專利名稱：虎舌紅素b的制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及虎舌紅素B的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
虎舌紅"nfo/amamf〃atoHance)為紫金牛科紫金牛 屬植物，其枝葉和根莖全部入藥。生長在海拔200 400米的背陰樹林 中，喜陰，群生。本屬植物全世界有300多種，我國有68種，12個變種。廣泛分布于長江以南廣大地區(qū)，蘊藏量豐富。尤以云南和海南 地區(qū)分布較為集中。虎舌紅在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中被認為具有清熱利濕， 活血化瘀的作用。根據(jù)《中藥大辭典》中記載，該植物可用于治療痢 疾、肝炎、膽囊炎、風濕、跌打損傷、咳血、瘡癤腫痛等疾病。1984年首次從虎舌紅中分離得到以Cydamiritin A為苷元的皂苷， 以后陸續(xù)報道從該植物中分離得到十余種皂苷化合物，其中絕大部分 是以五環(huán)三絡(luò)Cyclamiritin A為苷元?；⑸嗉t素B (Ardisiacrispin B) 是虎舌紅中含量最高的一種皂苷，但是其制備過程采用高效制備液相 進行分離，成本高，在工業(yè)上難以進行大規(guī)模生產(chǎn)。到目前為止，尚未見到虎舌紅素B具有預防和治療腫瘤、艾滋病、 白血病、流感、皰疹的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中虎舌紅素B提取分離成本高以及應用范圍較窄的不足，為人們提供一種低成本的虎舌紅素B的制備方法，以及虎舌紅素B作為預防和治療腫瘤、艾滋病、白 血病、流感、皰疹、肝炎、HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒感染與致病性微生 物所引起炎性反應的藥品，及作為抗炎鎮(zhèn)痛的藥物。本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明所述的虎舌紅素B的制備方法，由虎舌紅全株或枝葉或根 莖為藥材，粉碎或不經(jīng)粉碎，用20 30倍藥材重量的水、任意比例的 甲醇水溶液、乙醇水溶液或有機溶媒提取，提取液過濾濃縮；濃縮物 經(jīng)大孔樹脂、柱層析(氧化鋁或硅膠)色譜法單獨或聯(lián)合分離后，再
重結(jié)晶精制而成；其工藝流程如下<formula>formula see original document page 5</formula>
上述方案中，所述的虎舌紅素B (ArdisiacrispinB)其結(jié)構(gòu)如下:
<formula>formula see original document page 5</formula>
上述方案中，所述藥材為鮮品或干品的虎舌紅生藥或飲片，粉碎 目數(shù)為10目 60 H。上述方案中，提取所用有機溶媒包括但不限于卣代烷類如二氯甲 烷、三氯甲烷，醇類如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丁醇、乙二醇、 碳鏈小于32烷醇、碳鏈小于32烯醇，酯類如乙酸甲酯、乙酸乙酯、 乙酸丙酯，醚類如石油醚、乙醚，或它們的混合物。上述方案中，所用的提取方法包括但不限于加熱回流、滲漉、超 聲提取；超聲提取溫度在20 8(TC均可。上述方案中，所述大孔樹脂包括但不限于各種非極性、弱極性、 中極性或極性的大孔吸附樹脂，硅膠或氧化鋁為100~400目。上述方案中，大孔樹脂洗脫所用的溶劑包括但不限于以體積計的 4 : 1、5 : l及任意比例的甲醇或乙醇水溶液，或不同比例的乙酸乙醋、 氯仿、乙醇、甲醇、丙酮的混合物；柱色譜所用溶劑包括但不限于乙酸乙醋、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮、或它們的混合物。上述方案中，所用的重結(jié)晶溶劑包括但不限于丙酮、乙醇、甲醇、
水、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或它們的混合物。
