(shí)施例中對(duì)與實(shí)施例1中所用不同的單克隆抗體(IMA)進(jìn)行了采用CaCl2洗滌的小規(guī)模純化。含有不同單克隆抗體(IMA)的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAExplorer色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(17.3mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。如下文所述完成運(yùn)行。柱尺寸-1.1cmxl8.2cm(17.3mL)操作流速-300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5.1倍柱體積)洗滌1-20mMTris，1MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗漆2-50mM乙酸鈉，0.6MCaCI2，pH5.0(5倍柱體積)洗滌3-50mMTris，5mMNaCl，pH7.5(3倍柱體積)洗滌4-10mMTris，5mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，5mMNaCl，pH3.0(5倍柱體積)凈化-6M胍鹽酸鹽(5倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(6倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含1MNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約45mg產(chǎn)物/mL樹脂的量上樣。然后如下洗滌該柱5倍柱體積的pH7.5，含1.0MNaCl的20mMTris，5倍柱體積的pH5.0，含0.6MCaCl2的50mM乙酸鈉，3倍柱體積的pH7.5，含5mMNaCl的50mMTris和5倍柱體積的pH7.5，含5mMNaCl的10mMTris。用pH3.0，含5mMNaCl的50mM甘氨酸將產(chǎn)物從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.0的2MTris中和至7.7。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見表5，其提供了上樣樣品和峰樣品中IRT類的水平。表5:有CaCl2洗滌的運(yùn)行中上樣樣品和峰樣品的％IRT<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>結(jié)果顯示，0.6M的CaCl2洗滌使IRT減少了5倍。實(shí)施例4:宿主細(xì)胞蛋白的去除(IMA)本實(shí)施例中，檢驗(yàn)了CaCl2洗滌從含有IMA單克隆抗體的制品中除去宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的能力。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(19mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。如下文所述完成兩次MabSelect運(yùn)行。柱尺寸-1.1cmx20.0cm(19mL)操作流速-300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5.0倍柱體積)洗滌1-20mMTris，1MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌2-50mM乙酸鈉，0.6MCaCl2，pH5.0(5倍柱體積；只用于運(yùn)行2)洗滌3-50mMTris，5mMNaCl，pH7.5(2倍柱體積)洗滌4-10mMTris，5mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，5mMNaCl，pH3.0(5倍柱體積)凈化-6M胍鹽酸鹽(5倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(6倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約45mg產(chǎn)物/mL樹脂的量上樣。隨后用5倍柱體積的pH7.5，含1.0MNaCl的20mMTris洗滌該柱，對(duì)于運(yùn)行2，額外用5倍柱體積的pH5.0，含0.6MCaCl2的50mM乙酸鈉進(jìn)行洗滌。在洗脫之前，接著用5倍柱體積的pH7.5，含5mMNaCl的50mMTris和5倍柱體積的pH7.5，含5mMNaCl白勺10mMTris洗滌該柱。用pH3.0，含5mMNaCl的50mM甘氨酸將產(chǎn)物從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.0的2MTris中和至7.7。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見表6，其提供了對(duì)照運(yùn)行和用CaCh洗滌的運(yùn)行中存在的HCP類的水平。表6:用或不用CaCl2洗滌的HCP去除的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>結(jié)果顯示，與對(duì)照運(yùn)行相比，CaCl2洗滌使HCP去除量增大了3倍。