專利名稱：：用于診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征的改進(jìn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于定量測(cè)定樣品中游離PAPP-A的生物親和性分析，游離PAPP-A定義為未與主要堿性蛋白的原形(proform)(proMBP)復(fù)合的妊娠相關(guān)的血漿蛋白A(PAPP-A)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及以游離PAPP-A作為標(biāo)志物來(lái)診斷人體中急性冠狀動(dòng)脈綜合征的方法。
背景技術(shù)：
：這里使用的旨于解釋發(fā)明背景的出版物及其它材料，特別是一些給出額外實(shí)施細(xì)節(jié)的例子，在此引入作為參考。七十年代初首次鑒定妊娠相關(guān)的血漿蛋白A(PAPP-A)是在人晚期妊娠血清中發(fā)現(xiàn)的一種高分子量成分(1)。血清中的濃度隨著妊娠而增加，直至分娩(2)。PAPP-A最初被表征為一個(gè)同四聚體(Homotetramer)(1，3)，但后來(lái)證實(shí)妊娠期間循環(huán)的PAPP-A是與嗜酸性的主要堿性蛋白的原形(proMBP)以2∶2復(fù)合的通過(guò)二硫鍵結(jié)合的500kDa異四聚體(Heterotetramer)，稱作PAPP-A/proMBP(4)。不過(guò)，據(jù)報(bào)道妊娠血清或血漿中也含有痕量(＜1％)未復(fù)合的PAPP-A(5)。妊娠中PAPP-A和proMBP二者都產(chǎn)生于胎盤，但主要由不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生。通過(guò)原位雜交分析，發(fā)現(xiàn)大部分的PAPP-A是在合胞滋養(yǎng)層中合成，而所有的proMBP是在絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層中合成(6)。通過(guò)對(duì)克隆的cDNA的分析顯示PAPP-A亞基是一個(gè)由1547個(gè)殘基組成的多肽(7)。它含有一個(gè)延長(zhǎng)的鋅結(jié)合基序，三個(gè)Lin-Notch重復(fù)序列和5個(gè)短共有重復(fù)序列(8)。proMBP是糖基化的蛋白聚糖，它包含90個(gè)殘基的強(qiáng)酸性原片段和117個(gè)殘基的高度堿性的MBP成熟形式(9，10)。后者是一種細(xì)胞毒性蛋白，存在于嗜酸性白細(xì)胞的顆粒中(11)。通過(guò)脫顆粒將其從嗜酸性白細(xì)胞中釋放，在這些細(xì)胞的效應(yīng)物功能中發(fā)揮多種作用(12)。盡管在嗜酸性細(xì)胞中成熟MBP來(lái)源于proMBP的蛋白水解加工，但沒(méi)有證據(jù)顯示MBP能產(chǎn)生于PAPP-A/proMBP復(fù)合物中的proMBP。就proMBP在PAPP-A/proMBP復(fù)合物中的作用而言，有研究顯示proMBP在體外起PAPP-A的蛋白酶抑制劑的作用(5，13)。除PAPP-A外，proMBP還與血管緊張素原或補(bǔ)體C3dg形成共價(jià)復(fù)合物(14)。但是proMBP在其它復(fù)合物中的作用仍然不清楚。近來(lái)，PAPP-A已被發(fā)現(xiàn)在體外是胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)結(jié)合蛋白(IGFBP)-4和IGFBP-5的特異性蛋白酶(15，16)。值得一提的是，IGFBP-4的切割是以IGF依賴性方式，而IGFBP-5的切割是以IGF非依賴性方式。不過(guò)，PAPP-A在體內(nèi)的生理功能仍不清楚。胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGF-I和IGF-II)主要通過(guò)I型IGF受體的介導(dǎo)，在促進(jìn)眾多生物系統(tǒng)的細(xì)胞分化和增殖過(guò)程中發(fā)揮作重要的作用。IGF-I和IGF-II的生物學(xué)活性由6種同源的高親和性IGF結(jié)合蛋白調(diào)控，這些蛋白與IGF結(jié)合，然后阻斷IGF與其受體的結(jié)合(17)。PAPP-A切割I(lǐng)GFBP-4和IGFBP-5，導(dǎo)致釋放結(jié)合的IGF，這樣就增加了用于與IGF膜受體相互作用的可生物利用的IGF。在臨床上，降低的PAPP-A血清水平與唐氏綜合征(DS)妊娠有關(guān)聯(lián)(18)。作為一個(gè)標(biāo)志物，PAPP-A目前已被廣泛地用來(lái)在第一個(gè)三月期篩查DS(19)。僅僅在最近，PAPP-A被顯示在不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(冠狀動(dòng)脈和頸動(dòng)脈)中存在(20，21)，其循環(huán)水平在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者中升高(20，22)。