專(zhuān)利名稱(chēng)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在無(wú)血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的領(lǐng)域，具體指生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，例如人生長(zhǎng)激素(hGH)的細(xì)胞的培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞使之生長(zhǎng)和維持。
目前已廣泛采用細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)多種生物學(xué)活性產(chǎn)品，如病毒疫苗、單克隆抗體，非抗體免疫調(diào)節(jié)劑、多肽生長(zhǎng)因子、激素、酶、腫瘤特異性抗原等。這些產(chǎn)品可通過(guò)正常的或轉(zhuǎn)化的和經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞產(chǎn)生。
以往，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基需添加血清，作為生產(chǎn)生物活性產(chǎn)品的所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生長(zhǎng)和維持所需的通用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。血清含有激素、生長(zhǎng)因子、載體蛋白質(zhì)、粘附和擴(kuò)散因子、營(yíng)養(yǎng)成分、微量元素等。培養(yǎng)基通常含有高達(dá)約10％的動(dòng)物血清，例如胎牛血清(FBS)，也稱(chēng)為胎犢血清(FCS)。
雖然廣泛采了用血清，但其有許多缺點(diǎn)。細(xì)胞產(chǎn)生的感興趣所需蛋白質(zhì)的有限的量受到血清所含的許多高水平蛋白質(zhì)的干擾。在下游加工中，例如感興趣蛋白質(zhì)純化時(shí)，必須將源于血清的這些蛋白質(zhì)與所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物分離，因而這使得工藝復(fù)雜化并提高了成本。
一種具有長(zhǎng)時(shí)間潛伏期或孵化期的牛傳染性神經(jīng)退行性疾病BSE(牛海綿狀腦病)的出現(xiàn)，引起了對(duì)利用動(dòng)物來(lái)源血清生產(chǎn)生物活性產(chǎn)物的重新關(guān)注。
因此，極其需要開(kāi)發(fā)無(wú)動(dòng)物血清的替代培養(yǎng)基來(lái)支持生產(chǎn)生物活性產(chǎn)品的細(xì)胞生長(zhǎng)和維持該細(xì)胞。
通常，細(xì)胞培養(yǎng)基包含多種不同種類(lèi)的成分，例如氨基酸、維生素、鹽、脂肪酸和其它成分-氨基酸例如美國(guó)專(zhuān)利US6,048,728(Inlow等)公開(kāi)了可用于細(xì)胞培養(yǎng)基中的以下氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、苯丙胺酸、脯氨酸、絲氨酸、色氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。
-維生素例如美國(guó)專(zhuān)利US2003/0096414(Ciccarone等)或US5,811,299(Renner等)描述了可用于細(xì)胞培養(yǎng)基的以下維生素生物素、泛酸鹽、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、維生素B6、核黃素、維生素B12、硫胺、腐胺。
-鹽例如美國(guó)專(zhuān)利US6,399,381(Blum等)公開(kāi)的一種培養(yǎng)基包含CaCl2、KCl、MgCl2、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2SeO3、CuSO4、ZnCl2。另一美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)US2003/0153042(Arnold等)例子中公開(kāi)了可用于培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽，該培養(yǎng)基包含CaCl2、KCl、MgCl2、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、CuCl2·2H2O、ZnCl2。
-脂肪酸已知可用于培養(yǎng)基的脂肪酸有花生四烯酸、亞油酸、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸和甲基-β-環(huán)糊精。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,045,468(Darfler)。應(yīng)注意環(huán)糊精本身不是脂肪，但是它能夠與脂質(zhì)形成復(fù)合物，因此在細(xì)胞培養(yǎng)基中用它來(lái)溶解脂肪。
-其它成分，具體指用于構(gòu)成無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的化合物，例如包括葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰島素或乙醇胺(例如歐洲專(zhuān)利EP274445)，或保護(hù)劑如Pluronic F68。PluronicF68(也稱(chēng)為泊洛沙姆(Poloxamer)188)是一種環(huán)氧乙烷(EO)與環(huán)氧丙烷(PO)的嵌段共聚物。
標(biāo)準(zhǔn)的“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些培養(yǎng)基包含上述培養(yǎng)基諸成分。廣泛應(yīng)用的這種培養(yǎng)基的例子有達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)，DMEMF12(1∶1)，Ham’s Nutrientmixture F-10，Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI)，MCDB131，或William’s Medium E。這些商品化培養(yǎng)基可以從例如Gibco、Invitrogen獲得。
金屬元素，例如鋅(Zn)和銅(Cu)參與代謝反應(yīng)(Vallee和Falchuk，1993，或Lindner，1991)。
鋅是許多大分子的結(jié)構(gòu)與功能和許多酶反應(yīng)所必須的元素，其在蛋白質(zhì)正確折疊中發(fā)揮著催化、助催化或結(jié)構(gòu)性作用。在生物胺合成和單胺氧化酶代謝所必須的兩種輔酶5’-磷酸吡哆醛和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的合成中，Zn-ATP是必需的。
鋅在保護(hù)生物結(jié)構(gòu)免受自由基損傷中具有活性，可能是由于以下幾種因素它能保持足夠水平的金屬蛋白質(zhì)也即自由基清除劑、它構(gòu)成超氧化物歧化酶的一種主要成分、構(gòu)成巰基保護(hù)劑、和能防止化學(xué)基團(tuán)與鐵反應(yīng)形成自由基。
此外，Zn的存在防止了脂質(zhì)的過(guò)度氧化。鋅也是微管蛋白質(zhì)聚合的效應(yīng)物并在肌動(dòng)蛋白質(zhì)絲的體外形成和穩(wěn)定中起作用。鋅還是DNA結(jié)合蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)基序的一種成分，該基序是轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的共同基序。
鋅離子主要以與蛋白質(zhì)、核酸復(fù)合形式存在，它參與中間代謝、遺傳信息的傳遞和表達(dá)調(diào)節(jié)、肽激素的貯藏、合成和作用、及染色質(zhì)和生物膜結(jié)構(gòu)的維持。
銅也是對(duì)許多細(xì)胞酶功能有重要作用的微量元素。銅可采取不同的氧化還原狀態(tài)，氧化態(tài)Cu(II)，或還原態(tài)Cu(I)，在酶的氧化還原化學(xué)反應(yīng)中作為催化輔助因子而在細(xì)胞生理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它在一組銅氧化酶中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞色素C氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺-β-單加氧酶、胺氧化酶、賴(lài)氨酰氧化酶。銅還參與線粒體呼吸、作為血漿銅藍(lán)蛋白的組分參與鐵穩(wěn)態(tài)、自由基清除和彈性蛋白交聯(lián)(elsatin crosslining)。
