專利名稱：趨化因子ccl18作為生物標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在穩(wěn)態(tài)應(yīng)答和病理應(yīng)答中，白細(xì)胞運輸?shù)恼{(diào)節(jié)在很大程度上通過趨化因子來完成。趨化因子包括一大類同源蛋白質(zhì)，其通過結(jié)合細(xì)胞表面的七螺旋G蛋白偶聯(lián)的受體行使它們的生物功能。CCL18，又被稱為DC-CK1、PARC、AMAC-1和MIP-4，是一種與CCL3結(jié)構(gòu)相關(guān)的人趨化因子。目前，CCL18沒有小鼠等同物，其受體未知。CCL18在生發(fā)中心和扁桃體由樹突狀細(xì)胞(DC)組成型表達(dá)，其顯示主要吸引幼稚T細(xì)胞、CD38-帽狀區(qū)(mantle zone)B淋巴細(xì)胞和DC?？乖蔬f細(xì)胞(APC)對CCL18的產(chǎn)生能夠被Th2細(xì)胞因子(如IL-4、IL-13)增加，而被IFN-γ抑制。
遺傳過敏性皮炎(AD)是由T輔助細(xì)胞2(Th2)介導(dǎo)的慢性炎性皮膚疾病，其特征為濕疹性皮膚損傷，例如特征為伴隨有表皮細(xì)胞間水腫的強烈瘙癢的紅斑丘疹。AD的皮膚損傷在組織病理學(xué)上展現(xiàn)為由巨噬細(xì)胞、增多的承載IgE的朗氏細(xì)胞(LC)、炎性的樹突狀表皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD4+Th細(xì)胞組成的單核細(xì)胞浸潤(見例如Leung DY.，J.AllergyClin.Immunol.2000，105860-76)。急性損傷中的Th細(xì)胞主要產(chǎn)生如IL-4、IL-5和IL-13的Th2細(xì)胞因子，而在慢性AD中也存在分泌IFN-γ的Th細(xì)胞。被認(rèn)為介導(dǎo)Th細(xì)胞進(jìn)入AD皮膚的歸巢行為的趨化因子包括CCR4的配體CCL17、CCL22和CCR10的配體CCL27。然而，可能需要另外的趨化信號來特別招募專門的T細(xì)胞亞群。
目前，尚無用于AD的可靠的實驗室標(biāo)記，但是AD患者經(jīng)常有增高的IgE水平和對食物及其它普通過敏原(如花粉、霉菌和昆蟲)的過敏性反應(yīng)。無論過敏原類型怎樣，都非常需要能夠用于了解AD患者的病理學(xué)狀態(tài)以及決定疾病治療方案的診斷參數(shù)。對患者傷害較少并能方便的提供診斷所需信息的過敏疾病標(biāo)記將非常有用。

發(fā)明內(nèi)容
我們發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，患者(如AD患者)體液(如血液)中的CCL18以及CCL18分泌細(xì)胞水平顯著提高，所述分泌細(xì)胞如APC(包括單核細(xì)胞)和DC。這個發(fā)現(xiàn)和其它發(fā)現(xiàn)突出了CCL18作為生物標(biāo)記的有用性。
一方面，本發(fā)明提供趨化因子CCL18用作個體體液樣品中的生物標(biāo)記。
用在本發(fā)明中的“生物標(biāo)記”指對個體體液樣品中CCL18的測定(檢測和/或量化)是這類病癥的指示和/或紊亂狀況的監(jiān)控。
個體體液樣品可以來自血液，如分離的單核細(xì)胞，或者來自血液級分，如血漿或血清，如血清。
另一方面，本發(fā)明提供了CCL18作為血液樣品(如血清)中的生物標(biāo)記的用途。
本文用到的CCL18包括全長CCL18蛋白、CCL18蛋白片段、CCL18蛋白突變體、CCL18衍生物和分泌(產(chǎn)生)CCL18的細(xì)胞，如包括單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。CCL18的片段、突變體和衍生物中保留了CCL18的生物標(biāo)記特征。
根據(jù)本發(fā)明，CCL18作為生物標(biāo)記的用途指在上述個體樣品中的CCL18得到檢測，如使用包括測定領(lǐng)域常規(guī)的測定法的檢測手段，如免疫測定法，例如酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于熒光的測定法，例如解離增強的鑭熒光免疫測定法(DELFIA)或者放射性分析測定法。本發(fā)明的檢測手段包括如特異性識別CCL18的分子，如可直接或間接檢測的分子。本發(fā)明檢測手段優(yōu)選包括抗體，包括抗體衍生物或它的片段，如識別CCL18的抗體，或帶有標(biāo)簽的CCL18識別抗體。
