專(zhuān)利名稱(chēng)：選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)上的肽和相關(guān)結(jié)合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
無(wú)
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化和其后遺癥構(gòu)成西方世界中疾病和死亡的最常見(jiàn)且最重要的起因，這在西方所有的死亡中占到50％。如下文進(jìn)一步描述，動(dòng)脈粥樣硬化為由于動(dòng)脈粥樣化而引起的血管壁或動(dòng)脈增厚和無(wú)彈性所導(dǎo)致的病癥。
在正常心臟中，血管壁是由與具有結(jié)締組織上覆層的血管平滑肌細(xì)胞中間層緊密并置的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層組成。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層理想地位于血液與血管壁之間的界面上以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)由產(chǎn)生調(diào)控諸如血管緊張性、凝結(jié)狀態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡和白細(xì)胞通行的過(guò)程的因子來(lái)控制血管的穩(wěn)態(tài)平衡。血管平滑肌細(xì)胞維持血管回應(yīng)于血管活性劑之收縮緊張性且釋放細(xì)胞因子和其它生長(zhǎng)因子。平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生決定血管結(jié)構(gòu)的胞外基質(zhì)蛋白和蛋白酶。動(dòng)脈粥樣硬化的最常見(jiàn)形式阻塞性血管疾病的特征在于脂質(zhì)、炎性細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和胞外基質(zhì)蛋白在內(nèi)皮內(nèi)層與中間層之間的內(nèi)膜空間中的異常積累(空斑形成)。
動(dòng)脈粥樣硬化的療法通常預(yù)防、遏制或逆轉(zhuǎn)空斑形成過(guò)程或刺激新血管形成。然而，用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物或其它藥劑僅以冠狀血管為目標(biāo)很罕見(jiàn)。更常見(jiàn)的是，全身投與會(huì)導(dǎo)致不需的副作用，這是(例如)歸因于遍布于全身的全身性毒性作用。舉例而言，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖的血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)會(huì)促進(jìn)新血管形成，從而增加通往缺血組織的血流并緩解血管疾病。然而，VEGF也可促進(jìn)非特異性有絲分裂發(fā)生且增強(qiáng)血管生成驅(qū)動(dòng)的疾病(諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病)和某些腫瘤。類(lèi)似地，全身投與血管生成刺激物成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可引起嚴(yán)重的副作用，這是歸因于其缺乏對(duì)心臟組織的特異性。不幸的是，包括高血壓反復(fù)發(fā)作的這些副作用會(huì)限制用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的現(xiàn)有促血管生成療法的效用。
作為組成血管內(nèi)層的細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞是循環(huán)藥物或其它物質(zhì)所遇到的最先細(xì)胞類(lèi)型。內(nèi)皮細(xì)胞因此提供用于將治療物質(zhì)選擇性導(dǎo)向到心臟組織的目標(biāo)。藥物或其它治療物質(zhì)對(duì)心臟脈管系統(tǒng)的所述選擇性靶向?qū)⒔档突蛳T如全身毒性或惡性轉(zhuǎn)化的不當(dāng)副作用的風(fēng)險(xiǎn)。治療物質(zhì)對(duì)心臟脈管系統(tǒng)的選擇性靶向也將實(shí)現(xiàn)所述物質(zhì)的高局部濃度，從而降低有效治療所需的劑量。
因此，需要鑒定活體內(nèi)選擇性結(jié)合到心臟脈管系統(tǒng)上的分子。所述分子尤其適用于將治療劑選擇性靶向到心臟以治療心臟病和諸如動(dòng)脈粥樣硬化的心血管疾病。本發(fā)明滿足這一需要且提供相關(guān)優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供多種分離肽和肽模擬物，其(例如)可用于構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合物，或者當(dāng)肽自身具有生物活性時(shí)，可以未結(jié)合形式用作治療如下文所述的多種心血管疾病中的任一種的治療劑。因此，本發(fā)明提供具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其肽模擬物或氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO14)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXGRKSKTVZC(SEQ IDNO15)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本發(fā)明另外提供具有少于150個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。
本文還提供具有少于50個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。
本發(fā)明另外提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO16)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXRNSWKPNZC(SEQ IDNO17)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本文進(jìn)一步提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。
本發(fā)明還提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO18)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物包括氨基酸序列CXRSTRANPZC(SEQ ID NO19)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本發(fā)明另外提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ IDNO20)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，分離肽或肽模擬物包括氨基酸序列CXPKTRRVPZC(SEQ ID NO21)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本文進(jìn)一步提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ IDNO22)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXSGMARTKZC(SEQ ID NO23)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本文還提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使HLP/CRIP2或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與HLP/CRIP2特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上HLP/CRIP2結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2的錨定分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使受體克隆9或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與受體克隆9特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上受體克隆9結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9的錨定分子本發(fā)明還提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使Sigirr/TIR8或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與Sigirr/TIR8特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上Sigirr/TIR8結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8的錨定分子本文進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使MpcII-3相關(guān)蛋白或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與MpcII-3相關(guān)蛋白特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上MpcII-3相關(guān)蛋白結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合MpcII-3相關(guān)蛋白的錨定分子本發(fā)明進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使bc10或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與bc10特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上bc10結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10的錨定分子本文也提供在個(gè)體中將成分(moiety)導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其中對(duì)個(gè)體投與結(jié)合物，所述結(jié)合物含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本文還提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本文進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明另外提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO25)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。本文還提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQID NO27)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。本文還提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本文進(jìn)一步提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合單一Ig IL-2受體相關(guān)蛋白(Sigirr/TIR8；SEQ ID NO29)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。舉例而言，所述結(jié)合物可用于在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法中，所述方法是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33(與內(nèi)在膜蛋白(integral membrane protein)CII-3(MpcII-3)具有假定類(lèi)似性的蛋白產(chǎn)物)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。本發(fā)明另外提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ IDNO33的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
本文還提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。本發(fā)明另外提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。


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圖1繪示用結(jié)合細(xì)菌雙雜交分析的活體外和活體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)(phage display)鑒定錨定肽/受體對(duì)。(A)平行的錨定肽分離和受體鑒定的原則。將噬菌體展示的肽文庫(kù)注入小鼠并使其循環(huán)，采集組織且接著使其破碎為結(jié)合有噬菌體的單細(xì)胞。洗除未結(jié)合的噬菌體并回收結(jié)合的噬菌體，使其在細(xì)菌中生長(zhǎng)并重復(fù)所述過(guò)程或通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼肽的插入物且使其穿入細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體組份中。在細(xì)菌中，富含錨定到所選組織的能力的集合可與可能受體相互作用，從而產(chǎn)生耐羧芐青霉素性(carbenicillin-resistance)。將抗性克隆涂在含X-gal的瓊脂上以進(jìn)行二次篩檢，擴(kuò)增靶和誘餌插入物并從耐羧芐青霉素的LacZ表達(dá)細(xì)胞測(cè)序。(B)通過(guò)用抗CD31磁珠進(jìn)行第三輪活體外選擇，經(jīng)選擇的集合比非重組T7噬菌體高出約230倍地活體外結(jié)合心臟細(xì)胞。(C)當(dāng)針對(duì)活體內(nèi)錨定到心臟而進(jìn)一步選擇時(shí)，活體外/活體內(nèi)所選集合在心臟脈管系統(tǒng)中比非重組對(duì)照噬菌體多積累約190倍。(D)將來(lái)自最終集合的編碼肽的插入物亞克隆入誘餌載體中，且用肽-誘餌載體和靶載體中的心臟cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化細(xì)菌。選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌以在500μg/ml羧芐青霉素上生長(zhǎng)。(E)一些克隆對(duì)二級(jí)標(biāo)記物L(fēng)acZ也呈陽(yáng)性，這是由在含X-gal的平板上產(chǎn)生藍(lán)色而證實(shí)。
圖2繪示選擇性錨定到心臟的個(gè)別噬菌體展示的肽。將從心臟內(nèi)皮錨定的結(jié)合篩檢所鑒別的指定肽在T7噬菌體中重新構(gòu)建并通過(guò)靜脈內(nèi)注入小鼠來(lái)個(gè)別投與。除SEQ IDNO10外，展示心臟錨定肽的噬菌體相對(duì)于非重組噬菌體顯著錨定到心臟；此外，在所測(cè)試的主要器官中對(duì)心臟的錨定具特異性。對(duì)展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體記錄到最高的特異性(超過(guò)300倍)。(A)CRPPR(SEQ ID NO1)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。(B)CARPAR(SEQ ID NO5)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。(C)CKRAVR(SEQ ID NO7)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。(D)CLIDLHVMC(SEQ ID NO10)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。(E)CRSTRANPC(SEQ ID NO11)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。(F)CPKTRRVPC(SEQ IDNO12)噬菌體錨定到心臟、腎、大腦、肌肉和肺。
圖3繪示展示心臟錨定肽的噬菌體與血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物在心臟中協(xié)同定位。將噬菌體與熒光素結(jié)合番茄凝集素(fluorescein-conjugated tomato lectin)(綠色)一起靜脈內(nèi)注入小鼠，且用兔抗T7抗體和抗兔Alexa594(紅色)對(duì)心臟組織切片染色。(A)CRPPR(SEQ ID NO1)噬菌體染色。(B)CARPAR(SEQ ID NO5)噬菌體染色。(C)CKRAVR(SEQ ID NO7)噬菌體染色。(D)CLIDLHVMC(SEQ ID NO10)噬菌體染色。(E)CRSTRANPC(SEQ ID NO11)噬菌體染色。(F)CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)噬菌體染色。箭頭表示一些代表性雙陽(yáng)性血管(黃色)。放大率200倍。
圖4繪示展示心臟錨定肽的噬菌體特異性結(jié)合到經(jīng)同源受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在雙雜交檢定(表1)中鑒定的心臟錨定肽的假定受體在293T細(xì)胞中由經(jīng)轉(zhuǎn)染cDNA表達(dá)，使用經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞測(cè)試在緩沖液中或在代表對(duì)應(yīng)肽中每一者的合成肽(100mg/ml)存在下展示相關(guān)心臟錨定肽的同源噬菌體的結(jié)合。各噬菌體與表達(dá)其假定同源受體的細(xì)胞的結(jié)合(汽提柱)比與經(jīng)空白載體對(duì)照物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合(灰柱)多300至500倍。在所有情況下，通過(guò)與過(guò)量同源肽(黑柱)競(jìng)爭(zhēng)但不與無(wú)關(guān)心臟錨定肽(白柱)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制噬菌體與經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。用游離肽CRPPR(SEQ ID NO1)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)和CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)檢定四種經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的每一者。(A)表達(dá)同源肽CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體與經(jīng)CRIP2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合。(B)表達(dá)同源肽CKRAVR(SEQ ID NO7)的噬菌體與經(jīng)Sigirr轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合。(C)表達(dá)同源肽CRSTRANPC(SEQ ID NO11)的噬菌體與經(jīng)MpcII-3相關(guān)蛋白SEQ ID NO33轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合。(D)表達(dá)同源肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)的噬菌體與經(jīng)bc10轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合。
圖5繪示心臟錨定肽的受體在心臟中于mRNA水平上高度表達(dá)且定位于內(nèi)皮細(xì)胞。(A)四種受體mRNA于不同小鼠心臟、肺、脾、腎、大腦和肌肉中的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果，其是表達(dá)為心臟中相同mRNA含量的百分比(兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值)。(B)在分析結(jié)束時(shí)回收實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。ST＝100bp梯狀DNA。(C)通過(guò)原位雜交(紅色)定位受體。HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10在心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞中都高度表達(dá)。HLP/CRIP2、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10mRNA也在心臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)。肺毛細(xì)管另外對(duì)Sigirr/TIR8和MpcII-3相關(guān)蛋白明顯呈陽(yáng)性，同時(shí)觀察到HLP/CRIP2和belO的一些信號(hào)。偶爾在其它組織中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性染色的痕跡。放大率200倍。
圖6繪示CRPPR(SEQ ID NO1)肽和同源受體CRIP2與CD31在心血管的內(nèi)皮細(xì)胞中協(xié)同定位。將熒光素結(jié)合CRPPR(SEQ ID NO1)肽靜脈內(nèi)注入小鼠，并在兩小時(shí)后收集組織以用抗內(nèi)皮標(biāo)記物CD31的抗體染色。熒光肽以綠色顯示，而CD31標(biāo)記物以紅色顯示。(A)SEQ ID NO1與CD31于心血管中的協(xié)同定位。(B)SEQ ID NO1與CD31于心內(nèi)膜中的協(xié)同定位。(C)在心臟中未觀察到對(duì)照肽。(D)抗CRIP2抗體染色與CD31協(xié)同定位的心臟內(nèi)皮細(xì)胞(紅色)。(E)抗CRIP2抗體與所注射的CRPPR(SEQID NO1)肽在心血管中協(xié)同定位。(F)抗CRIP2抗體與所注射的CRPPR(SEQ ID NO1)肽在心內(nèi)膜中協(xié)同定位。
圖7繪示展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體結(jié)合到心臟細(xì)胞且展示SEQ ID NO1的噬菌體的錨定被抗CRIP2抗體阻斷。將展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體與從心臟制備的細(xì)胞懸浮液一起培育，在有和無(wú)各種濃度的指定抗體或肽的存在下測(cè)量噬菌體結(jié)合。(A)雞抗CRIP2抗體阻斷展示SEQ ID NO1的噬菌體與心臟細(xì)胞的結(jié)合，使用正常IgY作為陰性對(duì)照。(B)游離CRPPR(SEQ ID NO1)肽對(duì)展示SEQ ID NO1的噬菌體結(jié)合的劑量依賴(lài)抑制和兩種無(wú)關(guān)心臟錨定肽不進(jìn)行抑制可證實(shí)活體外噬菌體結(jié)合系統(tǒng)的特異性。(C)展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體與心臟的活體內(nèi)錨定受協(xié)同注射的抗CRIP2抗體抑制。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖8繪示鼠科富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2)的(A)核苷酸(SEQ ID NO24)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO25)序列。Genbank登記號(hào)NM_024223。
圖9繪示被鑒定為受體克隆9的鼠科RIKEN EST的(A)核苷酸(SEQ ID NO26)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO27)序列。Genbank登記號(hào)BC026536。
圖10繪示鼠科單一Ig IL-2受體相關(guān)蛋白(Sigirr/TIR8)的(A)核苷酸(SEQ ID NO28)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO29)序列。Genbank登記號(hào)BC010806。
圖11繪示鼠科嗅覺(jué)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO30)，所述嗅覺(jué)cDNA為經(jīng)鑒別為受體克隆27的含有富谷氨酰胺區(qū)域的蛋白。Genbank登記號(hào)AK032239。
圖12繪示與內(nèi)在膜蛋白CII-3(MpcII-3)具有假定類(lèi)似性的鼠科多肽的(A)核苷酸(SEQ ID NO32)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO33)序列。Genbank登記號(hào)AK032458。
圖13繪示鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10)的(A)核苷酸(SEQ ID NO34)序列和(B)氨基酸(SEQ ID NO35)序列。Genbank登記號(hào)BC026935。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及鑒定高選擇性地錨定到心臟脈管系統(tǒng)且可以結(jié)合物形式用于將全身性投與的治療劑或顯影劑選擇性靶向心臟脈管系統(tǒng)的分子。所述治療劑的選擇性靶向會(huì)增加傳遞到心臟脈管系統(tǒng)的藥劑的有效量，同時(shí)降低藥劑對(duì)其它器官具有不利作用的可能性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定用于本發(fā)明的錨定分子的同源受體。如下文進(jìn)一步公開(kāi)，這些受體在心臟內(nèi)皮上表達(dá)且可用于針對(duì)優(yōu)化選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的肽或其它分子的特征而篩檢。
如本文實(shí)例I中所公開(kāi)，使用活體外和活體內(nèi)噬菌體選擇與細(xì)菌雙雜交分析的新穎組合來(lái)鑒定選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的肽且鑒定用作這些肽的受體的內(nèi)皮分子。在用鼠科心臟細(xì)胞懸浮液和抗CD31磁珠進(jìn)行活體外噬菌體選擇后，針對(duì)與心臟的錨定進(jìn)行活體內(nèi)選擇，從而導(dǎo)致錨定到心臟的噬菌體集合相對(duì)于非重組噬菌體增加近200倍(圖1A和1B)。此外，如圖1C所示，經(jīng)活體外/活體內(nèi)選擇的噬菌體與其它組織相比優(yōu)先定位到心臟上，在心臟中的富集比在大腦、腎、皮膚和骨骼肌中的積累要大20到50倍。
在由細(xì)菌雙雜交分析用心臟錨定噬菌體集合鑒定的25個(gè)假定受體克隆中，大部分為在心肌中大量表達(dá)的蛋白。如表1所總結(jié)，剩余的6個(gè)克隆代表膜或細(xì)胞表面蛋白且為錨定肽的假定受體。被表示為受體克隆5的第一個(gè)克隆代表心臟LIM-蛋白(HLP)(也稱(chēng)作富半胱氨酸蛋白2(CRIP2))的羧基端92個(gè)氨基酸(殘基117至208)。全長(zhǎng)鼠科HLP/CRIP2核酸和氨基酸序列在本文中分別作為SEQ ID NO24和25(參看Genbank登記號(hào)NM_024223)提供。雙雜交分析產(chǎn)生若干結(jié)合這一受體的潛在心臟錨定肽。當(dāng)個(gè)別檢定時(shí)，展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體相對(duì)于非重組噬菌體以高出300倍的選擇性錨定到心臟(圖2A)，且CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)噬菌體相對(duì)于非重組噬菌體在心臟錨定中展示約50倍的選擇性。這些結(jié)果表示肽SEQ ID NO1和SEQ ID NO2為心臟錨定肽且進(jìn)一步表明HLP/CRIP2是用作錨定這些肽的受體。
如本文進(jìn)一步公開(kāi)，未注釋的RIKEN EST(受體克隆9)也被鑒定為與一種或一種以上心臟錨定肽結(jié)合的在膜或細(xì)胞表面上表達(dá)的肽。由受體克隆9代表的RIKEN EST的全長(zhǎng)鼠科核酸和氨基酸序列在本文中分別作為SEQ ID NO26和27(參看Genbank登記號(hào)BC026536)提供。在經(jīng)由雙雜交分析鑒定的三種不同肽中，兩種肽CARPAR(SEQ IDNO5)和CPKRPR(SEQ ID NO6)在于噬菌體上展示時(shí)呈現(xiàn)與心臟的選擇性錨定(圖2B)。
本文所公開(kāi)的結(jié)果進(jìn)一步鑒定作為心臟錨定肽的受體的單一Ig IL-1受體相關(guān)蛋白，其被稱(chēng)為Sigirr或TIR8(受體克隆15)。全長(zhǎng)鼠科Sigirr/TIR8核酸和氨基酸序列在本文中分別作為SEQ ID NO28和29(參看Genbank登記號(hào)BC010806)提供。如表1所總結(jié)，經(jīng)由雙雜交分析通過(guò)結(jié)合Sigirr/TIR8而鑒定的三種肽CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)和RGSSS(SEQ ID NO9)當(dāng)在噬菌體上展示且活體內(nèi)檢定時(shí)顯示20至30倍的心臟錨定選擇性(參看表1和圖2C)。
也如本文所公開(kāi)的心臟錨定受體為受體克隆36，其代表來(lái)自與內(nèi)在膜蛋白CII-3(MpcII-3)具有假定類(lèi)似性的RIKEN Fantom系列的未命名的蛋白產(chǎn)物，MpcII-3為作為琥珀酸脫氫酶復(fù)合體的一部分的線粒體膜蛋白。這種MpcII-3相關(guān)蛋白的核酸和氨基酸序列在本文中分別作為SEQ ID NO32和33(參看Genbank登記號(hào)26328274)提供。經(jīng)由雙雜交分析，鑒定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO11)與這種受體結(jié)合，展示SEQ IDNO11的噬菌體在活體內(nèi)個(gè)別檢定時(shí)以約20倍的選擇性錨定到心臟(表1和圖2E)。本文所公開(kāi)的其它結(jié)果表示鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物10(bc10)(其為在由膀胱中的前惡性病變發(fā)展癌癥時(shí)受到下調(diào)的小膜蛋白)可用作心臟錨定受體。所鑒定的受體克隆46代表bc10的小鼠同系物的一部分。全長(zhǎng)鼠科bc10核酸和氨基酸序列在本文中分別作為SEQID NO34和35(參看Genbank登記號(hào)20072483)提供。如表1和圖2F所示，表達(dá)結(jié)合克隆46的兩種肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)和CSGMARTKC(SEQ ID NO13)的噬菌體分別在心臟錨定中展現(xiàn)約60和10倍的選擇性。
如本文中另外公開(kāi)，分析若干心臟錨定肽在活體內(nèi)結(jié)合心臟內(nèi)皮的能力和其與其假定受體的特異性結(jié)合。將展示心臟錨定肽SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的噬菌體與熒光素結(jié)合番茄凝集素(一種血管標(biāo)記物)個(gè)別地注入小鼠，且用抗T7抗體觀察噬菌體的定位。如圖3A至C、E和F所示，展示SEQ ID NO1、5、7、11或12的噬菌體存在于心臟內(nèi)皮中且不存在于其它組織中，而展示肽SEQ ID NO10的陰性對(duì)照噬菌體不存在于心臟和其它組織中。這些結(jié)果證實(shí)展示肽CRPPR(SEQ ID NO1)、CARPAR(SEQ ID NO5)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)的噬菌體在活體內(nèi)定位到心臟脈管系統(tǒng)。另外，實(shí)時(shí)(RT)PCR和原位雜交分析顯示心臟錨定肽的四種同源受體HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10在心臟內(nèi)皮中表達(dá)。與所檢定的其它組織相比，這些受體也優(yōu)先在心臟中表達(dá)(參看圖5)。雖然心臟內(nèi)皮受體HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10不是僅在心臟中表達(dá)，但是其在心臟中的優(yōu)先表達(dá)產(chǎn)生在心臟中以約20至300倍的選擇性聚集測(cè)試噬菌體的錨定肽。與先前用其它分子觀察到的心臟錨定相比，所述在心臟錨定中20至300倍的選擇性顯著增加。
如本文進(jìn)一步公開(kāi)，檢定展示同源肽的噬菌體與經(jīng)全長(zhǎng)同源受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合的能力。如圖4所示，表達(dá)心臟錨定肽的噬菌體比對(duì)照噬菌體高出300至500倍地與經(jīng)對(duì)應(yīng)同源受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合，且噬菌體結(jié)合在100μg/ml同源肽存在下受到抑制但不受無(wú)關(guān)錨定肽抑制。這些結(jié)果證實(shí)心臟錨定肽CRPPR(SEQ ID NO1)特異性結(jié)合受體HLP/CRIP2；心臟錨定肽CKRAVR(SEQ ID NO7)特異性結(jié)合受體Sigirr/TIR8；心臟錨定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO11)特異性結(jié)合MpcII-3相關(guān)蛋白受體；且心臟錨定肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)特異性結(jié)合受體bc10。
本文所公開(kāi)的其它結(jié)果證實(shí)肽CRPPR(SEQ ID NO1)與同源受體HLP/CRIP2的協(xié)同定位。如本文圖6所示，來(lái)自經(jīng)靜脈內(nèi)注射的CRPPR(SEQ ID NO1)肽的熒光與血管標(biāo)記物CD31在心血管和心內(nèi)膜中大范圍協(xié)同定位，而在心臟中未檢測(cè)到經(jīng)熒光素標(biāo)記的對(duì)照肽?？笻LP/CRIP2抗體染色也與血管標(biāo)記物(圖6D)和肽CRPPR(SEQ ID NO1；圖6E和6F)在心血管和心臟心內(nèi)膜中協(xié)同定位。使用游離CRPPR(SEQ ID NO1)肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)檢定以證明CRPPR(SEQ ID NO1)-噬菌體與具有HLP/CRIP2的心血管的結(jié)合的特異性，所述游離CRPPR(SEQ ID NO1)肽以劑量依賴(lài)方式阻斷展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體與心臟來(lái)源的細(xì)胞懸浮液的結(jié)合。另外，抗HLP/CRIP2抗體在與噬菌體共同注射時(shí)會(huì)抑制CRPPR(SEQ ID NO1)噬菌體錨定(圖7C)。這些結(jié)果證明肽CRPPR(SEQ ID NO1)經(jīng)由特異性結(jié)合到HLP/CRIP2上而選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)。
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO25)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。在所述結(jié)合物中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其例如可為肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。所述錨定肽或肽模擬物視情況可在構(gòu)形上受限。