實(shí)施例5:DNA的去除(AAB)檢驗(yàn)本實(shí)施例檢驗(yàn)了CaCl2洗滌從含有AAB單克隆抗體的制品中除去宿主細(xì)胞DNA的能力。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(19mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。如下文所述完成三次MabSelect運(yùn)行。柱尺寸-1.1cmx20cm操作流速-300cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(2倍柱體積)洗滌1-50mMTris，2.0MCaCl2，pH7.5(5倍柱體積)(僅用于運(yùn)行2和3)洗滌2-20mMTris,1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)(僅用于運(yùn)行1和3)洗滌3-10mMTris，75mMNaCl，pH7.5(7倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.0(6倍柱體積)凈化-50mM甘氨酸，0.5MNaCl，pH2.7(5倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24°CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后該柱以約40mg產(chǎn)物/mL樹脂的上樣量上樣。隨后用2倍體積的平衡緩沖液沖洗。對(duì)于運(yùn)行2和3，該步驟后接著用5倍柱體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1和3，用5倍柱體積的洗滌2的溶液洗滌。所有3次運(yùn)行均用7倍柱體積的洗滌3的溶液洗滌。用pH3.0，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將所述單克隆抗體從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.5-8.0。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見表7。表7:用氯化鈣洗滌去除DNA運(yùn)行號(hào)洗滌1洗滌2DNA(ng/mL)DNA(ppm)1無(對(duì)照)20mMTris，1MNaCl，pH7.53.60.3750mMTris，2MCaCl2，pH7.5無0.90.09350mMTris,2MCaCl2,pH7.520mMTris，IMNaCl，0.30.03結(jié)果顯示，與在洗滌液中使用NaCl相比，pH7.5，含2.0M氯化鈣的50mMTris的加入使DNA的減少量增大了10倍。實(shí)施例6:宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的去除(12A11)本實(shí)施例在純化運(yùn)行中使用了第三種單克隆抗體12A11,并測試了不同洗滌條件去除HCP的能力。以96孔濾板格式進(jìn)行高通量篩選(HTS)，以鑒定MabSelect步驟的去除雜質(zhì)，如HCP的最佳洗滌條件。該篩選改變洗滌用輔料，輔料濃度和pH，以確定其對(duì)過程相關(guān)雜質(zhì)，如HCP的影響。MabSelect樹脂用pH7.3，含10mMNaCl的5mMTris平衡，并在柱中將產(chǎn)物上樣。然后取出樹脂，混合，向96孔濾板的各孔中分配50juL樹脂。各孔中的樹脂用pH為7.3，含有5mMTris和10mMNaCl的溶液平衡，然后用各自含有不同輔料的洗滌液分3個(gè)階段進(jìn)行洗滌，每階段使用300;iL洗滌緩沖液。輔料洗滌之后，用pH7.3，含有5mMTris和10mMNaCl的緩沖液分4個(gè)階段進(jìn)行第二次洗滌，每階段300ML。然后產(chǎn)物分3個(gè)階段，每階段300pL從樹脂上洗脫下來。合并第l和第2階段的洗脫液，測試HCP水平。樹脂體積50ML洗滌用輔料-氯化鈉，氯化鈣，氯化鎂輔料濃度-100，250，500，1000，1500和2000mM輔料pH-6.0禾B7.5洗脫緩沖液-25mMHepes，10mMNaCl，pH3.0，25mMHepes，lOOmMNaCl，pH3.0，50mM甘氨酸，10mMNaCl，pH3.0，50mM甘氨酸，100mMNaCl，pH3.0和100mM精氨酸，10mMNaCl，pH3.0，100mM精氨酸，lOOmMNaCl，pH3.0運(yùn)行溫度18-24°C結(jié)果見表8和9。表8:用pH6.0的氯化鈉，氯化鈣或氯化鎂洗滌MabSelect樹脂時(shí)的HCP值<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表9:用pH7.5的氯化鈉，氯化鈣或氯化鎂洗滌MabSelect樹脂時(shí)的HCP值洗脫緩沖液洗脫液的NaCl濃度(mM)洗滌用輔料濃度(mM)洗潘用輔料NaClCaCl2MgCl2HCP(ppm)50mM甘氨酸100訓(xùn)27,90017,90021,80025mMHEPES25024,70016,60018,200100mM精氨酸50026,50014,00017,30050mM甘氨酸100030,10014,50017，70025mMHEPES150035,30012,00012,500100mM精氨酸200041,7008,20011,700結(jié)果顯示，與所有輔料濃度下pH6.0(表8)和pH7.5(表9)的氯化鈉相比，氯化鈣和氯化鎂都降低了MabSelect峰池中HCP的水平。