無(wú)血清培養(yǎng)基包含金屬離子例如鋅或銅是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的，例如美國(guó)專(zhuān)利US6,048,728(Inlow等)，US4,767,704(Cleveland等)或國(guó)際專(zhuān)利WO01/16294(Life Technologies Inc.)。但是這些文獻(xiàn)中并沒(méi)有描述在標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加特定濃度的這些離子會(huì)有提高產(chǎn)量的作用。
開(kāi)發(fā)和提供生物學(xué)活性產(chǎn)品，例如治療蛋白質(zhì)或疫苗，需要大量生產(chǎn)。廣泛用于生產(chǎn)多肽的合適細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。CHO細(xì)胞首先由Puck(J.Exp.Med.108945，1958)從一雌性中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢活體組織中分離得到并培養(yǎng)。從這些原始細(xì)胞制備了多種具有不同特征的細(xì)胞亞系。這些CHO細(xì)胞系中的一個(gè)系CHO-K1，需要脯氨酸并且是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的二倍體。從該細(xì)胞系衍生的另一細(xì)胞系為DHFR缺陷型CHO細(xì)胞系(CHO DUKB11)(PNAS 774216-4220，1980)，該細(xì)胞系的特征是由于DHFR基因中有一個(gè)突變導(dǎo)致DHFR功能喪失，以及隨后其它基因的缺失。
常用于生產(chǎn)人用蛋白質(zhì)的其它細(xì)胞系有人細(xì)胞系，例如人纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080或人胚腎細(xì)胞系293。
鼠C127細(xì)胞系也很適合用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)(Carter等.，1989；Oka andRupp，1990)。
一種感興趣的治療蛋白質(zhì)為生長(zhǎng)激素。人生長(zhǎng)激素(hGH)也稱(chēng)為somatropin(INN)或促生長(zhǎng)素(somatotropin)，是由垂體前葉生長(zhǎng)激素(somatotropic)生成細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種蛋白質(zhì)激素。人生長(zhǎng)激素通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類(lèi)代謝的作用在兒童身體生長(zhǎng)和成人新陳代謝中起著關(guān)鍵作用。
人生長(zhǎng)激素是由191個(gè)氨基酸(Bewly等，1972)構(gòu)成的單鏈多肽，具有兩個(gè)二硫鍵，位于Cys-53和Cys-165之間的二硫鍵在分子內(nèi)形成一個(gè)大環(huán)，位于Cys-182和Cys-189之間的二硫鍵形成靠近C-末端的一個(gè)小環(huán)。Martial等(1979)報(bào)道了證實(shí)該氨基酸序列的DNA序列。純化hGH的凍干形式為白色無(wú)定形粉末。人生長(zhǎng)激素易溶于(濃度＞10mg/L)pH范圍6.5-8.5的水性緩沖液中。
hGH在溶液中主要以單體存在，有少量二聚體和高分子量寡聚體。在特定條件下，hGH可經(jīng)誘導(dǎo)形成大量的二聚物、三聚體和更高的寡聚物。
已知有幾種hGH衍生物，包括自然產(chǎn)生的衍生物、變體和代謝產(chǎn)物，主要是生物合成hGH的降解產(chǎn)物和通過(guò)遺傳方法產(chǎn)生的hGH的工程衍生物。hGH天然產(chǎn)生的衍生物的一個(gè)例子是胎盤(pán)中發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)激素變體GH-V。該基因座的其它成員在Chen等(1989)的文章有描述。hGH的衍生物，包括經(jīng)設(shè)計(jì)能在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期保持的衍生物都可用于本發(fā)明，只要這些衍生物保留了hGH的生物活性。
甲二磺酰(基)hGH是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的第一種形式的hGH。該化合物實(shí)際上是N-末端具有一額外甲硫氨酸殘基的hGH衍生物(Goeddel等，1979)。
有報(bào)道(Lewis等，1978；Lewis等，1980)稱(chēng)天然產(chǎn)生的hGH變體20-K-hCG見(jiàn)于垂體和血液中。該化合物由于mRNA的交替剪接缺失了從Glu-32到Gln-46的15個(gè)氨基酸殘基(DeNoto等，1981)。此化合物具有hGH的眾多但不是全部的生物學(xué)性能。
20-K-hGH在垂體中產(chǎn)生分泌到血液中。它占成人生長(zhǎng)激素輸出量的約5％和兒童生長(zhǎng)激素輸出量的約20％。它具有與22kD生長(zhǎng)激素相同的促生長(zhǎng)活性，據(jù)報(bào)道它具有與22kD生長(zhǎng)激素相等或更高的溶脂活性。它與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合的親和力與22kD生長(zhǎng)激素相同，催乳(促乳素-樣)生物學(xué)活性為22kD生長(zhǎng)激素的十分之一。與22kD生長(zhǎng)激素不同的是20-K-hGH的抗胰島素活性弱。
許多hGH衍生物是通過(guò)該分子的蛋白水解修飾而產(chǎn)生。hGH代謝的主要途徑包括蛋白質(zhì)水解。hGH的130-150殘基區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)水解極其敏感，已有報(bào)道(Thorlacius-Ussing，1987)幾種hGH衍生物在該區(qū)域有缺口或缺失。此區(qū)位于hGH的大環(huán)內(nèi)，切割此處肽鍵導(dǎo)致產(chǎn)生通過(guò)Cys-53和Cys-165之間二硫鍵連接的兩條鏈。據(jù)報(bào)道許多該雙鏈形式的生物學(xué)活性增強(qiáng)(Singh等，1974)。通過(guò)采用酶人工產(chǎn)生了許多人生長(zhǎng)激素衍生物。已利用胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等在不同位點(diǎn)上修飾整個(gè)hGH分子(Lewis等，1977；Graff等，1982)。其中一類(lèi)衍生物，稱(chēng)為雙鏈合成代謝蛋白質(zhì)(2-CAP)，是通過(guò)使用胰蛋白酶控制水解hGH而形成的。發(fā)現(xiàn)此2-CAP具有與完整hGH分子非常不同的生物學(xué)性能，它主要保留了hGH的促生長(zhǎng)活性但喪失了其對(duì)碳水化合物代謝的大部分活性。
在適當(dāng)條件下，蛋白質(zhì)中天冬酰胺和谷氨酰胺殘基易發(fā)生脫酰胺反應(yīng)。已證明垂體hGH發(fā)生該反應(yīng)后，導(dǎo)致Asn-152轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?，和較低程度Gln-137轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?Lewis等，1981)。已證明脫酰胺后的hGH對(duì)枯草桿菌蛋質(zhì)酶的水解易感性改變，提示脫酰胺對(duì)指導(dǎo)hGH蛋白質(zhì)水解切割具有生理學(xué)意義。已知生物合成的hGH在某些貯藏條件下能降解而導(dǎo)致另一天冬氨酸(Asn-149)脫酰胺。該位點(diǎn)為脫酰胺主要位點(diǎn)，但也發(fā)現(xiàn)Asn-152發(fā)生脫酰胺(Becker等，1988)。生物合成hGH的Gln-137脫酰胺未見(jiàn)報(bào)道。
蛋白質(zhì)的甲硫氨酸殘基易于氧化，主要被氧化成亞砜。垂體產(chǎn)生的和生物合成的hGH都在Met-14和Met-125發(fā)生磺化氧化(sulfoxidation)(Becker等，1988)，垂體中Met-170的氧化有報(bào)道但未見(jiàn)于生物合成的hGH。已發(fā)現(xiàn)脫酰胺hGH和Met-14磺化氧化hGH都顯示具有完全的生物學(xué)活性(Becker等，1988)。
可通過(guò)酶作用或遺傳學(xué)方法產(chǎn)生截短形式的hGH。通過(guò)控制的胰蛋白酶作用而產(chǎn)生的2-CAP去除了hGH的N-末端前8個(gè)殘基。hGH的其它截短形式可通過(guò)基因修飾然后在合適宿主中表達(dá)而產(chǎn)生。將前13個(gè)殘基除去，以產(chǎn)生具有與未切割多肽鏈不同的生物學(xué)性能的衍生物。
雖然人生長(zhǎng)激素最初獲自尸體腦垂體，但這些制品電泳上不具有均一性，用級(jí)別50％純制品治療的病人血液中出現(xiàn)了抗體，其免疫源性歸因于非活性成分。重組DNA技術(shù)可在一些不同系統(tǒng)中產(chǎn)生無(wú)限制提供的hGH。非常少量的污染蛋白質(zhì)的存在有利于從培養(yǎng)基中純化hGH。事實(shí)上，已證明能在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上用反相HPLC柱一步純化hGH(Hsiung等(1989)。