另一方面，使用CCL18特異性抗體來測定CCL18水平。
標(biāo)簽可以是常規(guī)的，如生物素或酶，例如堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)或過氧化物酶(POD)或熒光分子，如熒光染料，例如異硫氰酸熒光素。優(yōu)選標(biāo)簽是生物素?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法檢測帶有標(biāo)簽的分子(如帶有標(biāo)簽的抗體)，如通過熒光測量或酶檢測的方法。
在優(yōu)選的方面，使用識別CCL18的抗體作為檢測手段，如使用標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)的抗體形式。
個體的體液樣品(如血液)中的CCL18分泌細(xì)胞可以用例如下文描述的常規(guī)方法確定?？梢匀缤ㄟ^經(jīng)密度梯度分離，從樣品(如血液)中純化細(xì)胞，并且染色獲得的純化細(xì)胞。任選地刺激細(xì)胞(如用白細(xì)胞介素-4刺激)之后，將抗CCL18抗體(如熒光標(biāo)記的抗CCL18抗體)加入經(jīng)染色的細(xì)胞制品并檢測CCL18分泌細(xì)胞的水平。
任選地，將樣品中包含的CCL18或檢測手段中包括的識別CCL18的分子(如可檢測的分子)固定于固相。合適的固相包括如常規(guī)的材料，如聚苯乙烯或聚乙烯板之類的塑料板，尤其是微量滴定板。微珠也可被用作固相，如包被的微珠。固相可以用包被材料包被，該材料的性質(zhì)取決于檢測手段中包括的標(biāo)簽。包被材料應(yīng)該能與標(biāo)簽結(jié)合，如標(biāo)簽是生物素而包被材料包含鏈霉抗生物素蛋白，例如其共價結(jié)合到固相。
另一方面，本發(fā)明提供趨化因子CCL18在選自過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病的個體體液樣品中用作生物標(biāo)記。
另一方面，本發(fā)明提供趨化因子CCL18在與遺傳過敏性皮炎相關(guān)的紊亂或疾病的個體體液樣品中作為生物標(biāo)記的用途。
本發(fā)明使用的“紊亂和疾病”包括選自過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的多種類型和嚴(yán)重度的紊亂和疾病。過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂包括如過敏性肺炎、春季發(fā)生的角膜結(jié)膜炎、接觸性過敏以及與遺傳過敏性皮炎有關(guān)的包括多種炎性皮膚疾病(如遺傳過敏性皮炎)的紊亂或疾病。
另一方面，本發(fā)明提供用于篩選和/或體外診斷個體中選自過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病的方法，該方法包括a)提供個體體液樣品，b)測定步驟a)提供的上述樣品中的CCL18水平，c)將步驟b)測定的CCL18水平與來自健康對照個體體液樣品的參考水平相比較，和d)通過確定步驟b)測定的上述CCL18水平是否顯著不同于上述參考水平，篩選和/或體外診斷選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病。
CCL18的測定按如上所述進(jìn)行，使用如特異識別生物標(biāo)記的分子(如抗體、抗體衍生物、抗體片段，如抗CCL18抗體、如商業(yè)可獲得的CCL18特異性抗體)，通過如免疫診斷分析的方法。
另一方面，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測物質(zhì)對個體的治療功效的方法，該物質(zhì)預(yù)期能夠減輕或治愈選自過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病，該方法包括測定CCL18在上述個體體液樣品中的水平并且與施用上述物質(zhì)之前的CCL18水平相比較。
另一方面，本發(fā)明提供了在個體體液樣品中篩選和/或體外診斷選自過敏性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病的試劑盒，其包括a)識別CCL18蛋白或其部分的分子，任選為標(biāo)記的形式，b)使用說明書，c)任選的檢測方法，d)任選的固相。
