專利名稱：具有白介素－2中和能力的免疫治療制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠增強(qiáng)針對(duì)白介素-2(IL-2)的免疫反應(yīng)并且產(chǎn)生自身抗體的藥物制劑，所述抗體能阻斷與受體的結(jié)合，并且所述制劑可用于治療腫瘤。
現(xiàn)有技術(shù)的說明免疫系統(tǒng)特別是T細(xì)胞能識(shí)別腫瘤抗原的能力的發(fā)現(xiàn)，是開發(fā)用于控制免疫系統(tǒng)以便治療癌癥患者的策略的根本支柱之一。
因此，為了開發(fā)回收浸潤腫瘤基質(zhì)的特異性T細(xì)胞(被稱作腫瘤-浸潤淋巴細(xì)胞(TIL))或來自未治療個(gè)體的外周血液或在使用治療性癌癥疫苗之后的個(gè)體的外周血液的特異性T細(xì)胞的方法，主要努力方向是刺激所述細(xì)胞，以便加強(qiáng)它們?cè)隗w內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)能力。
因此，主要策略指向增強(qiáng)它們針對(duì)多種腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的特異性細(xì)胞毒活性。主要治療方法集中在白介素-2(IL-2)的體外應(yīng)用，以便激活并且擴(kuò)增來自攜帶腫瘤的個(gè)體的TIL，然后再將這些細(xì)胞重新輸回到所述個(gè)體體內(nèi)(Rosenberg，S.A.等(1986)Science 233，1318-1321；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6458-6462；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3515-3519)。不過，盡管證實(shí)了在體外實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)的刺激作用，所述干預(yù)具有有限的治療結(jié)果。由此導(dǎo)致了對(duì)基于使用治療性癌癥疫苗的主動(dòng)特異性免疫方案的應(yīng)用的治療模式的評(píng)估，設(shè)計(jì)了包含與IL-2結(jié)合的腫瘤抗原的疫苗載體，以便有利于體內(nèi)有效細(xì)胞免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，不過，上述方法的結(jié)果較差(Rosenberg，S.A.，等(1998)Nat.Med.4，321-327)。
目前，主要臨床策略業(yè)已轉(zhuǎn)向開發(fā)基于反應(yīng)性T細(xì)胞從患者獲得性轉(zhuǎn)移到其自身的腫瘤抗原的方式。在體外使用抗CD3單克隆抗體(mAb)和IL-2刺激并且擴(kuò)增所述細(xì)胞，在回輸?shù)窖髦兄?，提供IL-2胃腸外用藥。該方法構(gòu)成了為了治療癌癥患者而設(shè)計(jì)的主要治療干預(yù)之一，盡管治療結(jié)果仍然是謹(jǐn)慎的(Dudley，M.E.，等(2002)Science 298，850-854；Rosenberg，S.A.等(2004)Proc Natl AcadSci USA.101 Suppl 2，14639-45)。
所有這些治療策略的合理化設(shè)計(jì)都是基于將白介素-2用作抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞激活的必要分子(US 6,060,068和US 5,830,452)。
IL-2在免疫中所起作用的背景基于在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。從它的發(fā)現(xiàn)起，IL-2就被認(rèn)識(shí)到它刺激T細(xì)胞增殖的能力(因此，IL-2的同義詞是T細(xì)胞生長因子)。進(jìn)一步證實(shí)了T細(xì)胞增殖和功能可在體外使用抗IL-2或抗IL-2受體進(jìn)行抑制，驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)(Smith，KA.Immunol Rev 51337-357，1980)。
最近，業(yè)已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人類腫瘤能夠通過產(chǎn)生具有抗腫瘤免疫性抑制能力的T細(xì)胞而減弱免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。所述細(xì)胞業(yè)已在動(dòng)物模型和表現(xiàn)不同分化標(biāo)記的患者中表征，盡管它們的相關(guān)性與所述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒煌?Bach，J.F.(2003)Nat Rev Immunol 3，189-198；Chakraborty，N.G.，等(2004)Hum Immunol 65，794-802；Markus，Y.M.y Sykes，M.(2004)J Clin Oncol 22，1136-1151)。
分化簇25(CD25)構(gòu)成了IL-2受體的α鏈。此外，這種細(xì)胞因子的受體的結(jié)構(gòu)包括β(CD122)和γ(CD132)鏈。它們?cè)陟o息T淋巴細(xì)胞中以組成型方式表達(dá)，并且所述細(xì)胞的激活，誘導(dǎo)了α鏈的合成，高親和力雜三聚體受體的形成和IL-2分泌。CD25在5-10％的CD4+T淋巴細(xì)胞中組成型表達(dá)，并且在低于1％的外周CD8+T淋巴細(xì)胞中表達(dá)。所述細(xì)胞是無變應(yīng)性的，并且表現(xiàn)出體外抑制活性(Shevach，E.M.(2002)Nat Rev Immunol 2，389-400)。
最近業(yè)已證實(shí)，被動(dòng)施用抗CD25mAb，在某些實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤中能誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，盡管其他腫瘤對(duì)這種治療有耐受性(Onizuka，S.等(1999)Cancer Res 59，31 28-31 33)。