Serono International S.A.生產(chǎn)的重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)(SEROSTIM)已獲FDA加快批準(zhǔn)用于治療愛(ài)滋病人體重減輕或消瘦。SAIZEN是重組人生長(zhǎng)激素可用于兒童生長(zhǎng)激素缺乏、女孩Turner綜合癥、和兒童慢性腎功能衰竭。Genentech，Inc.(South SanFrancisco，CA)生產(chǎn)的PROTROPIN與天然序列hGH在結(jié)構(gòu)上略有不同，其N(xiāo)末端具有一額外甲硫氨酸殘基。重組hGH通常含有凍干形式的hGH和添加的賦形劑(例如糖膠、甘露醇)的小瓶銷(xiāo)售。提供了稀釋液小瓶，允許病人在按劑量給藥前重建該產(chǎn)品至需要的濃度。重組hGH也可以其它熟知的方式，例如預(yù)填裝注射器等銷(xiāo)售。
通常，沒(méi)有觀察到重組的天然序列hGH、重組的N-端甲硫氨酰hGH、或人垂體來(lái)源物的藥物動(dòng)力學(xué)或生物學(xué)活性有明顯的差異(Moore等，1988；Jorgensson等，1988)。
鑒于生長(zhǎng)激素可用于多種醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥，需要一種有效和安全的細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)生產(chǎn)足夠數(shù)量的生長(zhǎng)激素。
無(wú)血清培養(yǎng)基在本領(lǐng)域內(nèi)已有描述。
例如美國(guó)專(zhuān)利US6,162,643描述了一種無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，命名為HECK-109，該培養(yǎng)基含有微量硫酸銅和氯化鋅。這種特定設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基用于正常人細(xì)胞，例如角化細(xì)胞的原代和次代培養(yǎng)，目的是人移植組織的傳代。該美國(guó)專(zhuān)利沒(méi)有提到在體外細(xì)胞系中表達(dá)重組人蛋白質(zhì)。
美國(guó)專(zhuān)利US5,324,656公開(kāi)了稱(chēng)為MCDB 120和MCDB 131M的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有微量硫酸銅和氯化鋅。該培養(yǎng)基特定設(shè)計(jì)用于體外培養(yǎng)人肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，目的是防止這些細(xì)胞分化。該文獻(xiàn)也未注意到重組人蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
英國(guó)專(zhuān)利GB2196348描述了一種用于體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基含銅、鋅和鐵離子。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，專(zhuān)用于制備單克隆抗體。
美國(guó)專(zhuān)利US6,103,529提供了一種用于體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基配方?？衫脛?dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)病毒、單克隆抗體、激素或生長(zhǎng)因子。但是該文獻(xiàn)未提到生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)。
美國(guó)專(zhuān)利US6,048,728公開(kāi)了一種含有銅、鋅和鐵離子的無(wú)蛋白質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，以生產(chǎn)如天然或重組產(chǎn)品，例如抗體。所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品不包括專(zhuān)門(mén)提到的作為無(wú)血清培養(yǎng)基成分以增強(qiáng)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)因子。
美國(guó)專(zhuān)利US5,316,938公開(kāi)了一種用于培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的生化成分明確的培養(yǎng)基，其含有檸檬酸鐵、硫酸鋅和硫酸銅，命名為WCM5。該培養(yǎng)基專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)抗體和tPA。
美國(guó)專(zhuān)利US5,122,459描述了一種在含有鋅和鐵離子的無(wú)血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，該方法尤其適合培養(yǎng)CHO細(xì)胞。但該文獻(xiàn)中未提及生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)。
因此，本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是提供一種無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)有效生產(chǎn)生長(zhǎng)激素，特別是人生長(zhǎng)激素(hGH)。
發(fā)明概述本發(fā)明依據(jù)于開(kāi)發(fā)的一種細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含源自動(dòng)物血清的成分但同時(shí)能使培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效生長(zhǎng)和維持，特別是使其產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明第一方面涉及一種不含源自動(dòng)物血清的成分的細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有微量鋅和/或銅。優(yōu)選本發(fā)明培養(yǎng)基還含有微量鐵離子。
本發(fā)明第二方面涉及一種蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法，包括在本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明第三方面涉及使用本發(fā)明的培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第四方面涉及在感興趣多肽的生產(chǎn)期間使用本發(fā)明的培養(yǎng)基來(lái)維持所培養(yǎng)的細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示在連續(xù)添加10μM的各種元素到DMEM培養(yǎng)基生產(chǎn)階段中獲得的rhGH生成狀況(RB＝轉(zhuǎn)瓶，H1-H14＝生產(chǎn)階段的天數(shù)1-14)；圖2顯示連續(xù)添加10μM金屬元素(鎳、鋇、鈷、鉻)到DMEM培養(yǎng)基生產(chǎn)階段中獲得的rhGH平均產(chǎn)生值，表示為每轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)生的rhGH的毫克(mg)數(shù)；圖3顯示在檢測(cè)鋅(Zn 0.5μM)、銅(Cu 0.02μM)、硒(Se 0.050μM)、錳(Mn0.001μM)和檸檬酸鐵(4.8μM)組合的因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，與對(duì)照相比獲得的rhGH產(chǎn)量增加的平均值；
圖4顯示檢測(cè)金屬微量元素(Zn 0.5μM、Cu 0.02μM和檸檬酸鐵4.8μM)與氨基酸谷氨酰胺(Gln 4.8mM)、絲氨酸(Ser 0.49mM)、半胱氨酸(Cys 0.29mM)混合物效果的因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果；圖5顯示DMEM中不同濃度的銅與鋅和檸檬酸鐵(Zn 0.5μM、檸檬酸鐵4.8μM)聯(lián)用對(duì)rhGH產(chǎn)量的影響；圖6顯示DMEM中不同濃度的鋅與銅和檸檬酸鐵(Cu 0.02μM、檸檬酸鐵4.8μM)聯(lián)用對(duì)rhGH產(chǎn)量的影響；和圖7顯示利用產(chǎn)生rhGH的C127細(xì)胞進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)時(shí)，添加銅、鋅和檸檬酸鐵(Zn1.5和0.5μM、Cu0.02μM和檸檬酸鐵4.8μM)作為DMEM補(bǔ)充成分，對(duì)rhGH產(chǎn)量增加影響的總結(jié)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的基礎(chǔ)是開(kāi)發(fā)一種無(wú)動(dòng)物血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。