由本發(fā)明提供的這類試劑盒還可包含重要組分，包括測定樣品的適宜環(huán)境和例如測定樣品中CCL18的適當(dāng)手段。


圖1CCL18在AD中的表達(dá)。染色來自AD、銀屑病或健康皮膚的損傷活檢組織的冰凍切片以確定CCL18的表達(dá)。
圖2CCL18在AD中的表達(dá)。用所示抗體對AD皮膚活檢組織的冰凍切片進(jìn)行雙免疫熒光染色。原始放大200×(圖1)和400×(圖2)。
圖3CCL18的血清水平。用IL-4刺激來自AD患者(n＝8)和對照(n＝13)的PBMC。產(chǎn)生CCL18的單核細(xì)胞和分泌CCL18的CD11c+血液DC在PBMC中的百分率用盒圖表示。分析顯示了AD的單核細(xì)胞和對照之間(各自的平均值為7.1％和1.3％，p＜0.003)以及AD的DC和對照之間(各自的平均值為5.6％和1.9％，p＜0.001)的顯著性差異。
圖4CCL18的血清水平。AD患者(n＝36)血清中的CCL18水平顯著高于健康對照(n＝28)受試者(各自的平均值為34.9ng/ml和10.7ng/ml，p＜0.0003)。
圖5CCL18的血清水平。疾病重度分?jǐn)?shù)(severity disease scores)(IGA)不同的AD患者之間，CCL18的血清水平的圖形分布。
圖6CCL18的血清水平。AD患者的CCL18和CCL22血清水平間的聯(lián)系。實心圓包括極輕度的到重度的疾病表現(xiàn)的患者(r＝0.6，p＜0.003)。空心圓表示被排除于相關(guān)性分析之外的最高重度分?jǐn)?shù)的患者。
圖7源自AD的記憶T細(xì)胞的CCL18結(jié)合情況。AD皮膚中結(jié)合CCL18(紅)和表達(dá)CD3(深藍(lán))細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析。用HE復(fù)染(原始放大1000×)。
圖8源自AD的記憶T細(xì)胞的CCL18結(jié)合情況。在源自AD的靜息T細(xì)胞系和克隆中的CCL18或CCL22結(jié)合細(xì)胞，趨化因子用熒光(F)標(biāo)記。CD4+且結(jié)合CCL18的T細(xì)胞的百分率在右上角給出。
圖9源自AD的記憶T細(xì)胞的CCL18結(jié)合情況。結(jié)合CCL18的T細(xì)胞系NIT中對CCR3的FACS染色。
圖10源自AD的記憶T細(xì)胞的CCL18結(jié)合情況。T細(xì)胞系NIT中CCL18-F和CCL22-F結(jié)合的FACS。FACS染色都代表了5-10個重復(fù)實驗的結(jié)果，并且在不同的T細(xì)胞系和克隆中相一致。
圖11源自AD的記憶T細(xì)胞在體外和體內(nèi)應(yīng)答CCL18的遷移。在趨化室測定(chemotaxis chamber assay)中，源自AD皮膚的T細(xì)胞對于CCL18(實心圓)和CCL22(空心正方)的濃度增加有顯著應(yīng)答(p＜0.05)。通過與特異性中和的單克隆抗體孵育封閉最高濃度的細(xì)胞。每個數(shù)據(jù)點評估四個重復(fù)實驗，以平均值±SE表示。給出的是15次實驗其中2次的結(jié)果。
圖12源自AD的記憶T細(xì)胞在體外和體內(nèi)應(yīng)答CCL18的遷移。在SCID-hu皮膚小鼠中人記憶T細(xì)胞向人皮膚移植物的遷移。將CCL18(n＝8)、CCL22(n＝8)或PBS(n＝9)注射入人皮膚移植物并通過FACS分析評估記憶T細(xì)胞的皮膚歸巢。CCL18誘導(dǎo)T細(xì)胞系NIT和T細(xì)胞克隆98016T.02顯著遷移(p＜0.05)。給出的是4次獨立實驗中2次的結(jié)果。下列實施例中的溫度用攝氏度表示且未加校正。