實(shí)施例7:二硫鍵缺失類(UDB)的去除本實(shí)施例中檢驗(yàn)了CaCl2洗滌去除二硫鍵缺失類(UDB)的能力?；旧习磳?shí)施例1中所述完成兩次rmpA蛋白SepharoseFF運(yùn)行。柱尺寸-1.0cmxll.4cm操作流速-150cm/hr平衡1-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)沖洗-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(l倍柱體積)洗滌1-對(duì)于運(yùn)行l(wèi)，50mM醋酸鹽，2.0MCaCl2，pH5.0;運(yùn)行2無洗滌1洗滌2-20mMTris，1.0MNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗滌3-10mMTris,75mMNaCl，pH7.5(7倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，75mMNaCl，pH3.1(6倍柱體積)凈化1-20mM檸檬酸鈉，pH2.7(5倍柱體積)凈化2-6M胍鹽酸鹽(2倍柱體積)凈化洗滌-20mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)保存-16%乙醇(5倍柱體積)運(yùn)行溫度2-8°CrmpA蛋白SepahroseFF柱用5倍體積的pH7.5，含150mMNaCl的20mMTris平衡。然后以約10mg產(chǎn)物/mL樹脂的上樣量向該柱上樣。然后用1倍體積的平衡緩沖液沖洗，接著用5倍體積的洗滌1的溶液洗滌。對(duì)于運(yùn)行1，該洗滌1的溶液由50mM醋酸鹽，2.0MCaCl2組成，pH為5.0，而對(duì)于運(yùn)行2，則將此步完全刪去。洗滌1后，接著用5倍體積的pH7.5，含1.0MNaCl的20mMTris和7倍體積的pH7.5，含75mMNaCl的10mMTris洗滌。用pH3.1，含75mMNaCl的50mM甘氨酸將單克隆抗體從rmpA蛋白SepharoseFF柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH8.5的2MTris中和至7.8-8.2。然后將柱凈化，洗滌和保存。結(jié)果見表10。表10:用或未用鈣洗滌過的樣品的c/。UDB運(yùn)行號(hào)樣品%UDB150mM醋酸鹽，2.0MCaCl2，pH5.09.52無(對(duì)照)20.8觀察到額外用pH5.0，含2.0MCaCl2的50mM醋酸鹽洗滌過的樣品中UDB水平減少了兩倍。實(shí)施例8:用其它二價(jià)陽離子鹽洗滌除去HCP和IRT(AAB)本實(shí)施例檢驗(yàn)了含有MnCl2或NiCl2的洗滌液從含有AAB單克隆抗體的制品中去除雜質(zhì)的能力。進(jìn)行兩次運(yùn)行，以評(píng)價(jià)含有其它二價(jià)陽離子鹽，如MnCl2或NiCl2的洗滌液的作用。同樣完成兩次對(duì)照運(yùn)行——一次用pH7.5，含1.0MNaCl的50mMTris洗漆(期望無IRT或HCP被去除)，另一次用pH7.5，含2.0MCaCl2的50mMTris洗滌。含有所述單克隆抗體的培養(yǎng)物用與GEHealthcareAKTAFPLC色譜系統(tǒng)相連的MabSelectA蛋白柱(9mL)進(jìn)行小規(guī)模純化。按下文所述進(jìn)行MabSelect運(yùn)行。如下文所描述的那樣，4次運(yùn)行的所有操作參數(shù)除了洗滌l是可變的外，其余都相同(表ll)。柱尺寸-1.0cmx11.5cm(9mL)操作流速-300cm/hr(平衡，洗滌2，洗脫，再生，保存)操作流速-230cm/hr(上樣，沖洗，洗滌1)平衡1-50mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5.0倍柱體積)洗滌1-可變(見表U的比較)洗滌2-50mMTris，10mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)洗脫-50mM甘氨酸，10mMNaCl，pH3.0(3倍柱體積)再生-50mMNaOH，0.5MNa2SO4(5倍柱體積)保存-160/。乙醇，50mMTris，150mMNaCl，pH7.5(5倍柱體積)運(yùn)行溫度18-24。CMabSelectA蛋白柱用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的50mMTris平衡。將該柱以約40mg產(chǎn)物/mL樹脂的量上樣。柱上多余的樣品用5倍柱體積的pH7.5，含150mMNaCl的50mMTris沖洗出去。然后用表11所述溶液中的一種洗滌該柱。洗脫該柱之前，用5倍柱體積的pH7.5，含10mMNaCl的50mMTris洗滌。用pH3.0，含10mMNaCl的50mM甘氨酸將產(chǎn)物從MabSelectA蛋白柱中洗脫出來。然后產(chǎn)物池用pH9.0的2MTris中和至pH8.0。將柱用5倍柱體積的50mMNaOH，0.5MNa2SOW爭化，然后用5倍柱體積的pH7.5的16%乙醇，50mMTris，150mMNaCl保存。結(jié)果見表11(HCP的去除)和表12(IRT的去除)。