本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物血清細(xì)胞培養(yǎng)基含有濃度范圍0.2-1.75μM的鋅(Zn)，和/或濃度范圍10-75nM的銅(Cu)，和/或濃度范圍3-10μM的鐵(Fe)。
如以下實(shí)施例中所證明，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中添加微量鋅和/或銅可導(dǎo)致表達(dá)感興趣分泌性蛋白質(zhì)的細(xì)胞的生產(chǎn)能力提高。
添加上述鑒定濃度的Zn和Cu兩者導(dǎo)致C127細(xì)胞的重組人生長(zhǎng)激素(GH)產(chǎn)量比對(duì)照(同樣細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng))高60％。當(dāng)生長(zhǎng)激素表達(dá)細(xì)胞在含有上述鑒定濃度的Zn、Cu和Fe離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)量比對(duì)照增加約70％。
本發(fā)明培養(yǎng)基金屬離子的優(yōu)選濃度范圍如下-含約0.2、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75μM的鋅。
優(yōu)選含約0.5μM或約1.5μM的鋅。還優(yōu)選所述鋅成分是硫酸鋅。
-含約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、或75nM的銅。
優(yōu)選含約25nM的銅。還優(yōu)選所述銅成分是硫酸銅。
-含約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、4.8、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10μM的鐵離子優(yōu)選鐵離子成分約5或6μM。優(yōu)選鐵離子成分是檸檬酸鐵和/或硝酸鐵，更優(yōu)選檸檬酸鐵占該細(xì)胞培養(yǎng)基中的鐵離子的大部分。該培養(yǎng)基可包含例如約5μM的檸檬酸鐵和約1μM的硝酸鐵。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基還包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分。該培養(yǎng)基優(yōu)選包含Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基DMEM的組成報(bào)道見(jiàn)以下實(shí)施例。
本發(fā)明第二方面涉及一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括在本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明方法的培養(yǎng)步驟可在任何合適的環(huán)境中實(shí)施，例如在皮氏培養(yǎng)皿(Petri dishes)、T-瓶或轉(zhuǎn)瓶中實(shí)施，也可在大體積容器，如生物反應(yīng)器中實(shí)施。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)可采用適合所用特定細(xì)胞類(lèi)型的任何啟動(dòng)子。在一非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)表達(dá)采用金屬硫蛋白質(zhì)(MT)啟動(dòng)子。若用鼠細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)，啟動(dòng)子優(yōu)選鼠MT-1啟動(dòng)子。
本發(fā)明方法優(yōu)選包括收集含有感興趣蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基的步驟。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包括分離感興趣的蛋白質(zhì)。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包括將分離的蛋白質(zhì)與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體配制成藥物組合物。
本發(fā)明第三方面涉及本發(fā)明培養(yǎng)基生產(chǎn)感興趣多肽的用途。
本發(fā)明第四方面涉及在感興趣多肽的生產(chǎn)期間用本發(fā)明的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)的細(xì)胞。
在本發(fā)明各個(gè)方面框架內(nèi)所用的細(xì)胞優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞可以是人來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源?？筛鶕?jù)本發(fā)明方法進(jìn)行培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括例如鼠C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞、COS細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、BHK細(xì)胞、VERO細(xì)胞、CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、rHEK293細(xì)胞、正常人成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞或PER.C6細(xì)胞。可根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的雜交瘤的例子包括例如DA4.4細(xì)胞、123A細(xì)胞、GAMMA細(xì)胞和67-9-B細(xì)胞。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)鼠C127細(xì)胞。
本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞可以是懸浮生長(zhǎng)，或?qū)τ阱^定依賴(lài)性細(xì)胞，則附著于固體支持物。微載體和Fibra-Cel盤(pán)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中用于錨定依賴(lài)性細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可在已建立的技術(shù)平臺(tái)中用于蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)(例如參見(jiàn)Bohak等.1987；Petti等.1994)。
本發(fā)明方法優(yōu)選用于生產(chǎn)感興趣多肽。因此，可用本發(fā)明培養(yǎng)基小規(guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)感興趣的多肽或蛋白質(zhì)，該多肽或蛋白質(zhì)可以是需要生產(chǎn)的任何多肽。
所述感興趣多肽可以是例如天然分泌的蛋白質(zhì)、正常胞質(zhì)蛋白、正?？缒さ鞍?、或人或人源化抗體。當(dāng)感興趣蛋白質(zhì)為天然胞質(zhì)蛋白或天然跨膜蛋白時(shí)，優(yōu)選工程改造該蛋白質(zhì)成為可溶性分泌蛋白質(zhì)，例如在該蛋白質(zhì)或其片段(可溶性或胞外片段)前安置一信號(hào)肽。
感興趣多肽可以是任何來(lái)源，優(yōu)選感興趣多肽為人來(lái)源，更優(yōu)選感興趣蛋白質(zhì)為治療性蛋白質(zhì)。
優(yōu)選所述感興趣蛋白質(zhì)選自激素、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白質(zhì)、干擾素、可溶性受體或抗體。