本發(fā)明所制備的虎舌紅素B的醫(yī)藥用途，其特征在于虎舌紅素 B可用于制備治療和預防腫瘤、艾滋病、流感、皰疹、肝炎及致病性 微生物所引起的炎性反應的藥品，或在與這些疾病相關(guān)的產(chǎn)品中應用。
本發(fā)明的優(yōu)點是提供了可用于抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒(如 流感病毒、皰疹病毒、肝炎病毒、及包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒等)
的虎舌紅素B的制備方法，其成本低，工藝穩(wěn)定，收率為干燥藥材的 1%以上，可以得到除去大量雜質(zhì)的高純度的虎舌紅素B，并且藥理活 性顯著。
下面通過實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明不僅限于所述實施例。
具體實施例方式
實施例一
虎舌紅素B的制備取虎舌紅生藥(干品)1 kg粉碎成20目粗 粉，加IO倍藥材重量的80%(重量)乙醇水溶液，加熱回流提取3次， 每次2小時，濾過，合并提取液，減壓回收溶劑濃縮至1 g生藥/mL， D101大孔樹脂吸附，經(jīng)水洗后，再用80% (重量)乙醇水溶液洗脫， 乙醇洗脫液濃縮至浸膏得到有效部位39g，將有效部位以等重量硅膠 拌樣，30倍(重量)浸膏量硅膠裝柱，乙酸乙酯甲醇=8:3 (重量) 洗脫，收集兩倍柱體積后的餾分，濃縮析晶，得虎舌紅素B淺白色粉 末21g。
實施例二
虎舌紅素B的制備取虎舌紅藥材(鮮品)1 kg粉碎為60目， 加10倍藥材重量的75% (重量)乙醇水溶液，超聲提取3次，每次 20min，濾過，合并提取液，減壓回收溶劑濃縮至lg生藥/mL， D 141 大孔樹脂吸附，經(jīng)水洗，用75% (重量)的乙醇水溶液洗脫，濃縮至 浸膏得到有效部位23g，將有效部位以等重量硅膠拌樣，30倍(重量) 浸膏量硅膠裝柱，乙酸乙酯甲醇=8:3 (重量)洗脫，收集兩倍柱體 積后的餾分，濃縮至浸膏，乙醇超聲溶解后析晶，過濾，沉淀用乙醇 重結(jié)晶，得虎舌紅素B淺白色粉末12g。
實施例三
虎舌紅素B的制備取虎舌紅飲片1 kg粉碎為60目，以20倍藥 材重量的75% (重量)乙醇水溶液滲漉提取，提取液濾過，減壓回收
溶劑濃縮至lg生藥/mL， AB-8大孔樹脂吸附，經(jīng)水洗，用75% (重 量)的乙醇水溶液洗脫，濃縮至浸膏得到有效部位30 g，將有效部位 以等重量硅膠拌樣，30倍(重量)浸膏量硅膠裝柱，乙酸乙酯甲醇 =8:3 (重量)洗脫，收集兩倍柱體積后的餾分，濃縮至浸膏，丙酮 甲醇=1:1 (重量)超聲溶解后析晶，過濾，沉淀用丙酮甲醇=1:1 (重量)重結(jié)晶，得虎舌紅素B淺白色粉末14g。 實施例四
虎舌紅素B的制備取虎舌紅生藥(干品)1 kg粉碎成20目粗 粉，加10倍藥材重量的水，加熱回流提取3次，每次2小時，濾過， 合并提取液，減壓回收溶劑濃縮至稠浸膏，將浸膏以等重量硅膠拌樣， 30倍(重量)浸膏量硅膠裝柱，乙酸乙酯甲醇=8:3 (重量)洗脫， 收集兩倍柱體積后的餾分，濃縮至浸膏，甲醇超聲溶解，重結(jié)晶，得 虎舌紅素B淺白色粉末17g。
實施例五
虎舌紅素B的制備取虎舌紅生藥(干品)1 kg粉碎為60目，
加10倍藥材重量的甲醇，超聲提取3次，每次20min，濾過，合并 提取液，減壓回收溶劑濃縮至稠浸膏，將浸膏以等重量氧化鋁拌樣， 30倍(重量)浸膏量氧化鋁裝柱，乙酸乙酯甲醇=1:1 (重量)洗脫， 收集兩倍柱體積后的餾分，濃縮至浸膏，甲醇超聲溶解析晶，過濾， 沉淀用甲醇重結(jié)晶，得虎舌紅素B淺白色粉末15g。 實施例六
虎舌紅素B體外抗癌活性按本發(fā)明制備的虎舌紅素B在體外 具有較強的抗癌活性，其對K562較為敏感。在10ug.mL"濃度時， 抑制率達50%，與陽性對照藥的抑制率相當。按本發(fā)明制備的虎舌紅 素8對三種腫瘤細胞的1(:5。分別為36.311 g-mlAKato-IIlX ." g.mU1 (K562)40.8ug.mL-1 (OVCA2780)。 實施例七