免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)針對(duì)自身分子的反應(yīng)的能力是有限的，特別是對(duì)諸如生長因子的可溶性分子。然而，用與載體蛋白綴合并且在佐劑中乳化的這些因子進(jìn)行主動(dòng)免疫，能促進(jìn)針對(duì)所述分子的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)(U.S.5.984.018)。針對(duì)自體或異源分子產(chǎn)生的特異性自身抗體，能抑制其與它們的受體的結(jié)合，阻止通過這種結(jié)合觸發(fā)的增殖的機(jī)制。
根據(jù)以上結(jié)果可以將抗腫瘤反應(yīng)依賴于IL-2的存在視為現(xiàn)有技術(shù)。因此，我們決定表征體內(nèi)抗IL-2自身抗體對(duì)腫瘤演變的影響，所述抗體是通過用存在于佐劑中的與載體分子綴合的IL-2主動(dòng)免疫誘導(dǎo)的。
令人吃驚的是，阻斷IL-2與它的受體結(jié)合的自身抗體的誘導(dǎo)能促進(jìn)腫瘤生長的減弱，即使是對(duì)通過被動(dòng)施用抗CD25mAb誘導(dǎo)的抗腫瘤作用具有耐受性的腫瘤。另外，所述自身抗體的存在不會(huì)影響治療對(duì)象中對(duì)癌癥疫苗的免疫反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及對(duì)治療腫瘤有作用的治療制劑，對(duì)于所述腫瘤來說，對(duì)象免疫系統(tǒng)的作用是重要的。具體地講，本發(fā)明包括制備能夠產(chǎn)生自身抗體的免疫治療制劑，所述自身抗體能阻斷白介素-2與它的受體的結(jié)合，并且抑制腫瘤生長。
本發(fā)明的目的是能抑制IL-2與它的受體結(jié)合的治療制劑，可用于治療癌癥患者，其中，該制劑包括與載體蛋白結(jié)合的IL-2或它的肽；另外，它含有合適的佐劑。具體地講，本發(fā)明的治療制劑包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌的載體蛋白P64k，且佐劑選自氫氧化鋁和MontanideISA 51。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述治療制劑包括通過化學(xué)綴合與P64k綴合的IL-2。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，所述制劑包括融合蛋白形式的IL-2或它的肽與P64k。
本發(fā)明還包括能抑制IL-2與它的受體結(jié)合的治療制劑，可用于治療患有癌癥的個(gè)體，并且，該制劑包括抗人IL-2(hIL-2)的特異性單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療癌癥患者的方法，其需要阻斷IL-2與其受體結(jié)合，以便觸發(fā)針對(duì)腫瘤的合適的免疫反應(yīng)，該方法包括施用含有IL-2或抗IL-2抗體的疫苗組合物。
在本發(fā)明的另一方面，披露了基于IL-2的疫苗和基于特異性腫瘤抗原或腫瘤生長因子的其他癌癥疫苗以及實(shí)際常規(guī)應(yīng)用的化療劑或放療的治療組合。
術(shù)語″治療組合″表示物理組合(即混合物形式)，關(guān)于兩者作為不同和單獨(dú)的構(gòu)成組織(例如以試劑用具形式)并當(dāng)它們聯(lián)合用于治療患者時(shí)的關(guān)聯(lián)。因此，藥物組合是在涉及施用兩種化合物的治療方案中的有用組合，或通過物理結(jié)合，如同在治療過程中給同一患者施用的獨(dú)立劑量。
術(shù)語″癌癥疫苗″表示主動(dòng)免疫治療中的有用制劑，以便在接受治療的對(duì)象體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)識(shí)別用于所述疫苗中的抗原，并且可以進(jìn)行測(cè)量。
1.-獲得免疫原性組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物包括與載體蛋白綴合的人重組白介素-2(hIL-2r)作為活性成分，所述載體蛋白優(yōu)選是來自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜復(fù)合物的蛋白P64k(0474313EP A2和U.S.5.286.484)。另外，該疫苗組合物包括合適的佐劑。本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選使用Montanide ISA 51作為佐劑。
hIL-2r和載體蛋白之間的綴合可以是通過化學(xué)綴合，或者是構(gòu)建通過遺傳工程技術(shù)獲得的融合蛋白。
-獲得包括通過化學(xué)綴合與P64k蛋白綴合的hIL-2r的疫苗組合物。
為了獲得hIL-2r和P64k蛋白之間的蛋白綴合，以20∶1-5∶1(hIL-2r的摩爾數(shù)與P64k蛋白的摩爾數(shù)之比)的可變比例混合這兩種成分，優(yōu)選10∶1(hIL-2r的摩爾數(shù)與P64k蛋白的摩爾數(shù)之比)。將戊二醛添加到該混合物中，至最終濃度為0.02-0.1％，優(yōu)選0.5％，并且在室溫(RT)下溫育1-5小時(shí)。最后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液進(jìn)行充分透析。通過10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證所述綴合反應(yīng)(Laemmli UK(1970)Nature 277，680-685)。
-獲得包括hIL-2r和P64k蛋白之間的融合蛋白的疫苗組合物。