可根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的治療性蛋白質(zhì)包括例如絨毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促黃體-絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素(尤其是人生長(zhǎng)激素)、干擾素(如干擾素β-1a、干擾素β-1b)、干擾素受體(如干擾素γ受體)、腫瘤壞死因子受體p55和p75和它們的溶解形式、TAC受體及其Fc融合蛋白、白介素(如白介素-2、白介素-11)、白介素結(jié)合蛋白(如白介素-18結(jié)合蛋白)、抗-CD11a抗體、(促)紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經(jīng)期促性腺激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素-C)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凝血調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素、因子VIII、促生長(zhǎng)素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子、水蛭素、紅血球生成素(epoietin)、重組LFA-3/IgG1融合蛋白、葡糖腦苷脂酶、和它們的變體蛋白、片段、溶解形式、功能衍生物、融合蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽選自絨毛膜促性腺激素(CG)、促卵胞激素(FSH)、促黃體-絨毛膜促性腺激素(LH)、促甲狀腺激素(TSH)、人生長(zhǎng)激素(hGH)、干擾素(如干擾素β-1a、干擾素β-1b)、干擾素受體(如干擾素γ受體)、腫瘤壞死因子受體p55和p75、白介素(如白介素-2、白介素-11)、白介素結(jié)合蛋白(如白介素-18結(jié)合蛋白)、抗-CD11a抗體，和它們的變體蛋白、片段、溶解形式、功能衍生物、融合蛋白質(zhì)。
更優(yōu)選感興趣多肽包括例如(促)紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經(jīng)期促性腺激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素-C)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凝血調(diào)節(jié)蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素、因子VIII、促生長(zhǎng)素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子、水蛭素、紅血球生成素、重組LFA-3/IgG1融合蛋白、葡糖腦苷脂酶，和它們的變體蛋白、片段、溶解形式、功能衍生物、融合蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的感興趣蛋白質(zhì)可與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體配制成為藥物組合物。
定義“藥學(xué)上可接受的”意為包括不會(huì)干擾所述活性成分的生物活性效力，和對(duì)給予的宿主無(wú)毒性的任何運(yùn)載體。例如腸胃道外給藥時(shí)，可在媒介物如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液中將所述活性蛋白質(zhì)配制成注射用的單位劑型。
按照本發(fā)明配制的藥物組合物可通過(guò)多種途徑給予個(gè)體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如在緩釋制劑中)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、顱內(nèi)、硬腦膜外、局部、經(jīng)直腸和鼻內(nèi)途徑。也可采用任何其它的治療有效給藥途徑，例如通過(guò)上皮和內(nèi)皮組織吸收或通過(guò)基因治療將編碼活性成分的DNA分子(例如通過(guò)載體)給予病人，基因治療能使活性成分在體內(nèi)表達(dá)和分泌。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其它生物活性藥物的組分，例如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、運(yùn)載體、稀釋劑和媒介物一起給藥。
對(duì)于腸胃道外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))，可將活性蛋白質(zhì)與藥學(xué)上可接受的腸胃道外媒介物(如水、鹽水、葡萄糖溶液)和能維持等滲(例甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉?？刹捎贸Ｒ?guī)的技術(shù)對(duì)該制劑消毒。
本發(fā)明更優(yōu)選采用本發(fā)明的培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)生長(zhǎng)激素。
GH可以是天然GH，例如天然產(chǎn)生的GH。優(yōu)選生產(chǎn)的GH為人源GH。由于GH是可溶性分泌蛋白質(zhì)，所以可通過(guò)其天然的信號(hào)肽或通過(guò)異源信號(hào)肽(即衍生自另一分泌蛋白質(zhì)的可能在所用的特定表達(dá)系統(tǒng)中更為有效的信號(hào)肽)而釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素”與“GH”同義。該術(shù)語(yǔ)包括自然或天然的GH或重組產(chǎn)生的GH，及在“發(fā)明背景”中詳述的GH變體。本文所用術(shù)語(yǔ)“GH”還包括GH的突變蛋白、功能衍生物、活性片段、融合蛋白、循環(huán)性完全變化的蛋白(circularly permutated protein)和鹽。GH優(yōu)選人源，但也可是其它物種來(lái)源，特別是哺乳動(dòng)物來(lái)源。
本文所用術(shù)語(yǔ)“變體蛋白質(zhì)”指天然GH序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為不同氨基酸殘基取代、或缺失、或加入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而產(chǎn)生的與野生型GH相比活性無(wú)明顯減少的GH類(lèi)似物。這些變體蛋白質(zhì)可用已知的合成方法和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)，或其它已知的合適技術(shù)制備。
本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)包括能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與DNA或RNA雜交的編碼GH的核酸(如DNA或RNA)編碼的蛋白質(zhì)。編碼GH的DNA序列本領(lǐng)域先前熟知的。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所稱(chēng)的“嚴(yán)謹(jǐn)”雜交條件和隨后的洗滌條件。參見(jiàn)Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)。嚴(yán)謹(jǐn)條件的非限制性例子包括在所研究雜交物的計(jì)算Tm值以下12-20℃，例如用2xSSC和0.5％SDS處理5分鐘，2xSSC和0.1％SDS處理15分鐘；0.1xSSC和0.5％SDS 37℃處理30-60分鐘和隨后68℃用0.1xSSC和0.5％SDS處理30-60分鐘。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白嚴(yán)謹(jǐn)條件還取決于DNA序列、寡核苷酸探針(例如10-40個(gè)堿基)或混合寡核苷酸探針的長(zhǎng)度。如采用混合探針，優(yōu)選采用四甲基氯化銨(TMAC)替代SSC。參見(jiàn)Ausubel，同上。
通過(guò)序列比較檢測(cè)到的相同性反映了兩條或多條多肽序列或兩條或多條多聚核苷酸序列之間的關(guān)系。相同性通常指相對(duì)于所比較的序列的長(zhǎng)度而言，兩條多聚核苷酸或兩條多肽序列的核苷酸與核苷酸，或氨基酸與氨基酸的精確對(duì)應(yīng)關(guān)系。
對(duì)于不存在精確對(duì)應(yīng)關(guān)系的序列而言，可測(cè)定其“相同性百分比”。通常，將要比較的兩序列進(jìn)行排列使二序列之間最大相聯(lián)。排列包括在一條或二條序列中插入“空格”以提高排列對(duì)比程度?？苫谒容^的各序列的全長(zhǎng)來(lái)測(cè)定相同性百分比(所謂全長(zhǎng)排列對(duì)比)，這特別適用于相同或非常相似的序列，或可基于較短的、特定長(zhǎng)度(所謂局部排列對(duì)比)的序列來(lái)測(cè)定該相同性百分比，這更適合于不等長(zhǎng)的序列排列對(duì)比。
比較兩條或多條序列相同性和同源性的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如可使用在Wisconsin Sequence Analysis Oackage 9.1版中存在的程序(DevereuxJ等，1984)，例如BESTFIT和GAP來(lái)檢測(cè)兩條多聚核苷酸之間的相同性百分比，和兩條多肽序列之間的相同性和同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“局部同源”算法(1981)可發(fā)現(xiàn)兩序列之間的一個(gè)最佳相似區(qū)域。其它檢測(cè)兩序列之間相同性和/或相似性的程序也是本領(lǐng)域熟知的，例如BLAST程序家族(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，從NCBI主頁(yè)www.ncbi.nlm.nih.gov可以獲得)和FASTA程序(Pearson W R，1990).