此外，循環(huán)中PAPP-A的存在對(duì)于冠狀動(dòng)脈病患者來(lái)說(shuō)還是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后分層指標(biāo)(23)。到目前為止，仍不清楚PAPP-A在斑塊中的作用。不過(guò)，已經(jīng)提出，在ACS中觀察到的通過(guò)IGFBP-4蛋白水解而增加的IGF的生物利用度在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展及再狹窄中發(fā)揮作關(guān)鍵的作用(20，24)。在技術(shù)上，循環(huán)中的PAPP-A的可測(cè)性與PAPP-A的分子結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。存在于孕婦血中的PAPP-A的分子結(jié)構(gòu)是否與存在于ACS患者血中的PAPP-A的結(jié)構(gòu)相同是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。到目前為止，尚無(wú)解決此重要問(wèn)題的報(bào)道。目前用于在上述兩種情況下進(jìn)行PAPP-A測(cè)量的所有分析都是基于針對(duì)PAPP-A/proMBP復(fù)合物的PAPP-A亞基的特異性抗體(20，25，26，27)。從方法學(xué)觀點(diǎn)上看，該事實(shí)使得不能將妊娠中的循環(huán)PAPP-A與ACS中的循環(huán)PAPP-A區(qū)分開(kāi)來(lái)。這里，我們首次提供數(shù)據(jù)顯示妊娠期中循環(huán)PAPP-A分子不同于ACS中循環(huán)PAPP-A分子。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于更早期和更特異性地檢測(cè)循環(huán)中的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的PAPP-A具有重要的臨床意義。發(fā)明目的以及發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供更靈敏和更特異的用于早期診斷具有患急性冠狀動(dòng)脈綜合征危險(xiǎn)的個(gè)體的方法。特別是，目的是獲得一種診斷方法，其優(yōu)于通常使用的基于心臟肌鈣蛋白I的分析并且優(yōu)于建議的基于以總PAPP-A作為標(biāo)志物的分析。因此，一方面，本發(fā)明涉及一種用于定量測(cè)定樣品中的游離PAPP-A的生物親和性分析，游離PAPP-A定義為未與主要堿性蛋白的原形(proMBP)結(jié)合的妊娠相關(guān)的血漿蛋白A(PAPP-A)。根據(jù)本發(fā)明，游離PAPP-Ai)確定為計(jì)算出的測(cè)量的總PAPP-A和測(cè)量的與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差，或ii)通過(guò)僅僅測(cè)量游離PAPP-A的直接生物親和性分析而確定。另一方面，本發(fā)明涉及用游離PAPP-A或者一種比值作為標(biāo)志物來(lái)診斷人體中的急性冠狀動(dòng)脈綜合征的方法，所述比值是-游離PAPP-A/總PAPP-A，-游離PAPP-A/與proMBP復(fù)合的PAPP-A，或-與proMBP復(fù)合的PAPP-A/總PAPP-A。第三方法，本發(fā)明涉及一種結(jié)合劑，它與游離PAPP-A結(jié)合，但不結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示的是PAPP-A/proMBP復(fù)合物的表位示意圖。重疊的圓圈表示沒(méi)有可能的夾心形成。相切的圓圈表示干擾夾心形成。彼此分開(kāi)的圓圈表示獨(dú)立的表位。限定僅僅在proMBP上可以接近的表位的單克隆抗體用粗圈表示，而限定PAPP-A上可以接近的表位的單克隆抗體用細(xì)圈表示。圖2顯示的是分析T(分析T＝用于總PAPP-A的分析)和分析C(分析C＝用于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的分析)的校準(zhǔn)曲線和不精密曲線，分析T由兩種PAPP-A亞基特異性單克隆抗體構(gòu)建(A1/B4)，而分析C由一種用于檢測(cè)的proMBP亞基特異性單克隆抗體和一種用于捕獲的PAPP-A亞基特異性單克隆抗體構(gòu)建(A1/A11)。每一個(gè)濃度采用四次重復(fù)。具有實(shí)心符號(hào)的曲線與計(jì)數(shù)相關(guān)，而具有空心符號(hào)的曲線與濃度CV相關(guān)。圖3顯示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的第一個(gè)三月期的血清樣品的凝膠過(guò)濾。