多種治療劑適用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述結(jié)合物并有選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子。適用的治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子連接的血管生成劑的結(jié)合物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ IDNO25)的錨定分子連接的抗血栓形成劑的結(jié)合物。
本發(fā)明另外提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQID NO27)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。多種治療劑中任一種都適用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述結(jié)合物并有選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQID NO27)的錨定分子。適用的治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的錨定分子連接的血管生成劑的結(jié)合物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的錨定分子連接的抗血栓形成劑的結(jié)合物。
本文進(jìn)一步提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合單一Ig IL-2受體相關(guān)蛋白(Sigirr/TIR8；SEQ ID NO29)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。作為非限制性實(shí)例，適用于所述結(jié)合物中的錨定分子可以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。作為另一非限制性實(shí)例，特異性結(jié)合Sigirr/TIR8的錨定分子可為錨定肽或肽模擬物。
多種特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定肽和肽模擬物適用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述結(jié)合物包括(但不限于)含有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。適用于本發(fā)明的錨定肽和肽模擬物進(jìn)一步包括(但不限于)含有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)或其保守變異體或肽模擬物的肽和肽模擬物，所述肽和肽模擬物可能在構(gòu)形上受限或可能不在構(gòu)形上受限。其它適用于本發(fā)明的錨定肽和肽模擬物包括(但不限于)那些含有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。
多種治療劑中的任一種都適用于含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。適用于本發(fā)明的治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的血管生成劑的結(jié)合物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的抗血栓形成劑的結(jié)合物。
本文還提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括為錨定肽或肽模擬物的錨定分子。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物包括含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。所述錨定分子可視情況在構(gòu)形上受限。應(yīng)了解多種治療劑中的任一種都可用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。作為一實(shí)例，本發(fā)明的結(jié)合物可含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的血管生成劑。作為另一實(shí)例，本發(fā)明的結(jié)合物可含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的抗血栓生成劑。
本文還提供含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物。在所述結(jié)合物中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。錨定分子可為(但不限于)肽或肽模擬物。多種特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子中的任一種都可用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述結(jié)合物包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的適用錨定分子進(jìn)一步包括(但不限于)含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。適用的錨定分子進(jìn)一步包括(但不限于)包括氨基酸序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物的構(gòu)形受限形式。
熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者了解多種治療劑中的任一種都可用于本發(fā)明的結(jié)合物中，所述治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子連接的血管生成劑。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子連接的抗血栓生成劑。
在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物的肽或肽模擬物部分具有限定長(zhǎng)度。結(jié)合物的肽或肽模擬物部分可具有(但不限于)至多10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000或2000個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在其它實(shí)施例中，結(jié)合物的肽或肽模擬物成分可具有至少5、10、20、30、50、100、150、200、250或300個(gè)殘基的長(zhǎng)度。應(yīng)了解，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合物的肽或肽模擬物部分”意謂錨定肽或肽模擬物和任何連續(xù)蛋白、肽或肽模擬物(例如治療蛋白或促細(xì)胞凋亡肽)中的殘基總數(shù)。
如本文所公開(kāi)，肽SEQ ID NO1和2識(shí)別在心臟內(nèi)皮上表達(dá)且在其它組織中不會(huì)表達(dá)到相同程度的靶“受體”。所述靶受體(本文鑒別為HLP/CRIP2)的內(nèi)皮和組織選擇性表達(dá)會(huì)形成肽SEQ ID NO1和2和相關(guān)肽和肽模擬物以及其它具有類(lèi)似結(jié)合特異性的分子的選擇性錨定活性的基礎(chǔ)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，顯然在結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO1和2無(wú)關(guān)但具有特異性HLP/CRIP2結(jié)合活性的分子也將共有選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的特征。舉例而言，可鑒定所述分子與SEQ ID NO1或2特異性結(jié)合或與SEQ ID NO1或2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到HLP/CRIP2表達(dá)細(xì)胞(諸如經(jīng)本文所公開(kāi)的HLP/CRIP2轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)的能力。舉例而言，如本文實(shí)例II中所述，可容易地證實(shí)與心臟脈管系統(tǒng)的選擇性錨定。
因此，本發(fā)明提供選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO25)的錨定分子。在一實(shí)施例中，特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQID NO25)的錨定分子為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的分子。在另一實(shí)施例中，特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子為肽或肽模擬物。除本文所公開(kāi)的HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)結(jié)合分子CRPPR(SEQ ID NO1)和CGRKSKTVC(SEQID NO2)外，下文也提供用于鑒定其它在結(jié)構(gòu)上相關(guān)或無(wú)關(guān)的錨定分子的篩檢方法。
本文也已鑒定選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子的其它靶受體。受體克隆9(SEQ IDNO27)已被鑒定為特異性結(jié)合心臟錨定肽SEQ ID NO5和6的受體，且其形成這些肽和其它具有類(lèi)似結(jié)合活性的肽、肽模擬物和其它分子選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的能力的基礎(chǔ)。根據(jù)上文，顯然在結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO5或6無(wú)關(guān)但具有特異性受體克隆9(SEQID NO27)結(jié)合活性的分子也共有選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的特征?？设b定所述錨定分子與SEQ ID NO5或6特異性結(jié)合或與SEQ ID NO5或6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到受體克隆9(SEQID NO27)的能力?？墒褂媒?jīng)純化SEQ ID NO27或(例如)經(jīng)編碼SEQ ID NO27的核酸分子(SEQ ID NO26)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢定特異性結(jié)合。
根據(jù)上文，本發(fā)明提供選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ IDNO27)的錨定分子。在一實(shí)施例中，特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的錨定分子為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的分子。在另一實(shí)施例中，特異性結(jié)合受體克隆9(SEQID NO27)的錨定分子為肽或肽模擬物。本文公開(kāi)特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的示范性肽和肽模擬物，且下文提供適用于鑒定選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的其它錨定分子的篩檢方法。
如本文進(jìn)一步公開(kāi)，Sigirr/TIR8(一種特異性結(jié)合SEQ ID NO7、8和9的多肽)的內(nèi)皮和心臟選擇性表達(dá)形成這些肽和其它具有類(lèi)似結(jié)合活性的肽、肽模擬物和其它分子選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的能力的基礎(chǔ)。根據(jù)上文，顯然在結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO7、8或9無(wú)關(guān)但具有特異性Sigirr/TIR8結(jié)合活性的分子也共有選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的特征。可鑒定所述錨定分子與SEQ ID NO7、8或9特異性結(jié)合或與SEQ ID NO7、8或9競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到Sigirr/TIR8的能力。可使用經(jīng)純化Sigirr/TIR8或(例如)細(xì)胞(諸如在以下實(shí)例中所公開(kāi)的經(jīng)Sigirr/TIR8轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)檢定特異性結(jié)合。
基于鑒定作為心臟錨定受體的Sigirr/TIR8，本發(fā)明提供選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子。在一實(shí)施例中，特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的分子。在另一實(shí)施例中，特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子為肽或肽模擬物。本文公開(kāi)特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的示范性肽和肽模擬物。此外，下文提供適用于常規(guī)鑒定選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的其它錨定分子的篩檢方法。
肽CRSTRANPC(SEQ ID NO11)識(shí)別在心臟內(nèi)皮上選擇性表達(dá)的另一靶“受體”。歸因于MpcII-3相關(guān)蛋白SEQ ID NO33的內(nèi)皮和組織選擇性表達(dá)，肽SEQ ID NO11以及具有類(lèi)似結(jié)合特異性的相關(guān)肽、肽模擬物和其它分子可選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)。所述錨定分子包括那些在結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO11無(wú)關(guān)但也與MpcII-3相關(guān)蛋白SEQ IDNO33特異性結(jié)合的錨定分子。鑒于上文，顯然選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的其它分子可根據(jù)其與SEQ ID NO11特異性結(jié)合或與SEQ ID NO11競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到MpcII-3相關(guān)蛋白(包括經(jīng)純化的MpcII-3相關(guān)蛋白或在細(xì)胞表面表達(dá)MpcII-3相關(guān)蛋白的細(xì)胞)的能力加以鑒定。
根據(jù)MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)為心臟錨定受體的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子。在一實(shí)施例中，特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的分子。在另一實(shí)施例中，特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子為肽或肽模擬物。本文公開(kāi)特異性結(jié)合SEQ IDNO33的示范性肽和肽模擬物，和適用于鑒定選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的其它錨定分子的篩檢方法。
本文經(jīng)由SEQ ID NO12和13的特異性結(jié)合活性進(jìn)一步鑒定另一靶受體bc10。所述受體的內(nèi)皮和心臟選擇性表達(dá)形成肽SEQ ID NO12和13以及相關(guān)肽、肽模擬物和其它具有類(lèi)似結(jié)合特異性的分子的選擇性錨定活性的基礎(chǔ)。基于本文所公開(kāi)的發(fā)現(xiàn)，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者了解在結(jié)構(gòu)上與SEQ ID NO12和13無(wú)關(guān)的分子在其共有特異性結(jié)合bc10的特征時(shí)也可選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)。因此，其它錨定分子(例如)可根據(jù)其與SEQ IDNO12或13特異性結(jié)合或與SEQ ID NO12或13競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到靶受體bc10的能力加以鑒定，所述靶受體bc10例如可以經(jīng)純化bc10或表達(dá)bc10的細(xì)胞(諸如經(jīng)bc10轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)的形式提供。舉例而言，如本文實(shí)例II中所述，可容易地證實(shí)與心臟脈管系統(tǒng)的選擇性錨定。
基于bc10為肽SEQ ID NO12和13的同源受體的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)且為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的分子的錨定分子。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)且為肽或肽模擬物的錨定分子。肽SEQ ID NO12和13和其保守變異體在本文中是作為特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的分子而公開(kāi)的。另外，下文進(jìn)一步公開(kāi)的篩檢方法適用于鑒定其它錨定分子，其包括(但不限于)錨定肽和肽模擬物。
為方便起見(jiàn)，本文鑒定的5個(gè)靶受體HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10被統(tǒng)稱(chēng)為“心臟錨定受體”。
如上所述，本發(fā)明提供多種選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分子”廣泛用于意謂聚合或非聚合有機(jī)化學(xué)物，諸如小分子藥物；核酸分子，諸如RNA、cDNA或寡核苷酸；肽或肽模擬物；或蛋白，諸如抗體或生長(zhǎng)因子受體或其片段，諸如抗體的含抗原結(jié)合域的Fv、Fd或Fab片段。在一實(shí)施例中，分子為除抗體或其抗原結(jié)合片段外的有機(jī)化學(xué)物。在另一實(shí)施例中，分子為肽或肽模擬物。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“錨定分子”(homing molecule)意謂在活體內(nèi)優(yōu)先于大部分其它組織和脈管系統(tǒng)而選擇性定位到心臟脈管系統(tǒng)的任何分子。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“錨定肽”或“錨定肽模擬物”意謂在活體內(nèi)優(yōu)先于大部分其它組織和脈管系統(tǒng)而選擇性定位到心臟脈管系統(tǒng)的肽或肽模擬物。
如本文關(guān)于分子所用的術(shù)語(yǔ)“選擇性錨定”意謂在活體內(nèi)與大部分其它組織或脈管系統(tǒng)相比優(yōu)先定位到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子。選擇性錨定的特征一般為與諸如大腦、肺、腎和肌肉的其它組織相比，心臟脈管系統(tǒng)中的定位至少高出兩倍。錨定分子的特征可為與許多或大部分非腫瘤組織相比，與心臟脈管系統(tǒng)的優(yōu)先定位是5倍、10倍、20倍或更多倍。應(yīng)了解錨定分子除選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)外，還可部分地錨定到心臟外部的脈管系統(tǒng)或組織或錨定到心臟外部的小細(xì)胞群體。
如上所述，本發(fā)明的錨定分子特異性結(jié)合本發(fā)明的心臟錨定受體中的一種。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”意謂經(jīng)測(cè)量不同于非特異性相互作用的結(jié)合。舉例而言，可通過(guò)測(cè)定與對(duì)照分子結(jié)合相比的分子結(jié)合來(lái)測(cè)量特異性結(jié)合，所述對(duì)照分子一般為不具有結(jié)合活性的具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的分子。如果錨定分子經(jīng)測(cè)量對(duì)于經(jīng)同源心臟錨定受體(HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有比對(duì)于不表達(dá)同源受體的細(xì)胞更高的親和力，那么也可表示特異性結(jié)合。舉例而言，經(jīng)測(cè)量更高的親和力可為與對(duì)照細(xì)胞相比對(duì)于經(jīng)同源受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的親和力增加至少100倍、200倍、300倍、500倍或更多倍。舉例而言，也可通過(guò)用已知受體結(jié)合分子進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)抑制來(lái)證實(shí)結(jié)合特異性。
此外，如本文所用的術(shù)語(yǔ)特異性結(jié)合涵蓋低和高親和力特異性結(jié)合。舉例而言，特異性結(jié)合可由具有至少約10-4M的Kd的低親和力錨定分子呈現(xiàn)。舉例而言，如果心臟錨定受體具有一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，那么具有低親和力的錨定分子可用于靶向心臟脈管系統(tǒng)。特異性結(jié)合也可由高親和力錨定分子(例如具有至少約10-5M的Kd的錨定分子)呈現(xiàn)。舉例而言，所述分子可具有至少約10-6M、至少約10-7M、至少約10-8M、至少約10-9M、至少約10-10M的Kd，或者可具有至少約10-11M或10-12M或更大的Kd。低和高親和力錨定分子都適用且為本發(fā)明所涵蓋。低親和力錨定分子可用于靶向(但不限于)包括病毒和其它粒子的多價(jià)結(jié)合物。高親和力錨定分子可用于靶向(但不限于)多價(jià)和單價(jià)結(jié)合物。
本文還提供并有至少兩個(gè)各自選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的多價(jià)結(jié)合物。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合物包括至少10個(gè)或至少100個(gè)所述錨定分子。多種治療劑適用于本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合物，其包括(但不限于)噬菌體和下文進(jìn)一步描述的其它治療劑。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供多價(jià)結(jié)合物，其含有至少兩個(gè)各自選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQ ID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ IDNO35)的錨定肽或肽模擬物。在另一實(shí)施例中，所述結(jié)合物含有至少10個(gè)各自選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQ ID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ IDNO35)的錨定肽或肽模擬物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合物含有至少100個(gè)各自選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ ID NO35)的錨定肽或肽模擬物。
在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合物包括2個(gè)或2個(gè)以上、3個(gè)或3個(gè)以上、5個(gè)或5個(gè)以上、10個(gè)或10個(gè)以上、20個(gè)或20個(gè)以上、30個(gè)或30個(gè)以上、40個(gè)或40個(gè)以上、50個(gè)或50個(gè)以上、100個(gè)或100個(gè)以上、200個(gè)或200個(gè)以上、300個(gè)或300個(gè)以上、400個(gè)或400個(gè)以上、500個(gè)或500個(gè)以上或100個(gè)或100個(gè)以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQ ID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子。在一實(shí)施例中，錨定分子特異性結(jié)合同一心臟錨定受體。在另一實(shí)施例中，錨定分子具有相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施例中，多價(jià)結(jié)合物包括具有不相同氨基酸序列的錨定分子。適用于并有多個(gè)錨定分子的本發(fā)明多價(jià)結(jié)合物中的部分包括(但不限于)噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和其它病毒、細(xì)胞、脂質(zhì)體、聚合基質(zhì)、非聚合基質(zhì)或粒子(諸如金粒子)、微型裝置、毫微裝置(nanodevice)和毫微級(jí)半導(dǎo)體材料。
舉例而言，本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合物可含有與至少兩個(gè)各自選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQ ID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子連接的脂質(zhì)體或其它聚合基質(zhì)。必要時(shí)，脂質(zhì)體或其它聚合基質(zhì)可與所述錨定分子中的至少10個(gè)或至少100個(gè)連接。舉例而言，適用于所述多價(jià)結(jié)合物中的錨定分子可獨(dú)立地包括氨基酸序列SEQ ID NO1、2、7、8、9、11、12或13或所述序列的保守變異體或肽模擬物。例如，由磷脂或其它脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體無(wú)毒、可為生理學(xué)上所接受并且是相對(duì)易于制造和投藥的可代謝載體(Gregoriadis，Liposome Technology.第1卷(CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)L(1984))。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在本發(fā)明的多價(jià)結(jié)合物中，脂質(zhì)體或其它聚合基質(zhì)在必要時(shí)另外可包括另一組份，諸如(但不限于)治療劑、抗血管生成劑、消炎劑或免疫抑制劑。
本發(fā)明提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。適用于本發(fā)明方法的抗體包括(但不限于)單克隆抗體和具有生物活性的抗體。當(dāng)使用本發(fā)明方法將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)時(shí)，成分可為(但不限于)可檢測(cè)成分或治療劑，諸如(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑或病毒載體。下文進(jìn)一步描述成分和心血管疾病。
本發(fā)明也提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明另外提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其中對(duì)個(gè)體投與結(jié)合物，所述結(jié)合物含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。在本發(fā)明的所述方法中，抗體可為(但不限于)單克隆抗體或具有生物活性的抗體。當(dāng)使用本發(fā)明方法將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)時(shí)，成分可為(但不限于)可檢測(cè)成分或治療劑，諸如(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑或病毒載體。
本發(fā)明也提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另外，本文還提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。在本發(fā)明方法中，抗體可為(但不限于)單克隆抗體或具有生物活性的抗體。如上所述，當(dāng)使用本發(fā)明方法將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)時(shí)，成分可為(但不限于)可檢測(cè)成分或治療劑，諸如(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑或病毒載體。
本文進(jìn)一步提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明也提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。適用于本發(fā)明方法的抗體包括(但不限于)單克隆抗體以及具有生物活性的抗體。在用于將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法中，成分可為(但不限于)可檢測(cè)成分或治療劑，諸如(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑或病毒載體。
本發(fā)明另外提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明也提供將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。舉例而言，可用單克隆抗體或具有生物活性的抗體實(shí)施本發(fā)明方法。在用于將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法中，可使多種成分中的任一種與特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的抗體連接。所述成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分和治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”是以其最廣泛的意義使用以包括多克隆和單克隆抗體，以及保留至少1×105M-1的對(duì)心臟錨定受體的結(jié)合活性的抗體多肽片段。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體(包括(但不限于)Fab、F(ab′)2和Fv片段)可保留對(duì)心臟錨定受體的結(jié)合活性且因此包括于抗體定義中。另外，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋特異性結(jié)合心臟錨定受體的非天然存在的通常至少含有一個(gè)VH和一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域的抗體和片段，諸如嵌合抗體、人源化抗體和單鏈Fv片段(scFv)。所述非天然存在的抗體可使用固相肽合成來(lái)構(gòu)建、可重組產(chǎn)生或可(例如)通過(guò)使用(例如)下文所述的檢定篩檢噬菌體展示的文庫(kù)或其它組合文庫(kù)來(lái)獲得，諸如那些由Borrebaeck(編輯)，Antibody Engineering(第2版)New YorkOxford University Press(1995)所述的可變重鏈和輕鏈組成的組合文庫(kù)。
舉例而言，也可使用HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10融合蛋白或編碼一部分HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10的合成肽作為免疫原來(lái)制備選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可(例如)使用本文中作為SEQ ID NO24、26、28、32和34所公開(kāi)的核酸序列以重組方式產(chǎn)生的經(jīng)純化的人類(lèi)、鼠科或其它HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10以及HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10的片段和肽部分可用作提高選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗HLP/CRIP2、抗Sigirr/TIR8、抗MpcII-3相關(guān)蛋白或抗bc10抗體的免疫原。應(yīng)了解適用于作為免疫原的HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10的片段包括(但不限于)用于產(chǎn)生抗體的片段。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步了解，可通過(guò)使半抗原與諸如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)的載體分子偶合而使心臟錨定受體的非免疫原性片段或合成肽具有免疫原性。另外，舉例而言，如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)所述，多種其它載體分子和使半抗原與載體分子偶合的方法在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的。
基于鑒別選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子和其將經(jīng)連接的治療劑靶向心臟脈管系統(tǒng)的能力，本發(fā)明提供將成分靶向心臟脈管系統(tǒng)的方法和治療心血管疾病的方法。舉例而言，本發(fā)明提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。在本發(fā)明方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其例如可為錨定肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，將成分靶向心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法依賴(lài)含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明方法依賴(lài)含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。適用于本發(fā)明中的錨定肽或肽模擬物可視情況在構(gòu)形上受限。此外，多種成分中的任一種都可用于本發(fā)明方法中，所述成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分，諸如放射性核素和熒光分子。適用于本發(fā)明的成分進(jìn)一步涵蓋(但不限于)治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。適用于本發(fā)明中的錨定分子可以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其可為錨定肽或肽模擬物。應(yīng)了解特異性結(jié)合SEQ ID NO27的多種錨定分子中的任一種都可用于將成分靶向心臟脈管系統(tǒng)。所述錨定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ IDNO6)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。適用于本發(fā)明的成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分，諸如放射性核素和熒光分子；以及治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本文進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。作為非限制性實(shí)例，適用于本發(fā)明方法中的錨定分子可以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。作為另一非限制性實(shí)例，適用于本發(fā)明方法中的錨定分子可為錨定肽或肽模擬物。