優(yōu)選所有這種突變蛋白質(zhì)的一段氨基酸序列與GH的氨基酸序列充分相同，例如具有與GH基本上相似的活性。GH的活性之一是能結(jié)合GH受體。只要該突變蛋白實(shí)質(zhì)上能結(jié)合GH受體(GHR)，即可認(rèn)為其具有與GH基本上相似的活性。因此可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定某給定的突變蛋白是否具有與GH基本上相同的活性，該實(shí)驗(yàn)包括對(duì)該突變蛋白質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的夾心競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，檢測(cè)其是否能結(jié)合適當(dāng)標(biāo)記的GHR或表達(dá)GHR的細(xì)胞，例如可采用放射性免疫試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，這類(lèi)突變蛋白與GH的氨基酸或DNA序列至少具有40％相同性或同源性。這些序列是本領(lǐng)域熟知的，例如見(jiàn)DeNoto等，1981或Martial等，1979所述。
更優(yōu)選該突變蛋白具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或最優(yōu)選至少90％或95％相同性或同源性。
本發(fā)明突變蛋白中優(yōu)選的變化是所謂的保守性置換。GH多肽的保守氨基酸置換包括理化特性充分相似的同組成員中的同義氨基酸置換因而保留了該分子的生物學(xué)功能(Grantham，1974)。清楚的是，在上述序列中也可有氨基酸插入和缺失而不會(huì)改變它們的功能，尤其是插入或缺失只涉及很少的氨基酸，例如30個(gè)以下，優(yōu)選10個(gè)以下，但不去除或置換功能構(gòu)型的關(guān)鍵氨基酸(如半胱氨酸殘基)。通過(guò)這種缺失和/或插入而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白質(zhì)”指含有與另一蛋白質(zhì)(如能延長(zhǎng)體液中存留時(shí)間的蛋白)融合的GH、或其突變蛋白或片段的多肽。因此可將GH與另一蛋白質(zhì)、多肽等，例如免疫球蛋白質(zhì)或其片段融合。IgG的Fc部分適合于制備免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。Ig融合蛋白的例子在歐洲專(zhuān)利EP314,317 A1(Genentech)或EP0,325,224 A2(Zymogenetics Inc.)中有描述。
作為GH或其突變蛋白和融合蛋白的“活性片段”，本發(fā)明包括單獨(dú)的或與其相連的結(jié)合的分子或殘基(例如糖或磷酸殘基)一起的蛋白分子的多肽鏈的任何片段或前體，或該蛋白質(zhì)分子或其糖基的凝聚物，只要所述片段具有與GH基本上相似的活性。
本發(fā)明的GH應(yīng)以藥物組合物使用，可用該組合物治療和/或預(yù)防許多疾病或病癥。這些疾病和病癥優(yōu)選涉及內(nèi)源GH生產(chǎn)不足。純化的GH可用于如治療和/或預(yù)防GH不足、AIDS消瘦、脂肪代謝障礙(也稱(chēng)為HARS-HIV-相關(guān)畸變/代謝障礙綜合癥)，或短腸綜合征，尤其是兒科疾病。其它需要給予生長(zhǎng)激素的適應(yīng)癥包括肝硬化、成人生長(zhǎng)激素缺乏癥(adult growth deficiency)、動(dòng)脈硬化癥、克羅恩(節(jié)段性回腸炎)病和潰瘍性結(jié)腸炎、骨關(guān)節(jié)炎、心源性惡病質(zhì)、充血性心力衰竭、慢性腎功能不全、血細(xì)胞重建和動(dòng)員、男性不育、造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)移、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)、多系統(tǒng)萎縮癥、或癌癥。
現(xiàn)已充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，不需要過(guò)多的試驗(yàn)即可以大范圍的同等參數(shù)、濃度和條件實(shí)施本發(fā)明。
雖然本發(fā)明已結(jié)合具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)知道仍能對(duì)其作進(jìn)一步修改。本申請(qǐng)包括遵循本發(fā)明的原理作出的任何變化、應(yīng)用或修改，包括例如本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或常規(guī)實(shí)踐范圍內(nèi)的偏差變動(dòng)(departure)以及可能會(huì)被應(yīng)用于上文所述必要特征的那些變化、應(yīng)用或修改這些都屬于本發(fā)明附帶權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
本文所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括期刊雜志論文或摘要、發(fā)表或未發(fā)表美國(guó)或外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、出版的美國(guó)或外國(guó)專(zhuān)利或其它文獻(xiàn)均納入本文參考文獻(xiàn)，包括引用文獻(xiàn)中的所有數(shù)據(jù)、表格、圖形和文本。另外，本文引用文獻(xiàn)中所引用文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容也納入作為參考。
參見(jiàn)已知的方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法，并非承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨敢言谙嚓P(guān)領(lǐng)域作了公開(kāi)、說(shuō)明或提出。
上述具體實(shí)施方案的描述完全揭示了本發(fā)明的整體性質(zhì)，使得其他人在不脫離本發(fā)明的總體構(gòu)思的情況下，可運(yùn)用本領(lǐng)域的知識(shí)(包括本文中所引用參考文獻(xiàn)中的內(nèi)容)，無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，不難修改和/或改編本發(fā)明的具體實(shí)施方案而提供各種應(yīng)用。因此，根據(jù)本文的說(shuō)明或指導(dǎo)作出的這類(lèi)改編和修改仍應(yīng)認(rèn)為屬于本文公開(kāi)的實(shí)施方案的等同范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)知道本文所用的詞匯或術(shù)語(yǔ)目的是描述而不是限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照本文提供的說(shuō)明和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)來(lái)解釋本說(shuō)明書(shū)中的詞匯或術(shù)語(yǔ)。
實(shí)施例開(kāi)發(fā)用于C127細(xì)胞表達(dá)hGH的新型無(wú)血清培養(yǎng)基產(chǎn)品1.簡(jiǎn)介本研究描述的實(shí)驗(yàn)工作涉及開(kāi)發(fā)加有微量金屬元素的培養(yǎng)基產(chǎn)品(DMEM，“Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)。開(kāi)發(fā)該產(chǎn)品的結(jié)果是，在C127細(xì)胞培養(yǎng)物中r-hGH產(chǎn)量的顯著提高。
下表1小結(jié)了本實(shí)施例框架內(nèi)所提供的DMEM的組成和及開(kāi)發(fā)。
表1生長(zhǎng)培養(yǎng)基，DMEM和生產(chǎn)培養(yǎng)基配方