用分析T和分析C檢測(cè)PAPP-A。PAPP-A/proMBP在甲狀腺球蛋白(669kDa)洗脫出來(lái)的位置洗脫為單峰。圖4顯示ACS患者PAPP-A的血清動(dòng)力學(xué)。PAPP-A由分析T和分析C來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。圖5顯示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的四份ACS血清樣品和兩份第一個(gè)三月期的血清樣品的凝膠過(guò)濾比較。PAPP-A由分析T檢測(cè)。ACSPAPP-A在脫鐵鐵蛋白(481kDa)洗脫出來(lái)的位置洗脫為單峰。圖6顯示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的一份ACS血清樣品(實(shí)心符號(hào))和一份第一個(gè)三月期血清樣品(空心符號(hào))的凝膠過(guò)濾比較。PAPP-A由分析T檢測(cè)。圖7A顯示的是三份正常血清樣品(稱作S1，S2和S3)在用單克隆抗體A1進(jìn)行吸附處理之前和之后的PAPP-A水平。圖7B顯示的是兩份ACS血清樣品(稱作ACS1和ACS2)在用單克隆抗體A1進(jìn)行吸附處理之前和之后的PAPP-A水平。圖8A顯示的是三份正常人血清樣品(稱作S1，S2和S3)在用單克隆抗體A11進(jìn)行吸附處理之前和之后的PAPP-A水平。圖8B顯示的是兩份ACS血清樣品(稱作ACS1和ACS2)在用單克隆抗體A11進(jìn)行吸附處理之前和之后的PAPP-A水平。PAPP-A水平由分析T測(cè)量。圖9顯示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的四份ACS血清樣品(稱作S1、S2、S3和S4)及一份第一個(gè)三月期血清的樣品的凝膠過(guò)濾比較。用分析C分析級(jí)分。圖10顯示的是說(shuō)明PAPP-A濃度和Δ值(定義為通過(guò)分析T獲得的PAPP-A值與通過(guò)分析C獲得的PAPP-A值的差)在正常受試者中分布的框須圖。曲線1顯示由分析T測(cè)定的PAPP-A濃度。曲線2顯示由分析C測(cè)定的PAPP-A濃度。曲線3顯示兩種分析測(cè)量的PAPP-A濃度所獲得的Δ值。框表示25到75的百分位數(shù)，須表示5和95的百分位數(shù)。所有高于95和低于5的百分位數(shù)以·表示。水平線表示中值，虛線框表示平均值。圖11顯示的是應(yīng)用ACS患者中的Δ值(具有空心圓圈的線)與使用總PAPP-A濃度(具有實(shí)心圓圈的線)的比較。Δ值和相關(guān)的判斷限已根據(jù)總PAPP-A濃度的97.5％的參考上限標(biāo)準(zhǔn)化。虛線表示適用于Δ值和總PAPP-A濃度的判斷限。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)″PAPP-A″應(yīng)當(dāng)被解釋為包括未與主要堿性蛋白的原形(proMBP)結(jié)合的任何PAPP-A。因此，″游離PAPP-A″包括絕對(duì)游離的PAPP-A還有與除proMBP外的任何物質(zhì)結(jié)合的PAPP-A。術(shù)語(yǔ)″結(jié)合劑(binder)″應(yīng)當(dāng)被解釋為特別地包括抗體和抗體片段(任選經(jīng)過(guò)基因工程化的)、適體和蛋白支架衍生的結(jié)合物比如Affibodies和Flurobodies。不過(guò)，術(shù)語(yǔ)″結(jié)合劑″并不局限于上面所提到的例子，任何可用于生物親和性分析的結(jié)合劑都應(yīng)當(dāng)被理解為被此定義所包涵。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方案，游離PAPP-A確定為計(jì)算出的測(cè)量的總PAPP-A和測(cè)量的與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差。這一選項(xiàng)例如可以使用兩次獨(dú)立的分析來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中將樣品的一份等分樣品暴露于與總PAPP-A結(jié)合的結(jié)合劑，并且檢測(cè)該結(jié)合劑以得到總PAPP-A。將樣品的另一份等分樣品暴露于僅僅結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的結(jié)合劑檢測(cè)該結(jié)合劑，以得到與proMBP復(fù)合的PAPP-A。最后，游離PAPP-A的量計(jì)算為確定的總PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差。