通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用特異性引物擴(kuò)增編碼IL-2的基因(447pb)。消化所得到的DNA片段，并且連接在表達(dá)載體的特定結(jié)合位點(diǎn)中，在該載體中克隆編碼所述載體蛋白的基因，以便所得到的蛋白包括這兩種分子的一個(gè)或多個(gè)拷貝?？梢允褂脕碜圆溉閯?dòng)物細(xì)胞和來自細(xì)菌或酵母的任何表達(dá)載體。所述載體在載體蛋白的N-末端還可包括六個(gè)組氨酸。通過以下方法驗(yàn)證所得到的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行限制分析，使用酶Sequenace 2.0(Amersham-USB)分析DNA序列，最后，通過″Western印跡″技術(shù)，使用特異性抗hIL-2單克隆抗體，分析所述融合蛋白在大腸桿菌的任何表達(dá)菌株中的生產(chǎn)。為了獲得所述蛋白，使用強(qiáng)力破碎方法破碎細(xì)胞壁，然后通過使用硫酸銨的示差沉淀方法和層析方法的組合來純化所述蛋白。最后，在無菌條件下過濾所述蛋白并且在-20℃下保存或者凍干并且在4℃下保存待用。
-獲得包括與P64k蛋白化學(xué)綴合或作為融合蛋白結(jié)合的來自hIL-2r的肽的疫苗組合物。
通過化學(xué)合成獲得的來自IL-2的氨基酸序列的肽可以通過化學(xué)綴合而結(jié)合到P64k蛋白上，如U.S.5,984,018中所述。另外，來自hIL-2r的肽與P64k蛋白的融合蛋白大體上是按照前面部分所述相同方法獲得的，例子可以包括來自以下區(qū)域的肽1)肽 N33-A50
氨基酸數(shù)目 18序列NPKLTRMLTFKFYMPKKA2)肽 T113-T133氨基酸數(shù)目 21序列TIVEFLNRWITFCQSIISTLT-化學(xué)綴合的hIL-2r-P64k的電泳。
可以用10％SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(Laemmli U.K.(1970)Nature 277，680-685)。每個(gè)孔添加15μg樣品，并且用考馬斯染料染色。
2.-由包括hIL-2r和蛋白P64k的疫苗組合物產(chǎn)生的效果的表征。臨床前研究。
-疫苗組合物的免疫原性。
為了在動(dòng)物中研究本發(fā)明疫苗制劑的免疫原性，使用了8-12周齡，體重18-20g的雌性BALB/c小鼠。在實(shí)驗(yàn)期間，小鼠在按照GoodPractices of Care of and Use of the Experimental Animals的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)下建立的飼養(yǎng)和操作的標(biāo)準(zhǔn)條件下圈養(yǎng)。
可以遵循不同的免疫接種方案-方案A，通過肌內(nèi)途徑每2周施用0.1mL的4μg當(dāng)量劑量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式綴合的hIL-2r的四個(gè)劑量，交替肢體的接種部位。
-方案B，通過肌內(nèi)途徑施用0.1mL的10μg當(dāng)量劑量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式綴合的hIL-2r的四個(gè)劑量。前兩個(gè)劑量是在兩個(gè)肢體的獨(dú)立的免疫接種部位同時(shí)施用的，并且在兩周之后，在另外兩個(gè)肢體上施用兩個(gè)劑量。
-評(píng)估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)hIL-2r的抗體反應(yīng)。
可檢測(cè)血清中的自身抗體滴度，通過現(xiàn)有用于測(cè)定封閉性抗體或評(píng)估外周血液中特異性免疫反應(yīng)的方法之一，測(cè)定特異性抗體或B細(xì)胞。
由疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51誘導(dǎo)的抗hIL-2r抗體可以通過間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)評(píng)估，使用來自免疫動(dòng)物的血清，參見下文用50μl/孔的hIL-2r覆蓋96孔平底微量滴定板(Costar，HighBinding，USA)，用碳酸鹽-碳酸氫鹽0.1M，pH9.6溶液制備成10μg/mL的濃度。在4℃下溫育所述平板過夜，并且用200μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-Tween 20)洗滌2次。在37℃下與100μl/孔含有1％的牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA 1％)溫育1小時(shí)之后，用200l/孔的PBS-Tween 20洗滌平板，然后添加在PBS-BSA 1％中不同稀釋度的血清樣品50μl/孔。在37℃下溫育1小時(shí)之后，用PBS-Tween 20洗滌平板，并且添加50μl/孔的與堿性磷酸酶(JacksonImmunoresearch Laboratories)綴合的綿羊抗小鼠血清(它是以1/5000的比例用PBS-BSA稀釋的)，并且在37℃下溫育1小時(shí)。洗滌平板，并且添加50μl/孔的底物溶液，該溶液由1μg/mL的對(duì)硝基苯磷酸(Sigma)在pH9.8的二乙醇胺緩沖溶液中組成。在室溫(RT)下溫育平板30分鐘之后，通過ELISA讀數(shù)器(Organon Teknika，Austria)在405nm波長下測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。
-評(píng)估由基于EGF的疫苗誘導(dǎo)的抗hEGF抗體反應(yīng)可以檢測(cè)血清中的自身抗體滴度，通過現(xiàn)有用于測(cè)定封閉性抗體或評(píng)估外周血液中的特異性免疫反應(yīng)的方法之一，測(cè)量特異性抗體或B細(xì)胞。
通過基于EGF的疫苗誘導(dǎo)的抗hEGF抗體可以通過間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)評(píng)估，使用來自免疫動(dòng)物的血清，參見Gonzalez，G.，等(2002)Vaccine Research 5，233-244。