使用到下列縮寫AD遺傳過敏性皮炎APC 抗原呈遞細(xì)胞BSA 牛血清白蛋白CFSE 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯DC樹突細(xì)胞EASI 濕疹面積嚴(yán)重度指數(shù)ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定法FACS 熒光激活細(xì)胞分選術(shù)FACS緩沖液含有2％FCS和0.1％NaN3的PBSFCS 胎牛血清FITC 異硫氰酸熒光素IGA 研究員的全球評估(Investigator’s GlobalAssessment)IL白細(xì)胞介素LC朗格漢斯細(xì)胞mAb 單克隆抗體PBMC 外周血單核細(xì)胞PBS 磷酸鹽緩沖鹽水RPMI Roosevelt Park Memorial研究所開發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)基RT 室溫SCID重度聯(lián)合免疫缺陷SCID-hu Skin mice 移植人皮膚的SCID小鼠SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差SE 標(biāo)準(zhǔn)誤差Th T輔助細(xì)胞實施例方法患者血液樣品得自36個AD患者和28個非特異反應(yīng)性的健康對照。臨床上嚴(yán)重性用EASI和IGA記錄(見如，Hanifin，J.M.，等人，Exp.Dermatol.2001，1011-18)。患者群體的組成用IGA評分幾乎清除n＝3，輕度疾病n＝0，中度疾病n＝15，重度疾病n＝10，超重度疾病n＝4。在采集血液樣品和皮膚活檢組織之前至少4周，患者未受到任何全身或局部免疫抑制藥物的治療。
細(xì)胞純化和培養(yǎng)來自人血液的PBMC用Ficoll-PaqueTMPlus(Amersham Biosciences)以密度梯度分離制備。源自AD的T細(xì)胞系(NIT、SVT、DK2-JOT)和克隆(98016T.02、98016T.24)表達(dá)皮膚的淋巴細(xì)胞抗原(CLA)、CCR4并且在激活后呈現(xiàn)Th2/Th0細(xì)胞因子分泌方式，該細(xì)胞系和克隆產(chǎn)生自損傷的穿孔活檢組織，如描述于-Carballido，J.M.等人，J.Immunol.1997，1594316-4321，-Biedermann，T.等人，Eur.J.Immunol.2002，323171-3180。
T細(xì)胞在補充了重組人IL-2(20ng/ml)的X-Vivo15培養(yǎng)基(BioWitthaker)中培養(yǎng)。
流式細(xì)胞計數(shù)在冰上用FACS緩沖液染色細(xì)胞30分鐘。使用到下列單克隆抗體及其相應(yīng)的同種型CD3-Pe、CD3-Percp、CD4-Pe、CD4-Percp、CD8-Percp、CD14-FITC、CD19-FITC、CD20-FITC、CD62-Pe、CD56-FITC、HLADR-Cychrome、CCR4-Pe(BD Pharmingen)、CD3-APC、CD3-FITC、CD4-APC、CD11a-Pe、CD11c-APC、CD19-APC、(Caltag)、CCR3-Pe、CCR5-Pe、CCR7-Pe、CXCR3-Pe、CXCR4、CXCR6-Pe(R&D Systems)。CCL22-Alexa647由Dictagene提供。CCL18(Peprotech)按照廠商指示用FITC或生物素(Molecular Probes)標(biāo)記。用BD CELLTMQUEST軟件在FACSCaliburTM(BD)型流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。
用IL-4刺激單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)CCL18的檢測取自AD患者(n＝8)和對照(n＝13)的PBMC用或不用10ng/ml重組人IL-4刺激(5×105細(xì)胞/ml)48小時并在最后3小時用布雷菲德菌素A(10μg/ml，Sigma)處理。通過CD14染色識別單核細(xì)胞，骨髓的DC被確定為HLA-DR+、lin(CD3、14、19、20、56)-PBMC中的CD11c+級分。為了對細(xì)胞內(nèi)的CCL18染色，用4％低聚甲醛(Sigma)固定表面染色的細(xì)胞，0.5％皂苷(Sigma)透化細(xì)胞，以山羊抗人CCL18單克隆抗體繼之以猴抗山羊Pe(DPC Biermann)染色。山羊血清(Sigma)被用作同種型對照。
ELISA用Duoset ELISA測定法測定血清CCL18和CCL22水平。