兩次分析可以是競(jìng)爭(zhēng)性分析，或更優(yōu)選是非競(jìng)爭(zhēng)性?shī)A心分析，其中特異性結(jié)合劑是捕獲結(jié)合劑或檢測(cè)性(標(biāo)記的)結(jié)合劑?；蛘?，可以在一個(gè)單次雙分析物分析中測(cè)量游離PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A?？梢詫悠繁┞队谂c總PAPP-A結(jié)合的捕獲結(jié)合劑和用不同標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的兩種檢測(cè)性結(jié)合劑，使得用第一種標(biāo)記物標(biāo)記的第一種檢測(cè)性結(jié)合劑針對(duì)任何PAPP-A分子中存在的表位，其中第一種標(biāo)記物的信號(hào)用于得到總PAPP-A。用第二種標(biāo)記物標(biāo)記的第二種檢測(cè)性結(jié)合劑針對(duì)分子的proMBP亞基中的表位，其中第二種標(biāo)記物的信號(hào)被用于專門得到與proMBP復(fù)合的PAPP-A。措辭″分子的proMBP亞基中的表位″應(yīng)當(dāng)被理解為包括僅僅位于所述proMBP亞基中的表位，和一部分位于proMBP亞基中，另一部分位于PAPP-A分子的另一部分中的表位。因此，也可以通過(guò)僅僅與一部分位于proMBP亞基中，另一部分位于PAPP-A分子的另一部分中的表位反應(yīng)的結(jié)合劑，特異性測(cè)量與proMBP復(fù)合的PAPP-A。根據(jù)另一種優(yōu)選實(shí)施方案，游離PAPP-A由一種直接的僅檢測(cè)游離PAPP-A的生物親和性分析來(lái)測(cè)量。根據(jù)一種選項(xiàng)，可以通過(guò)將樣品暴露于結(jié)合游離PAPP-A但不結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的抗體(包括抗體片段如Fab和單鏈可變區(qū)(scFv)片段)或其它結(jié)合劑而進(jìn)行，并且檢測(cè)抗體或其它結(jié)合劑以得到游離PAPP-A。這樣的抗體或其它的結(jié)合劑可以例如針對(duì)PAPP-A的表位而產(chǎn)生，所述表位僅僅在未與proMBP結(jié)合的分子中，如氨基酸381-652的區(qū)域中可獲得。對(duì)游離PAPP-A具有特異性的多克隆抗體可以通過(guò)用游離PAPP-A和免疫佐劑免疫宿主動(dòng)物如兔和羊來(lái)制備。而對(duì)游離PAPP-A具有特異性的單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤技術(shù)和同樣的免疫原(用來(lái)免疫的宿主動(dòng)物常常是小鼠)來(lái)制備。此外，對(duì)游離PAPP-A具有特異性的抗體或其片段如Fab和單鏈可變片段(scFv)還可以通過(guò)從合成或天然抗體文庫(kù)中使用噬菌體展示來(lái)制備。游離PAPP-A可以從ACS斑塊或者從未與proMBP復(fù)合的妊娠PAPP-A或者從編碼PAPP-A的DNA序列的重組表達(dá)中得到?；蛘?，可以進(jìn)行僅僅測(cè)量游離PAPP-A的生物親和性分析，這是通過(guò)使與proMBP復(fù)合的PAPP-A不能參與生物親和性反應(yīng)，所述反應(yīng)中樣品暴露于結(jié)合于總PAPP-A的抗體或其它結(jié)合劑。有兩種方法可以達(dá)到這種目的。一種涉及到使用如圖8B所顯示的吸附，與proMBP復(fù)合的PAPP-A在前面的步驟中通過(guò)抗體A11吸附被去除，從而能夠測(cè)量游離PAPP-A。另一種方法涉及到應(yīng)用阻斷策略，其中某種PAPP-A亞基特異性抗體或者其它結(jié)合劑與其表位的接近被阻斷，這是由于proMBP反應(yīng)性抗體/其它用特定基團(tuán)或不用特定基團(tuán)衍生化的結(jié)合劑的結(jié)合。阻斷可以在分析前的步驟中進(jìn)行或者與分析同時(shí)進(jìn)行。這樣，游離PAPP-A也能被有效地測(cè)量出來(lái)。本發(fā)明將由下面的非限制性的實(shí)驗(yàn)部分闡述。實(shí)驗(yàn)部分材料和方法試劑ITC-TEKESEu3+熒光螯合劑(4-[2-(4-異硫氰酰苯基)乙炔基]-2，6，-二{[N，N-二(羧甲基)-氨基]甲基}吡啶)和生物素異硫氰酸酯(BITC)獲自InnotracDiagnosticsOy。DELFIA分析緩沖液和洗滌溶液根據(jù)以前的描述(28)制備。補(bǔ)0.01％變性的小鼠IgG和0.02％天然小鼠IgG的分析緩沖液稱作修飾的分析緩沖液系。低熒光12孔Maxisorp微量滴定條(紫外光淬滅的)購(gòu)自NUNC。鏈親合素包被的單孔和條獲自InnotracDiagnosticsOy。牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Intergen。NAP-5TM和NAP-10TM柱購(gòu)自PharmaciaBiotech。