-在與來自用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51免疫接種的動(dòng)物血清或針對(duì)hIL-2r的特異性單克隆抗體(mAb)溫育之后對(duì)CTLL-2細(xì)胞系增殖的影響。
將IL-2依賴型T-細(xì)胞系CTLL-2保持在含有1U/mL的hIL-2h的RPMI-1640培養(yǎng)基中，使它處在連續(xù)增殖狀態(tài)。CTLL-2培養(yǎng)是在裝有25mL含有8-20％的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640和0.5×105-106細(xì)胞/mL細(xì)胞懸浮液的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行的。所述細(xì)胞在體外擴(kuò)增兩天之后使用。
為了進(jìn)行所述分析，從體外培養(yǎng)物中提取細(xì)胞，并且用RPMI-1640或PBS洗滌不少于四次。在96孔平底培養(yǎng)平板(Costar，High Binding，USA)中，接種5×103細(xì)胞。用來自免疫動(dòng)物的血清稀釋液處理這些細(xì)胞，所述動(dòng)物是使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的，對(duì)IL-2的ELISA滴度為1∶10000，或使用抗IL-2特異性mAb處理細(xì)胞，并且添加1U/mL的hIL-2r。在37℃下在潮濕氣氛中在含有5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。通過在培養(yǎng)的最后18-24小時(shí)用[3H]胸苷(1μCi/孔)進(jìn)行脈沖而測(cè)定增殖。通過液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定胸苷摻入。所有操作都是在無菌條件下進(jìn)行的。
3-hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗的抗腫瘤效果。臨床前研究。
為了在動(dòng)物中研究本發(fā)明疫苗制劑的抗腫瘤效果，使用了8-12周齡的體重18-20g的雌性BALB/c小鼠。可按照前面詳述的方案A和B用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，并且在一周之后通過皮下途徑同位接種腫瘤細(xì)胞系，如乳腺癌F3II，接種量為5×104細(xì)胞/動(dòng)物。將具有可觸及的腫瘤的小鼠評(píng)分為陽性，并且使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長，確定最大表面長度(a)和它的垂直寬度(b)，并且將腫瘤大小報(bào)道為a×b。定期檢查腫瘤。
令人吃驚和出乎預(yù)料的是，本發(fā)明的作者業(yè)已發(fā)現(xiàn)了在攜帶惡性腫瘤對(duì)象體內(nèi)IL-2與它的受體的結(jié)合中和，增強(qiáng)了針對(duì)該腫瘤的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)了腫瘤尺寸的縮小?，F(xiàn)有技術(shù)表明，這種作用會(huì)導(dǎo)致抑制個(gè)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的反應(yīng)。
作者業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)象接受本發(fā)明的疫苗組合物的主動(dòng)治療時(shí)，在循環(huán)IL-2水平顯著降低時(shí)，獲得了對(duì)腫瘤生長的這種作用，正如這種減輕作用在用抗IL-2單克隆抗體被動(dòng)治療下獲得時(shí)。
為此，本發(fā)明產(chǎn)生了在治療患有惡性腫瘤患者方面的不可否認(rèn)的優(yōu)點(diǎn)，并且提供了用IL-2進(jìn)行免疫接種的方法，該方法有效，簡(jiǎn)單，并且與這些情況下使用的常規(guī)治療相比對(duì)患者來說更容易接受和攻擊性更小。
以下實(shí)施例包括說明本發(fā)明主題的疫苗組合物的免疫學(xué)效果的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。
實(shí)施例用于本發(fā)明的疫苗組合物中的人重組IL-2(hIL-2r)可通過商業(yè)渠道獲得(U.S.5.614.185)。用在該疫苗中的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白P64k是通過重組DNA技術(shù)獲得的，參見EP 0474313 A2和U.S.5,286,484。
實(shí)施例1由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。
為了促進(jìn)針對(duì)人白介素-2的免疫原性，通過化學(xué)方法將它綴合到來自腦膜炎奈瑟氏球菌的載體蛋白P64k蛋白上。所述化學(xué)綴合可以通過戊二醛方法實(shí)現(xiàn)(U.S.5.984.018)。通過10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證綴合的效率，分別添加每一種成分的樣品(hIL-2r，P64k)，與化學(xué)綴合物hIL-2r-P64k和標(biāo)準(zhǔn)分子量圖譜進(jìn)行比較?？梢酝ㄟ^添加hIL-2r-P64k的泳道中的連續(xù)存在驗(yàn)證獲得了綴合物(

圖1)。