虎舌紅素B體內(nèi)抗癌活性分別在小鼠體內(nèi)種植S180實體瘤、 lewis肺癌實體瘤、HCA腹水瘤和S180腹水瘤。發(fā)現(xiàn)按本發(fā)明制備 的虎舌紅素B 50mg/kg和100xmg/kg均有抑制腫瘤生長的作用、并且 有劑量依賴關(guān)系，虎舌紅素B組與對照組比較有明顯差異，高劑量組 與陽性藥5-Fu20mg/kg抗腫瘤作用相當，能明顯延長腹水瘤小鼠的活
存時間。
實施例八
虎舌紅素B的鎮(zhèn)痛活性評價昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18 —22g。給藥后30min， ip 1 %冰醋酸0.4ml，記錄15min內(nèi)每鼠扭體數(shù)。 按本發(fā)明制備的虎舌紅素B在小鼠醋酸扭體模型上的鎮(zhèn)痛作用與延胡 索乙素在lOOmg.kg"相似，強于阿斯匹林和撲熱息痛，而且按本發(fā)明 制備的虎舌紅素B在低于50 mg.kg"仍顯示較好的鎮(zhèn)痛活性。
實施例九
虎舌紅素B對二甲苯誘發(fā)小鼠耳部水腫的影響小鼠70只，隨 機分為7組，溶媒組和按本發(fā)明制備的虎舌紅素B六個組(3.125、6.25、 12.5、 25、 50、 lOOmg.kg")，各組于致炎前1小時ig受試藥物和等量 溶媒，致炎后30分鐘取兩側(cè)耳片，求得腫脹度。結(jié)果顯示，按本發(fā)明 制備的虎舌紅素B對二甲苯致小鼠耳部水腫有一定抑制作用，其中 25mg.kg-'作用最為顯著，抑制率達83.5%。
實施例十
虎舌紅素B對角叉菜膠誘發(fā)大鼠足爪腫脹的抑制作用大鼠40 只，隨機分為4組溶媒組和按本發(fā)明制備的虎舌紅素B組(12.5、 25、 SOmgAg-1),各組均于致炎前l(fā)h給大鼠ig受試藥物或等量溶媒，致炎 后分別于l一7h， 24 h測得大鼠的足爪腫脹度。結(jié)果表明，按本發(fā)明 制備的虎舌紅素B三個劑量組均可顯著抑制角叉菜膠誘導的大鼠足腫 脹。
實施例十一
虎舌紅素B的體外殺滅HIV的活性
虎舌紅素B直接體外殺滅HIV的試驗表明，按本發(fā)明制備的虎舌 紅素B在濃度為0.10mg/ml時，對HIV病毒的直接殺滅率達到了 85%以上。
實施例十二
虎舌紅素B體外抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性
虎舌紅素B體外抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶活性的試驗表明，按本發(fā) 明制備的虎舌紅素B對HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用，在濃度為 l:2000時，對fflV-l的反轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用達到了 70%以上。
實施例十三
虎舌紅素B對受HIV感染的細胞的保護作用
用HIV病毒感染MT4細胞，在細胞懸液中加入按本發(fā)明制備的 虎舌紅素B，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，用XTT法測定細胞的數(shù)量，與不加 虎舌紅素B的HIV感染的MT4細胞對比，從而計算出虎舌紅素B對 受HIV感染的細胞的保護作用。按本發(fā)明制備的虎舌紅素B在濃度為 0.10mg/ml時，對細胞的保護率達到了 74.03%。
實施例十四
虎舌紅素B的體外抗乙肝的活性
用表達乙肝病毒抗原的2.2丄5細胞，在細胞懸液中加入按本發(fā)明 制備的虎舌紅素B，繼續(xù)培養(yǎng)，四天后，換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)兩天，然后 用乙肝表面抗原和e抗原測定試劑盒測定抗原的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 按本發(fā)明制備的虎舌紅素B在250ng/ml時，對2.2丄5細胞的表面抗 原的表達抑制率為52.12%，對2.2丄5細胞的e抗原的表達抑制率為 53.89%,在這個藥物濃度下，2.2丄5細胞的MTT結(jié)果為0.787，而正 常2.2丄5細胞的MTT結(jié)果為1.047，細胞存活率達到75.12%，細胞 毒作用不大。按本發(fā)明制備的虎舌紅素B可以抑制2.2.1.5細胞的表面 抗原和e抗原的表達。