所有使用的其它化學(xué)試劑是分析級(jí)。6種稱作mabB1、2、3、4、5和6的PAPP-A/proMBP復(fù)合物的特異性單克隆抗體由丹麥國(guó)家血清研究所的MichaelChristiansen博士饋贈(zèng)。其他的11種稱作mabA1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的PAPP-A/proMBP復(fù)合物的特異性單克隆抗體由芬蘭HyTestOy的MariaSeverina博士饋贈(zèng)。校準(zhǔn)物是通過(guò)以下方法制備的在含有60g/L牛血清白蛋白、50mmol/L的Tris-HCl(pH7.75)、15mmol/LNaCl和0.5g/LNaN3的緩沖液中稀釋10份第3個(gè)三月期的妊娠血清的過(guò)濾后(通過(guò)0.22微米孔徑的過(guò)濾器)的合并物，針對(duì)第3個(gè)三月期妊娠合并血清來(lái)源的WHOIRP78/610進(jìn)行妊娠相關(guān)蛋白(WHO生物標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家血清研究所，丹麥哥本哈根)的校準(zhǔn)。PAPP-A和proMBP的水平以微單位/升表示。校準(zhǔn)物儲(chǔ)存在-20℃直到使用。血清樣品8例ACS患者(4位男性，平均年齡57±5歲和4位女性，平均年齡81±3歲)有長(zhǎng)期胸痛并伴有ST段升高和異常增加的CKMB與cTnI水平。在進(jìn)入Turku大學(xué)中心醫(yī)院心臟科時(shí)以及此后1、2、4、6、24、48和72小時(shí)采集這些患者的血清樣品。此外，兩份第一個(gè)三月期血清樣品(孕齡9和11周)也包括在本研究中。所有的血清樣品都是在知情同意下獲得的。遵循的程序是按照1996年修訂過(guò)的1975年版赫爾辛基宣言。所有的樣品在測(cè)量前都儲(chǔ)存在-20℃(妊娠樣品)或-70℃(ACS樣品)。用鑭系金屬螯合物和生物素標(biāo)記抗體用本身具有熒光的銪螯合物標(biāo)記抗體(29)。標(biāo)記反應(yīng)的操作如同以前報(bào)道(25)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用溶于50mmol/L碳酸鈉緩沖液(pH9.6)的100倍摩爾過(guò)量的螯合物在室溫下標(biāo)記抗體過(guò)夜(16-20h)。在用25ml/h的50mmol/LTris-HCl(pH7.75)、15mmol/LNaCl、0.5g/LNaN3操作的Superdex200HR10/30凝膠過(guò)濾柱(PharmaciaBiotech，瑞典)上將標(biāo)記的抗體從過(guò)量的游離螯合物和聚集的蛋白分離出來(lái)。收集0.45ml的級(jí)分。合并含有標(biāo)記的抗體的級(jí)分，用銪校準(zhǔn)溶液確定標(biāo)記的程度?？贵w的標(biāo)記程度為5-15Eu3+螯合物/每分子IgG。抗體的生物素標(biāo)記反應(yīng)用溶于50mmol/L碳酸鈉緩沖液(pH9.6)的50倍摩爾過(guò)量的生物素-異硫氰酸酯室溫下進(jìn)行3小時(shí)。通過(guò)將反應(yīng)混合液經(jīng)過(guò)以50mmol/LTris-HCl(pH7.75)、15mmol/LNaCl、0.5g/LNaN3為洗脫液的NAP-5TM和NAP-10TM柱(AmershamBioscienceAB)，實(shí)現(xiàn)生物素化的抗體與游離生物素化試劑的分離。加入終濃度為1g/L的BSA，溶液通過(guò)0.22μm孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，然后儲(chǔ)存于4℃。表位作圖所有針對(duì)PAPP-A/proMBP復(fù)合物的抗體被成對(duì)地測(cè)試，每種抗體或用作捕獲抗體或用作檢測(cè)抗體。采用一步夾心分析方式，并且采用100mIU/LPAPP-A校準(zhǔn)物及空白溶液。程序與以前描述的類似(30)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在已被直接包被0.4μg抗體的孔中以三份重復(fù)加入10μl的PAPP-A校準(zhǔn)物或空白溶液以及溶解于20μl分析緩沖液中的100ng的Eu3+標(biāo)記的抗體。37℃下振蕩下溫育10分鐘和60分鐘(900rpm，iEMS溫育器/振蕩器，LabsystemsOy，芬蘭)。此后，洗孔6次并用熱的干燥氣流吹干5分鐘，然后用VictorTM1420多標(biāo)記計(jì)數(shù)器(Perkin/ElmerLifeSciences，WallacOy，芬蘭)測(cè)量熒光。免疫分析兩種免疫分析被應(yīng)用于此項(xiàng)研究。一種分析稱作分析T，由生物素化的mabA1和銪標(biāo)記的mabB4構(gòu)建；另一種分析稱作分析C，由生物素化的mabA1和銪標(biāo)記的mabA11構(gòu)建。