多種特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子中的任一種都適用于本發(fā)明方法中，所述錨定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物；含有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQID NO8)或其保守變異體或肽模擬物的肽和肽模擬物；和含有氨基酸序列RGSSS(SEQID NO9)或其保守變異體或肽模擬物的肽和肽模擬物。所述錨定肽和肽模擬物可為(但不限于)線性、環(huán)狀或在構(gòu)形上受限。此外，多種成分中的任一種都可用于依賴(lài)特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子的本發(fā)明方法中。所述成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分，諸如放射性核素和熒光分子；和治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。作為非限制性實(shí)例，可用以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子或者用為肽或肽模擬物的錨定分子實(shí)施本發(fā)明方法。在一實(shí)施例中，用含有包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQID NO11)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物的結(jié)合物實(shí)施本發(fā)明方法。在所述方法中，含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)的錨定肽或肽模擬物可視情況在構(gòu)形上受限。多種成分中的任一種都可用于本發(fā)明方法中，所述成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分，諸如放射性核素和熒光分子；和治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本文進(jìn)一步提供在個(gè)體中將成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。適用于本發(fā)明中的錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其可為肽或肽模擬物。特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的多種錨定分子中的任一種都可用于本發(fā)明方法中。所述錨定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQID NO13)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。所述錨定肽和肽模擬物可用作線性、環(huán)狀或以其它方式在構(gòu)形上受限的結(jié)構(gòu)?？捎枚喾N成分中的任一種來(lái)實(shí)施依賴(lài)于并入有特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的錨定分子的結(jié)合物的本發(fā)明方法。適用成分包括(但不限于)可檢測(cè)成分，諸如放射性核素和熒光分子；以及治療劑，諸如血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本發(fā)明也提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有治療劑的結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述治療劑與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQID NO25)的錨定分子連接結(jié)合物。在本發(fā)明的所述方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其例如可為錨定肽或肽模擬物。特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的多種錨定分子中的任一種都可用于本發(fā)明方法中，所述錨定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物；和含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQID NO2)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。適用于本發(fā)明中的錨定肽或肽模擬物可視情況在構(gòu)形上受限。多種治療劑中的任一種都可用于根據(jù)本發(fā)明方法治療心血管疾病，所述治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本文進(jìn)一步提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。適用于治療心血管疾病的錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。特異性結(jié)合SEQ ID NO27的多種錨定分子中的任一種都可用于本發(fā)明方法中，所述錨定分子包括錨定肽或肽模擬物，諸如含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物；和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。多種治療劑中的任一種都可用于根據(jù)本發(fā)明方法治療心血管疾病。所述治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本文也提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本發(fā)明方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的多種錨定分子中的任一種都適用于本發(fā)明方法中，所述錨定分子包括(但不限于)錨定肽和肽模擬物。舉例而言，所述錨定肽或肽模擬物可為具有氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；具有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQID NO8)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；或具有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。舉例而言，適用于治療心血管疾病的本發(fā)明方法中的錨定肽和肽模擬物可為線性、環(huán)狀或在構(gòu)形上受限。多種治療劑中的任一種都可與本發(fā)明方法中特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接，所述治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。作為非限制性實(shí)例，可用以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子或者用為肽或肽模擬物的錨定分子實(shí)施所述方法。在特定實(shí)施例中，使用包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物實(shí)施用于治療心血管疾病的本發(fā)明方法。適用于本發(fā)明方法中的治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療個(gè)體的心血管疾病的方法，其是通過(guò)對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)的錨定分子連接的治療劑的結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。適用于本發(fā)明中的錨定分子包括(但不限于)可以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子，例如(但不限于)錨定肽和肽模擬物。特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的多種錨定分子中的任一種都可用于根據(jù)本發(fā)明方法治療心血管疾病。所述錨定分子包括(但不限于)含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。如上所述，所述錨定肽和肽模擬物視情況可在構(gòu)形上受限。適用于本發(fā)明方法中的治療劑包括(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
如下文進(jìn)一步論述，本發(fā)明的結(jié)合物和方法可用于治療多種心臟病和心血管疾病中的任一種。所述心臟病和心血管疾病包括(但不限于)冠狀動(dòng)脈病(CAD)；動(dòng)脈粥樣硬化；血栓形成；再狹窄；血管炎，其包括自體免疫性血管炎和病毒性血管炎，諸如多發(fā)性結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(Churg-Strass syndrome)、高安動(dòng)脈炎(Takayasu′s arteritis)、川崎病(Kawasaki Disease)和立克次體血管炎(Rickettsialvasculitis)；動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈瘤(atherosclerotic aneurism)；心肌肥大；先天性心臟病(CHD)；缺血性心臟病和絞痛；后天瓣膜疾病/心內(nèi)膜疾病；原發(fā)性心肌病，包括心肌炎；心律不齊；和移植排斥反應(yīng)。欲根據(jù)本發(fā)明方法治療的心臟病和心血管疾病進(jìn)一步包括(但不限于)代謝性心肌病(諸如充血性、肥大性和限制性心肌病)和心臟移植。與本發(fā)明的錨定分子連接的治療劑將集中在心血管中且可進(jìn)一步在心肌中積累。因此，本發(fā)明的結(jié)合物和方法適用于治療這些和其它心血管或心肌病癥。
使用刺激新血管形成(血管生成)的治療劑的以血管生成為基礎(chǔ)的療法可用于根據(jù)本發(fā)明方法治療心血管疾病。血管生成劑可用于治療(但不限于)缺血性心臟病，其包括慢性心肌缺血和急性心肌梗塞(Ware和Simons，Nature Med.3158-164(1997))。患有嚴(yán)重血管疾病的許多并非機(jī)械血管再造的候選者的患者可受益于以血管生成為基礎(chǔ)的療法，包括那些因血管阻塞而難以旁通的患者、不具有導(dǎo)管的患者和由于并發(fā)疾病而并非外科手術(shù)候選者的患者。已計(jì)算出在美國(guó)有314,000,000例病例，且歐盟可能會(huì)受益于以血管生成為基礎(chǔ)的療法(Miller和Abrams，Gen.Engin.News181(1998))。因此，選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子可與血管生成劑連接并傳遞給患者，從而刺激血管生成并緩解心血管疾病。
適用于本發(fā)明中的血管生成劑也可為天然存在的血管生成生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子，其通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)或遷移而誘導(dǎo)或促進(jìn)血管生成。適用于本發(fā)明中的血管生成劑涵蓋(但不限于)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的異型體(isoform)，諸如VEGF-A，包括VEGF121和VEGF165；和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子形式，包括(但不限于)FGF-1和FGF-2形式(Ruel和Sellke，Sem.Thor.Cardiovasc.Surg.15222-235(2003))。如下文進(jìn)一步論述，本發(fā)明的血管生成劑和其它治療劑可以蛋白治療劑形式或核酸治療劑形式經(jīng)由基因療法載體傳遞。
另外被稱(chēng)為血管滲透因子(VPF)的VEGF-A也可用于本發(fā)明(Dvorak等人，Am.J.Pathol.1461029-1039(1995)；Thomas等人，J.Bid.Chem.271603-606(1996)；Olofsson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA932576-2581(1996)；Joukov等人，EMBOJ.15290-298(1996)；和Harada等人，Am.J.Phvsiol.270H1791-H1802(1996))。其它VEGF(B、C和D)具有血管生成活性但不能實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮滲透。編碼VEGF的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移已顯示出會(huì)導(dǎo)致在支架植入之后血栓形成和內(nèi)膜增厚的顯著降低(J.Am.Coll.Cardiol.291371-1379(1997))。適用于本發(fā)明的血管生成劑包括(但不限于)VEGF的重組165kDa異型體，稱(chēng)為rhVEGF，其是由Genentech開(kāi)發(fā)的；編碼VEGF的121氨基酸異型體的核酸分子(BioByPassTM；GenVec/Parke Davis)；和編碼VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D的核酸。例如參看Miller和Abrams，上文，1998。
適用于本發(fā)明的血管生成劑也可為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的成員，諸如FGF-1(酸性)、FGF-2(堿性)、FGF-4或FGF-5(Slavin等人，Cell Biol.Int.19431-444(1995)；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.26710931-10934(1992))。舉例而言，欲與本發(fā)明的結(jié)合物或方法中選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子連接的FGF可為FIBLAST(曲弗明(trafermin)，Scios，Inc.(Mountain View，CA)和Wyeth Ayerst Laboratories(Radnor，PA)正在開(kāi)發(fā)的FGF-2的重組形式)或GENERXTM(由Collateral Therapeutics(San Diego，CA)和Schering AG開(kāi)發(fā)的編碼FGF-4的腺病毒基因療法載體)(Miller和Abrams，上文，1998)。
適用于本發(fā)明的血管生成劑也可為血管生成素-1(angiopoietin-1)，即通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞特異性Tie2受體酪氨酸激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的血管生成因子(Davis等人，Cell871161-1169(1996))。同VEGF一樣，血管生成素-1是正常血管發(fā)育所必需的，且其過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致血管生成增加(Suri等人，Cell871171-1180(1996))。
適用于本發(fā)明的結(jié)合物或方法中的治療劑也可為預(yù)防血栓形成的抗血栓形成劑，血栓是在細(xì)胞基本組份的捕集下血液因子、主要是血小板和血纖維蛋白的積聚物。通過(guò)存在粥樣空斑來(lái)刺激血栓形成，且血栓形成是急性缺血性心臟病發(fā)作的主要原因。適用于本發(fā)明的抗血栓形成劑可為(但不限于)IIb/IIIa整合素(integrin)的抑制劑(Coller，Circulation922373(1995))；組織因子抑制劑；血纖維蛋白溶酶原活化因子或抗凝血酶劑。
免疫抑制劑也可適用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中，例如用于治療心臟移植接受者。應(yīng)了解免疫抑制劑可用于器官移植接受者通常需要全部壽命的慢性預(yù)防性治療中，或者用于治療展現(xiàn)一種或一種以上與移植排斥反應(yīng)一致的癥狀的患者，或者用作嚴(yán)重排斥反應(yīng)中的救援藥劑(rescue agent)。適用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中的免疫抑制劑涵蓋(但不限于)類(lèi)固醇，其包括皮質(zhì)類(lèi)固醇和潑尼松龍(prednisolone)；鈣調(diào)蛋白(calcineurin)抑制劑，諸如Prograf、Neoral、Rapamune、環(huán)孢霉素A(cyclosporine A)和其它環(huán)孢霉素；抗增殖劑，其包括Cellcept、Imuran(硫唑嘌呤(azathioprine))和CerticanTM(艾羅莫司(everolimus))；和治療性單克隆抗體，諸如OKT3、ATGAM、抗胸腺細(xì)胞球蛋白(thymoglobulin/anti-thymocyte globulin)、地路奇單抗(dicluzimab)和巴利昔單抗(basiliximab)。這些和其它免疫抑制劑都可單獨(dú)地或以與另一免疫抑制劑或其它治療劑的組合形式用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中。
作為減少一種或一種以上炎癥癥狀的分子的消炎劑也可用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中。所述消炎劑包括(但不限于)類(lèi)固醇(包括皮質(zhì)類(lèi)固醇)和免疫球蛋白以及環(huán)氧化酶抑制劑和其它非類(lèi)固醇消炎藥物。在一實(shí)施例中，消炎劑為AGI-1067，即膽固醇降低性消炎劑(AtheroGenics；Atlanta，AL)。
抗心律不齊劑也可用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中，例如用于治療心律失常，其為心臟的正常周期性和規(guī)律機(jī)電活性被破壞的病癥。因此，在本發(fā)明的結(jié)合物或方法中，治療劑可為抗心律不齊劑，諸如局部麻醉劑(I類(lèi)藥劑)、交感拮抗劑(II類(lèi)藥劑)、抗纖顫藥劑(III類(lèi)藥劑)、鈣通道藥劑(IV類(lèi)藥劑)或陰離子拮抗劑(V類(lèi)藥劑)，例如，如Vukmir，Am.J.Emer.Med.13459-470(1995)；Grant，PACE20432-444(1-99-7)；Mann，Curr.Med.Res.Opin.13325-343(1995)；或Lipka等人，Am，Heart J.130632-640(1995)中所述。作為局部麻醉劑的抗心律不齊劑充當(dāng)快速鈉通道拮抗劑，諸如，抗心律不齊劑可為(但不限于)普魯卡因胺(procainamide)、奎尼定(quinidine)或丙吡胺(disopyramide)；利多卡因(lidocaine)、苯妥英(phenytoin)、妥卡尼(tocainide)或美西律(mexiletine)；或恩卡胺(encainide)；氟卡尼(flecainide)；勞卡尼(lorcainide)；普萘洛爾(III)(propafenone(III))或莫雷西嗪(moricizine)(Vukmir，上文，1995)?？剐穆刹积R劑也可為交感拮抗劑(P-腎上腺素拮抗劑)，諸如(但不限于)心得安(propranolol)、艾司洛爾(esmolol)、美托洛爾(metoprolol)、阿替奈爾(atenelal)、醋丁洛爾(acebutolol)；或通過(guò)延長(zhǎng)作用電位時(shí)程(action potential duration，APD)起作用的抗纖顫藥劑，例如溴芐銨(bretylium)、胺碘酮(amiodarone)、索他洛爾(II)(sotalol(II))或N-乙酰普魯卡因胺(N-acetylprocainamide)(Vukmir，上文，1995)?？捎米鞅景l(fā)明結(jié)合物或方法中的治療劑的其它抗心律不齊劑包括(但不限于)鈣通道藥劑(諸如維拉帕米(verapamil)、地爾硫卓(diltiazem)和芐普地爾(bepridil))和陰離子拮抗劑(諸如烯丙尼定(alinidine))(Vukmir，上文，1995)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，所屬領(lǐng)域中已知的這些和其它抗心律不齊劑可為適用于在本發(fā)明的結(jié)合物或方法中治療心律失常的治療劑。
也被稱(chēng)為鈣通道阻斷劑(CBB)的鈣拮抗劑在許多心血管疾病中具有有益作用，其充當(dāng)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的有效抑制劑。使得這些治療劑適用于治療動(dòng)脈粥樣硬化和其它心血管疾病的其它特性包括其抑制鈣流入血管壁的能力；減少胞外基質(zhì)合成的能力；促進(jìn)低密度脂蛋白的攝取和裂解的能力；保護(hù)脂蛋白免受氧化修飾的能力；維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的能力；和抑制血小板活化的能力。在鈣拮抗劑中，氨氯地平(amlodipine)為具有血管選擇性的治療劑(Marche等人，Int.J.Cardiol.62(Suppl)S17-S22(1997)；Schachter，Int.J.Cardiol.62(Suppl.)S85-S90(1997))。可用作適用于本發(fā)明的治療劑的其它鈣拮抗劑包括(但不限于)尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、心得安(propanolol)、硝酸異山梨酯(isosorbide dinitrate)、地爾硫卓(diltiazem)和伊拉地平(isradipine)(Nayler(編輯).Calcium Antagonists，第157-260頁(yè)，LondonAcademic Press(1988)；Schachter，Int.J.Cardiol.62(增刊)S9-S15(1997))。提高cAMP或cGMP含量的治療劑會(huì)降低血管平滑肌細(xì)胞反應(yīng)性或增殖，并且在與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子連接時(shí)也是適用的。所述治療劑包括(但不限于)cAMP磷酸二酯酶抑制劑西洛他索(cilostasol)和來(lái)源于內(nèi)皮的一氧化氮(NO)或一氧化氮產(chǎn)生性血管擴(kuò)張劑。例如，參看Takahashi等人，J.Cardiovas.Pharm.20900-906(1992)；和Cornwell等人，Am.J.Phvsiol.267C1405-1413(1994)。
適用于本發(fā)明中的治療劑也可為抗病毒劑或抗生素藥劑。許多研究已報(bào)導(dǎo)心內(nèi)膜炎、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄與特定細(xì)菌和病毒感染、尤其是巨細(xì)胞病毒和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)的聯(lián)系(Cheng和Rivera，Annals of Pharmacotherapy321310-1316(1998))。為預(yù)防性用于心臟移植物或具有發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化的高風(fēng)險(xiǎn)的其它患者中，可對(duì)患者投與含有與抗病毒劑(諸如更昔洛韋(ganciclovir))連接的選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子的結(jié)合物。可包括在本發(fā)明的結(jié)合物或方法中的其它抗病毒劑包括(但不限于)利巴韋林(Ribavirin)(病毒唑(Virazole)，1-(3-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)和重組人類(lèi)白細(xì)胞IFN-a A/D(Matsumori等人，Circulation71834-839(1985)；Matsumori等人，J.Am.Coll.Cardiol.91320-1325(1987))。
所述結(jié)合物和方法也可用于治療動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈粥樣硬化與其后果結(jié)合組成西方世界疾病和死亡的最常見(jiàn)和最重要的起因。同其它阻塞性血管疾病一樣，動(dòng)脈粥樣硬化的特征在于脂質(zhì)、炎性細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和胞外基質(zhì)蛋白在內(nèi)皮內(nèi)層與中間層之間的內(nèi)膜空間中的異常積累(空斑形成)。特定而言，對(duì)內(nèi)皮的損傷允許富含膽固醇的低密度脂蛋白(LDL)進(jìn)入內(nèi)膜。脂質(zhì)被噬菌體攝入內(nèi)膜中，同時(shí)經(jīng)由攝取氧化LDL的受體無(wú)關(guān)性路徑在內(nèi)膜噬菌體中積累過(guò)量的脂質(zhì)。噬菌體將脂質(zhì)釋放到內(nèi)膜中并分泌刺激增殖的細(xì)胞因子。具有成肌纖維細(xì)胞特征的內(nèi)膜細(xì)胞分泌膠原，從而引起空斑在一些情況下變得纖維化。由于病變發(fā)展，因此存在基質(zhì)的壓迫性萎縮，且彈性薄層受到破壞。進(jìn)一步膠原沉積會(huì)形成空斑(纖維脂質(zhì)空斑)的致密纖維帽，其含有游離脂質(zhì)以及巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)。空斑的脆弱內(nèi)皮通常潰爛，從而允許血小板積聚和血栓形成。諸如血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子通過(guò)刺激細(xì)胞增殖而引起進(jìn)一步空斑發(fā)展。
內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖的增加引起肌內(nèi)膜增生(myointimal hyperplasia)和內(nèi)腔變窄(luminal narrowing)。在新生內(nèi)膜形成中起作用的異常細(xì)胞增殖可由諸如血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)或血管緊張素II的特異性生長(zhǎng)因子引起(Ross，Annu.Rev.Physiol.57791(1995)；Schwartz等人，Circ.Res.77445(1995)；和Gibbons和Dzau，New Eng.J.Med.3301431(1994))。
適用于在本發(fā)明的結(jié)合物和方法中治療心血管疾病(諸如血管成形術(shù)后的內(nèi)膜增生)的治療劑可為生長(zhǎng)抑制劑，其通過(guò)限制新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖來(lái)減少或預(yù)防血管疾病。舉例而言，皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因和全身性更昔洛韋可用于殺死增殖細(xì)胞并限制新生內(nèi)膜形成。在一項(xiàng)研究中，用編碼tk的腺病毒載體感染豬髂股動(dòng)脈，并且在暴露于更昔洛韋后，在氣囊損傷后所看到的新生內(nèi)膜增厚減少50-87％(Ohno等人，Science，265781-784(1994)；也參看Guzman等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA9110732-10736(1994)；Chang等人，Mol.Med.1172-181(1995)；和Simari等人，Circulation921-501(1995))。因此，適用于本發(fā)明中的治療劑可為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，諸如(但不限于)胸苷激酶與更昔洛韋的組合。
用于限制新生內(nèi)膜形成的其它治療劑在所屬領(lǐng)域中也是已知的且包括抑制細(xì)胞周期蛋白和原癌基因的基因(Simari和Nabel，Semin.Intervent.Cardiol.177-83(1996))。所述治療劑包括(但不限于)腫瘤抑制基因(諸如p53和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)以及編碼bcl-x、ras的突變體形式和一氧化氮合成酶的基因。作為非限制性實(shí)例，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物(Rb)抑制許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中的細(xì)胞增殖，且編碼活性Rb的重組腺病毒轉(zhuǎn)移到受傷大鼠頸動(dòng)脈和豬髂動(dòng)脈中會(huì)降低新生內(nèi)膜形成(Chang等人，Science267518-522(1994))。已類(lèi)似地顯示p53的基因轉(zhuǎn)移會(huì)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖(Yonemitsu等人，Circ.Res.82147-156(1998)；也參看Muller，Prog.Cardiovas.Pis.40117-128(1997))。顯性負(fù)ras變異體的直接基因轉(zhuǎn)移也抑制大鼠頸動(dòng)脈和豬髂股模型中氣囊損傷后的內(nèi)膜發(fā)育(Chang等人，J.Clin.Invest.962260-2268(1995))。在大鼠頸動(dòng)脈損傷模型中，一氧化氮合成酶的基因轉(zhuǎn)移也限制內(nèi)膜形成(von der Leyen等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA921137-1141(1995))。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑也可用作本發(fā)明的結(jié)合物或方法中的治療劑。
對(duì)抗細(xì)胞目標(biāo)(諸如E2F或各種細(xì)胞周期素之一)的誘捕或反義寡核苷酸也可為適用于在本發(fā)明方法中限制新生內(nèi)膜增殖的治療劑(Morishita等人，Circ.Res.821023-1028(1998)；和Mann等人，Circulation961-41997))。在活體內(nèi)血管損傷后于血管平滑肌細(xì)胞中快速下調(diào)的生長(zhǎng)遏制同源異形盒(homeobox)基因gax也可為適用于抑制內(nèi)膜增生的治療劑(Smith等人，Genes Dev.111674-1689(1997)；和Skopicki等人，Circ.Res.80452-462(1997))?？捎糜谠诒景l(fā)明的結(jié)合物或方法中限制內(nèi)膜增生的其它治療劑在所屬領(lǐng)域中也是已知的(例如參看Laitinen和Yla-Herttuala，Current Opin.Lipid.9465-469(1998))。
本發(fā)明的結(jié)合物或方法也可用于治療再狹窄，再狹窄為可能在血管成形術(shù)之后發(fā)生的內(nèi)腔尺寸的再度變窄，血管成形術(shù)是將氣囊插入受阻血管中、然后充氣以使變窄區(qū)域擴(kuò)大的程序。經(jīng)過(guò)3到6個(gè)月的時(shí)程在約30到50％的病例中發(fā)生再狹窄，且其包括新生內(nèi)膜內(nèi)的細(xì)胞增生、血管壁內(nèi)的血栓組建和總體血管尺寸的收縮。血管成形術(shù)剝除通常產(chǎn)生血管平滑肌遷移和增殖的旁分泌抑制劑的內(nèi)皮細(xì)胞的血管。
一氧化氮缺乏與血管舒張受損和粘附性增加相聯(lián)系，從而使血管組織易于形成動(dòng)脈粥樣硬化病變(Gibbons和Dzau，Science272689-693(1996))。適用于本發(fā)明的結(jié)合物和方法中的治療劑包括(但不限于)內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮(NO)合酶藥劑，其為增強(qiáng)一氧化氮合酶活性的藥劑。所述增強(qiáng)一氧化氮(NO)活性的治療劑涵蓋(但不限于)一氧化氮合酶基因和一氧化氮供體藥物。在新生內(nèi)膜形成大鼠模型中將一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染到氣囊損傷后的血管壁中會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一氧化氮并實(shí)質(zhì)上抑制新生內(nèi)膜形成所必需的細(xì)胞增殖、遷移和基質(zhì)產(chǎn)生(von der Leyen等人，上文，1995)。臨床研究也表明一氧化氮供體藥物可用于增加一氧化氮活性并治療再狹窄(Ferguson，Circulation904(1994))。
本發(fā)明的結(jié)合物和方法也可用于治療充血性心力衰竭(CHF)，其為僅在美國(guó)就影響近五百萬(wàn)人的病癥。當(dāng)心臟由于動(dòng)脈粥樣硬化或諸如高血壓、心肌梗塞或有缺陷心臟瓣膜的其它病狀而受到破壞時(shí)，引起充血性心力衰竭。失效的心臟無(wú)法有效工作，從而引起體液潴留(fluid retention)、呼吸急促和疲勞。因此，為治療充血性心力衰竭，可將選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子與諸如(但不限于)TNF抑制劑(諸如重組可溶性TNF誘捕受體EmbrelTM(Immunex Corp.；Seattle，WA))的治療劑連接。
作為使血管收縮的多肽的內(nèi)皮素在充血性心力衰竭中也升高。因此，可將選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明分子與作為內(nèi)皮素抑制劑(例如小分子藥物TBC11251)的治療劑連接。由Texas Biotechnology Corp.研發(fā)的這種藥物會(huì)抑制內(nèi)皮素A受體結(jié)合，并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的松弛。TBC11251已導(dǎo)致患有中度到嚴(yán)重充血性心力衰竭的患者的顯著改善(Potera，Gen.Enein.News1812(1998))。
用于本發(fā)明的結(jié)合物或方法中的治療劑也可為遺傳性心臟病的替換基因療法載體。例如，所述遺傳性疾病可為心肌的遺傳性疾病，諸如X連接的擴(kuò)張型心肌病(X-linkeddilated cardiomyopathy)、肥大性心肌病、長(zhǎng)QT綜合癥(Long QT Syndrome)或引起疾病的突變尚未確定的另一疾病(Bowles等人，Cardiovas.Res.35422-430(1997))。在一個(gè)實(shí)施例中，用與腺病毒基因療法載體連接的選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子實(shí)施本發(fā)明的結(jié)合物或方法，所述載體含有編碼所要替換基因產(chǎn)物的核酸分子。
舉例而言，治療劑可如Harada等人，J.Clin.Invest.94623-630(1994)中所述以蛋白形式傳遞。微球體(例如，經(jīng)由SO3殘余物可逆吸附諸如bFGF等血管生成因子的7μm直徑的微球體)也可與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子連接以選擇性傳遞用于治療心血管疾病的微球體。所述微球體留在周?chē)⒀h(huán)中而不會(huì)干擾總流量并經(jīng)一周時(shí)期緩慢釋放(Arras等人，Nature Biotech.16159-162(1998)；也參看Tice和Staas，Nature Biotech.16134(1998))。單獨(dú)注入生物可降解的微球體可用于傳遞血管生成劑或其它治療劑，其在注入后經(jīng)一或數(shù)月釋放，藥物釋放的速率和持續(xù)時(shí)間由諸如聚合物類(lèi)型和微粒大小等因素控制(Maulding，Controlled Release6167-176(1987)；Tice和Tabibi，第315-339頁(yè)，Kydonieus(編輯)，Treatise on Controlled Drug DeliveryMarcel Dekker，New York(1992))?；虔煼ㄝd體也可與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接以傳遞編碼血管生成劑或其它治療劑的核酸分子(例如參看Isner等人，Lancet348370-374(1996)；Giordano等人，Nature Med.2534-539(1996))。