為了評(píng)估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)hIL-2r的抗體反應(yīng)，用方案A和B對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。將來自對(duì)hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗有反應(yīng)的動(dòng)物的超免疫血清用作陽性對(duì)照，并且將免疫前血清用作陰性對(duì)照。它被定義為免疫動(dòng)物的抗體滴度，血清的光密度大于免疫前血清的光密度的平均值加上五倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的較大稀釋度。為了確定對(duì)照動(dòng)物的滴度，使用與之前相同的標(biāo)準(zhǔn)，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作為陰性對(duì)照。
誘導(dǎo)抗體反應(yīng)達(dá)到1∶100-1∶50000的滴度。該免疫方案持續(xù)大約52天，這是必須對(duì)該方案進(jìn)行改進(jìn)以便在較短時(shí)間內(nèi)獲得相似或更好抗體滴度的原因，因此我們使用方案B并且獲得了類似結(jié)果，參見圖2。
實(shí)施例2用來自使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的動(dòng)物的血清處理的CTLL-2細(xì)胞系的增殖實(shí)驗(yàn)通過與IL-2依賴型T-細(xì)胞系CTLL-2培養(yǎng)評(píng)估在用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的血清抗體的體外IL-2結(jié)合能力。在存在IL-2的條件下將CTLL-2細(xì)胞接種到培養(yǎng)平板中，讓它們生長，并且添加來自動(dòng)物的抗體滴度為大約1∶10000的不同的血清稀釋液。觀察到了血清濃度和對(duì)CTLL-2細(xì)胞系增殖的抑制作用之間的正相關(guān)(圖3)。證實(shí)了來自免疫動(dòng)物的血清的體外IL-2中和能力。
實(shí)施例3用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗處理的動(dòng)物的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。
按照方案B用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。一周之后，用5×104F3II腫瘤細(xì)胞攻擊動(dòng)物。與用PBS-P64k/Montanide ISA 51接種的對(duì)照組相比，用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的動(dòng)物的腫瘤生長動(dòng)力學(xué)較緩慢(圖4a)。觀察到了這兩組之間腫瘤大小在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。
實(shí)施例4用抗IL-2特異性mAb處理的CTLL-2細(xì)胞系的增殖試驗(yàn)。
通過與IL-2依賴型T-細(xì)胞系CTLL-2一起培養(yǎng)評(píng)估由S4B6(ATCC#HB-8794)雜交瘤產(chǎn)生的針對(duì)hIL-2r的特異性抗體的體外IL-2結(jié)合能力。在存在IL-2的條件下將CTLL-2細(xì)胞接種到培養(yǎng)平板中，使它們生長，并且添加不同的抗體稀釋液。發(fā)現(xiàn)了抗體濃度和對(duì)CTLL-2細(xì)胞系增殖的抑制作用之間的正相關(guān)(圖5)。發(fā)現(xiàn)1∶100的抗體稀釋度能夠抑制80％以上的CTLL-2細(xì)胞系增殖，證實(shí)了所述單克隆抗體的體外IL-2中和能力。
實(shí)施例5抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗腫瘤效果。F3II實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?乳腺癌)。
連續(xù)五天每天用劑量為1mg的特異性單克隆抗體(抗IL-2 mAb或抗CD25 mAb)處理小鼠。兩天之后，用5×104細(xì)胞/小鼠的實(shí)驗(yàn)乳腺癌F3II通過皮下垂直注射而攻擊小鼠。定期測(cè)量最大表面長度(a)的它的垂直寬度(b)。對(duì)照組(用PBS處理)的腫瘤尺寸比用抗IL-2mAb處理組的尺寸大(圖6)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的腫瘤尺寸在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有差異的。不過，抗CD25 mAb(ATCC-PC61)處理的動(dòng)物的腫瘤尺寸與對(duì)照組類似。這一結(jié)果表明，IL-2中和抗體具有有效的抗腫瘤效果，即使對(duì)于其中消除CD25調(diào)控細(xì)胞沒有作用的腫瘤也是如此。
實(shí)施例6抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗腫瘤效果。EL4實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?淋巴瘤)。
用5×104細(xì)胞/小鼠的EL4淋巴瘤皮下攻擊C57BL/6動(dòng)物。在腫瘤攻擊之前兩天用一個(gè)劑量的1mg的抗CD25mAb(PC61)靜脈內(nèi)處理動(dòng)物，或連續(xù)五天每天用1mg劑量的抗IL-2mAb(S4B6)處理，在腫瘤接種之前六天開始。其他組基于前面所述的類似方案同時(shí)施用抗CD25和抗IL-2mAb。
記錄每一組小鼠的腫瘤生長。在腫瘤攻擊之后，每周兩次沿兩個(gè)垂直維度測(cè)量每一只小鼠的腫瘤尺寸。EL4腫瘤的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為*p＝0.0232，**p＝0.0039，***p＜0.0001。圖7顯示兩種單克隆抗體的組合對(duì)腫瘤生長具有強(qiáng)烈作用。
實(shí)施例7誘導(dǎo)抗IL-2自身抗體不影響對(duì)EGF癌癥疫苗的反應(yīng)。