2.材料和方法試劑和溶液所有化學(xué)試劑購(gòu)自Merck硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、氯化鋇(BaCl2·2H2O)、氯化鈷(CoCl2·6H2O)、硫酸鉻鉀(K[Cr(SO6H4)2(H2O)2]·6H2O)、硝酸鎳(Ni(NO3)2·6H2O)、亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O)。檸檬酸鐵(FeC6H5O7Sigma目錄號(hào)F3388)作為鐵離子來(lái)源。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基微量元素混和液(100,000X)由JRHBiosciences提供。
所有待檢測(cè)的微量元素用蒸餾水配成濃縮液并用0.2μm濾膜過(guò)濾除菌。
不同實(shí)驗(yàn)中將不同的測(cè)試添加物(金屬溶液等)直接加入到新鮮培養(yǎng)基中。
細(xì)胞培養(yǎng)用遺傳改造的C127鼠細(xì)胞(ATCC CRL 1616)表達(dá)重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)。載體基于BPV69T，含有pBR322多克隆位點(diǎn)和在小鼠金屬硫蛋白-1(MT-1)啟動(dòng)子控制下的1.6kb rhGH微小基因。實(shí)驗(yàn)中使用產(chǎn)生自用不同rhGH生產(chǎn)批次獲得的工作細(xì)胞庫(kù)的培養(yǎng)物。
將細(xì)胞培養(yǎng)物保持在36℃±0.5℃以0.4rpm培育的含375mL±15mL培養(yǎng)基的2125cm2轉(zhuǎn)瓶或含300mL培養(yǎng)基的1700cm2轉(zhuǎn)瓶中。
培養(yǎng)基rhGH生產(chǎn)階段所用培養(yǎng)基為DMEM，含4.5g/L葡萄糖，用碳酸氫鈉溶液(3.7g/L)緩沖。
RHGH滴定每天用反相HPLC滴定檢測(cè)培養(yǎng)基中的rhGH含量材料Synchropak RP4，100×4.6毫米內(nèi)徑，300Cat#C4R103-10(Eichrom)。
Resource RPC 1mL，30mm×6.4mm內(nèi)徑，15μm，art 17-1181-01，AmershamBiosciences。
Symmetry300，50mm×4.6內(nèi)徑，C4 5μm，P/N186000287(Waters)。
試劑三氟乙酸(TFA)(Pierce，Cat#28904或等同物)。
乙腈(ACN)(Merck 1.00030或等同物)。
純水，PW(如MilliQ水，或等同物)。
氦氣溶液流動(dòng)相ATFA 0.08％，用水配制(v/v)用量筒量取PW水并按下表加入TFA。攪拌并標(biāo)記。
流動(dòng)相BTFA 0.08％的乙腈溶液(v/v)用容量瓶量取PW水并按下表加入TFA。攪拌并標(biāo)記。
層析條件-梯度洗脫以60/40比例的相A/相B混合液開(kāi)始，以20/80比例的相A/相B混合液結(jié)束。5分鐘內(nèi)完成梯度洗脫(可根據(jù)所用儀器做輕微改變)-上樣體積50μl-檢測(cè)215nm處的UV吸光度-標(biāo)準(zhǔn)曲線10，50，100，120和150μg/ml的r-hGH標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)r-hGH濃度比較確定樣品的r-hGH濃度。
GH產(chǎn)量產(chǎn)量表示為每轉(zhuǎn)瓶rhGH的毫克數(shù)。初始數(shù)據(jù)為收獲時(shí)的rhGH濃度(HPLC檢測(cè))和轉(zhuǎn)瓶總數(shù)。通常轉(zhuǎn)瓶在收獲期含約109個(gè)細(xì)胞。
3.結(jié)果在第一系列實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了在培養(yǎng)基中間歇性加入高濃度鈷(20μMCoCl2.6H2O)的作用。在一批培養(yǎng)的最初步驟(清洗，PM＝生產(chǎn)培養(yǎng)基，即收獲期的0點(diǎn))和生產(chǎn)階段的中間步驟中(收獲6和7)兩種培養(yǎng)基互換時(shí)加入。結(jié)果(沒(méi)有顯示)提示此啟動(dòng)子具有活性并可調(diào)節(jié)。
提高產(chǎn)量用其它金屬元素得到進(jìn)一步證實(shí)。將10μM濃度的鋇(BaCl2·2H2O)、鈷(CoCl2·6H2O)、鉻(K[Cr(SO6H4)2(H2O)2]·6H2O)和鎳(Ni(NO3)2·6H2O)各自連續(xù)加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2描述。
圖1顯示在實(shí)驗(yàn)期間(14天)，當(dāng)在含有測(cè)試元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)hGH的C127細(xì)胞分泌的hGH量。圖2顯示各個(gè)測(cè)試元素所達(dá)到的產(chǎn)量平均值。與無(wú)微量元素的對(duì)照值相比較，獲得的平均產(chǎn)量增加百分比范圍是鋇1.1％和鈷32.4％。還注意到當(dāng)試驗(yàn)中連續(xù)或間歇性加入鈷時(shí)，rhGH產(chǎn)量與對(duì)照值相比增加了9％-32.5％。測(cè)試濃度的鋇和鉻在DMEM中都不顯示產(chǎn)量增加。
各微量元素的檢測(cè)在DMEM按下表2中所列濃度加入微量元素Zn、Cu、Se和Co。這些濃度與生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的金屬元素濃度相對(duì)應(yīng)。表2顯示在DMEM中添加微量元素導(dǎo)致rhGH產(chǎn)量獲得提高。
表2當(dāng)在DMEM中測(cè)試所示濃度(μM)的金屬離子時(shí)，rhGH產(chǎn)量增加百分?jǐn)?shù)
應(yīng)注意1.5μM測(cè)試濃度的鋅可導(dǎo)致細(xì)胞“剝脫”現(xiàn)象，即細(xì)胞單層從轉(zhuǎn)瓶塑料底層脫離。在一些情況下，這種剝脫可導(dǎo)致在最后收獲步驟(通常介于收獲12-14)時(shí)培養(yǎng)物的損失。采用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)容器，例如購(gòu)自Corning公司商標(biāo)名Cellbind的轉(zhuǎn)瓶可以避免這種細(xì)胞剝脫現(xiàn)象。
檢測(cè)金屬(離子)之間的相互作用根據(jù)銅和鋅對(duì)hGH生產(chǎn)產(chǎn)量的影響，進(jìn)行了因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)金屬組合的可能影響。
結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見(jiàn)表3所示。發(fā)現(xiàn)聯(lián)用Cu和Zn對(duì)產(chǎn)量有很強(qiáng)的協(xié)同作用(p≤0.0001)。
表3三因子因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析產(chǎn)量變化分析
R-平方＝98.1139％R-平方(基于d.f.調(diào)整)＝96.8565％無(wú)論是否有銅存在，所有經(jīng)1.5μM濃度鋅處理的培養(yǎng)物均觀察到細(xì)胞剝脫現(xiàn)象。
進(jìn)行了隨后的因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以研究當(dāng)降低鋅濃度(Zn0.5μM)和加入其它微量元素(例如可提高產(chǎn)量和培養(yǎng)物粘附基底層的錳、硒、檸檬酸鐵)到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)同時(shí)加入鋅與銅對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的影響。
持續(xù)培養(yǎng)獲得從起始時(shí)間點(diǎn)的每轉(zhuǎn)瓶約20mg rhGH普通產(chǎn)量，達(dá)到終點(diǎn)值每轉(zhuǎn)瓶接近70mg rhGH，而與之比較標(biāo)準(zhǔn)DMEM(未顯示)對(duì)照培養(yǎng)物為30mgrhGH。與對(duì)照相比GH產(chǎn)量(即第14天時(shí)檢測(cè)的每轉(zhuǎn)瓶mg數(shù))增加平均值見(jiàn)圖3。
在本系列實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞剝脫離現(xiàn)象減少。