在所屬領(lǐng)域中已知用于在本發(fā)明方法中治療心臟病或心血管疾病的多種合適的基因療法(例如參看Li等人，Cardiol.4139-46(1997))。作為非限制性實(shí)例，包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體的病毒載體在與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子連接時(shí)可用于基因傳遞。所述基因療法載體可包括編碼治療劑的核酸分子，所述治療劑諸如(但不限于)血管生成劑，諸如VEGF或FGF。舉例而言，如Sylven，Drugs of Today38819-827(2002)；Symes，J.Card.Sure.15283-290(2000)；和Grines等人，Am.J.Cardiol.92(增刊)24N-31N(2003)中所述，具有VEGF、FGF和其它血管生成劑形式的基因療法在所屬領(lǐng)域中眾所周知。具有無(wú)法復(fù)制的血清型5腺病毒的血管生成基因療法在具有慢性穩(wěn)定型心絞痛的人類(lèi)體內(nèi)的安慰劑控制試驗(yàn)中具有有益作用，在所述腺病毒中E1A和E1B基因已在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下經(jīng)人類(lèi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(FGF-4)基因替換(Grines等人，上文，2003)。也參看Simari和Nabel，上文，1996；和Indolfi和Chiariello，Cardiologia43365-373(1998))。因此，在一實(shí)施例中，本發(fā)明方法依賴(lài)于表達(dá)治療基因產(chǎn)物的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體。
鑒于上文，應(yīng)了解多種治療劑適用于根據(jù)本發(fā)明方法治療心血管疾病。適用的治療劑涵蓋(但不限于)血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在并入本發(fā)明的結(jié)合物或方法中時(shí)，可將這些和額外已知或其它治療劑選擇性導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。此外，心臟病學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，這些和其它治療劑都可在本發(fā)明的結(jié)合物和方法中單獨(dú)或一起使用。應(yīng)進(jìn)一步了解，本發(fā)明的結(jié)合物可含有所述治療劑中的一種或一種以上并且其它組份可視情況包括在本發(fā)明的結(jié)合物中。作為實(shí)例，在一些情況下，可能需要在錨定分子與治療劑之間利用寡肽間隔物。例如參看Fitzpatrick和Garnett，Anticancer Drug Design101-9(1995)。
應(yīng)進(jìn)一步了解多種投藥途徑適用于本發(fā)明方法中。所述途徑涵蓋全身和局部投藥且包括(但不限于)經(jīng)口投藥、靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮擴(kuò)散或電泳、局部注射和緩釋傳遞裝置(包括局部植入的緩釋裝置，諸如可生物腐蝕或以?xún)?chǔ)集層為基礎(chǔ)的植入物)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在個(gè)體中顯影心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的錨定分子連接的可檢測(cè)成分的結(jié)合物；并檢測(cè)結(jié)合物。在顯影心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟，且其例如可為錨定肽或肽模擬物。特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的多種錨定分子可用于根據(jù)本發(fā)明方法顯影心臟脈管系統(tǒng)。所述錨定分子涵蓋(但不限于)含有氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物，和含有氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。多種可檢測(cè)成分適用于上述本發(fā)明方法中，所述成分例如包括放射性核素和順磁離子。
本文進(jìn)一步提供在個(gè)體中顯影心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO27的錨定分子連接的可檢測(cè)成分的結(jié)合物；并檢測(cè)結(jié)合物。在顯影心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。特異性結(jié)合SEQ ID NO27的多種錨定分子可用于根據(jù)本發(fā)明方法顯影心臟脈管系統(tǒng)。所述錨定分子涵蓋(但不限于)錨定肽或肽模擬物，諸如含有氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物，和含有氨基酸序列CPKRPR(SEQID NO6)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽或肽模擬物。多種可檢測(cè)成分適用于顯影心臟脈管系統(tǒng)，所述成分例如包括放射性核素和順磁離子。
本發(fā)明另外提供在個(gè)體中顯影心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子連接的可檢測(cè)成分的結(jié)合物；并檢測(cè)結(jié)合物。在本發(fā)明的顯影方法中，錨定分子可以(例如)相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟。此外，多種特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的錨定分子中的任一種都適用于根據(jù)本發(fā)明方法顯影心臟脈管系統(tǒng)，所述錨定分子包括(但不限于)具有氨基酸序列CKRAVR(SEQID NO7)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；具有氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物；和具有氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，適用于本發(fā)明的顯影方法中的錨定肽和肽模擬物例如可為線性、環(huán)狀或在構(gòu)形上受限。適用于顯影的可檢測(cè)成分包括(但不限于)放射性核素和順磁離子。
本文進(jìn)一步提供在個(gè)體中顯影心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合SEQ ID NO33的錨定分子連接的可檢測(cè)成分的結(jié)合物；并檢測(cè)結(jié)合物。作為非限制性實(shí)例，可用以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子或者用作為肽或肽模擬物的錨定分子實(shí)施本發(fā)明的顯影方法。適用于本發(fā)明的顯影方法的錨定分子包括(但不限于)錨定肽和肽模擬物，諸如具有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物?？捎冒?例如)放射性核素和順磁離子的多種可檢測(cè)成分中的任一種實(shí)施顯影心臟脈管系統(tǒng)的本發(fā)明方法。
本文也提供在個(gè)體中顯影心臟脈管系統(tǒng)的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的對(duì)個(gè)體投與含有與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)的錨定分子連接的可檢測(cè)成分的結(jié)合物；并檢測(cè)結(jié)合物。適用于根據(jù)本發(fā)明方法顯影的錨定分子包括(但不限于)可以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性在活體內(nèi)錨定到心臟的錨定分子。特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的多種錨定分子中的任一種都可用于根據(jù)本發(fā)明方法顯影心臟脈管系統(tǒng)，所述錨定分子包括錨定肽和肽模擬物，諸如含有氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物，和含有氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)或其保守變異體或肽模擬物的錨定肽和肽模擬物。適用于本發(fā)明中的錨定肽和肽模擬物可以線性、環(huán)狀或構(gòu)形上受限的形式使用。如上所述，適用于顯影的可檢測(cè)成分包括(但不限于)放射性核素和順磁離子。
本發(fā)明的顯影方法依賴(lài)可檢測(cè)成分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)成分”是指可在活體內(nèi)投藥并隨后檢測(cè)的任何分子。適用于本發(fā)明的結(jié)合物和顯影方法中的示范性可檢測(cè)成分包括順磁離子、放射性核素和熒光分子。示范性放射性核素包括銦-111、锝-99、碳-11和碳-13。熒光分子包括(但不限于)熒光素(fiuorescein)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、若丹明(rhodamine)和德州紅(Texas red)。當(dāng)可檢測(cè)成分為發(fā)射伽瑪射線的放射性核素(諸如銦-113、銦-115或锝-99)時(shí)，可在投與個(gè)體后使用固態(tài)閃爍檢測(cè)器使結(jié)合物顯現(xiàn)。
本文還提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使HLP/CRIP2或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與HLP/CRIP2特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上HLP/CRIP2結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2的錨定分子。在細(xì)胞表面表達(dá)HLP/CRIP2的細(xì)胞以及經(jīng)純化HLP/CRIP2或其片段可用于本發(fā)明的篩檢方法中。作為非限制性實(shí)例，HLP/CRIP2的天然、重組、人類(lèi)、鼠科(SEQ ID NO25)和其它變異體和同系物和其片段(諸如(但不限于)經(jīng)純化或在細(xì)胞表面表達(dá)的HLP/CRIP2的CRPPR(SEQ ID NO1)或CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)結(jié)合片段)可用于本發(fā)明的篩檢方法中。可根據(jù)本發(fā)明方法篩檢的文庫(kù)包括(但不限于)肽和肽模擬物文庫(kù)、小分子文庫(kù)和抗體和其抗原結(jié)合片段文庫(kù)(包括合成單鏈或其它抗體文庫(kù))。在一實(shí)施例中，本發(fā)明方法包括另一在靜脈內(nèi)注射后檢定一種或一種以上所分離的文庫(kù)分子的定位的步驟。當(dāng)使用HLP/CRIP2的片段替代全長(zhǎng)HLP/CRIP2時(shí)，應(yīng)了解所述片段可為(但不限于)特異性結(jié)合SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的片段。
多種HLP/CRIP2多肽中的任一種都可用于本發(fā)明方法中以分離選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“HLP/CRIP2”意謂在心臟脈管系統(tǒng)中選擇性表達(dá)并與SEQ ID NO25具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定實(shí)施例中，HLP/CRIP2與SEQ ID NO25具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使受體克隆9或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與受體克隆9特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上受體克隆9結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9的錨定分子?？捎迷诩?xì)胞表面表達(dá)受體克隆9的細(xì)胞以及經(jīng)純化受體克隆9或其片段實(shí)施本發(fā)明方法。作為非限制性實(shí)例，受體克隆9(SEQ ID NO27)的天然、重組、人類(lèi)、鼠科(SEQ ID NO27)和其它變異體和同系物和其片段(諸如(但不限于)經(jīng)純化或在細(xì)胞表面表達(dá)的受體克隆9的SEQ ID NO5和SEQ ID NO6結(jié)合片段)可用于本發(fā)明的篩檢方法中?？筛鶕?jù)本發(fā)明方法篩檢多種文庫(kù)中的任一種，其包括(但不限于)上文所述的文庫(kù)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受體克隆9”意謂在心臟脈管系統(tǒng)中選擇性表達(dá)并與SEQ ID NO27具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定實(shí)施例中，受體克隆9與SEQ ID NO27具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。
本發(fā)明還提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使Sigirr/TIR8或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與Sigirr/TIR8特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上Sigirr/TIR8結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8的錨定分子。在細(xì)胞表面表達(dá)Sigirr/TIR8的細(xì)胞以及經(jīng)純化Sigirr/TIR8或其片段可用于本發(fā)明的篩檢方法中。作為非限制性實(shí)例，Sigirr/TIR8的天然、重組、人類(lèi)、鼠科(SEQ ID NO29)和其它變異體和物種同系物和其片段(諸如(但不限于)經(jīng)純化或在細(xì)胞表面表達(dá)的SEQ ID NO7或SEQ ID NO8結(jié)合片段)可用于本發(fā)明的篩檢方法中。應(yīng)進(jìn)一步了解，如上所述，多種文庫(kù)中的任一種都可用于本發(fā)明的篩檢方法中。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Sigirr/TIR8”意謂在心臟脈管系統(tǒng)中選擇性表達(dá)并與SEQ ID NO29具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定實(shí)施例中，Sigirr/TIR8與SEQ ID NO29具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。
本文進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使MpcII-3相關(guān)蛋白或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與MpcII-3相關(guān)蛋白特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上MpcII-3相關(guān)蛋白結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合MpcII-3相關(guān)蛋白的錨定分子。舉例而言，可用在細(xì)胞表面表達(dá)MpcII-3相關(guān)蛋白的細(xì)胞或經(jīng)純化MpcII-3相關(guān)蛋白或其片段實(shí)施本發(fā)明的篩檢方法。作為非限制性實(shí)例，MpcII-3相關(guān)蛋白的天然、重組、人類(lèi)、鼠科(SEQ ID NO33)和其它變異體和物種同系物以及SEQ ID NO33或人類(lèi)或其它MpcII-3相關(guān)蛋白的片段(包括(但不限于)經(jīng)純化或在細(xì)胞表面表達(dá)的CRSTRANPC(SEQ ID NO11)結(jié)合片段)可用于本發(fā)明的篩檢方法中。本發(fā)明方法可用于篩檢多種文庫(kù)中的任一種，諸如(但不限于)肽和肽模擬物文庫(kù)、小分子文庫(kù)和抗體或其抗原結(jié)合片段文庫(kù)(包括合成單鏈或其它抗體文庫(kù))。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“MpcII-3相關(guān)蛋白”意謂在心臟脈管系統(tǒng)中選擇性表達(dá)并與SEQID NO33具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定實(shí)施例中，MpcII-3相關(guān)蛋白與SEQID NO33具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的使bc10或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與bc10特異性結(jié)合的條件下接觸；檢定特異性結(jié)合；并從文庫(kù)中分離一種或一種以上bc10結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10的錨定分子。在細(xì)胞表面表達(dá)bc10的細(xì)胞以及經(jīng)純化bc10或bc10片段可用于本發(fā)明的篩檢方法中。作為非限制性實(shí)例，bc10的天然、重組、人類(lèi)、鼠科(SEQ ID NO35)以及變異體和其它物種同系物和其片段(包括(但不限于)經(jīng)純化或在細(xì)胞表面表達(dá)的SEQ ID NO12結(jié)合片段或SEQ ID NO13結(jié)合片段)可用于本發(fā)明的篩檢方法中。本發(fā)明方法可用于篩檢上述多種文庫(kù)中的任一種。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“bc10”意謂在心臟脈管系統(tǒng)中選擇性表達(dá)并與SEQ ID NO35具有至少60％氨基酸一致性的多肽。在特定實(shí)施例中，bc10與SEQ ID NO35具有至少70％、80％、90％、95％或95％以上的氨基酸一致性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供多種分離肽和肽模擬物，其例如可用于構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合物，或者當(dāng)肽自身具有生物活性時(shí)，可以未結(jié)合形式用作治療如上所述的任何心血管疾病或心肌病的治療劑。例如，如Ruoslahti，Nat.Rev.Cancer283-90(2002)，和Laakkonen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1019381-9386(2004)中所述，其它具有生物活性的錨定肽在所屬領(lǐng)域中是已知的。作為一實(shí)例，本發(fā)明提供具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)的分離肽。包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)的本發(fā)明的分離肽或肽模擬物例如可具有少于40個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO14)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO14)的分離肽。例如，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可在構(gòu)形上受限且可包括氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)。在其它實(shí)施例中，包括氨基酸序列GRKSKTV(SEQ IDNO14)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度、少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXGRKSKTVZC(SEQ ID NO15)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本發(fā)明另外提供具有少于150個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于150個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)的分離肽。包括氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)的本發(fā)明的分離肽和肽模擬物可具有(但不限于)少于100個(gè)殘基、少于60個(gè)殘基或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
本文還提供具有少于50個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于50個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)的分離肽。包括氨基酸序列SEQ ID NO6的本發(fā)明的分離肽和肽模擬物可具有多種長(zhǎng)度，其包括(但不限于)少于40個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
本發(fā)明另外提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)的分離肽。包括氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)的本發(fā)明的肽或肽模擬物可具有(但不限于)少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度、少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO16)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO16)的分離肽。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可在構(gòu)形上受限且可具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度、少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXRNSWKPNZC(SEQ ID NO17)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本文進(jìn)一步提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)的分離肽。在其它實(shí)施例中，含有氨基酸序列SEQ ID NO9的本發(fā)明的分離肽或肽模擬物具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度、少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
本發(fā)明還提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO18)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。舉例而言，本發(fā)明提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO18)的分離肽。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可在構(gòu)形上受限。作為另一非限制性實(shí)例，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可包括氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)。本發(fā)明的分離肽或肽模擬物進(jìn)一步可具有多種長(zhǎng)度中的任一種。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可具有少于100個(gè)殘基、少于60個(gè)殘基或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物包括氨基酸序列CXRSTRANPZC(SEQ ID NO19)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本發(fā)明另外提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ IDNO20)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列PKTRRVP(SEQ ID NO20)的肽。本發(fā)明的分離肽或肽模擬物例如可在構(gòu)形上受限且可包括氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)。在特定實(shí)施例中，含有氨基酸序列SEQ ID NO20的本發(fā)明的分離肽或肽模擬物具有少于100個(gè)殘基、少于60個(gè)殘基或少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在另一實(shí)施例中，分離肽或肽模擬物包括氨基酸序列CXPKTRRVPZC(SEQ ID NO21)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本文進(jìn)一步提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ IDNO22)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列SGMARTK(SEQ ID NO22)的肽。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的分離肽或肽模擬物包括氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)。本發(fā)明的分離肽或肽模擬物進(jìn)一步可具有多種長(zhǎng)度中的任一種。作為非限制性實(shí)例，具有氨基酸序列SEQ ID NO22的本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可具有少于100個(gè)殘基、60個(gè)殘基或20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括氨基酸序列CXSGMARTKZC(SEQ ID NO23)或其肽模擬物的分離肽或肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
本發(fā)明的肽和肽模擬物是以經(jīng)分離形式提供的。如本文關(guān)于本發(fā)明的肽或肽模擬物所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”意謂肽或肽模擬物是呈相對(duì)不含通常在細(xì)胞中與肽或肽模擬物相關(guān)或在文庫(kù)或粗制劑中與肽或肽模擬物相關(guān)的物質(zhì)(諸如污染性多肽、脂質(zhì)、核酸和其它細(xì)胞物質(zhì))的形式。
因此，本發(fā)明提供包括如下文公開(kāi)的構(gòu)形上受限、雙功能和多價(jià)肽和肽模擬物的肽和肽模擬物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽”廣義上用于意謂肽、蛋白、蛋白片段等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽模擬物”意謂具有作為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的肽的活性的肽樣分子。所述肽模擬物包括經(jīng)化學(xué)修飾的肽、含有非天然存在的氨基酸的肽樣分子和類(lèi)肽，且具有活性，諸如獲得肽模擬物的肽的選擇性錨定活性(例如參看Goodman和Ro，Peptidomimetics for DrugDesign，″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″第1卷(M.E.Wolff編輯；JohnWiley & Sons 1995)，第803-861頁(yè))。
多種肽模擬物在所屬領(lǐng)域中是已知的且涵蓋于本發(fā)明內(nèi)，所述肽模擬物例如包括含有受限氨基酸、模擬肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的非肽組份或酰胺鍵等排體(amide bond isostere)的肽樣分子。例如，含有受限的非天然存在的氨基酸的肽模擬物包括α-甲基化氨基酸；α，α-二烷基甘氨酸或α-氨基環(huán)烷烴羧酸；Nα-Cα環(huán)化氨基酸；Nα-甲基化氨基酸；β-或γ-氨基環(huán)烷烴羧酸；α，β-不飽和氨基酸；β，β-二甲基或β-甲基氨基酸；β-經(jīng)取代-2，3-亞甲基氨基酸；N-Cδ或Cα-Cδ環(huán)化氨基酸；經(jīng)取代脯氨酸或另一氨基酸模擬物。例如，模擬肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽模擬物可含有非肽β轉(zhuǎn)角模擬物、γ轉(zhuǎn)角模擬物、β折疊結(jié)構(gòu)的模擬物或螺旋結(jié)構(gòu)的模擬物，其各自在所屬領(lǐng)域中眾所周知。肽模擬物也可為例如含有酰胺鍵等排體的肽樣分子，所述酰胺鍵等排體例如逆反式修飾(retro-inverso modification)；經(jīng)還原的酰胺鍵；亞甲基硫醚或亞甲基亞砜(methylene-sulfoxide)鍵；亞甲基醚鍵；亞乙基鍵；硫代酰胺鍵；反式烯烴或氟代烯烴鍵；經(jīng)1，5-二取代的四唑環(huán)；亞甲基酮(ketomethylene)或氟代亞甲基酮鍵或另一酰胺等排體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解這些和其它肽模擬物都涵蓋于如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽模擬物”的含義中。
鑒別肽模擬物的方法在所屬領(lǐng)域中眾所周知且(例如)包括篩檢含有潛在肽模擬物文庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。舉例而言，劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Cambridge Structural Database)含有超過(guò)300,000種具有已知晶體結(jié)構(gòu)的化合物的集合(Allen等人，Acta Crystallogr.章節(jié)B，352331(1979))。由于新的晶體結(jié)構(gòu)得到確定，所以這一結(jié)構(gòu)存放庫(kù)不斷更新，且可在其中篩檢具有合適形狀(例如與本發(fā)明的肽相同的形狀)以及與同源受體的潛在幾何和化學(xué)互補(bǔ)性的化合物。當(dāng)無(wú)法獲得本發(fā)明的肽的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，可使用例如程序CONCORD產(chǎn)生結(jié)構(gòu)(Rusinko等人，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29251(1989))。另一種數(shù)據(jù)庫(kù)化學(xué)品目錄數(shù)據(jù)庫(kù)(Available Chemicals Directory)(Molecular Design Limited，InformationsSystems；San Leandro CA)含有約100,000種市面有售的化合物，且也可進(jìn)行搜尋以鑒別本發(fā)明的肽的潛在肽模擬物，例如在選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)中具有活性的肽模擬物。
包括下文所述的構(gòu)形上受限、雙功能和多價(jià)肽和肽模擬物的本發(fā)明的肽和肽模擬物可具有多種長(zhǎng)度。例如，本發(fā)明的肽或肽模擬物可具有少于6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70或80個(gè)殘基的相對(duì)短的長(zhǎng)度。本發(fā)明的肽或肽模擬物也可用于如下文進(jìn)一步描述的顯著較長(zhǎng)的序列的情形中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“殘基”是指氨基酸或其類(lèi)似物。應(yīng)了解，例如含有氨基酸序列SEQ ID NO1的肽包括并未由其它氨基酸分隔的連續(xù)序列形式的指定氨基酸。
本發(fā)明的分離肽或肽模擬物可為(但不限于)環(huán)狀或在構(gòu)形上受限。如本文關(guān)于分子所用，術(shù)語(yǔ)“在構(gòu)形上受限”意謂三維結(jié)構(gòu)隨時(shí)間實(shí)質(zhì)上維持成一種空間排列的分子，諸如肽或肽模擬物。構(gòu)形上受限的分子可具有改進(jìn)的特性，諸如增加的親和力、代謝穩(wěn)定性、膜滲透性或可溶性。構(gòu)形限制方法在所屬領(lǐng)域中眾所周知且包括(但不限于)環(huán)化。
如本文關(guān)于肽或肽模擬物所用，術(shù)語(yǔ)環(huán)狀是指在兩個(gè)非鄰近氨基酸或氨基酸類(lèi)似物之間包括分子內(nèi)鍵的結(jié)構(gòu)。可經(jīng)由共價(jià)或非共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)環(huán)化。分子內(nèi)鍵包括(但不限于)主鏈與主鏈、側(cè)鏈與主鏈和側(cè)鏈與側(cè)鏈的鍵。環(huán)化方法包括(但不限于)在非鄰近氨基酸或氨基酸類(lèi)似物的側(cè)鏈之間形成二硫鍵；形成內(nèi)酰胺鍵，例如在一個(gè)氨基酸或其類(lèi)似物的側(cè)鏈基團(tuán)與氨基端殘基的N端胺之間；和形成賴(lài)氨酸正亮氨酸鍵和二酪氨酸鍵。
本發(fā)明也提供含有作為(例如)CRPPR(SEQ ID NO1)、CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)、CARPAR(SEQ ID NO5)、CPKRPR(SEQ ID NO6)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)、RGSSS(SEQ ID NO9)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)、CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或CSGMARTKC(SEQ ID NO13)序列的保守變異體的氨基酸序列的分離肽或肽模擬物。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有作為SEQ ID NO1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守變異體(其中準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)只有一個(gè)氨基酸經(jīng)保守取代)的氨基酸序列的分離肽或肽模擬物。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有作為SEQID NO1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守變異體(其中準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)有兩個(gè)氨基酸經(jīng)保守取代)的氨基酸序列的分離肽或肽模擬物。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有作為SEQ ID NO1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的保守變異體(其中準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)有三、四或五個(gè)氨基酸經(jīng)保守取代)的氨基酸序列的分離肽或肽模擬物。