趨化性測定將30μl趨化因子或?qū)φ张囵B(yǎng)基(含有0.5％BSA的RPMI 1640)加入96孔趨化室(Neuro Probe)的下層孔中。鈣熒光素AM(1μM，MolecularProbes)標(biāo)記的細(xì)胞以3×106細(xì)胞/ml接種于上層室和下層室中選作用來得到100％遷移值的孔。上下兩室區(qū)用3μm孔徑的聚碳酸酯濾膜(NeuroProbe)分開。在37℃孵育2.5小時后，移去濾膜，翻轉(zhuǎn)板丟棄上清液。向每孔加入20μl 0.4％的Triton-X100(Sigma)。遷移度使用Victor II(Wallac)多孔板讀取器通過讀取熒光而量化。
SCID-hu皮膚小鼠中的體內(nèi)遷移測定根據(jù)機構(gòu)和政府的倫理學(xué)指南，使用如Carballido，J.M.等人，J.Immunol.Methods 2003，273125-135所述方法向SCID(C.B-17/GbmsTac-PrkdcscidLystbg)小鼠(Taconic M&B)移植人皮膚片，其獲得自WHRTB，Petz Aladár County Hospital Gyr，匈牙利。趨化因子誘導(dǎo)的人T細(xì)胞的皮膚歸巢實驗使用經(jīng)改良的Biedermann，T.等人在Eur.J.Immunol.2002，23171-3180中提到方法進(jìn)行。源自AD皮膚的T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記(Molecular Probes，1M于PBS室溫5分鐘)，并且以5×107細(xì)胞/小鼠的細(xì)胞量靜脈注射入移植了人皮膚的SCID小鼠(SCID-hu皮膚小鼠)。其后立即向人皮膚移植物皮內(nèi)注射CCL18或CCL22(300ng于30μl PBS，R&D)或僅注射PBS。24小時后，皮膚移植物被移出并處理成單細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS染色分析確定于活細(xì)胞級分(碘化丙啶陰性)中存在的CD3+、CFSE+細(xì)胞的百分率。
免疫組織學(xué)來自健康人(n＝3)正常皮膚和AD患者(n＝10)或銀屑病患者(n＝3)的損傷皮膚的5μm的恒冷箱切片，經(jīng)過丙酮固定后用山羊抗CCL18單克隆抗體(R&D)或山羊血清和生物素化的馬抗山羊IgG(Vector)并隨后加入綴合抗生物素蛋白的堿性磷酸酶(AP)和萘酚AS磷酸鹽/FAST RedTR底物(Sigma)染色。AD樣品中的CCL18結(jié)合細(xì)胞用CCL18-生物素隨后用抗生物素蛋白-AP和Fast Red檢測。樣品用抗CD3單克隆抗體(BD繼之以抗小鼠Ig-生物素(Vector)、抗生物素蛋白-AP和Fast Blue(Sigma)供染，并用蘇木精-伊紅(HE，Merck)復(fù)染。用于免疫熒光分析的恒冷箱切片用山羊抗CCL18和小鼠抗HLA-DR或抗CD3(BD)、抗CD1a(Caltag)、抗CD207(Baxter)繼之分別加入兔抗山羊-TxRd和馬抗小鼠-FITC(Vector)進(jìn)行染色。載玻片用含有DAPI的封固劑(Vector)蓋片。
統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值±SE或以盒圖(標(biāo)明平均值、中值、25％-75％百分位數(shù)和SD)表示。統(tǒng)計學(xué)的顯著性用非配對t檢驗確定。臨床數(shù)據(jù)的單相關(guān)性通過測定Pearson’s相關(guān)系數(shù)和未經(jīng)校正的概率值來測試。P＜0.05被認(rèn)為有顯著性。
實施例1AD是一種與皮膚對過敏原高反應(yīng)性和IL-4高產(chǎn)生相關(guān)的炎性皮膚疾病。因此，AD能夠為上調(diào)CCL18提供適宜環(huán)境。為了證明這一點，用免疫組織化學(xué)的方法評估并比較來自AD患者(n＝10)、正常人(n＝3)和銀屑病患者(n＝3)的皮膚樣品中CCL18的表達(dá)。在全部AD皮膚樣品中都可以檢測到CCL18表達(dá)，但是在健康個體或銀屑病個體的皮膚中CCL18表達(dá)缺失(見如圖1)。在AD皮膚中，CCL18表達(dá)在與單核細(xì)胞浸潤密切相關(guān)的上皮血管叢(upper dermal vascular plexus)強烈CCL18表達(dá)。免疫熒光染色證明CCL18表達(dá)限于HLA-DR+APC(見如圖2)。特別地，表皮中所有的CCL18表達(dá)細(xì)胞都是CD1a+的。隨后用CD207染色證明大部分CCL18表達(dá)細(xì)胞是LC，而剩余的群體由炎性的樹突表皮細(xì)胞組成。由于正?；蜚y屑病皮膚中的LC不產(chǎn)生CCL18趨化因子，LC產(chǎn)生CCL18似乎是與AD相關(guān)聯(lián)的Th2細(xì)胞因子環(huán)境的結(jié)果。角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和CD3陽性T細(xì)胞不表達(dá)CCL18(見如圖2)。