為了評(píng)估由疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51誘導(dǎo)的抗hEGF的抗體反應(yīng)是否受先前用hIL-2r免疫(誘導(dǎo)自身抗體)的影響，按照方案A用制備的hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗對(duì)BALB/c動(dòng)物進(jìn)行免疫，并且在19天之后用制備的hEGF-P64k/Montanide ISA 51或hEGF/Montanide ISA 51疫苗免疫。在所有實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用hEGF疫苗接種時(shí)，通過肌內(nèi)途徑施用在0.1mL體積中制備的綴合在疫苗中的4μg當(dāng)量的hEGF。將對(duì)疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51有反應(yīng)的動(dòng)物的超免疫血清用作陽性對(duì)照，將免疫前血清用作陰性對(duì)照。將它定義為免疫動(dòng)物的抗體滴度，血清的光密度大于免疫前血清的光密度的平均值加上5倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的較大稀釋度。為了確定動(dòng)物對(duì)照的滴度，采用了與之前相同的標(biāo)準(zhǔn)，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作為陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)通過用EGF/Montanide ISA 51或hEGF-P64k/Montanide ISA 51免疫誘導(dǎo)的抗EGF抗體的滴度不受抗hIL-2r自身抗體的誘導(dǎo)的影響，參見圖8。
實(shí)施例8在體內(nèi)中和白介素-2恢復(fù)細(xì)胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的淋巴結(jié)細(xì)胞中進(jìn)行評(píng)估。
在攜帶腫瘤的宿主體內(nèi)評(píng)估了IL-2中和作用對(duì)于對(duì)標(biāo)稱抗原的免疫反應(yīng)的影響。在標(biāo)準(zhǔn)圈養(yǎng)條件下維持雌性C57BL/6J小鼠(H-2b)。對(duì)所有實(shí)驗(yàn)來說，使用6-12周齡的小鼠。卵白蛋白(OVA)和肽VII級(jí)OVA(Sigma，St.Louis，MO)是在這些實(shí)驗(yàn)中使用的模型蛋白Ag。所使用的優(yōu)勢(shì)肽OVA275-264(SIINFEKL)的純度＞90％。增殖試驗(yàn)用104細(xì)胞的MB16F10腫瘤或PBS通過皮下途徑在C57BL/6小鼠的左脅進(jìn)行攻擊。定期測(cè)量腫瘤直徑。三周之后，對(duì)所述小鼠進(jìn)行皮下免疫接種，在第0天使用1mg的OVA與100g/小鼠的聚肌胞苷酸[poly IC](PIC)(Sigma，St.Louis，MO)，而在隨后2天只施用PIC。同時(shí)，連續(xù)五天用對(duì)hIL-2r的特異性單克隆抗體(αIL-2)或PBS處理動(dòng)物。用通過熒光染料CFSE(Molecular Probes，Paisley，UK)差示標(biāo)記的來自幼稚小鼠的脾細(xì)胞測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞裂解活性。將標(biāo)記CFSEhigh的細(xì)胞用作靶標(biāo)，并且用SIINFEKL脈沖(1μM；90分鐘，37℃，5％CO2)，而標(biāo)記CFSElow的細(xì)胞不進(jìn)行脈沖，以便用作內(nèi)部對(duì)照。對(duì)經(jīng)肽脈沖的靶細(xì)胞進(jìn)行充分洗滌，以便除去游離肽，然后以1∶1的比例對(duì)先前免疫的小鼠靜脈內(nèi)共同注射。十六小時(shí)之后，取出淋巴結(jié)和脾臟，并且通過流式細(xì)胞計(jì)測(cè)量與兩種熒光強(qiáng)度(CFSElow和CFSEhigh)相應(yīng)的總事件。計(jì)算未包被的與SIINFEKL包被的百分比之間的比例(CFSEint/CFSEhigh)，以便獲得細(xì)胞毒性的數(shù)值。在體內(nèi)在用OVA加上PIC免疫的C57BL/6小鼠中評(píng)估的淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA肽的細(xì)胞裂解活性產(chǎn)生了最大的反應(yīng)。連續(xù)5天每天通過靜脈內(nèi)注射施用1mg劑量的抗IL-2單克隆抗體在這些動(dòng)物中不影響細(xì)胞裂解反應(yīng)。用MB16F10腫瘤攻擊的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，對(duì)OVA的細(xì)胞裂解活性降低。不過，體內(nèi)施用具有IL-2中和能力的單克隆抗體恢復(fù)了淋巴結(jié)細(xì)胞的免疫反應(yīng)(圖9)。
實(shí)施例9在體內(nèi)中和白介素-2恢復(fù)細(xì)胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的脾細(xì)胞中評(píng)估。
在攜帶腫瘤的宿主體內(nèi)評(píng)估了IL-2中和作用對(duì)于對(duì)標(biāo)稱抗原的免疫反應(yīng)的影響。用OVA和PIC對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫，并且在體內(nèi)評(píng)估脾細(xì)胞對(duì)OVA肽的細(xì)胞裂解活性，獲得了最大反應(yīng)。連續(xù)5天每天通過靜脈內(nèi)注射施用1mg劑量的抗IL-2單克隆抗體不會(huì)影響所述動(dòng)物中的細(xì)胞裂解反應(yīng)。
用MB16F10腫瘤攻擊的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，對(duì)OVA的細(xì)胞裂解活性降低。不過，體內(nèi)施用具有IL-2中和能力的單克隆抗體恢復(fù)腺細(xì)胞的免疫反應(yīng)(圖10)。