如本文所用，“保守變異體”為第一氨基酸經(jīng)具有至少一種類(lèi)似生化特性的第二氨基酸或氨基酸類(lèi)似物替換的氨基酸序列，所述類(lèi)似生化特性例如可為類(lèi)似大小、變化、疏水性或氫鍵合能力。舉例而言，第一疏水性氨基酸可經(jīng)諸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸或其類(lèi)似物的第二(不相同)疏水性氨基酸保守取代。類(lèi)似地，第一堿性氨基酸可經(jīng)諸如精氨酸或賴(lài)氨酸或其類(lèi)似物的第二堿性氨基酸保守取代。同樣地，第一酸性氨基酸可經(jīng)諸如天冬氨酸或谷氨酸或其類(lèi)似物的第二酸性氨基酸保守取代，或者諸如苯丙氨酸的芳香族氨基酸可經(jīng)諸如酪氨酸的第二芳香族氨基酸或氨基酸類(lèi)似物保守取代。
如本文所公開(kāi)，選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的肽或肽模擬物可在顯著較長(zhǎng)的序列的情形下保持錨定活性。舉例而言，5-mer CRPPR(SEQ ID NO1)在與噬菌體外殼蛋白融合時(shí)保持錨定能力，從而證實(shí)本發(fā)明的肽在埋入較大蛋白序列后可具有選擇性錨定活性。因此，本發(fā)明提供含有與異源蛋白融合的本發(fā)明的肽或肽模擬物的嵌合蛋白。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有與異源蛋白融合的選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2、受體克隆9、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白或bc10的錨定肽或肽模擬物的嵌合蛋白。適用于本發(fā)明中的異源蛋白包括(但不限于)具有作為抗體或其抗原結(jié)合片段的治療活性的異源蛋白。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供其中含有氨基酸序列SEQ ID NO1、2、5、6、7、8、9、11、12或13的肽或肽模擬物或這些序列中之一序列的保守變異體或肽模擬物與異源蛋白融合的嵌合蛋白。如本文關(guān)于與本發(fā)明的肽或肽模擬物融合的蛋白所用的術(shù)語(yǔ)“異源”意謂來(lái)源于除編碼融合肽的基因或獲得融合肽模擬物的來(lái)源以外的來(lái)源的蛋白。本發(fā)明的嵌合蛋白可具有多種長(zhǎng)度，其包括(但不限于)至多100、200、300、400、500、800、1000或2000個(gè)殘基。
本文進(jìn)一步提供雙功能肽，其含有與具有獨(dú)立功能的第二肽融合的選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)、受體克隆9(SEQ ID NO27)、Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)、MpcII-3相關(guān)蛋白(SEQ ID NO33)或bc10(SEQ ID NO35)的錨定肽。所述雙功能肽具有由不同的肽成分所賦予的至少兩種功能，且例如可展示除選擇性錨定活性之外的促細(xì)胞凋亡活性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括至少兩個(gè)各自獨(dú)立結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)的基序的分離多價(jià)肽或肽模擬物。例如，所述多價(jià)肽或肽模擬物可具有至少兩個(gè)各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其保守變異體或肽模擬物的基序。例如，多價(jià)肽或肽模擬物可具有所述基序中的至少三個(gè)、至少五個(gè)或至少十個(gè)，其各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其保守變異體或肽模擬物。在特定實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸序列SEQID NO1或SEQ ID NO2或其保守變異體或肽模擬物的相同或不相同的基序。在另一實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物含有相同的基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO1或所述序列的保守變異體或肽模擬物組成。在另一實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物含有相同的基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO2或所述序列的保守變異體或肽模擬物組成。在其它實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物含有連續(xù)的HLP/CRIP2結(jié)合基序，其可相同或不相同。
本文也提供包括至少兩個(gè)各自獨(dú)立結(jié)合受體克隆9(SEQ ID NO27)的基序的分離多價(jià)肽或肽模擬物。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可具有至少兩個(gè)各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO5或6或所述序列的保守變異體或肽模擬物的基序。應(yīng)了解，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物(例如)可包括所述基序中的至少三個(gè)、至少五個(gè)或至少十個(gè)，其各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO5或6或其保守變異體或肽模擬物。在特定實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸序列SEQID NO5或6或其保守變異體或肽模擬物的相同或不相同的基序。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO5或6或所述序列的保守變異體或肽模擬物組成。在其它實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物含有連續(xù)的受體克隆9(SEQID NO27)結(jié)合基序，其相同或不相同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括至少兩個(gè)各自獨(dú)立結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)的基序的分離多價(jià)肽或肽模擬物。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可具有至少兩個(gè)各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO7、8或9或所述序列的保守變異體或肽模擬物的基序。應(yīng)了解，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物(例如)可包括所述基序中的至少三個(gè)、至少五個(gè)或至少十個(gè)，其各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO7、8或9或其保守變異體或肽模擬物。在特定實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物具有2、3、4、7、8、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸序列SEQ ID NO7、8或9或其保守變異體或肽模擬物的相同或不相同的基序。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO7、8或9或所述序列的保守變異體或肽模擬物組成。在其它實(shí)施例中，多價(jià)肽或肽模擬物含有連續(xù)的Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)結(jié)合基序，其相同或不相同。
本文進(jìn)一步提供包括至少兩個(gè)各自獨(dú)立結(jié)合SEQ ID NO33的基序的分離多價(jià)肽或肽模擬物。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可具有至少兩個(gè)各自獨(dú)立含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或所述序列的保守變異體或肽模擬物的基序。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可包括所述基序中的至少三個(gè)、至少五個(gè)或至少十個(gè)，其各自獨(dú)立含有氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物。作為其它非限制性實(shí)例，多價(jià)肽或肽模擬物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物的相同或不相同的基序。本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物例如也可包括相同基序，其是由氨基酸序列SEQ ID NO11或所述序列的保守變異體或肽模擬物組成。應(yīng)了解，多價(jià)肽或肽模擬物可包括連續(xù)或不連續(xù)的SEQ ID NO33結(jié)合基序，其可相同或不相同。
本發(fā)明也提供包括至少兩個(gè)各自獨(dú)立結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)的基序的分離多價(jià)肽或肽模擬物。SEQ ID NO35結(jié)合基序可連續(xù)或不連續(xù)，且進(jìn)一步可相同或不相同。例如，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可具有至少兩個(gè)各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或所述序列的保守變異體或肽模擬物的基序。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物可包括所述基序中的至少三個(gè)、至少五個(gè)或至少十個(gè)，其各自獨(dú)立含有氨基酸序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或其保守變異體或肽模擬物。作為其它非限制性實(shí)例，多價(jià)肽或肽模擬物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)氨基酸序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或其保守變異體或肽模擬物的相同或不相同的基序。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括相同基序的本發(fā)明的多價(jià)肽或肽模擬物，所述基序是由氨基酸序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO12或SEQ IDNO13的保守變異體或肽模擬物組成。
以下實(shí)例旨在說(shuō)明而非限制本發(fā)明。
實(shí)例I鑒別選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的肽和錨定肽的同源受體本實(shí)例描述使用活體外和活體內(nèi)噬菌體選擇以鑒別選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的肽，同時(shí)結(jié)合細(xì)菌雙雜交檢定以鑒別錨定肽的同源受體。
使用抗CD31磁珠對(duì)從鼠科心臟組織獲得的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行心臟內(nèi)皮細(xì)胞的富集度的活體外噬菌體選擇以分離血管內(nèi)皮細(xì)胞。在三輪活體外選擇后，與非重組噬菌體相比觀察到與心臟細(xì)胞的活體外結(jié)合的230倍強(qiáng)化(圖1B)。隨后用于錨定到心臟的活體內(nèi)選擇得到相對(duì)于非重組噬菌體的錨定以近200倍的增加在活體內(nèi)錨定到心臟的噬菌體集合。此外，經(jīng)活體外/活體內(nèi)選擇的噬菌體與其它組織相比優(yōu)先定位到心臟中。如圖1C所示，與大腦、腎、皮膚和骨骼肌中的噬菌體積累相比，心臟中的富集為20到50倍。
如下進(jìn)行對(duì)心臟錨定肽的假定受體的分離。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增心臟錨定噬菌體的編碼肽的DNA插入物，將其插入細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的“誘餌載體”中，并與編碼心臟cDNA文庫(kù)的靶載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)菌中。高嚴(yán)格度篩檢揭示了表明頻率與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)?shù)恼T餌-目標(biāo)相互作用的菌落，而在不存在兩種載體中任一種的情況下未觀察到菌落生長(zhǎng)(圖1D)。此外，用于系統(tǒng)泄漏性的控制在100個(gè)菌落中去除75個(gè)可能是假陽(yáng)性的菌落(圖1E)。
使用NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)分析來(lái)自25個(gè)剩余候選受體cDNA的同框序列。在所述25個(gè)克隆中，19個(gè)是在心肌中大量表達(dá)的蛋白，諸如肌球蛋白、肌紅蛋白、鐵蛋白和酮戊二酸脫氫酶。代表表1中所總結(jié)的膜或細(xì)胞表面蛋白的剩余6個(gè)克隆是心臟錨定分子的假定受體。這些結(jié)果表明結(jié)合活體外/活體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)與細(xì)菌雙雜交分析可快速鑒別心臟錨定肽和其同源受體。
如下進(jìn)行活體外和活體內(nèi)噬菌體選擇。如Laakkonen等人，Nat.Med.8751-755(2002)中所述產(chǎn)生在T7Select415-1噬菌體(Novagen；San Diego，CA)上展示的由NNK編碼的CX7C文庫(kù)。如Clarkson和Lowman(編輯)Phage DisplayA Practical ApproachOxford，U.K.Oxford University Press(2004)中的Hoffman等人，“In vivo and ex vivo selectionsusing phage-displayed libraries”所述進(jìn)行噬菌體選擇和確認(rèn)。在對(duì)心臟細(xì)胞進(jìn)行三輪活體外選擇后，在活體內(nèi)進(jìn)行三輪選擇。為進(jìn)行活體外選擇，使用1mg/ml的膠原酶IA(Sigma；St.Louis，MO)分散組織，從而自鼠科心臟組織制備細(xì)胞懸浮液。在4℃下將細(xì)胞懸浮液與5×1010個(gè)空斑形成單位(pfu)的CX7C文庫(kù)一起培育過(guò)夜并隨后洗滌以移除未結(jié)合的噬菌體。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用磁珠(M450；Dynal；Oslo，Norway)和抗小鼠CD31(PharMingen；San Diego，California)分離血管內(nèi)皮細(xì)胞。如Hoffman等人，上文，2004所述，救援與CD31陽(yáng)性細(xì)胞群體結(jié)合的噬菌體并使其在大腸桿菌中擴(kuò)增。
如下進(jìn)行活體內(nèi)淘選。將經(jīng)活體外選擇的噬菌體集合(5×109p.f.u.)靜脈內(nèi)注入小鼠尾部靜脈，并使其循環(huán)10分鐘，然后用DMEM通過(guò)左心室小心地灌注小鼠以移除未結(jié)合的血管內(nèi)噬菌體。切除心臟和對(duì)照組織(大腦、腎、皮膚和肌肉)，并如Hoffman等人，上文，2004所述回收噬菌體。將從心臟回收的噬菌體再注入小鼠，并重復(fù)所述循環(huán)總共三次。將非重組噬菌體注入單獨(dú)小鼠以在各實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照。
為進(jìn)行細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)使用引物5′-TCAGGTGTGATGCTCGG-3′(SEQ ID NO36；正向引物)和5′-GAGTAACTAGTTAACC-3′(SEQ ID NO31；反向引物)對(duì)來(lái)自心臟錨定噬菌體的編碼肽的DNA插入物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建誘餌質(zhì)粒文庫(kù)。用EcoRI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，并將其亞克隆到誘餌pBT質(zhì)粒(Stratagene；La Jolla，CA)中以產(chǎn)生被稱(chēng)為“pBT-hp”的誘餌的重組文庫(kù)。將pBT-hp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XL1-Blue MRF′Kan感受態(tài)細(xì)胞中，并在100mm LB-氯霉素平板上涂布2μl或5μl細(xì)胞以確定主要轉(zhuǎn)化體的總數(shù)量。集中剩余轉(zhuǎn)化體并將其涂布在150mm LB-氯霉素平板上。對(duì)20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其具有適當(dāng)?shù)木幋a肽的插入物。然后刮削平板，并采集細(xì)菌。在涂布2μl和5μl所采集的文庫(kù)以確定經(jīng)擴(kuò)增文庫(kù)的大小之后，使用市面有售的maxiprep DNA柱從經(jīng)集中的細(xì)菌中純化pBT-hp質(zhì)粒集合。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)(Stratagene；La Jolla，CA)，使用經(jīng)純化DNA以轉(zhuǎn)化BacterioMatch雙雜交系統(tǒng)報(bào)告菌株感受態(tài)細(xì)胞。
將2μl含有小鼠心臟質(zhì)粒cDNA文庫(kù)(Stratagene；#982303)的細(xì)胞稀釋到25ml SOC培養(yǎng)基中，然后將細(xì)胞涂覆在25個(gè)25cm×25cm LB-四環(huán)素平板上，由此平板純化心臟cDNA文庫(kù)質(zhì)粒。將平板在30℃下培育24小時(shí)，然后采集大約5×106個(gè)單獨(dú)克隆并隨后進(jìn)行質(zhì)粒純化。
根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，用BacterioMatch雙雜交系統(tǒng)(Stratagene)進(jìn)行細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，使用50ng各種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染pBT-hp和心臟cDNA文庫(kù)質(zhì)粒。將共轉(zhuǎn)染體的等分試樣(100μl)涂布在選擇性LB平板上(500μg/ml羧芐青霉素(carbenicillin))并在37℃下培育20小時(shí)，然后對(duì)平板的生長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)分。如對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照Gal4和Gal11P雜交蛋白所觀察到的，在選擇性平板上的生長(zhǎng)表明在一對(duì)雜交蛋白之間存在相互作用。隨后，用來(lái)自羧芐青霉素平板的個(gè)別陽(yáng)性菌落在X-gal平板上劃線以進(jìn)行二級(jí)篩檢。在將細(xì)胞培育12到14小時(shí)后，選擇顯示X-gal平板呈深藍(lán)色的細(xì)胞，并且所述細(xì)胞能夠于30℃下在LB-氯霉素或LB-四環(huán)素(目標(biāo)和誘餌質(zhì)粒的標(biāo)記)的存在下生長(zhǎng)過(guò)夜。純化質(zhì)粒DNA，并用假定誘餌和靶質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化報(bào)告菌株。在選擇性平板上可再現(xiàn)地生長(zhǎng)的克隆被確定為陽(yáng)性。通過(guò)PCR擴(kuò)增誘餌和靶插入物，隨后進(jìn)行序列分析。使用來(lái)自靶載體的序列作為非冗余小鼠基因組的BLASTN搜尋中的查詢(xún)序列。
實(shí)例II受體-肽對(duì)和肽心臟錨定活性本實(shí)例描述通過(guò)用展示心臟錨定活性的肽集合進(jìn)行細(xì)菌雙雜交分析而被鑒別為心臟錨定肽的假定受體的由膜或細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白。
受體克降5如表1所總結(jié)，受體克隆5代表心臟LIM-蛋白(HLP)的羧基端92個(gè)氨基酸，其也被稱(chēng)為富半胱氨酸蛋白2(CRIP2)和ESP1。在血管心臟中表達(dá)(Yu等人，Mech.Dev.116187-192(2002))的HLP是與Crp-1具有同源性的含LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白(Karim等人，Genomics31167-176(1996)；和van Ham等人，Genes Cells8631-644(2003))。在來(lái)自用HLP克隆進(jìn)行的雙雜交分析的5個(gè)陽(yáng)性菌落中，鑒別三種同源肽CRPPR(SEQ ID NO1)存在兩次，CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)存在一次且CGNQVDSRC(SEQ ID NO3)存在兩次。在將這些肽克隆到T7Select 415-1展示載體中之后，檢定其在靜脈內(nèi)注射后錨定到心臟脈管系統(tǒng)的能力。相對(duì)于非重組噬菌體，展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體以超過(guò)300倍的選擇性錨定到心臟(圖2A)。如表1所總結(jié)，CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)噬菌體在心臟錨定中展示約50倍的選擇性，而對(duì)于展示CGNQVDSRC(SEQ ID NO3)的噬菌體未觀察到顯著的選擇性錨定。
受體克隆9受體克隆9也被鑒別為與一種或一種以上心臟錨定肽結(jié)合的膜蛋白。如表1所示，受體克隆9是未注解的RIKEN EST。在通過(guò)用受體克隆9進(jìn)行的雙雜交分析鑒別的5個(gè)群落中，鑒別到三種肽，即CPSELLLP(SEQ ID NO4)、CARPAR(SEQ ID NO5)和CPKRPR(SEQ ID NO6)。后兩種肽展現(xiàn)對(duì)心臟的選擇性錨定，但第一種卻沒(méi)有(表1和圖2B)。
受體克隆15受體克隆15是被稱(chēng)為Sigirr或TIR8的單一Ig IL-1受體相關(guān)蛋白(Thomassen等人，Cytokine11389-399(1999))?？寺?5所代表的蛋白部分含有Sigirr的跨膜結(jié)構(gòu)域以及約190個(gè)氨基酸的氨基端胞外部分。已知Sigirr在腎、肺、腸和其它組織的上皮中表達(dá)(Thomassen等人，上文，1999；和Polentarutti等人，Eur.Cytokine Netw.14211-218(2003))，盡管尚未報(bào)導(dǎo)心臟或內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。如表1所總結(jié)，三種肽通過(guò)雙雜交分析被鑒別為結(jié)合Sigirr。這些肽CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)和RGSSS(SEQ ID NO9)展示20到30倍的心臟錨定選擇性(參看表1和圖2C)。
受體克隆27受體克隆27為假定蛋白，其被注解為含有經(jīng)確定來(lái)自嗅覺(jué)cDNA文庫(kù)的蛋白的富谷氨酰胺區(qū)域。所有經(jīng)分析的五種誘餌克隆都編碼相同的肽CLIDLHVMC(SEQ ID NO10)，其不展示與心臟的特異性錨定(表1和圖2D)。
受體克隆36受體克隆36含有來(lái)自RIKEN Fantom套組的未命名蛋白產(chǎn)物的完整編碼序列。這種受體經(jīng)假定與內(nèi)在膜蛋白CII-3(MpcII-3)類(lèi)似，MpcII-3是作為琥珀酸脫氫酶復(fù)合體的部分的線粒體膜蛋白。通過(guò)與克隆36的結(jié)合活性鑒別的5種經(jīng)測(cè)序群落中的每一種都編碼相同的肽CRSTRANPC(SEQ ID NO5)，其展示約20倍的心臟錨定選擇性(表1和圖2E)。
受體克隆46受體克隆46是人類(lèi)膀胱癌相關(guān)蛋白10的小鼠同系物(bc10)的一部分，bc10是隨著從膀胱中的前惡性病變發(fā)展癌癥而下調(diào)的小膜蛋白。作為受體克隆46分離的片段含有bc10的預(yù)測(cè)胞外結(jié)構(gòu)域的羧基端32個(gè)氨基酸。雙雜交分析確定兩種結(jié)合受體克隆46的肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)和CSGMARTKC(SEQ ID NO13)，其分別展示約60倍和10倍的心臟錨定選擇性(表1和圖2F)。
總而言之，這些結(jié)果表明結(jié)合活體內(nèi)淘選的細(xì)菌雙雜交分析可用于鑒別器官錨定肽和其同源受體。
如下重建個(gè)別噬菌體克隆。合成編碼來(lái)自所選誘餌質(zhì)粒的肽的寡核苷酸，在37℃下用T4多核苷酸激酶(PNK；NEB)磷酸化1小時(shí)，并在0.08pmol/μl的濃度下退火。將經(jīng)退火的插入物稀釋到0.04pmol/μl并在16℃下用T4連接酶連接到T7Select 415-1側(cè)臂(Novagen)中過(guò)夜。次日，通過(guò)如制造商所述將連接反應(yīng)物與包裝提取物混合來(lái)制備完整的重組噬菌體。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入物，并擴(kuò)增個(gè)別克隆以用于如上文實(shí)例I所述的活體外和活體內(nèi)測(cè)試。
實(shí)例III噬菌體展示的心臟錨定肽定位到心臟脈管系統(tǒng)中本實(shí)例證明選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的所公開(kāi)肽特異性結(jié)合由心臟脈管系統(tǒng)活體內(nèi)表達(dá)的受體。
A.噬菌體展示的心臟錨定肽與血管標(biāo)記協(xié)同定位對(duì)如表1所總結(jié)的選擇性倍數(shù)所表明的5種最有效的錨定肽和其假定受體進(jìn)行進(jìn)一步表征。分析這些錨定肽在活體內(nèi)選擇性結(jié)合心臟內(nèi)皮的能力和其與其假定受體的特異性結(jié)合，還分析所述假定受體在心臟內(nèi)皮中的表達(dá)。將展示特定錨定肽的噬菌體中的每一種都單獨(dú)靜脈內(nèi)注入具有熒光素結(jié)合番茄凝集素以作為血管標(biāo)記的小鼠中。噬菌體與抗T7抗體的定位表明展示肽CRPPR(SEQ ID NO1)、CARPAR(SEQ ID NO5)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)的噬菌體存在于心臟內(nèi)皮中(圖3A到C、E和F)。展示CLIDLHVMC(SEQ ID NO10)的噬菌體是用作陰性對(duì)照(圖3D)，且通過(guò)噬菌體免疫染色發(fā)現(xiàn)其也不存在于心臟中(圖3D)。在相同條件下在除心臟以外的組織中未檢測(cè)到6個(gè)噬菌體中的任一個(gè)。
這些結(jié)果證實(shí)展示肽CRPPR(SEQ ID NO1)、CARPAR(SEQ ID NO5)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)的噬菌體在活體內(nèi)定位到心臟脈管系統(tǒng)。
如下進(jìn)行免疫組織化學(xué)。從BD Pharmingen(San Jose，CA)獲得大鼠單克隆抗小鼠CD31(1∶100)，并從GenWay(San Diego，CA)獲得兔多克隆抗T7噬菌體(1∶500)和雞抗小鼠CRIP2 IgY(1∶100)。從Molecular Probes(Eugene，OR)獲得二級(jí)抗體AlexaFluor-488山羊抗大鼠IgG(1∶1000)和AlexaFluor-594山羊抗大鼠或兔IgG(1∶1000)，并從GenWay獲得二級(jí)抗體GAYFC-AlexaFluor 594山羊抗IgY Fc(1∶250)。將冷凍切片與阻斷緩沖液(1×PBS中的5％正常山羊血清和0.5％BSA)一起預(yù)培育1小時(shí)，用PBS洗滌三次并與所關(guān)注的一級(jí)抗體在4℃下一起培育過(guò)夜。在培育過(guò)夜后，加入二級(jí)抗體并在室溫下培育1小時(shí)。用PBS洗滌玻片三次并將其固定在具有DAPI的Vectashield封片劑(Mounting Medium)中(Vector Laboratories；Burlingame，California)。通過(guò)靜脈內(nèi)注射購(gòu)自Vector Laboratories的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素結(jié)合熒光素(200μlPBS中的100μg)另外觀察血管。
B.與經(jīng)錨定肽的假定同源受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合的錨定肽構(gòu)建四種假定心臟錨定受體HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10的全長(zhǎng)cDNA，并在293T細(xì)胞中表達(dá)。如圖4所示，展示所述四種同源肽中的每一種的噬菌體與經(jīng)其對(duì)應(yīng)假定受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合，這比對(duì)照噬菌體高出300到500倍(帶點(diǎn)條形圖)。另外，噬菌體結(jié)合在100μg/ml的同源肽存在下受到抑制(實(shí)心條形圖)，但不受無(wú)關(guān)錨定肽抑制(空心條形圖)。這些結(jié)果證實(shí)錨定肽CRPPR(SEQ ID NO1)特異性結(jié)合受體HLP/CRIP2；錨定肽CKRAVR(SEQ ID NO7)特異性結(jié)合受體Sigirr/TIR8；錨定肽CRSTRANPC(SEQ ID NO11)特異性結(jié)合MpcII-3相關(guān)蛋白受體；且錨定肽CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)特異性結(jié)合受體bc10。
如下進(jìn)行受體轉(zhuǎn)染和噬菌體結(jié)合檢定。使用Fugene轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics)，以編碼HLP/CRIP2、Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10的來(lái)源于pMH6的質(zhì)粒(RocheDiagnostics；Indianapolis，IN)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將10μg質(zhì)粒與700μl無(wú)血清DMEM和30μl Fugene轉(zhuǎn)染試劑混合并在室溫下培育15分鐘，然后將混合物加入細(xì)胞中。48小時(shí)后，使用EDTA從培養(yǎng)皿分離細(xì)胞并用PBS洗滌一次。將展示CRPPR(SEQ ID NO1)、CKRAVR(SEQ ID NO7)、CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或CPKTRRVPC(SEQID NO12)的噬菌體和非重組對(duì)照噬菌體(1×109p.f.u)與經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在4℃下一起培育2小時(shí)。通過(guò)用PBS中的1％BSA洗滌五次來(lái)移除未結(jié)合的噬菌體。通過(guò)加入細(xì)菌來(lái)救援結(jié)合的噬菌體，如上所述由空斑檢定來(lái)確定結(jié)合效率。
在固相合成儀中使用Fmoc化學(xué)在The Burnham Institute肽設(shè)備上合成用于競(jìng)爭(zhēng)檢定的肽，隨后通過(guò)HPLC純化并通過(guò)質(zhì)譜分析確定其身份。如Wender等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9713003-13008(2000)中所述，合成熒光素結(jié)合肽。通過(guò)向細(xì)胞和噬菌體中加入100μg肽來(lái)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)檢定，隨后在4℃下培育2小時(shí)。在用1％PBS洗滌五次后，救援結(jié)合的噬菌體并通過(guò)空斑檢定進(jìn)行量化。
C.受體mRNA存在于心臟內(nèi)皮中使用實(shí)時(shí)PCR和原位雜交在組織內(nèi)研究心臟錨定受體的表達(dá)。實(shí)時(shí)PCR分析(圖5A)展示肽SEQ ID NO1的受體HLP/CRIP2在心臟中高度表達(dá)并在肺和大腦中以較低程度表達(dá)。包括骨骼肌的若干其它組織對(duì)HLP/CRIP2mRNA呈陰性。其它心臟錨定受體Sigirr/TIR8、MpcII-3相關(guān)蛋白和bc10也在心臟中最高程度地表達(dá)，而在其它組織中以較低程度表達(dá)(圖5A)。通過(guò)結(jié)合熔解曲線和DNA序列分析的凝膠電泳(圖5B)來(lái)證實(shí)RT-PCR分析的特異性。
使用原位雜交確認(rèn)RT-PCR分析并確定所關(guān)注的受體是否在心臟和其它組織的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。如圖5C第一行所示，在心臟中存在大量HLP/CRIP2信號(hào)且其展現(xiàn)血管表達(dá)圖樣(圖5C；第一行)。在肺和大腦中也觀察到痕量級(jí)表達(dá)，但在腎中沒(méi)有觀察到表達(dá)。雖然原位雜交在肺中檢測(cè)到HLP/CRIP2 mRNA表達(dá)，但是在這一組織中僅檢測(cè)到很少的CRPPR(SEQ ID NO1)噬菌體錨定(參看上文)。
Sigirr/TIR8原位雜交分析也證實(shí)RT-PCR結(jié)果。信號(hào)在心臟脈管系統(tǒng)中很強(qiáng)(圖5，第二行)，在肺和腎中較弱且在大腦中沒(méi)有。MpcII-3相關(guān)蛋白mRNA存在于心臟中，主要是在心血管中(圖5，第三行)。MpcII-3相關(guān)蛋白mRNA也存在于一些肺血管中，盡管其并不存在于大腦和腎中。如圖5C最后一行另外所示，bc10 mRNA存在于心血管中并另外存在于一些肺、腎和肌肉血管中，但不存在于大腦血管中?？偠灾?，原位雜交結(jié)果很大程度上證實(shí)以下RT-PCR結(jié)果四種心臟錨定受體都在心臟中最充足地表達(dá)。此外，四種心臟錨定受體的mRNA定位在心臟內(nèi)皮上，這與選擇性錨定到肺脈管系統(tǒng)的所公開(kāi)的肽的定位一致。
基本上如St Croix等人，Science2891197-1202(2000)所述進(jìn)行非放射性原位雜交。簡(jiǎn)言之，使用并入反義引物中的SP6啟動(dòng)子和并入正義引物中的T7啟動(dòng)子，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生經(jīng)地高辛(digoxigenin，DIG)標(biāo)記的反義RNA探針。用DIG RNA標(biāo)記試劑和T7 RNA聚合酶(Roche Diagnostics)進(jìn)行活體外轉(zhuǎn)錄。用4％多聚甲醛固定冷凍組織切片，用胃蛋白酶滲透并與RNA探針(200ng/ml)一起在55℃下培育過(guò)夜。使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)兔抗DIG抗體(DAKO；Carpinteria，CA)來(lái)催化使用GenPoint試劑盒的生物素-酪胺(Biotin-Tyramide)沉積以用于信號(hào)擴(kuò)增(DAKO)。通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)兔抗生物素(DAKO)、生物素-酪胺和堿性磷酸酶(AP)兔抗生物素(DAKO)來(lái)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)增。在用蘇木精復(fù)染色的組織切片中，以AP substrate Fast RedTR/Napthol AS-MX(Sigma)檢測(cè)信號(hào)。