兩種免疫分析均以帶有iEMS溫育器/振蕩器的常規(guī)微量滴定板分析形式進(jìn)行。對(duì)于這兩種分析而言，首先通過(guò)室溫下緩慢振蕩的條件下將每孔300ng的生物素化mabA1在50μlDELFIA分析緩沖液中溫育60分鐘，將生物素化的mabA1固定在包被有鏈親合素的微量滴定板孔上。然后，對(duì)于分析T，將10μl的校準(zhǔn)物或樣品以及溶于20μl的修飾的分析緩沖液中的200ngEu3+標(biāo)記的mabB4加入每個(gè)孔中。37℃下緩慢振蕩的條件下將孔溫育30分鐘，隨后洗孔6次。此后，使孔干燥5分鐘，并且直接從帶有VictorTM1420多標(biāo)記計(jì)數(shù)器的干燥表面測(cè)量時(shí)間分辨的銪熒光。通過(guò)對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)使用spline算法的MultiCalc免疫分析程序(Perkin-ElmerLifeSciences，WallacOy，芬蘭)，針對(duì)來(lái)自校準(zhǔn)孔的校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)熒光信號(hào)，獲得未知樣品的濃度。對(duì)于分析C，每孔加入10μl校準(zhǔn)物或樣品和20μl修飾的分析緩沖液。37℃下緩慢振蕩的條件下將孔溫育30分鐘，洗孔兩次。此后，每孔加入溶于30μl修飾的分析緩沖液的300ngEu3+標(biāo)記的mabA11，37℃下緩慢振蕩的條件下將孔溫育30分鐘，隨后洗孔6次。后面的步驟與分析T相同。凝膠過(guò)濾層析這是在SuperoseTM6(3.2×300mm)精密柱PC3.2/30(PharmaciaBiotech，瑞典)上操作的，該柱以含有0.15mol/LNaCl和0.02％NaN3的50mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0平衡并洗脫，流速為0.04ml/min。上樣量為50μl(血清已用洗脫緩沖液兩倍稀釋并用0.22μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾)。在280nm處監(jiān)測(cè)柱洗脫液，在最初洗脫0.6ml之后，收集100μl級(jí)分。全部過(guò)程操作時(shí)間為75分鐘。10℃下在PharmaciaSmart系統(tǒng)(PharmaciaBiotech，瑞典)上操作層析柱，且用下面的蛋白校準(zhǔn)甲狀腺球蛋白(669kDa)，脫鐵鐵蛋白(481kDa)，免疫球蛋白G(160kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，凝乳酶原A(25kDa)，和核酸酶A(13.7kDa)。第一個(gè)三月期妊娠血清樣品和ACS血清樣品通過(guò)凝膠過(guò)濾層析分級(jí)分離。從正常血清樣品吸附PAPP-A此實(shí)驗(yàn)使用鏈親和素包被的微量滴定板孔和生物素化的mabA1或生物素化的A11。將30μl血清樣品加入表面已固定了300ng生物素化的單克隆抗體A1或400ng生物素化的單克隆抗體A11的每個(gè)孔中。對(duì)生物素化的單克隆抗體A1來(lái)說(shuō)，室溫緩慢振蕩下溫育1小時(shí)，然后，從每個(gè)孔中取出10μl處理過(guò)的血清，應(yīng)用到上面的用于測(cè)量PAPP-A的免疫分析中。對(duì)生物素化的單克隆抗體A11來(lái)說(shuō)，室溫緩慢振蕩下溫育1小時(shí)，血清樣品然后被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)包被過(guò)的孔中，然后溫育1小時(shí)。此后，重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)移步驟和溫育直到進(jìn)行第三次溫育。最后，10μl處理過(guò)的血清被應(yīng)用到上面的用于測(cè)量PAPP-A的免疫分析中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是使用StatView(SASInstitute，Cary，美國(guó))進(jìn)行的。結(jié)果由17種抗體確定的妊娠PAPP-A的表位1顯示的表位示意圖是根據(jù)獲自每一種可能的抗體雙位點(diǎn)組合的數(shù)據(jù)制作的。每種抗體的定位關(guān)系是在一種抗體的結(jié)合是否可能允許或干擾另一種抗體的獨(dú)立結(jié)合的基礎(chǔ)上決定的。在17種單克隆抗體中，B1、B2、B3和B4此前已被顯示為特異性地結(jié)合PAPP-A/proMBP復(fù)合物的PAPP-A亞基，而B(niǎo)5和B6與PAPP-A/proMBP復(fù)合物的proMBP亞基發(fā)生反應(yīng)(5，31)。