實(shí)施例10用制備的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的動(dòng)物的血細(xì)胞計(jì)數(shù)。
為了評(píng)估用制備的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫是否會(huì)誘導(dǎo)血細(xì)胞數(shù)量的改變，對(duì)紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)，用制備的疫苗免疫過的動(dòng)物(按照方案A)或者沒有免疫過的動(dòng)物，一直到首次免疫之后100天。參見圖11，在分析組之間沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異。
附圖的簡(jiǎn)要說明圖1-化學(xué)綴合的hIL-2r-P64k的電泳。從左到右的條帶分別相應(yīng)于P64k，hIL-2r，hIL-2r-P64k和分子量的標(biāo)準(zhǔn)模式。
圖2-通過用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫誘導(dǎo)的抗hIL-2r的抗體的滴度，使用前面所披露的兩種免疫方案。y軸表示抗IL-2的抗體滴度的幾何平均值。x軸表示相應(yīng)于用以下物質(zhì)免疫的動(dòng)物的組對(duì)照P64k/Montanide ISA 51。
Sch A IL-2hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案A。
Sch B IL-2hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案B。
圖3-在存在hIL-2r和來自動(dòng)物血清的不同稀釋液的條件下CTLL-2細(xì)胞系的增殖，所述動(dòng)物是用疫苗hIL-2r-P64k/MontanideISA 51免疫接種的，并且血清滴度數(shù)量級(jí)為1∶1000-1∶50000。
圖4-用疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51或P64k/MontanideISA 51(對(duì)照組)免疫并且隨后用F3II腫瘤攻擊的動(dòng)物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為由較大的直徑乘以垂直選定的較小的直徑。
圖5-在存在hIL-2r和抗IL-2抗體的不同稀釋液的條件下CTLL-2細(xì)胞系的增殖。
圖6-用抗IL-2mAb，抗CD25 mAb或PBS(對(duì)照組)處理并且用F3II腫瘤細(xì)胞系攻擊的動(dòng)物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為較大直徑乘以垂直選定的較小直徑。
圖7-用αIL-2mAb，抗CD25mAb或PBS(對(duì)照組)處理并且隨后用淋巴瘤EL4攻擊的動(dòng)物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為較大直徑乘以垂直選定的較小直徑。
圖8-通過用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51和hEGF-P64k/Montanide ISA 51接種誘導(dǎo)的對(duì)EGF的抗體滴度。y軸表示對(duì)EGF的抗體滴度的幾何平均值。x軸表示用以下物質(zhì)免疫的組hIL-2rhIL-2r-P64k/Montanide ISA 51hEGFhEGF/Montanide ISA 51hIL-2r+hEGFhIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hEGF/P64khIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hIL-2r+hEGF/P64khIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/P64k/Montanide。
圖9-誘導(dǎo)的對(duì)白介素-2的抗體恢復(fù)細(xì)胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的淋巴結(jié)細(xì)胞中進(jìn)行評(píng)估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC進(jìn)行皮下免疫接種，并且在隨后2天僅施用PIC。使用來自幼稚小鼠的脾細(xì)胞測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞裂解活性，所述細(xì)胞是用熒光染料CFSE進(jìn)行差示標(biāo)記的。將標(biāo)記CFSEhigh的細(xì)胞用作靶標(biāo)，并且用SIINFEKL脈沖，而標(biāo)記CFSElow的細(xì)胞不進(jìn)行脈沖，用作內(nèi)部對(duì)照。然后以1∶1的比例對(duì)先前免疫過的小鼠進(jìn)行共同靜脈內(nèi)注射。在淋巴結(jié)細(xì)胞中評(píng)估細(xì)胞裂解活性。
對(duì)照-用PBS處理的動(dòng)物，αIL-2-用IL-2中和單克隆抗體處理的動(dòng)物，MB16F10-與對(duì)照類似但用MB16F10攻擊的動(dòng)物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和單克隆抗體處理的攜帶MB16F10腫瘤的小鼠。