權(quán)利要求
1.一種虎舌紅素B的制備方法，其特征在于由虎舌紅全株或枝葉或根莖為藥材，粉碎或不經(jīng)粉碎，用20～30倍藥材重量的水、任意比例的甲醇水溶液、乙醇水溶液或有機溶媒提取，提取液過濾濃縮；濃縮物經(jīng)大孔樹脂、柱層析(氧化鋁或硅膠)色譜法單獨或聯(lián)合分離后，再重結(jié)晶精制而成；其工藝流程如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于所 述的虎舌紅素B (ArdisiacrispinB)其結(jié)構(gòu)如下
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于所 述藥材為鮮品或干品的虎舌紅生藥或飲片，粉碎目數(shù)為10目 60目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于提取所用有機溶媒包括但不限于鹵代烷類如二氯甲烷、三氯甲烷，醇類 如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丁醇、乙二醇、碳鏈小于32烷醇、碳 鏈小于32烯醇，酯類如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯，醚類如石油 醚、乙醚，或它們的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于所 用的提取方法包括但不限于加熱回流、滲漉、超聲提?。怀曁崛囟仍?0 80。C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于所 述大孔樹脂包括但不限于各種非極性、弱極性、中極性或極性的大孔 吸附樹脂，硅膠或氧化鋁為100-400目。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于大 孔樹脂洗脫所用的溶劑包括但不限于以體積計的4 : 1、5 : l及任意比 例的甲醇或乙醇水溶液，或不同比例的乙酸乙醋、氯仿、乙醇、甲醇、 丙酮的混合物；柱色譜所用溶劑包括但不限于乙酸乙醋、氯仿、乙醇、 甲醇、丙酮、或它們的混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎舌紅素B的制備方法，其特征在于所 用的重結(jié)晶溶劑包括但不限于丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸乙酯、乙 醚、石油醚或它們的混合物。
9. 虎舌紅素B的用途，其特征在于虎舌紅素B用于制備治療和預 防腫瘤、艾滋病、流感、皰疹、肝炎及致病性微生物所引起的炎性反 應的藥品，或在與這些疾病相關(guān)的產(chǎn)品中應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中虎舌紅素B的制備方法與用途，由虎舌紅全株或枝葉或根莖為藥材，用水、任意比例的甲醇水溶液、乙醇水溶液或有機溶媒提取，提取液過濾濃縮；濃縮物經(jīng)大孔樹脂、柱層析(氧化鋁或硅膠)色譜法單獨或聯(lián)合分離后，再重結(jié)晶精制而成。本發(fā)明的優(yōu)點是提供了可用于抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒(如流感病毒、皰疹病毒、肝炎病毒、及包括HIV在內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒等)的虎舌紅素B的制備方法，其成本低，工藝穩(wěn)定，收率為干燥藥材的1％以上，可以得到除去大量雜質(zhì)的高純度的虎舌紅素B，并且藥理活性顯著。
文檔編號C07J71/00GK101157717SQ200610141988
公開日2008年4月9日 申請日期2006年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月4日
發(fā)明者剛 薛, 洪 薛, 薛永新, 薛永江 申請人:薛永新