實施例2進(jìn)一步研究表明，AD患者血液中的CCL18和分泌CCL18的APC增加。IL-4刺激細(xì)胞后，用細(xì)胞內(nèi)的免疫熒光染色評估AD患者和健康對照中APC表達(dá)的CCL18。我們發(fā)現(xiàn)AD患者血液中分泌CCL18的單核細(xì)胞(CD14+)的百分比顯著高于(＞5倍，p＜0.003)健康個體中的觀察值(見如圖3)。同樣地，AD患者的血液中產(chǎn)生CCL18的DC中的CD11c+、HLA-DR+百分比都有增加(3倍，p＜0.001)(見如圖3)。兩組實驗都是僅在IL-4刺激后才檢測到CCL18表達(dá)細(xì)胞。未經(jīng)過或經(jīng)過IL-4刺激的PBMC的CD3+T和CD19+B細(xì)胞級分檢測不到CCL18產(chǎn)生。存在于AD患者循環(huán)中的更高數(shù)目的CCL18分泌細(xì)胞與升高的CCL18血清水平相關(guān)(見如圖4)。AD患者的CCL18血清值(平均值34.9ng/ml±5.3SE)三倍(p＜0.0003)高于健康的、非變態(tài)性的且年齡和性別匹配的對照(平均值10.7ng/ml±0.9SE)。在中度和重度AD期(以臨床IGA和EASI分?jǐn)?shù)評估)的CCL18表達(dá)水平高于在有輕微疾病表現(xiàn)時(見如圖5)。然而，在疾病重度分?jǐn)?shù)很高的患者體內(nèi)，CCL18的血清水平下降(見如圖5)。非常嚴(yán)重/慢性的AD表現(xiàn)不僅包括產(chǎn)生IL-4，許多產(chǎn)生IFN-γ的Th細(xì)胞也在這類皮膚損傷中被發(fā)現(xiàn)(見如Grewe，M.等人，Immunol.Today 19359-361，1998)。可預(yù)期在嚴(yán)重/慢性AD情況下，當(dāng)環(huán)境中的IL-4不豐富時，CCL18的產(chǎn)生會減少。這可能是在具有最高臨床疾病分?jǐn)?shù)患者的血清中觀察到CCL18表達(dá)減少的原因。在我們的患者群中還發(fā)現(xiàn)EASI和血清CCL22水平間的關(guān)系(r＝0.4，p＜0.05，數(shù)據(jù)未出示)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在輕微到重度疾病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CCL18與CCL22的表達(dá)強烈相關(guān)(r＝0.6，p＜0.003，圖6，實心圓)。然而，有最高CCL22血清水平也具有最高疾病分?jǐn)?shù)的患者僅表現(xiàn)出中等的CCL18表達(dá)(見如圖6，空心圓)。因此，CCL18表達(dá)在AD發(fā)展中的選擇性增加及其隨后在具有最高臨床疾病分?jǐn)?shù)的患者體內(nèi)的下降表明一種獨特的CCL18調(diào)節(jié)模式。
實施例3我們還發(fā)現(xiàn)AD中CCL18結(jié)合記憶T細(xì)胞。CCL18受體未知這一事實妨礙了對CCL18靶向的細(xì)胞群體的檢測。為了克服這個問題，我們制備了用FITC和生物素標(biāo)記且生物特性不變的CCL18。在AD患者活檢組織中，CCL18與CD3+皮膚浸潤T細(xì)胞的一部分結(jié)合(見如圖7)。此外，CCL18結(jié)合到淋巴管，表明這種趨化因子可能參與經(jīng)由這些管道的淋巴細(xì)胞運輸(見如圖7)。CCL18還結(jié)合高達(dá)5％的記憶T細(xì)胞系和源自AD皮膚的克隆(見如圖8)。在這些T細(xì)胞系中，在CD4+區(qū)優(yōu)先觀察到CCL18表達(dá)(見如圖8)。該結(jié)合是特異性的，因為CCL18還結(jié)合包括人CD45RA+、CCR7high、CD62Lhigh、CD25-、CD4+或CD8+T細(xì)胞的不同PBMC群體，其與已報道的CCL18對幼稚T細(xì)胞的影響相一致，見如Adema，G.J.等人，Nature 387713-717(1997)。