MabA11能與除mabB5和B6外的所有其它的單克隆抗體形成夾心，說(shuō)明它應(yīng)該與PAPP-A/proMBP復(fù)合物的proMBP亞基發(fā)生反應(yīng)。在其它與PAPP-A/proMBP復(fù)合物的PAPP-A亞基反應(yīng)的14種單克隆抗體中，兩種抗體(A10和B4)并不與其它的抗體有共同的表位。校準(zhǔn)曲線顯示在圖2中的兩種分析的校準(zhǔn)曲線是用來(lái)自第3個(gè)3月期妊娠血清合并物的標(biāo)準(zhǔn)材料獲得的。兩條曲線在1.0mIU/L-300mIU/L的濃度范圍中都是線性的。對(duì)于分析T來(lái)說(shuō)，分析的不精確度是低的，表現(xiàn)為分析內(nèi)濃度CV在1.0mIU/L-300mIU/L的濃度范圍內(nèi)低于10。對(duì)于分析C來(lái)說(shuō)，分析的不精確度為在1mIU/L時(shí)高于20％，在3.0mIU/L-300mIU/L低于15。更為重要的是，兩個(gè)校準(zhǔn)曲線彼此平行，表示標(biāo)準(zhǔn)材料中的PAPP-A是同等地被這兩種分析方法檢測(cè)出來(lái)。妊娠PAPP-A的分子譜和免疫反應(yīng)性一份第一個(gè)三月期血清樣品通過(guò)大小排阻層析進(jìn)行分級(jí)分離，通過(guò)兩種免疫分析來(lái)分析級(jí)分。這兩種分析顯示的妊娠PAPP-A在與甲狀腺球蛋白(669kDa)相同的位置以單峰洗脫(見(jiàn)圖3)。此外，通過(guò)兩種分析獲得的兩個(gè)峰完全彼此重疊。由分析T測(cè)出的PAPP-A濃度略微高于分析C測(cè)出的PAPP-A濃度。ACS患者中的PAPP-A通過(guò)兩種分析測(cè)量4名ACS患者的系列血清樣品中的PAPP-A水平。使用分析T，在胸痛發(fā)生后的不同時(shí)間觀察到所有4例患者中PAPP-A水平高于5.68mIU/L(22)的參照水平(示于圖4中)。盡管PAPP-A水平最大增加的程度不一樣，PAPP-A水平的顯著增加早期發(fā)生在所有的4例ACS患者胸痛發(fā)生后的2小時(shí)內(nèi)。使用分析C，在這4例患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PAPP-A水平的顯著增加，其中PAPP-A濃度在所有血清樣品中均低于4mIU/L。這樣的結(jié)果顯示存在于循環(huán)中的ACS特異性的PAPP-A不能被proMBP反應(yīng)性抗體檢測(cè)出來(lái)。ACSPAPP-A的分子譜和免疫反應(yīng)性對(duì)來(lái)自于另外4例ACS患者的4份含有水平顯著增加的PAPP-A的血清樣品通過(guò)大小排阻層析進(jìn)行分級(jí)分離。由分析T對(duì)級(jí)分進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAPP-A的免疫反應(yīng)性洗脫為單峰，在相當(dāng)于脫鐵鐵蛋白(481kDa)的位置洗脫下來(lái)(見(jiàn)圖5)。不考慮PAPP-A的濃度，從所有4份ACS血清樣品的洗脫模式相同，并且，明顯地與來(lái)自兩份妊娠樣品(669kDa)的曲線分開(kāi)。這種在妊娠PAPP-A和ACSPAPP-A間的分子大小的差別被清楚地展示在圖5中，并且，當(dāng)用更小體積級(jí)分(25μL)進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，這種差別變得更顯著。正常受試者中的PAPP-A在正常受試者(n＝130，年齡為50到69歲)中，血清PAPP-A的水平小于7.6mIU/L，中值為3.0mIU/L。存在于正常受試者中的這樣的循環(huán)PAPP-A水平不僅可以被分析T而且可以被分析C檢測(cè)出來(lái)。圖7A顯示正常受試者中低水平的循環(huán)PAPP-A可被分析T和分析C檢測(cè)。此外，通過(guò)PAPP-A亞基特異性抗體A1(圖7A)或proMBP特異性抗體A11(圖8A)，吸附處理可以除去正常血清中的PAPP-A。ACS患者中的PAPP-A在ACS患者中的PAPP-A可以被分成兩類，即與proMBP復(fù)合的形式和未與proMBP復(fù)合的形式，二者一起構(gòu)成分析T檢測(cè)到的總PAPP-A。與proMBP復(fù)合的形式構(gòu)成基礎(chǔ)水平的PAPP-A，可被分析C特異地檢測(cè)出來(lái)。未與proMBP復(fù)合的形式和ACS相關(guān)，能被Δ值特異地確定，Δ值是用上面提到的兩種分析或者雙標(biāo)記分析或者阻斷分析或者特別是游離PAPP-A特異性分析來(lái)獲得。圖7B顯示ACS患者中的PAPP-A(與proMBP復(fù)合的形式和未與proMBP復(fù)合的形式)能被分析T測(cè)量，而與proMBP復(fù)合的形式(ACS無(wú)關(guān)的)能被分析C測(cè)量。用mabA1吸附有效地去除與proMBP復(fù)合的形式和未與proMBP復(fù)合的形式(圖7B)。