基本上如Galang等人，J.Biol.Chem.27911281-11292(2004)所述進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢定。簡(jiǎn)言之，用RNeasy試劑盒(Qiagen；Valencia，CA)從所關(guān)注的器官中提取總RNA，并使用Superscript II First-Strand Synthesis System試劑盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)從50ng總RNA制備cDNA。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用LightCycler SYBRgreen DNA master mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。為進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，使用控制基因磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)的含量使受體表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。將各受體的心臟中GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)定義為100％，且將其用作比較基礎(chǔ)。通過(guò)各PCR產(chǎn)物的熔解曲線以及瓊脂糖凝膠電泳和DNA序列分析來(lái)確認(rèn)實(shí)時(shí)PCR的特異性。
實(shí)例IV靜脈內(nèi)注射的CRPPR(SEO ID NO1)肽與HLP/CRIP2蛋白在心血管中協(xié)同定位本實(shí)例展現(xiàn)肽CRPPR(SEQ ID NO1)與其同源受體HLP/CRIP2的協(xié)同定位。
使用抗HLP/CRIP2抗體，將心臟中CRPPR(SEQ ID NO1)肽的定位與HLP/CRIP2受體的表達(dá)相比較。如圖6A和6B所示，來(lái)自靜脈內(nèi)注射的CRPPR(SEQ ID NO1)肽的熒光與血管標(biāo)記CD31在心血管和心內(nèi)膜中廣泛地協(xié)同定位。此外，在心臟中未檢測(cè)到經(jīng)熒光素標(biāo)記的對(duì)照肽(圖6C)?？笻LP/CRIP2染色也與CD31和肽CRPPR(SEQ IDNO1)在心血管和心臟心內(nèi)膜中協(xié)同定位(圖6D到6F)。
使用競(jìng)爭(zhēng)檢定來(lái)檢定與心臟脈管系統(tǒng)結(jié)合的CRPPR(SEQ ID NO1)-噬菌體的特異性。如圖7A和7B所示，CRPPR(SEQ ID NO1)肽和抗HLP/CRIP2抗體以劑量依賴(lài)方式阻斷展示CRPPR(SEQ ID NO1)的噬菌體與心臟來(lái)源的細(xì)胞懸浮液的結(jié)合。作為陰性對(duì)照，兩種其它心臟錨定肽對(duì)CRPPR(SEQ ID NO1)-噬菌體結(jié)合不具有任何作用。此外，共注射的抗HLP/CRIP2抗體也抑制CRPPR(SEQ ID NO1)-噬菌體的活體內(nèi)錨定(圖7C)?？偠灾@些結(jié)果證明肽CRPPR(SEQ ID NO1)經(jīng)由特異性結(jié)合到HLP/CRIP2上而選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)。
上文以括號(hào)或以其它方式提供的所有期刊論文、參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利引證無(wú)論先前是否說(shuō)明都以全文引用的方式并入本文。
雖然已經(jīng)參考上文所提供的實(shí)例描述本發(fā)明，但是應(yīng)了解可在不偏離本發(fā)明精神的情況下作出各種修改。因此，本發(fā)明僅受以下權(quán)利要求書(shū)限制。
序列表<110>伯納姆研究院<120>選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)上的肽和相關(guān)結(jié)合物和方法<130>66821-331<150>US 10/936,027<151>2004-09-07<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>1Cys Arg Pro Pro Arg1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>2Cys Gly Arg Lys Ser Lys Thr Val Cys1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<400>3Cys Gly Asn Gln Val Asp Ser Arg Cys1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>4Cys Pro Ser Glu Leu Leu Leu Pro1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>5Cys Ala Arg Pro Ala Arg1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>6Cys Pro Lys Arg Pro Arg1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>7Cys Lys Arg Ala Val Arg1 5<210>8
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>8Cys Arg Asn Ser Trp Lys Pro Asn Cys1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>9Arg Gly Ser Ser Ser1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>10Cys Leu Ile Asp Leu His Val Met Cys1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>11Cys Arg Ser Thr Arg Ala Asn Pro Cys1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>12Cys Pro Lys Thr Arg Arg Val Pro Cys1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>13Cys Ser Gly Met Ala Arg Thr Lys Cys1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>14Gly Arg Lys Ser Lys Thr Val1 5<210>15<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<221>VARIANT<222>2，10<223>Xaa＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基<400>15Cys Xaa Gly Arg Lys Ser Lys Thr Val Xaa Cys1 5 10<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體
<400>16Arg Asn Ser Trp Lys Pro Asn1 5<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<221>VARIANT<222>2，10<223>Xaa＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基<400>17Cys Xaa Arg Asn Ser Trp Lys Pro Asn Xaa Cys1 5 10<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>18Arg Ser Thr Arg Ala Asn Pro1 5<210>19<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<221>VARIANT<222>2，10<223>Xaa＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基<400>19Cys Xaa Arg Ser Thr Arg Ala Asn Pro Xaa Cys1 5 10<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>20Pro Lys Thr Arg Arg Val Pro1 5<210>21<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<221>VARIANT<222>2，10<223>Xaa＝1到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基<400>21Cys Xaa Pro Lys Thr Arg Arg Val Pro Xaa Cys1 5 10<210>22<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>22Ser Gly Met Ala Arg Thr Lys1 5<210>23<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<221>VARIANT<222>2，10<223>Xaa＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基<400>23Cys Xaa Ser Gly Met Ala Arg Thr Lys Xaa Cys1 5 10<210>24
<211>1174<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(40)...(666)<400>24cggacgcgtg ggtccgcgga ccgaccgagc gcaccgacc atg gcc tcc aag tgt54Met Ala Ser Lys Cys1 5ccc aag tgt gac aag acc gta tac ttc gct gag aag gtg agc tcc ctg102Pro Lys Cys Asp Lys Thr Val Tyr Phe Ala Glu Lys Val Ser Ser Leu10 15 20ggc aag gac tgg cac aag ttc tgt ctc aag tgt gag cgc tgc aac aag150Gly Lys Asp Trp His Lys Phe Cys Leu Lys Cys Glu Arg Cys Asn Lys25 30 35aca ctg acc ccc ggc ggc cat gct gag cat gat ggg aag ccc ttc tgc198Thr Leu Thr Pro Gly Gly His Ala Glu His Asp Gly Lys Pro Phe Cys40 45 50cac aag ccc tgc tat gcc aca ctg ttt gga ccc aaa ggc gtg aac atc246His Lys Pro Cys Tyr Ala Thr Leu Phe Gly Pro Lys Gly Val Asn Ile55 60 65ggg ggc gct ggc tcc tac atc tac gag aag cct cag acc gag gcc cct294Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Ile Tyr Glu Lys Pro Gln Thr Glu Ala Pro70 75 80 85cag gtc act ggc ccc atc gag gtc cct gtg gtg aga act gag gag cga342Gln Val Thr Gly Pro Ile Glu Val Pro Val Val Arg Thr Glu Glu Arg90 95 100aag acc agc ggc ccc ccc aag ggt ccc agc aaa gcc tct agt gtc acc390Lys Thr Ser Gly Pro Pro Lys Gly Pro Ser Lys Ala Ser Ser Val Thr105 110 115aca ttc act ggg gag ccc aac atg tgt cct cga tgc aac aag aga gtg438Thr Phe Thr Gly Glu Pro Asn Met Cys Pro Arg Cys Asn Lys Arg Val120 125 130tac ttc gct gag aag gtg acc tct ctg ggc aag gac tgg cac cgg ccc486Tyr Phe Ala Glu Lys Val Thr Ser Leu Gly Lys Asp Trp His Arg Pro135 140 145tgc ctg cgc tgt gag cgc tgc tcc aag acc ctg acc cca ggc ggg cat534Cys Leu Arg Cys Glu Arg Cys Ser Lys Thr Leu Thr Pro Gly Gly His150 155 160 165
gct gag cac gat ggc cag ccc tac tgc cac aag cct tgc tat gga ata 582Ala Glu His Asp Gly Gln Pro Tyr Cys His Lys Pro Cys Tyr Gly Ile170 175 180ctc ttt gga ccc aaa gga gtg aat act ggt gct gtg ggc agc tat atc 630Leu Phe Gly Pro Lys Gly Val Asn Thr Gly Ala Val Gly Ser Tyr Ile185 190 195tac gac aag gac ccg gaa ggc aca gtt cag ccc tag atctgcagat 676Tyr Asp Lys Asp Pro Glu Gly Thr Val Gln Pro *200 205gctgtcctcg gggtccccct gtttgacccg gaggcaaagt ggcctgttgc ctagtcctgc736ctcagcgtgt ctcgcctgca aatccgggac ctaagtggtg gaggagaaag cctggatagt796cccagagctt cagccccctt tgtcaccttg gcgtgtcccg tgctgcccac cgtttacttc856ctgtctgtgt gcctccgtag ccccatgggt cctgtgttcc tgtgtccctg atagctctcc916aaggtgactg tcctatgata tatccctttg cccacacctg cccaccagta ttatttatgc976tctgcttgcc ggtgatggcc gtgagctcac agcattccca gggtgatggc tggtgccctt1036gcgaggagcc ctctgctggt tccacactac tccctaccta ccctcacatg gttcatggct1096atggagactt ttgctgtcaa taaatagttt ggtttgagga ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa1156aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1174<210>25<211>208<212>PRT<213>小家鼠<400>25Met Ala Ser Lys Cys Pro Lys Cys Asp Lys Thr Val Tyr Phe Ala Glu1 5 10 15Lys Val Ser Ser Leu Gly Lys Asp Trp His Lys Phe Cys Leu Lys Cys20 25 30Glu Arg Cys Asn Lys Thr Leu Thr Pro Gly Gly His Ala Glu His Asp35 40 45Gly Lys Pro Phe Cys His Lys Pro Cys Tyr Ala Thr Leu Phe Gly Pro50 55 60Lys Gly Val Asn Ile Gly Gly Ala Gly Ser Tyr Ile Tyr Glu Lys Pro65 70 75 80Gln Thr Glu Ala Pro Gln Val Thr Gly Pro Ile Glu Val Pro Val Val85 90 95Arg Thr Glu Glu Arg Lys Thr Ser Gly Pro Pro Lys Gly Pro Ser Lys100 105 110Ala Ser Ser Val Thr Thr Phe Thr Gly Glu Pro Asn Met Cys Pro Arg115 120 125Cys Asn Lys Arg Val Tyr Phe Ala Glu Lys Val Thr Ser Leu Gly Lys130 135 140Asp Trp His Arg Pro Cys Leu Arg Cys Glu Arg Cys Ser Lys Thr Leu145 150 155 160Thr Pro Gly Gly His Ala Glu His Asp Gly Gln Pro Tyr Cys His Lys165 170 175Pro Cys Tyr Gly Ile Leu Phe Gly Pro Lys Gly Val Asn Thr Gly Ala180 185 190Val Gly Ser Tyr Ile Tyr Asp Lys Asp Pro Glu Gly Thr Val Gln Pro
195 200 205<210>26<211>1276<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(16)...(840)<400>26ccagctcaga gcagg atg gcg gcg aca atg tct gaa cct cgg cgt gtg ggc 51Met Ala Ala Thr Met Ser Glu Pro Arg Arg Val Gly1 5 10ttc gtg ggt gca ggc cgc atg gcg gag gcc att gcc cga ggc ctc atc99Phe Val Gly Ala Gly Arg Met Ala Glu Ala Ile Ala Arg Gly Leu Ile15 20 25caa gca ggc aaa gta gaa gct aaa caa gtg ctg gcc agt gca cca acg147Gln Ala Gly Lys Val Glu Ala Lys Gln Val Leu Ala Ser Ala Pro Thr30 35 40gac aac aac ctc tgc cac ttc agg gct ctg ggt tgc cag act act cac195Asp Asn Asn Leu Cys His Phe Arg Ala Leu Gly Cys Gln Thr Thr His45 50 55 60tcc aac cat gag gtg ctg caa aac tgc cca ctt gtc atc ttt gcc acc243Ser Asn His Glu Val Leu Gln Asn Cys Pro Leu Val Ile Phe Ala Thr65 70 75aaa ccc caa gtc ctg cca act gtc ctg gcg gaa gtg gcc ccc ata gtc291Lys Pro Gln Val Leu Pro Thr Val Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Val80 85 90acc act gag cac atc atc gta tct gtg gct gct ggg atc tct ctg agc339Thr Thr Glu His Ile Ile Val Ser Val Ala Ala Gly Ile Ser Leu Ser95 100 105aca atg gag ggg ctg tta ccc ccg aac aca cga gta ttg cga gtc tct387Thr Met Glu Gly Leu Leu Pro Pro Asn Thr Arg Val Leu Arg Val Ser110 115 120ccc aat cta ccc tgc gtt gtc cag gag ggg gcc atg gtg atg gcc cgg435Pro Asn Leu Pro Cys Val Val Gln Glu Gly Ala Met Val Met Ala Arg125 130 135 140ggc cac cat gct ggg aac gat gac gca gag ctc cta cag aac ttg ctg483Gly His His Ala Gly Asn Asp Asp Ala Glu Leu Leu Gln Asn Leu Leu145 150 155gaa gcc tgt ggg cag tgc ata gag gtt ccc gag tcc tac gta gat atc531
Glu Ala Cys Gly Gln Cys Ile Glu Val Pro Glu Ser Tyr Val Asp Ile160 165 170cac acc ggt ctc agt ggc agt ggt gtg gcc ttt gtg tgt aca ttt tca579His Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Val Ala Phe Val Cys Thr Phe Ser175 180 185gag gcc ctg gct gaa ggt gcc atc aaa atg ggc atg ccc agt ggc ctg627Glu Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ile Lys Met Gly Met Pro Ser Gly Leu190 195 200gcc cac cgc att gct gct cag acc ctg ctg ggg aca gcc aag atg ctg675Ala His Arg Ile Ala Ala Gln Thr Leu Leu Gly Thr Ala Lys Met Leu205 210 215 220cag cag gaa ggg aag cac cca gcc cag ctt cgg aca gat gtg ctc aca723Gln Gln Glu Gly Lys His Pro Ala Gln Leu Arg Thr Asp Val Leu Thr225 230 235cca gct gga acc acc atc cat ggg ttg cat gcc cta gag cgg ggc ggt771Pro Ala Gly Thr Thr Ile His Gly Leu His Ala Leu Glu Arg Gly Gly240 245 250ttt cga gcg gct acc atg agt gcg gtg gaa gca gct acc tgc cgg gct819Phe Arg Ala Ala Thr Met Ser Ala Val Glu Ala Ala Thr Cys Arg Ala255 260 265aag gag ctc agc aag aag taa ggcaggcctc agatgagact acgggctcct 870Lys Glu Leu Ser Lys Lys *270tgcccagctg cagcctctgt ggtgagaata gccctggacg ggagatgtag tgggcagtcc 930tctaagtgga atggctaatt tatccaagaa gcggtgacta cttgtaagat gctatcaaga 990cggggttgcc ttgactgtga cattcagtca aggaagaatc gcttgcccct tacctgagat 1050tccagatcct cccttctgca cctcctggcc agttgcagtt gtgtcctcat ggtcacagga 1110gctggtagaa tatgtctcct gtggaggtgg tagacatcat cctccatgct ggcgtgagac 1170gtctttggtt gtggctgctt tgggatcacc cacactccgt aagcagcgcc ccgtccatat 1230tctctaagcc caataaactc attggttctc taaaaaaaaa aaaaaa 1276<210>27<211>274<212>PRT<213>小家鼠<400>27Met Ala Ala Thr Met Ser Glu Pro Arg Arg Val Gly Phe Val Gly Ala1 5 10 15Gly Arg Met Ala Glu Ala Ile Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ala Gly Lys20 25 30Val Glu Ala Lys Gln Val Leu Ala Ser Ala Pro Thr Asp Asn Asn Leu35 40 45Cys His Phe Arg Ala Leu Gly Cys Gln Thr Thr His Ser Asn His Glu50 55 60
Val Leu Gln Asn Cys Pro Leu Val Ile Phe Ala Thr Lys Pro Gln Val65 70 75 80Leu Pro Thr Val Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Val Thr Thr Glu His85 90 95Ile Ile Val Ser Val Ala Ala Gly Ile Ser Leu Ser Thr Met Glu Gly100 105 110Leu Leu Pro Pro Asn Thr Arg Val Leu Arg Val Ser Pro Asn Leu Pro115 120 125Cys Val Val Gln Glu Gly Ala Met Val Met Ala Arg Gly His His Ala130 135 140Gly Asn Asp Asp Ala Glu Leu Leu Gln Asn Leu Leu Glu Ala Cys Gly145 150 155 160Gln Cys Ile Glu Val Pro Glu Ser Tyr Val Asp Ile His Thr Gly Leu165 170 175Ser Gly Ser Gly Val Ala Phe Val Cys Thr Phe Ser Glu Ala Leu Ala180 185 190Glu Gly Ala Ile Lys Met Gly Met Pro Ser Gly Leu Ala His Arg Ile195 200 205Ala Ala Gln Thr Leu Leu Gly Thr Ala Lys Met Leu Gln Gln Glu Gly210 215 220Lys His Pro Ala Gln Leu Arg Thr Asp Val Leu Thr Pro Ala Gly Thr225 230 235 240Thr Ile His Gly Leu His Ala Leu Glu Arg Gly Gly Phe Arg Ala Ala245 250 255Thr Met Ser Ala Val Glu Ala Ala Thr Cys Arg Ala Lys Glu Leu Ser260 265 270Lys Lys<210>28<211>1568<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(120)...(1349)<400>28ctacagaaag gagcccttct cagcctgcag tggaccccat ctgctcggtt aaggagccac 60ggcggtgcca gggagggaaa ccagcgtttg gcctgccgtg aagaggtccc agaagagcc119atg gca ggt gtc tgt gac atg gcc cct aat ttc ctt tcc cca tct gaa 167Met Ala Gly Val Cys Asp Met Ala Pro Asn Phe Leu Ser Pro Ser Glu1 5 10 15gac cag gcc ttg ggt ctt gcc ctt ggc aga gaa gtt gct ttg aat tgc 215Asp Gln Ala Leu Gly Leu Ala Leu Gly Arg Glu Val Ala Leu Asn Cys20 25 30aca gct tgg gtg ttc tct agg ccc cag tgt ccc cag cca tca gtg cag 263Thr Ala Trp Val Phe Ser Arg Pro Gln Cys Pro Gln Pro Ser Val Gln35 40 45
tgg ctg aaa gat ggt ctg gca ttg ggc aat gga agc cac ttc agc ctc311Trp Leu Lys Asp Gly Leu Ala Leu Gly Asn Gly Ser His Phe Ser Leu50 55 60cat gag gac ttc tgg gtc agc gcc aac ttc tca gag att gtg tcc agt359His Glu Asp Phe Trp Val Ser Ala Asn Phe Ser Glu Ile Val Ser Ser65 70 75 80gtc ctg gtg ctc aac ttg acc aat gca gag gac tat gga acc ttc acc407Val Leu Val Leu Asn Leu Thr Asn Ala Glu Asp Tyr Gly Thr Phe Thr85 90 95tgt tct gtc tgg aat gtc agc tcc cat tcc ttc act ctt tgg cga gct455Cys Ser Val Trp Asn Val Ser Ser His Ser Phe Thr Leu Trp Arg Ala100 105 110ggc cct gct ggc cat gtg gct gca gta ctg gct tcc ctc ctg gtc ctg503Gly Pro Ala Gly His Val Ala Ala Val Leu Ala Ser Leu Leu Val Leu115 120 125gtg gtt ctg ctg ctg gtg gcc ctg ctc tat gtt aag tgt cgg ctg aac551Val Val Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Tyr Val Lys Cys Arg Leu Asn130 135 140atg ctg ctt tgg tac caa gac act tac ggg gag gtg gag atg aac gat599Met Leu Leu Trp Tyr Gln Asp Thr Tyr Gly Glu Val Glu Met Asn Asp145 150 155 160ggg aag tta tac gat gcc tac gtg tcc tat agc gac tgc cca gag gac647Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Val Ser Tyr Ser Asp Cys Pro Glu Asp165 170 175cgc aaa ttt gta aat ttt att ctg aag cct cag ttg gag cgg cgt cgg695Arg Lys Phe Val Asn Phe Ile Leu Lys Pro Gln Leu Glu Arg Arg Arg180 185 190gga tac aaa ctc ttc cta gag gac cgc gac ctc ttg cct cgc gcg gag743Gly Tyr Lys Leu Phe Leu Glu Asp Arg Asp Leu Leu Pro Arg Ala Glu195 200 205ccc tct gcc gac ctt ttg gtg aac ctg agt cgc tgt cgg cgt ctc atc791Pro Ser Ala Asp Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg Cys Arg Arg Leu Ile210 215 220gtg gtt ctt tca gat gcc ttc cta agc cgg ccc tgg tgt agc cag agc839Val Val Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ser Arg Pro Trp Cys Ser Gln Ser225 230 235 240ttc cgg gag gga ctg tgc cgc cta ctg gag ctc acc cgc aga cct atc887Phe Arg Glu Gly Leu Cys Arg Leu Leu Glu Leu Thr Arg Arg Pro Ile245 250 255ttc atc acc ttt gag ggc cag agg cgt gag ccc ata cac cct gct ctc935
Phe Ile Thr Phe Glu Gly Gln Arg Arg Glu Pro Ile His Pro Ala Leu260 265 270cgg ctc ctg cgc cag cac cgc cac ctc gtg acc ctg gtg ctt tgg aag983Arg Leu Leu Arg Gln His Arg His Leu Val Thr Leu Val Leu Trp Lys275 280 285cct ggc tcc gtg act cct tcc tct gat ttt tgg aaa gag cta cag cta1031Pro Gly Ser Val Thr Pro Ser Ser Asp Phe Trp Lys Glu Leu Gln Leu290 295 300gca ctg cca cgg aag gtg cag tac agg ccg gtg gag gga gac cct caa1079Ala Leu Pro Arg Lys Val Gln Tyr Arg Pro Val Glu Gly Asp Pro Gln305 310 315 320acc cga ctt cag gat gac aaa gat ccc atg cta atc gtg aga gga cgt1127Thr Arg Leu Gln Asp Asp Lys Asp Pro Met Leu Ile Val Arg Gly Arg325 330 335gct gcc cag ggc cgg ggc atg gag tca gag ctg gat cca gac cct gag1175Ala Ala Gln Gly Arg Gly Met Glu Ser Glu Leu Asp Pro Asp Pro Glu340 345 350gga gac ctg ggt gtc cgt gga cct gtc ttt ggg gag cca cca act cca1223Gly Asp Leu Gly Val Arg Gly Pro Val Phe Gly Glu Pro Pro Thr Pro355 360 365ctg cag gaa acc agg atc tgc ata gga gag agc cac ggc agt gaa atg1271Leu Gln Glu Thr Arg Ile Cys Ile Gly Glu Ser His Gly Ser Glu Met370 375 380gat gtc tct gac ctc ggc tct cga aac tac agt gca cgg aca gac ttc1319Asp Val Ser Asp Leu Gly Ser Arg Asn Tyr Ser Ala Arg Thr Asp Phe385 390 395 400tac tgc ctc gtg tct gag gat gat gtg tag cccatatccc agcagcccag 1369Tyr Cys Leu Val Ser Glu Asp Asp Val *405accatgagat cacggtggca gcttccaggg tagaggcagc aggcactcct tcctaggatc 1429acaacccttg cctctatccc tgggcccctc aggaaaggag tgtggcccca gggtgtcaca 1489aaataaaatc ctgttggttc ctgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1549aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1568<210>29<211>409<212>PRT<213>小家鼠<400>29Met Ala Gly Val Cys Asp Met Ala Pro Asn Phe Leu Ssr Pro Ser Glu1 5 10 15Asp Gln Ala Leu Gly Leu Ala Leu Gly Arg Glu Val Ala Leu Asn Cys