圖10-誘導(dǎo)的對(duì)白介素-2的抗體恢復(fù)細(xì)胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主脾細(xì)胞中進(jìn)行評(píng)估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC進(jìn)行皮下免疫接種，并且在隨后2天僅施用PIC。使用來自幼稚小鼠的脾細(xì)胞測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞裂解活性，所述脾細(xì)胞是用熒光染料CFSE進(jìn)行差示標(biāo)記的。標(biāo)記CFSEhigh的細(xì)胞被用作靶標(biāo)，并且用SIINFEKL脈沖，而標(biāo)記CFSElow的細(xì)胞不進(jìn)行脈沖，用作內(nèi)部對(duì)照，然后以1∶1的比例對(duì)先前免疫過的小鼠進(jìn)行共同靜脈內(nèi)注射。在脾細(xì)胞中評(píng)估細(xì)胞裂解活性。
對(duì)照-用PBS處理的動(dòng)物，αIL-2-用IL-2中和單克隆抗體處理的動(dòng)物，MB16F10-與對(duì)照類似但用MB16F10攻擊的動(dòng)物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和單克隆抗體處理的攜帶MB16F10腫瘤的小鼠。
圖11-用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的動(dòng)物的血細(xì)胞計(jì)數(shù)(白細(xì)胞(白血球)，紅細(xì)胞(紅血球)和血小板)與對(duì)照(P64k/Montanide ISA 51)的比較。
權(quán)利要求
1.用于治療癌癥患者的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括下列至少一種A.-通過遺傳學(xué)方法或化學(xué)綴合而與任何載體蛋白結(jié)合的IL-2或它的任意衍生物，包含合適的佐劑，B.-抗IL-2單克隆抗體，C.-基于特異性腫瘤抗原或生長因子的癌癥疫苗，D.-抗CD25單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括同時(shí)或依次施用A+C或A+D或B+C或B+D。
3.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括與載體蛋白結(jié)合的IL-2或它的任意衍生物，以及合適的佐劑。
4.如權(quán)利要求3的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括與載體蛋白結(jié)合的IL-2和合適的佐劑。
5.如權(quán)利要求4的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，其中，所用載體蛋白是來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64k。
6.如權(quán)利要求5的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，其中，所述佐劑選自氫氧化鋁和Montanide ISA 51。
7.如權(quán)利要求6的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，其中，所述佐劑是Montanide ISA 51。
8.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括IL-2和P64k之間的化學(xué)綴合。
9.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括IL-2與P64k的融合蛋白。
10.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括衍生自IL-2的肽與P64k的融合蛋白。
11.如權(quán)利要求1的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括抗人IL-2的特異性單克隆抗體。
12.如權(quán)利要求2的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括給對(duì)象施用與載體蛋白結(jié)合的IL-2或它的任何衍生物和佐劑，聯(lián)合基于特異性腫瘤抗原或生長因子的癌癥疫苗。
13.如權(quán)利要求12的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，其中，所述癌癥疫苗包括EGF。
14.如權(quán)利要求2的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括給對(duì)象施用與載體蛋白結(jié)合的IL-2或它的任意衍生物和佐劑，聯(lián)合抗CD25特異性單克隆抗體。
15.如權(quán)利要求13的引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的治療制劑，包括抗CD25特異性單克隆抗體。
16.權(quán)利要求1-15的治療制劑用于生產(chǎn)引發(fā)針對(duì)IL-2的免疫反應(yīng)的能夠抑制癌癥患者的腫瘤生長的藥物的用途。
17.權(quán)利要求1-15的治療制劑用于抑制腫瘤生長的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物制劑，它可用于癌癥，并阻斷白介素2(IL－2)與其受體的結(jié)合。具體地講，本發(fā)明涉及通過在佐劑Montanide ISA 51中將IL－2與腦膜炎奈瑟氏球菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P64k結(jié)合而可增強(qiáng)IL－2的免疫原性的治療制劑，用于誘導(dǎo)阻斷IL－2與其受體結(jié)合的自身抗體。本發(fā)明還涉及治療腫瘤包括乳腺癌的有效方法。另外，本發(fā)明還涉及基于IL－2的疫苗與基于特異性腫瘤抗原或腫瘤生長因子的其他癌癥疫苗以及常規(guī)用于腫瘤學(xué)實(shí)踐的放療或化療藥物的治療組合。
文檔編號(hào)C07K14/55GK101061136SQ200580039186
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者J·E·蒙特羅卡西米洛, L·B·艾倫索薩戴, R·佩雷斯羅德里格斯, A·B·拉格戴維拉 申請(qǐng)人:分子免疫中心