此外，CCL18結(jié)合能夠被未經(jīng)標(biāo)記的CCL18競爭，但是不被包括CCL11的其它趨化因子競爭，CCL11的受體CCR3曾被報道介導(dǎo)CCL18的拮抗反應(yīng)(見如Nibbs，R.J.等人，J.Immunol.2000，1641488-1497)。使用特異性的單克隆抗體還可以排除CCL18結(jié)合的T細(xì)胞群體上的CCR3的表達(dá)(見如圖9)。在不同的T細(xì)胞系和克隆中，CCL22結(jié)合細(xì)胞的百分比高于CCL18結(jié)合細(xì)胞的百分比(見如圖3B)。另一方面，所有結(jié)合CCL18的細(xì)胞也結(jié)合CCL22(見如圖10)，表明它們可能代表CCR4+Th細(xì)胞的亞群。
實施例4在體外和體內(nèi)遷移測定中功能性評估CCL18結(jié)合記憶Th細(xì)胞的功能相關(guān)性。在體外，所有測試的AD來源的T細(xì)胞系和克隆顯著遷移，并以劑量依賴的方式應(yīng)答CCL18。CCL18誘導(dǎo)的遷移程度與CCL22誘導(dǎo)的遷移程度相當(dāng)(見如圖11)。CCL18和CCL22誘導(dǎo)的遷移都能夠用特異性的中和單克隆抗體阻斷，證明該應(yīng)答的特異性(見如圖11)。CCL18的體內(nèi)功能用前面提到的SCID-hu皮膚小鼠模型(Biederman T.等人，Eur.J.Immunol.2002，32，3171-3180)的修飾體研究。源自AD的記憶T細(xì)胞系和克隆應(yīng)答CCL18向移植在SCID小鼠的人皮膚移植物顯著遷移(見如圖12)。CCL18誘導(dǎo)的皮膚歸巢在遷移程度上與CCL22誘導(dǎo)的遷移相當(dāng)(見如圖12)。
總之，所有這些結(jié)果為CCL18蛋白質(zhì)表達(dá)與AD相關(guān)提供了證據(jù)并且描述了CCL18在體內(nèi)招募記憶Th細(xì)胞群進(jìn)入人皮膚的新能力。在取自患者的樣品(如血液樣品)中可以測定CCL18水平的調(diào)控(如增長)，因此可用作AD的指示。
權(quán)利要求
1.CCL18趨化因子用作個體體液樣品中的生物標(biāo)記的用途。
2.權(quán)利要求1的趨化因子用作個體體液樣品中紊亂或疾病的生物標(biāo)記的用途，所述紊亂或疾病選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)紊亂。
3.權(quán)利要求1或2中任意一項的趨化因子，其中紊亂或疾病與遺傳過敏性皮炎有關(guān)。
4.用于篩選和/或體外診斷個體中紊亂或疾病的方法，所述紊亂或疾病選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂，該方法包括a)提供個體的體液樣品，b)測定步驟a)提供的上述樣品中CCL18的水平，c)將步驟b)測定的CCL18水平與來自健康對照個體體液樣品的參考水平相比較，和d)通過確定步驟b)測定的上述CCL18水平是否顯著不同于上述參考水平，篩選和/或體外診斷選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病。
5.權(quán)利要求4的方法，其中用CCL18特異性抗體測定CCL18的水平。
6.用于監(jiān)測物質(zhì)對個體的治療功效的方法，所述物質(zhì)預(yù)期能夠有效減輕或治愈選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂的紊亂或疾病，該方法包括測定所述個體體液樣品中的CCL18水平并且將它與施用所述物質(zhì)前的CCL18水平相比較。
7.用于在個體體液樣品中篩選和/或體外診斷紊亂或疾病的試劑盒，所述紊亂或疾病選自變態(tài)性疾病和Th2介導(dǎo)的紊亂，該試劑盒包括a)識別CCL18蛋白或其部分的分子，任選地，其是被標(biāo)記的形式，b)使用說明書，c)任選的檢測手段，d)任選的固相。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷工具，例如作為個體體液樣品中的生物標(biāo)記的趨化因子CCL18，以及它在多種方法中的用途。
文檔編號C07K14/435GK1930476SQ200580008172
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月22日
發(fā)明者埃雷拉 J·M·卡瓦利多, C·京特 申請人:諾瓦提斯公司