表11:用不同洗滌液去除HCP<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>*基于MnCl2和NiCl2的溶解性選擇pH5.0表12:用不同洗滌液去除IRT運(yùn)行號(hào)洗滌1的條件IRT(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>*基于MnCl2和NiCl2的溶解性選擇pH5.0表11顯示，用含有二價(jià)陽離子的溶液洗滌的運(yùn)行中存在的HCP類的水平比對(duì)照(l.OmMNaCl洗滌)小1.5-3.5倍。表12顯示，與含有1.0mMNaCl的洗滌液相比，包含用二價(jià)陽離子鹽溶液洗滌的步驟的運(yùn)行也提供了大于3.5倍的IRT去除量。因此，這些結(jié)果證明了用其它不同于CaCl2的二價(jià)陽離子(例如，用MnCl2或NiCl2)進(jìn)行鹽洗滌也能有效去除雜質(zhì)。等同體通過不超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或能確定本文所述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同體。這些等同體希望為所附權(quán)利要求書所涵蓋。權(quán)利要求1.從包括具有Fc區(qū)的蛋白和一種或多種雜質(zhì)的源液中純化所述具有Fc區(qū)的蛋白的方法，其包括步驟將所述蛋白吸附在Fc結(jié)合劑上；用含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液洗滌所述Fc結(jié)合劑；以及從洗脫液中的所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)選自內(nèi)含子連讀變異體類(IRT)，二硫鍵缺失類(UDB)和低分子量種類(LMW)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)是IRT。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白是抗體。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體選自抗體融合，鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體和人抗體。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體是抗IL-13抗體。7.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體與選自如下的抗原結(jié)合CD3，CD52，VEGF，EGFR，CD33，C訓(xùn)，HER-2，TNFa，CD25，RSV，IgE，gpIIb/IIIa，CDlla和a4整聯(lián)蛋白。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述具有Fc區(qū)的蛋白是重組產(chǎn)生的。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有Fc區(qū)的蛋白是在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中重組產(chǎn)生的。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fc結(jié)合劑包括A蛋白和G蛋白的一種或多種。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述Fc結(jié)合劑被固定在固相上。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述固相包括珠，凝膠，樹脂和顆粒的一種或多種。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)陽離子鹽包括離液序列高的鹽。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述二價(jià)陽離子鹽選自CaCl2，MgCl2，NiCl2及其混合物。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液的pH值在約4至約8的范圍內(nèi)。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液的pH值在約4.5至約7.5的范圍內(nèi)。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖溶液的二價(jià)陽離子鹽濃度在約0.1M至約5M的范圍內(nèi)。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖溶液的二價(jià)陽離子鹽濃度在約0.5M至約3M的范圍內(nèi)。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液包括至少約0.6M的CaCl2。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液包括至少約2M的MgCl2。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有二價(jià)陽離子鹽的緩沖溶液包括至少約2M的CaCl2。22.權(quán)利要求l的方法，其中將所述蛋白吸附到Fc結(jié)合劑上以及洗滌所述Fc結(jié)合劑的步驟在約2°C至約24°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞蛋白，宿主細(xì)胞DNA，細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白及其混合物的一種或多種。