20 25 30Thr Ala Trp Val Phe Ser Arg Pro Gln Cys Pro Gln Pro Ser Val Gln35 40 45Trp Leu Lys Asp Gly Leu Ala Leu Gly Asn Gly Ser His Phe Ser Leu50 55 60His Glu Asp Phe Trp Val Ser Ala Asn Phe Ser Glu Ile Val Ser Ser65 70 75 80Val Leu Val Leu Asn Leu Thr Asn Ala Glu Asp Tyr Gly Thr Phe Thr85 90 95Cys Ser Val Trp Asn Val Ser Ser His Ser Phe Thr Leu Trp Arg Ala100 105 110Gly Pro Ala Gly His Val Ala Ala Val Leu Ala Ser Leu Leu Val Leu115 120 125Val Val Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Tyr Val Lys Cys Arg Leu Asn130 135 140Met Leu Leu Trp Tyr Gln Asp Thr Tyr Gly Glu Val Glu Met Asn Asp145 150 155 160Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Val Ser Tyr Ser Asp Cys Pro Glu Asp165 170 175Arg Lys Phe Val Asn Phe Ile Leu Lys Pro Gln Leu Glu Arg Arg Arg180 185 190Gly Tyr Lys Leu Phe Leu Glu Asp Arg Asp Leu Leu Pro Arg Ala Glu195 200 205Pro Ser Ala Asp Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg Cys Arg Arg Leu Ile210 215 220Val Val Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ser Arg Pro Trp Cys Ser Gln Ser225 230 235 240Phe Arg Glu Gly Leu Cys Arg Leu Leu Glu Leu Thr Arg Arg Pro Ile245 250 255Phe Ile Thr Phe Glu Gly Gln Arg Arg Glu Pro Ile His Pro Ala Leu260 265 270Arg Leu Leu Arg Gln His Arg His Leu Val Thr Leu Val Leu Trp Lys275 280 285Pro Gly Ser Val Thr Pro Ser Ser Asp Phe Trp Lys Glu Leu Gln Leu290 295 300Ala Leu Pro Arg Lys Val Gln Tyr Arg Pro Val Glu Gly Asp Pro Gln305 310 315 320Thr Arg Leu Gln Asp Asp Lys Asp Pro Met Leu Ile Val Arg Gly Arg325 330 335Ala Ala Gln Gly Arg Gly Met Glu Ser Glu Leu Asp Pro Asp Pro Glu340 345 350Gly Asp Leu Gly Val Arg Gly Pro Val Phe Gly Glu Pro Pro Thr Pro355 360 365Leu Gln Glu Thr Arg Ile Cys Ile Gly Glu Ser His Gly Ser Glu Met370 375 380Asp Val Ser Asp Leu Gly Ser Arg Asn Tyr Ser Ala Arg Thr Asp Phe385 390 395 400Tyr Cys Leu Val Ser Glu Asp Asp Val405<210>30<211>2591<212>DNA
<213>小家鼠<400>30aaggccccct cctctggacc ctcctctccg gccagagtca ataccacacc tagatgacat60caccctgcca cccataggag ctcaggcttt tgcccatctg agggcgtgct ggccaggtgc120cggtggccac cttgtgcgca tgctcggtag ctgcacagtg cgcatgctcg gtagctgcac180aatgcatctt aggcagcgtc ctctctgacc cttgtgcaag accatcctgg tattggcgct240taggaaggtg taagcagcag agtctggtgt ccacaaaaag aaaaaaaaat gttttagtat300agtgagaagc aaaagagaaa caactccaat tgtccttgag cgacgaactt ccatggcaga360actttaggtc agtcacaaac agctccgttt tgaatacacg aaaccctcct tgtaccaacc420gccgcatgtg tatatccaga tgtgtgggta tacaactgtg gcgattccga attgcatttt480tttataacgc gatacgctga catattttag tgaaggtcag cagttttcta acttgtgcct540aagaattatt gggaaatgaa aatgcatttc tatctagttt cctggaaata tttctaccca600aaatagagaa gaaaagaagg aaagaaagaa agaaaaaaaa agaaaaggta gaagcatgcc660tatctgccac cgagtgatcc cctgcttaac ctaaacacca gcgatttgta gatggtaact720gcctttggaa aaatagcttc ttagtccaac gtgactgggg tcactggtac cccactgcag780gatttaatta tgacttctcc tatcccaagg aggtgaaatg tagcggggtg ggggtggggg840gaactgagga gtcatatagt ctggccaatg ttttcctcct tagtgattca ttatcttgaa900aacaccagtt ttgctccgcc ccccccccca atggcatctt ggaatccatc atcaagctag960tattgcgtcc tcaggaaaac atgggagcat gtggcttttg cagcgaggat gagcctgaac1020ttggagaaga tcaagaccat gcatggctca tcttcatgac agaggagtct ggtagggcca1080ccatggctcc catcacggcc tctcataggc aacacccaca ttttcagttt ggttctatga1140ctcgacccca tcaccacaca acaagatggc tcaggggttc cagtcaaggc ttccagaaac1200cagcctttct ctcttgggga aaggagggaa gccagttcta aaggtgctag atcatgtccc1260ttctgctgga gggtcaccag ggctgcacct ggtagtagtc ccatcttagc cccagaaggc1320tctcccagac aagggaacgc agtgaaacgg ccagccggca tccatcagcc actggactgg1380cctttgactc taacacggta gaaattagac cacgaaaggt attcatgtag tgctatggaa1440gattagaggc atgatccaca aaggagaagt agttttaaca gtcaacacag tgccgataac1500gatacctttg tttcctgtat atgacaagag acccttcact ttctaagcat gggcctgcct1560gtctttgagc atgcccaaga tgacaagagc aatggagcca agcagaaatg gcctgggcat1620ggtgacagct tctccaagga tacacataac tgactcagag gcaaatgtgg tctgtatccc1680ttctatggct ctgagttggg cgtccttggc ctcggatgca tctgactgta gccagcttcc1740atgggtcttg cccattctgg agacacacac ggtagataca cagagaagaa acaggtcttt1800tccctttggc tctgcatgat actgggatac tgagctgggc attccataat agtagcccat1860gccatgtcag ttacacacac acacacacaa atatttattc ttttagcagg cacaacctgc1920aggtataagt ttggttggcc acttagctct ccaagttagg acccgcctcc acagctgtac1980ctgctgaggg caggtactca gcaatacaga gttcgatgtg attatagaat gtggtgcagt2040atgttaggct gttgtggtca aagtggtagc aatgttagat ctatgtaccc tcattaggtg2100gactagagct ttgccctaat cagcctcgac cctgggcact tgaataaatc tccccatggc2160cctggcttcg tttctccatc acagacaccc atcacatatg gtaccccacc tgaattaagt2220tctgagatcc aggtggccag agctgctatg attcctctgc ctccatgctg ctatgatccg2280gacctctcgg catggaaacc cgagtctgtc tcccttccca ggctggggaa ctgcgccctc2340ccctcctgcc acagacagac ctgccaaaca gctctgttct tcatggagtc aggaggtcct2400gctggcctgc agcaactcag ttgccttggg ctgggactgc attcttgtga tgtctggatg2460ggtttggggc tggaggtcag gtactctggg attagctgaa gggggcacag tgttctttgt2520cctgcccctc cggttaactg tgctccatat ttgtgttgaa ctctaaaagc atattaaagt2580gaacctgagg g 2591<210>31<211>16<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>31gagtaactag ttaacc 16<210>32<211>3171<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(28)...(534)<400>32tgatttccgt ccaggccgga actcaag atg gct gcg ttc ttg ctg aga cat gtc 54Met Ala Ala Phe Leu Leu Arg His Val1 5agc cgt cac tgc ctc cga gcc cac ctg aat gct cag ctt tgt atc aga 102Ser Arg His Cys Leu Arg Ala His Leu Asn Ala Gln Leu Cys Ile Arg10 15 20 25aat gct gct cct ttg gga acc aca gct aag gag gag atg gag cgg ttc 150Asn Ala Ala Pro Leu Gly Thr Thr Ala Lys Glu Glu Met Glu Arg Phe30 35 40tgg aag aag aac acg agt tca aac cgt cct ctg tct ccc cat ttg act 198Trp Lys Lys Asn Thr Ser Ser Asn Arg Pro Leu Ser Pro His Leu Thr45 50 55atc tac aaa tgg tct ctt cct atg gca ctg tcc gtt tgc cac cga ggc 246Ile Tyr Lys Trp Ser Leu Pro Met Ala Leu Ser Val Cys His Arg Gly60 65 70tct gga ata gcc ttg agt gga ggg gtc tct ctt ttt ggc ctg tcg gca 294Ser Gly Ile Ala Leu Ser Gly Gly Val Ser Leu Phe Gly Leu Ser Ala75 80 85ctg ctg ctt cct ggg aac ttt gag tca tat ttg atg ttt gtg aag tcc 342Leu Leu Leu Pro Gly Asn Phe Glu Ser Tyr Leu Met Phe Val Lys Ser90 95 100 105ctg tgt ttg ggg cca aca ctg atc tac tcg gct aag ttt gtg ctt gtc 390Leu Cys Leu Gly Pro Thr Leu Ile Tyr Ser Ala Lys Phe Val Leu Val110 115 120ttc ccg ctc atg tac cac tca ctg aat ggg atc cga cac ttg cta tgg 438Phe Pro Leu Met Tyr His Ser Leu Asn Gly Ile Arg His Leu Leu Trp125 130 135gac cta gga aaa ggc ctg gca ata ccc cag gtc tgg ctg tct gga gtg 486
Asp Leu Gly Lys Gly Leu Ala Ile Pro Gln Val Trp Leu Ser Gly Val140 145 150gcg gtc gtg gtt ctt gct gtg ttg tcc tct ggc ggg ctg gcc gcc ctg 534Ala Val Val Val Leu Ala Val Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ala Ala Leu155 160 165tgaagagctg gagttcccag cacccctgta catcatcaaa ctgatttata ttcctgttta594tcactatccc cacccctccc ccccagcctc ccaggttctc ctgatttgtt tagatgccac654atgctttcaa tccccttgga gtgcagtaga gcggcttaaa gacctgttgt agtaagaaag714ggtcatcctc cctgggcctg ggagcccttg ctccggttcc acatttgact gatttgtgct774gagggtcagc tttccgctgc tttctgctga gacagtggaa acaatgccag ttctgtgacc834gccccgagtg ccactgcctg tgggctgctg gcttaaagga cacttctgtc cattggtcag894cttagggcct ttagcaccca caccgcgtga ctgagaggag agaggtggag gaggagggat954tgtcctgctc agctagaggg agataaagag cagcctggga gcttggagct cgagcctggg1014aacagataca gcttttgatg tatgaggaag atcaaaaaaa attgtattaa gtttctgttc1074tgtttttcat ttctaggaaa atacaccttt aatgtcatat tttctaatct aaattcttgt1134accatcttct ttggaaacga ttaaagtact actcatttta tgcttgactc tttggaatct1194agtgacaggt gggtagaaag ggtctaatct ctgcccctcc ctttggatct tggacattta1254caccctccag tatggaggga aatagtttgc ccaacaacta ccactgcgaa aaatgaggta1314atcacaacca agtagtggag agattttggt caaggaaaga acataagaag tcagctaagc1374atgcggggag cttttggggt gttgtagggc ccaggcctgt ggatggccag cttggtactt1434aagcagacca tttggttatg gacacctagc accagtggag gtggaggcta agggctaaat1494agatttgggg ggaggtaggg gaagtagaag agaatttttt aaaagcaggg caggattgga1554ggcatcagag ttcttgaaga tggatataca gtgggaaacg ttgcttcttt acccctactg1614aggccctgga tccttaccaa gggtgctttg tttgtggtgc taggggtcaa agccaggtcc1674ttgtgcgtgt tagcaagcgc tgtaccacta caccagttcc ctagccagga gtgctatttt1734gatagatttt tgccaactct ggagtaaaag ctccatcttg ggactagaga tttggttcca1794tgatcatatg cccaaggcct gtggttcagt ccccaccacc aagaaaaaca ctactccaag1854agattggtca gagcactgga ttggggagtg attgctgggt ggcagttaga caggaagaca1914gcatgaactc aaatccgtgg cagcagaggt gggctgggcc caggttaggt tgggttgagg1974gctgtttcat tagtctcttg aaatctgtag aaagggattc accatttatc cccaaatggc2034ctggaagtct tacccagact accttccagt tggtgtgatc ttgcttctgc ctcccgggtg2094catgttacca ccaccctcag ccctcagcct attcctgatc ccaagtagtg tttggcctca2154agcaacgatc actaccactc tcctctagac aggccccggg aggtctggtg gtgccaggaa2214ttcagcccag ggtcccatcc gtgctaggca agcactgaac ctgagtcagg ccttgccaag2274tacccagccc agcccagaca ggcctcgaac tgaccaccca tctgcttcag cctcccaagt2334agctggaatt acaggaccat gctaccacat gcgactgctg ggatgtcctg tagatttcat2394ccagcgtcaa tcaggttgtc cttagagtag agtcagagtt catggggaaa cacttttgct2454ttagacttgg caagggcatt aaattcaaca accagtgcca gaaagatgta tagacagggc2514aaaggtcaac atattggcag gctgggaaat taatgtggac atttttactt ttttttttga2574tggcttctta accagtgatt ggagggaagt aggtcgcctg gcttctttat ttttctcttt2634gtaagccggt ctgtaggctt atatatatat atatatatat ttttttttaa gatttattta2694tttattatat gtaagtacac tatagttgtc ttcagatacc ccagaagagg gcatcagatc2754tcattacaga tggttgtgaa ccaccatgtt gttgttagga tttgaactca ggaccttcag2814aagagcagac agtgctctta actgctgagc catctctcca gccctggctt atatctttta2874aaacctagtt taataagggc atttaaaggc tttaacctcc ctttctaacc taccacccag2934cagaggtagt gggaaggaaa ggttagtaac cagacatttt tacttcactg gtctgtcaag2994ataactcagc gggtgcaggc tctggccccc aagcctgagg acgcgagttt gatcccagga3054tccacgtgtc agaaggatcc accctccgta agctgtctct ggcttccacg tgcttgaggc3114acacctccat gcatacgtaa agtcaatgaa tgcgtgtaat aaaggcttgt gtgctct 3171<210>33
<211>169<212>PRT<213>小家鼠<400>33Met Ala Ala Phe Leu Leu Arg His Val Ser Arg His Cys Leu Arg Ala1 5 10 15His Leu Asn Ala Gln Leu Cys Ile Arg Asn Ala Ala Pro Leu Gly Thr20 25 30Thr Ala Lys Glu Glu Met Glu Arg Phe Trp Lys Lys Asn Thr Ser Ser35 40 45Asn Arg Pro Leu Ser Pro His Leu Thr Ile Tyr Lys Trp Ser Leu Pro50 55 60Met Ala Leu Ser Val Cys His Arg Gly Ser Gly Ile Ala Leu Ser Gly65 70 75 80Gly Val Ser Leu Phe Gly Leu Ser Ala Leu Leu Leu Pro Gly Asn Phe85 90 95Glu Ser Tyr Leu Met Phe Val Lys Ser Leu Cys Leu Gly Pro Thr Leu100 105 110Ile Tyr Ser Ala Lys Phe Val Leu Val Phe Pro Leu Met Tyr His Ser115 120 125Leu Asn Gly Ile Arg His Leu Leu Trp Asp Leu Gly Lys Gly Leu Ala130 135 140Ile Pro Gln Val Trp Leu Ser Gly Val Ala Val Val Val Leu Ala Val145 150 155 160Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ala Ala Leu165<210>34<211>2065<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>CDS<222>(253)...(516)<400>34gttggtggcg agctaaggtg gaggcaagca gcggcggcga cggcgacagt ggcggcagtg60ccatggtggg gctcgcagga tccctgctgc cttggtgatc ccgggctgac agccagagag120cacagcggct cagctcctgg agagagagtc gaagaaagcg aagggcagcc acctgtgcct180gctggctccc attaggtcgg ttcctgcagc ggtgcctggc agccttggtg aaggccctgc240ccggcagaga tc atg tat tgc ctc cag tgg ctg ctg ccc gtc ctc ctc atc291Met Tyr Cys Leu Gln Trp Leu Leu Pro Val Leu Leu Ile1 5 10ccc aag ccc ctc aac ccc gct ctg tgg ttc agc cac tcc atg ttc atg 339Pro Lys Pro Leu Asn Pro Ala Leu Trp Phe Ser His Ser Met Phe Met15 20 25ggc ttc tac ctg ctc agc ttc ctc ctg gaa cgg aaa cct tgc aca ata 387Gly Phe Tyr Leu Leu Ser Phe Leu Leu Glu Arg Lys Pro Cys Thr Ile30 35 40 45
tgt gcc ttg gtt ttc ctg gca gcc ctc ttt ctc atc tgc tat agc tgc 435Cys Ala Leu Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Leu Ile Cys Tyr Ser Cys50 55 60tgg gga aat tgt ttc ctg tac cac tgc tcc gat tcc cca ctt ccg gaa 483Trp Gly Asn Cys Phe Leu Tyr His Cys Ser Asp Ser Pro Leu Pro Glu65 70 75tca gcc cat gac ccc ggt gtt gtg ggc acc taa cgtctgccga gatagcttgc536Ser Ala His Asp Pro Gly Val Val Gly Thr *80 85caaggaagca gaagacggga ggggaggcat tgacataggt cataaagcat tggagtttca596aatcccgcag tcctgcgggt accacattcc taatggagcc ttttggcctg tgatgtttta656tccttacaat gtgaataatg gcactgatcg gtgcttctgt tgtagagtcc tgtagtcgtg716ggtggtctta tggttgtgtg ttctgtcacc atctgggtcc cggctgacgg attggcccac776ccccttgctc attgatttgg ggaatctata cccttgatat gacctgtgtg gatacagtgt836agtctcaatg tcacctccat aacccttcct cgtcaagacc ttcctcgttc cctcctcgtc896ccctttcccc gttttcccct tggttcactt ccaacccctt tccttttttg gggagcacct956gtccaagaca gggcttgttt ttgcacttat ctcaaatttg aagagattgc tgatgcccga1016gagcctcgct ttttcatcct tcgttccctt ttgagaaggt gagacggaat catgtctcaa1076ctgctcgttg tctgcagacc tccagtattt cctctgcctc atttttaaga aagaagcgat1136ggggagacat tgctctttgg cctgggtatc tgggctcctg ccttccagcc cagcctctct1196ccctttgctc ttcctcctgt ctctctcagc tgacctaaag gggccacctc atgtctccag1256tgcatgctct tcaggaggga gatgtgcagt attctcgtag acccagtggt ccctggctga1316gtgaatgaga aagtattaca tttttcatag cagccatgat tcccttggta ggtgtttgga1376tatttttgat gtgccctgta tgtatgtgtg cactagtgtc agcgtgtatg tacacacgta1436tgtgtgaatg tgtgttgtgt gtgtgtttac ataccaatac atgtgtatat tccttttgaa1496gaagctttat tgaatatgtt ctgattttga ggtttagtag tagtagctag ctgtagtagg1556tcctgctgca gtttttattt agcatgggga ttgcagagcg accagcacag tggactccaa1616ggtggttcag acaagaccca ggggagcagt cgccatcatc ctcccaccag gagcttcctc1676attgctgcgc acgtagactg tacactatga agaaaacaca ggaagaaaga tttggtgact1736tggtacttgt ttgcttttct ctgcgcttca gaaacaagtg tttgcaaatg agactttctc1796ctggccccta cccactgggg atcagcatgg ttgttcttcc agtcggaaat gtacccccct1856cctttccccc tcttgtgtgc aagtgggggg gggggcaggc ataggacaga gctggaagca1916ggcttctggg gagtgggact tagaggccac acttgtgaaa cactcggact gctgttgtaa1976agcttttatt tctggtgtgt tcgttccaca gctgtttgaa atgtttaata aagctttata2036aactttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2065<210>35<211>87<212>PRT<213>小家鼠<400>35Met Tyr Cys Leu Gln Trp Leu Leu Pro Val Leu Leu Ile Pro Lys Pro1 5 10 15Leu Asn Pro Ala Leu Trp Phe Ser His Ser Met Phe Met Gly Phe Tyr20 25 30Leu Leu Ser Phe Leu Leu Glu Arg Lys Pro Cys Thr Ile Cys Ala Leu35 40 45Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Leu Ile Cys Tyr Ser Cys Trp Gly Asn
50 55 60Cys Phe Leu Tyr His Cys Ser Asp Ser Pro Leu Pro Glu Ser Ala His65 70 75 80Asp Pro Gly Val Val Gly Thr85<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)筑體<400>36tcaggtgtga tgctcgg 1權(quán)利要求
1.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列CRPPR(SEQID NO1)或其肽模擬物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于40個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
5.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列GRKSKTV(SEQ ID NO14)或其肽模擬物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其在構(gòu)形上受限。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ IDNO2)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
12.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CXGRKSKTVZC(SEQ ID NO15)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且其中Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
13.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于150個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列CARPAR(SEQ ID NO5)或其肽模擬物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
18.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于50個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其肽模擬物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于40個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
22.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其肽模擬物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
27.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列RNSWKPN(SEQ ID NO16)或其肽模擬物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其在構(gòu)形上受限。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQID NO8)。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
34.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CXRNSWKPNZC(SEQ ID NO17)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且其中Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
35.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其肽模擬物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
40.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列RSTRANP(SEQ ID NO18)或其肽模擬物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其在構(gòu)形上受限。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CRSTRANPC(SEQID NO11)。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
45.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
46.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
47.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CXRSTRANPZC(SEQ ID NO19)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且其中Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
48.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列PKTRRVP(SEQ ID NO20)或其肽模擬物。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其在構(gòu)形上受限。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQID NO12)。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
54.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
55.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CXPKTRRVPZC(SEQ ID NO21)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且其中Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
56.一種分離肽或肽模擬物，其具有少于400個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包含氨基酸序列SGMARTK(SEQ ID NO22)或其肽模擬物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其為肽。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其在構(gòu)形上受限。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CSGMARTKC(SEQID NO13)。
60.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于100個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