添加氨基酸進(jìn)行了氨基酸分析以檢測(cè)hGH產(chǎn)量增加是否受到任何氨基酸的可用性的限制。表4顯示用加和不加鋅和銅培養(yǎng)兩天后收獲的培養(yǎng)基的氨基酸百分比。
表4培養(yǎng)兩天后收獲的粗培養(yǎng)基中氨基酸濃度百分比，得自用標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行的培養(yǎng)或添加了0.5μM Zn、0.02μM Cu和4.8μM檸檬酸鐵的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行的培養(yǎng)。
檢測(cè)了銅、鋅和檸檬酸鐵混合物(Zn 0.5μM，Cu 0.02μM和檸檬酸鐵4.8μM)和以最高比例消耗的那些氨基酸的組合L-谷氨酰胺(Gln 4.8mM)，L-絲氨酸(Ser0.49mM)和L-胱氨酸(Cys 0.29mM)。結(jié)果見(jiàn)圖4所示。
任何測(cè)試的氨基酸單獨(dú)或聯(lián)合都未見(jiàn)到對(duì)產(chǎn)量有正面作用。
當(dāng)金屬元素與氨基酸一起加入時(shí)，觀察到對(duì)產(chǎn)量只有微小影響谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)量有輕微正面影響(78.2％升至81.1％)和胱氨酸對(duì)產(chǎn)量有負(fù)面影響(78.2％降至69.9％)。這種差異認(rèn)為不顯著。
使用含有金屬混合物的DMEM所測(cè)得的結(jié)果(每轉(zhuǎn)瓶每次收獲的平均值約為50mg rhGH)與使用不含金屬元素DMEM的培養(yǎng)(每轉(zhuǎn)瓶每次收獲的平均值約30mg rhGH)的產(chǎn)量差異顯著。鑒于這些結(jié)果，認(rèn)為不需要對(duì)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的原先氨基酸成分進(jìn)行修改。
滴定銅和鋅的作用為了檢測(cè)銅的最佳濃度，保持檸檬酸鐵濃度(4.8μM)和鋅濃度(0.5μM)不變而改變銅的濃度進(jìn)行了試驗(yàn)(圖5)。
如圖5所示，劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)鋅和檸檬酸鐵為所示濃度時(shí)，DMEM培養(yǎng)基中銅的最佳添加濃度為25.6nM在另一實(shí)驗(yàn)中，保持檸檬酸鐵濃度(4.8μM)和銅濃度(0.025μM)不變而改變鋅的濃度(圖6)鋅濃度大于200nM時(shí)觀察到最高產(chǎn)量水平(平臺(tái))，產(chǎn)量穩(wěn)定地高出對(duì)照平均值約60％。
結(jié)果總結(jié)圖7總結(jié)了微量鋅和銅離子，聯(lián)用或不聯(lián)用鐵離子獲得的結(jié)果以下數(shù)值基于為提高產(chǎn)量通過(guò)在DMEM培養(yǎng)基中添加金屬微量元素而獲得的數(shù)據(jù)鋅1.5μM10.3％±5.0％，鋅0.5μM16.8％±1.6％銅0.02μM32.1％±9.4％，鋅1.5μM+銅0.02μM66.3％±16％鋅0.5μM+銅0.02μM61.2％(±10％)鋅0.5μM+銅0.02μM+檸檬酸鐵4.8μM69.4％±19％.
鑒于以上數(shù)據(jù)，以下混合物為DMEM培養(yǎng)基的最佳添加物●以硫酸銅(CuSO4·5H2O)形式提供的銅，25nM銅，硫酸銅
●以硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)形式提供的鋅，50nM-1500nM，優(yōu)選濃度范圍為200-500nM的鋅●檸檬酸鐵，4.8μM，鑒于EMEM中已有硝酸鐵，該離子的最終濃度為6μM。
結(jié)論與標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基相比，在DMEM培養(yǎng)基中使用微量的銅、鋅和檸檬酸鐵作為補(bǔ)充，rhGH產(chǎn)量提高了50％以上。
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40.EP27444541.EP314317A142.EP0325224A243.WO01/1629權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)生長(zhǎng)激素的方法，其特征在于，該方法包括在無(wú)得自動(dòng)物血清的組分的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)生長(zhǎng)激素的細(xì)胞系細(xì)胞的步驟，所述培養(yǎng)基含有濃度為0.2μM-1.75μM的鋅和濃度為10nM-75nM的銅。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其中所述培養(yǎng)基還含有濃度為1-10μM的鐵離子。
3.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.2μM的鋅。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.5μM的鋅。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基所含的鋅是硫酸鋅。
6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有25nM的銅。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基所含的銅是硫酸銅。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含5μM或6μM的鐵離子。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有的鐵離子為檸檬酸鐵和/或硝酸鐵的鐵離子。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述生長(zhǎng)激素在金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述金屬硫蛋白啟動(dòng)子是小鼠MT-1啟動(dòng)子。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述方法還包括從細(xì)胞培養(yǎng)物收集生長(zhǎng)激素的步驟。
15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述方法還包括純化生長(zhǎng)激素。
16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述該方法還包括將純化的生長(zhǎng)激素與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體制備成藥物組合物。
17.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法或應(yīng)用，其中所述生長(zhǎng)激素為人生長(zhǎng)激素。
18.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在生產(chǎn)生長(zhǎng)激素中的用途。
19.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在生產(chǎn)生長(zhǎng)激素期間維持培養(yǎng)的細(xì)胞用的用途。
20.如權(quán)利要求18或19所述的用途，其中所述生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激素。
21.如權(quán)利要求18-19中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述細(xì)胞為小鼠C127細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制造蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101052708SQ200580037602
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者J·卡薩托瑞斯埃爾南德斯, C·馬丁皮拉 申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司