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括具有Fc區(qū)的非所需種類的蛋白。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述具有Fc區(qū)的非所需種類的蛋白包括一種或多種具有內(nèi)含子連讀序列的抗體鏈或其片段，一種或多種具有不正確二硫鍵的抗體鏈或其片段，半抗體或其片段，輕鏈二聚體或其片段和重鏈二聚體或其片段。26.權(quán)利要求l的方法，其中從所述Fc結(jié)合劑回收所述蛋白的步驟包括用pH范圍為約2.0至約6.5的洗脫緩沖液洗脫所述蛋白。27.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括選自如下的色譜步驟陰離子交換色譜，陽離子交換色譜，固定化金屬親和色譜和疏水相互作用色譜(HIC)。28.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括選自如下的色譜步驟羥基磷灰石色譜，透析，親和色譜，硫酸銨沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)和色譜聚焦。29.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體，并且含有所述蛋白的洗脫溶液的內(nèi)含子連讀變異體水平比所述源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少5倍。30.權(quán)利要求29的方法，其中含有在所述洗脫溶液中回收的蛋白的溶液的內(nèi)含子連讀變異體水平比所述源液中的內(nèi)含子連讀變異體水平小至少io倍。31.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種內(nèi)含子連讀變異體，并且在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約1%的所述蛋白的種類。32.權(quán)利要求31的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.8%的所述蛋白的種類。33.權(quán)利要求32的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.5%的所述蛋白的種類。34.權(quán)利要求33的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述內(nèi)含子連讀變異體包括小于約0.2。/。的所述蛋白的種類。35.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種低分子量種類，并且在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類包括小于約1%的所述蛋白的種類。36.權(quán)利要求35的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類包括小于約0.8%的所述蛋白的種類。37.權(quán)利要求36的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類包括小于約0.5%的所述蛋白的種類。38.權(quán)利要求37的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述低分子量種類包括小于約0.2%的所述蛋白的種類。39.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種雜質(zhì)包括所述蛋白的一種或多種二硫鍵缺失變異體，并且在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約15%的所述蛋白的種類。40.權(quán)利要求39的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約10%的所述蛋白的種類。41.權(quán)利要求40的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約5%的所述蛋白的種類。42.權(quán)利要求41的方法，其中在所述洗脫溶液中，所述二硫鍵缺失變異體包括小于約2%的所述蛋白的種類。43.根據(jù)權(quán)利要求1的方法純化的蛋白。44.權(quán)利要求43的蛋白，其中所述蛋白是抗體。45.包括用于從雜質(zhì)中純化具有Fc區(qū)的蛋白的試劑的試劑盒，所述試劑盒包括選自如下的試劑和使用說明書二價(jià)陽離子鹽和Fc結(jié)合劑。全文摘要本申請?zhí)峁┝送ㄟ^將具有Fc區(qū)的多肽，例如，抗體或抗體融合吸附到Fc結(jié)合劑，例如，A蛋白或G蛋白上，然后用二價(jià)陽離子鹽緩沖液洗滌，以除去雜質(zhì)，隨后回收被吸附的多肽來純化所述具有Fc區(qū)的多肽的方法。本申請的特征還在于洗脫被純化多肽的方法及純化系列中該方法的并入。本申請還提供了包括執(zhí)行該方法的組分和使用說明書的試劑盒。文檔編號(hào)C07K16/00GK101213211SQ200680021590公開日2008年7月2日申請日期2006年6月16日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者蘭加納坦·戈達(dá)瓦蒂,蒂莫西·伊斯克拉申請人:惠氏公司