61.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
62.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離肽或肽模擬物，其具有少于20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
63.一種分離肽或肽模擬物，其包含氨基酸序列CXSGMARTKZC(SEQ ID NO23)或其肽模擬物，其中X＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基且其中Z＝0到20個(gè)獨(dú)立選擇的殘基。
64.一種分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子(homingmolecule)的方法，其包含(a)使HLP/CRIP2或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與HLP/CRIP2特異性結(jié)合的條件下接觸；(b)檢定分子與HLP/CRIP2的特異性結(jié)合；和(c)從所述文庫(kù)中分離一種或一種以上HLP/CRIP2結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合HLP/CRIP2的錨定分子。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中步驟(a)包含使經(jīng)純化的HLP/CRIP或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中步驟(a)包含使表達(dá)細(xì)胞表面HLP/CRIP2的細(xì)胞或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述HLP/CRIP2為人類(lèi)或鼠科HLP/CRIP2。
68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其包含使HLP/CRIP2的CRPPR(SEQ ID NO1)或CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)結(jié)合片段與所述分子文庫(kù)接觸。
69.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述分子文庫(kù)為小分子、肽和肽模擬物或抗體和其抗原結(jié)合片段的文庫(kù)。
70.一種分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其包含(a)使受體克隆9或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與受體克隆9特異性結(jié)合的條件下接觸；(b)檢定分子與受體克隆9的特異性結(jié)合；和(c)從所述文庫(kù)中分離一種或一種以上受體克隆9結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合受體克隆9的錨定分子。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中步驟(a)包含使經(jīng)純化的受體克隆9或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中步驟(a)包含使表達(dá)細(xì)胞表面受體克隆9的細(xì)胞或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述受體克隆9為人類(lèi)或鼠科受體克隆9。
74.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其包含使受體克隆9的SEQ ID NO5或SEQ ID NO6結(jié)合片段與所述分子文庫(kù)接觸。
75.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述分子文庫(kù)為小分子、肽和肽模擬物或抗體和其抗原結(jié)合片段的文庫(kù)。
76.一種分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其包含(a)使Sigirr/TIR8或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與Sigirr/TIR8特異性結(jié)合的條件下接觸；(b)檢定分子與Sigirr/TIR8的特異性結(jié)合；和(c)從所述文庫(kù)中分離一種或一種以上Sigirr/TIR8結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合Sigirr/TIR8的錨定分子。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中步驟(a)包含使經(jīng)純化的Sigirr/TIR8或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
78.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中步驟(a)包含使表達(dá)細(xì)胞表面Sigirr/TIR8的細(xì)胞或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
79.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述Sigirr/TIR8為人類(lèi)或鼠科Sigirr/TIR8。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中所述鼠科Sigirr/TIR8包含SEQ ID NO29。
81.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其包含使Sigirr/TIR8的SEQ ID NO7、SEQ ID NO8或SEQ ID NO9結(jié)合片段與所述分子文庫(kù)接觸。
82.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述分子文庫(kù)為小分子、肽和肽模擬物或抗體和其抗原結(jié)合片段的文庫(kù)。
83.一種分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其包含(a)使MpcII-3相關(guān)蛋白或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與MpcII-3相關(guān)蛋白特異性結(jié)合的條件下接觸；(b)檢定分子與MpcII-3相關(guān)蛋白的特異性結(jié)合；和(c)從所述文庫(kù)中分離一種或一種以上MpcII-3相關(guān)蛋白結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合MpcII-3相關(guān)蛋白的錨定分子。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中步驟(a)包含使經(jīng)純化的MpcII-3相關(guān)蛋白或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中步驟(a)包含使表達(dá)細(xì)胞表面MpcII-3相關(guān)蛋白的細(xì)胞或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述MpcII-3相關(guān)蛋白為人類(lèi)或鼠科MpcII-3相關(guān)蛋白。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述鼠科MpcII-3相關(guān)蛋白包含SEQ ID NO33。
88.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其包含使MpcII-3相關(guān)蛋白的CRSTRANPC(SEQ ID NO11)結(jié)合片段與所述分子文庫(kù)接觸。
89.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中所述分子文庫(kù)為小分子、肽和肽模擬物或抗體和其抗原結(jié)合片段的文庫(kù)。
90.一種分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子的方法，其包含(a)使bc10或其片段與分子文庫(kù)在適于使分子與bc10特異性結(jié)合的條件下接觸；(b)檢定分子與bc10的特異性結(jié)合；和(c)從所述文庫(kù)中分離一種或一種以上bc10結(jié)合分子，從而分離一種或一種以上選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)且特異性結(jié)合bc10的錨定分子。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中步驟(a)包含使經(jīng)純化的bc10或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
92.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中步驟(a)包含使表達(dá)細(xì)胞表面bc10的細(xì)胞或其片段與所述分子文庫(kù)接觸。
93.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述bc10為人類(lèi)或鼠科bc10。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述鼠科bc10包含SEQ ID NO35。
95.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其包含使bc10的SEQ ID NO12或SEQ ID NO13結(jié)合片段與所述分子文庫(kù)接觸。
96.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中所述分子文庫(kù)為小分子、肽和肽模擬物或抗體和其抗原結(jié)合片段的文庫(kù)。
97.一種將成分(moiety)導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物(conjugate)，所述抗體特異性結(jié)合HLP/CRIP2(SEQ ID NO25)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述抗體具有生物活性。
100.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)成分。
101.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述成分為治療劑。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
103.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，所述抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO2-7，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
105.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述抗體具有生物活性。
106.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)藥劑。
107.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述成分為治療劑。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
109.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，所述抗體特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
111.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述抗體具有生物活性。
112.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)藥劑。
113.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中所述成分為治療劑。
114.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
115.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，所述抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO33，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
117.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中所述抗體具有生物活性。
118.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)藥劑。
119.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中所述成分為治療劑。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
121.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的抗體或其抗原結(jié)合片段連接的成分的結(jié)合物，所述抗體特異性結(jié)合bc10(SEQ ID NO35)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
122.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
123.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述抗體具有生物活性。
124.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)藥劑。
125.根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法，其中所述成分為治療劑。
126.根據(jù)權(quán)利要求125所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
127.一種結(jié)合物，其包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的治療劑，所述錨定分子特異性結(jié)合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO25)。
128.根據(jù)權(quán)利要求127所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
129.根據(jù)權(quán)利要求127所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
130.根據(jù)權(quán)利要求129所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物。
131.根據(jù)權(quán)利要求130所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO1或其肽模擬物。
132.根據(jù)權(quán)利要求131所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO1。
133.根據(jù)權(quán)利要求129所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)或其保守變異體或肽模擬物。
134.根據(jù)權(quán)利要求133所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO2或其肽模擬物。
135.根據(jù)權(quán)利要求134所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO2。
136.根據(jù)權(quán)利要求133所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
137.根據(jù)權(quán)利要求127所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
138.根據(jù)權(quán)利要求127、130或133所述的結(jié)合物，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
139.根據(jù)權(quán)利要求138所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為血管生成劑。
140.根據(jù)權(quán)利要求138所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為抗血栓形成劑。
141.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，所述錨定分子特異性結(jié)合富半胱氨酸蛋白2(HLP/CRIP2；SEQ ID NO25)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
142.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
143.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
144.根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其保守變異體或肽模擬物。
145.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO1或其肽模擬物。
146.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO1。
147.根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CGRKSKTVC(SEQ ID NO2)或其保守變異體或肽模擬物。
148.根據(jù)權(quán)利要求147所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO2或其肽模擬物。
149.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO2。
150.根據(jù)權(quán)利要求147所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
151.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
152.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)成分。
153.根據(jù)權(quán)利要求152所述的方法，其中所述可檢測(cè)成分為放射性核素或順磁離子。
154.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述成分為治療劑。
155.根據(jù)權(quán)利要求154所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
156.一種結(jié)合物，其包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的治療劑，所述錨定分子特異性結(jié)合單一Ig IL-2受體相關(guān)蛋白(Sigirr/TIR8；SEQ ID NO29)。
157.根據(jù)權(quán)利要求156所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
158.根據(jù)權(quán)利要求156所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
159.根據(jù)權(quán)利要求158所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其保守變異體或肽模擬物。
160.根據(jù)權(quán)利要求159所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO7或其肽模擬物。
161.根據(jù)權(quán)利要求160所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO7。
162.根據(jù)權(quán)利要求158所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)或其保守變異體或肽模擬物。
163.根據(jù)權(quán)利要求162所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO8或其肽模擬物。
164.根據(jù)權(quán)利要求163所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO8。
165.根據(jù)權(quán)利要求162所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
166.根據(jù)權(quán)利要求158所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其保守變異體或肽模擬物。
167.根據(jù)權(quán)利要求166所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO9或其肽模擬物。
168.根據(jù)權(quán)利要求167所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO9。
169.根據(jù)權(quán)利要求156所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
170.根據(jù)權(quán)利要求156、159、162或166所述的結(jié)合物，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
171.根據(jù)權(quán)利要求170所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為血管生成劑。
172.根據(jù)權(quán)利要求170所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為抗血栓形成劑。
173.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，所述錨定分子特異性結(jié)合Sigirr/TIR8(SEQ ID NO29)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
174.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
175.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
176.根據(jù)權(quán)利要求175所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CKRAVR(SEQ ID NO7)或其保守變異體或肽模擬物。
177.根據(jù)權(quán)利要求176所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO7或其肽模擬物。
178.根據(jù)權(quán)利要求177所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO7。
179.根據(jù)權(quán)利要求175所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRNSWKPNC(SEQ ID NO8)或其保守變異體或肽模擬物。
180.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO8或其肽模擬物。
181.根據(jù)權(quán)利要求180所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO8。
182.根據(jù)權(quán)利要求179所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
183.根據(jù)權(quán)利要求175所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列RGSSS(SEQ ID NO9)或其保守變異體或肽模擬物。
184.根據(jù)權(quán)利要求183所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO9或其肽模擬物。
185.根據(jù)權(quán)利要求184所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO9。
186.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
187.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)成分。
188.根據(jù)權(quán)利要求187所述的方法，其中所述可檢測(cè)成分為放射性核素或順磁離子。
189.根據(jù)權(quán)利要求173所述的方法，其中所述成分為治療劑。
190.根據(jù)權(quán)利要求189所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
191.一種結(jié)合物，其包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的治療劑，所述錨定分子特異性結(jié)合SEQ ID NO33。
192.根據(jù)權(quán)利要求191所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
193.根據(jù)權(quán)利要求191所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
194.根據(jù)權(quán)利要求193所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物。
195.根據(jù)權(quán)利要求194所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO11或其肽模擬物。
196.根據(jù)權(quán)利要求195所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO11。
197.根據(jù)權(quán)利要求194所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
198.根據(jù)權(quán)利要求191所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
199.根據(jù)權(quán)利要求191或194所述的結(jié)合物，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
200.根據(jù)權(quán)利要求199所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為血管生成劑。
201.根據(jù)權(quán)利要求199所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為抗血栓形成劑。
202.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，所述錨定分子特異性結(jié)合SEQ ID NO33，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
203.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
204.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
205.根據(jù)權(quán)利要求204所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CRSTRANPC(SEQ ID NO11)或其保守變異體或肽模擬物。
206.根據(jù)權(quán)利要求205所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO11或其肽模擬物。
207.根據(jù)權(quán)利要求206所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO11。
208.根據(jù)權(quán)利要求205所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
209.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
210.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)成分。
211.根據(jù)權(quán)利要求210所述的方法，其中所述可檢測(cè)成分為放射性核素或順磁離子。
212.根據(jù)權(quán)利要求202所述的方法，其中所述成分為治療劑。
213.根據(jù)權(quán)利要求212所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
214.一種結(jié)合物，其包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的治療劑，所述錨定分子特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)。
215.根據(jù)權(quán)利要求214所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
216.根據(jù)權(quán)利要求214所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
217.根據(jù)權(quán)利要求216所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物。
218.根據(jù)權(quán)利要求217所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO12或其肽模擬物。
219.根據(jù)權(quán)利要求218所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO12。
220.根據(jù)權(quán)利要求217所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
221.根據(jù)權(quán)利要求216所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)或其保守變異體或肽模擬物。
222.根據(jù)權(quán)利要求221所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO13或其肽模擬物。
223.根據(jù)權(quán)利要求222所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQID NO13。
224.根據(jù)權(quán)利要求221所述的結(jié)合物，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
225.根據(jù)權(quán)利要求214所述的結(jié)合物，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
226.根據(jù)權(quán)利要求214、217或221所述的結(jié)合物，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
227.根據(jù)權(quán)利要求226所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為血管生成劑。
228.根據(jù)權(quán)利要求226所述的結(jié)合物，其中所述治療劑為抗血栓形成劑。
229.一種將成分導(dǎo)向到個(gè)體的心臟脈管系統(tǒng)的方法，其包含對(duì)所述個(gè)體投與包含與選擇性錨定到心臟脈管系統(tǒng)的錨定分子連接的成分的結(jié)合物，所述錨定分子特異性結(jié)合鼠科膀胱癌相關(guān)蛋白同系物(bc10；SEQ ID NO35)，從而將所述成分導(dǎo)向到心臟脈管系統(tǒng)。
230.根據(jù)權(quán)利要求229所述的方法，其中所述錨定分子在活體內(nèi)以相對(duì)于非重組噬菌體至少5倍的選擇性錨定到心臟。
231.根據(jù)權(quán)利要求229所述的方法，其中所述錨定分子為肽或肽模擬物。
232.根據(jù)權(quán)利要求231所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CPKTRRVPC(SEQ ID NO12)或其保守變異體或肽模擬物。
233.根據(jù)權(quán)利要求232所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO12或其肽模擬物。
234.根據(jù)權(quán)利要求233所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO12。
235.根據(jù)權(quán)利要求232所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
236.根據(jù)權(quán)利要求231所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列CSGMARTKC(SEQ ID NO13)或其保守變異體或肽模擬物。
237.根據(jù)權(quán)利要求236所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO13或其肽模擬物。
238.根據(jù)權(quán)利要求237所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物包含氨基酸序列SEQ IDNO13。
239.根據(jù)權(quán)利要求236所述的方法，其中所述錨定肽或肽模擬物在構(gòu)形上受限。
240.根據(jù)權(quán)利要求229所述的方法，其中所述錨定分子為抗體或其抗原結(jié)合片段。
241.根據(jù)權(quán)利要求229所述的方法，其中所述成分為可檢測(cè)成分。
242.根據(jù)權(quán)利要求241所述的方法，其中所述可檢測(cè)成分為放射性核素或順磁離子。
243.根據(jù)權(quán)利要求229所述的方法，其中所述成分為治療劑。
244.根據(jù)權(quán)利要求243所述的方法，其中所述治療劑選自血管生成劑、抗血栓形成劑、消炎劑、免疫抑制劑、抗心律不齊劑、腫瘤壞死因子抑制劑、內(nèi)皮素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、鈣拮抗劑、抗生素藥劑、抗病毒劑和病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明提供多種分離肽和肽模擬物，其例如可用于構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合物(conjugate)，或者當(dāng)肽自身具有生物活性時(shí)，其可以未結(jié)合形式用作治療如下所述的多種心血管疾病中的任一種的治療劑。因此，本發(fā)明提供一種分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CRPPR(SEQ ID NO1)或其肽模擬物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離肽或肽模擬物，其具有少于60個(gè)殘基的長(zhǎng)度且包括氨基酸序列CARPAR(SEQ IDNO5)或其肽模擬物，或氨基酸序列CPKRPR(SEQ ID NO6)或其肽模擬物。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101052408SQ200580037515
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者張良林, 賈森·A·霍夫曼, 埃爾基·羅斯拉赫蒂 申請(qǐng)人:伯納姆研究院