不過(guò)，用mabA11吸附僅僅去除與proMBP復(fù)合的形式(圖8B)，因此，使得未與proMBP復(fù)合的形式，即游離PAPP-A被檢測(cè)出來(lái)。對(duì)來(lái)自ACS血清樣品和來(lái)自妊娠血清樣品的級(jí)分的分析顯示主要由分析C檢測(cè)到的信號(hào)實(shí)際與妊娠PAPP-A一致，已知妊娠PAPP-A是與proMBP復(fù)合的(參見(jiàn)圖9)。基礎(chǔ)PAPP-A水平在正常受試者中的分布在130例正常老年男性中發(fā)現(xiàn)通過(guò)分析C測(cè)定的PAPP-A濃度與僅僅用PAPP-A亞基特異性抗體通過(guò)分析C測(cè)定的濃度相關(guān)(Y＝0.6131+0.59669X，R＝0.63，P＜0.001)。圖10顯示的是分別由兩種分析測(cè)量的血清PAPP-A濃度和相對(duì)于正常老年人群的Δ值的數(shù)據(jù)分布特性的框圖。此外，直方圖表明Δ值的分布是最少偏斜的，峰度為0.1，而PAPP-A濃度的分布是正偏斜，且具有大得多的峰度(分別為3.47和1.58)。由于與高斯分布相容，適合的Δ值的判斷限是可以被推斷出來(lái)的。Δ值的臨床用途原則上講，Δ值僅僅反映ACS相關(guān)的PAPP-A。所以，它不受基礎(chǔ)PAPP-A水平的影響?；A(chǔ)PAPP-A水平在患者中彼此不同，這可能是干擾僅僅使用PAPP-A亞基特異性抗體的分析得到的測(cè)量結(jié)果(假陰性和假陽(yáng)性)的一種原因。為了解決可能的假陰性問(wèn)題，我們用兩種分析對(duì)來(lái)自29例ACS患者的亞組的系列血清樣品(所有患者的cTnI都升高)進(jìn)行了分析。當(dāng)判斷限是來(lái)源于通過(guò)僅僅使用PAPP-A亞基特異性抗體的分析得到的正常受試者PAPP-A濃度的97.5％參考上限(5.68mIU/L)時(shí)，所有的患者都是PAPP-A陰性的。不過(guò)，當(dāng)判斷限基于定義為平均值+3SD的Δ值時(shí)，29例患者中的20例轉(zhuǎn)為PAPP-A陽(yáng)性。圖11顯示使用這兩種判斷限進(jìn)行比較的一些實(shí)例的結(jié)果。用于測(cè)量總PAPP-A、或與proMBP復(fù)合的PAPP-A或游離的PAPP-A的抗體組合目前可行的所有可能的雙位點(diǎn)抗體組合的特征都在于源于妊娠的PAPP-A和獲自動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的ACS相關(guān)的PAPP-A(又稱作動(dòng)脈粥樣硬化或斑塊來(lái)源的PAPP-A)。如表1所示，發(fā)現(xiàn)有三種分析或抗體組合。第一種，用于總PAPP-A的抗體組合對(duì)源于妊娠的PAPP-A和ACS-相關(guān)的PAPP-A均產(chǎn)生高的特異性信號(hào)，表明這些分析同樣地適合源于妊娠的PAPP-A以及ACS相關(guān)的PAPP-A的測(cè)量。第二種，僅僅識(shí)別PAPP-A/proMBP的抗體組合僅對(duì)源于妊娠的PAPP-A而不對(duì)ACS相關(guān)的PAPP-A產(chǎn)生高的特異性信號(hào)，表明這些分析僅適用于妊娠相關(guān)的PAPP-A的測(cè)量。第三種類型的抗體組合(比如3C8/7A6)對(duì)源于妊娠的PAPP-A產(chǎn)生低的特異性信號(hào)，但是對(duì)優(yōu)先由游離或未復(fù)合形式的PAPP-A組成的ACS相關(guān)的PAPP-A產(chǎn)生高的特異性信號(hào)。由于PAPP-A在非妊娠非ACS個(gè)體中的分子形式與妊娠中發(fā)現(xiàn)的形式(即PAPP-A/proMBP)是相似的，像這種形式的分析優(yōu)選適合于對(duì)ACS或動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的PAPP-A的特異測(cè)量。總之，以PAPP-A/proMBP復(fù)合物形式存在的基礎(chǔ)水平的PAPP-A在樣品間經(jīng)常波動(dòng)。ACS患者中的病變相關(guān)的PAPP-A僅被總分析檢測(cè)到，而不是被復(fù)合物分析檢測(cè)到。另一方面，基礎(chǔ)水平的PAPP-A可被應(yīng)用這兩種分析檢測(cè)出來(lái)。這樣的事實(shí)為使用去除個(gè)體間基礎(chǔ)PAPP-A水平波動(dòng)的影響的游離PAPP-A或Δ值(間接反映游離PAPP-A)的使用奠定了基礎(chǔ)。因此，基于游離PAPP-A或Δ值確立的判斷限比簡(jiǎn)單地基于總PAPP-A濃度的判斷限更加合理，并且，允許對(duì)循環(huán)中ACSPAPP-A的精確測(cè)量。討論我們已經(jīng)證明了妊娠中的循環(huán)PAPP-A與ACS中的循環(huán)PAPP-A是不同的。我們首先證實(shí)妊娠PAPP-A是與proMBP復(fù)合的復(fù)合物，因?yàn)樗芡鹊赜每筆APP-A亞基或者proMBP亞基的抗體作為示蹤跡而確定。第二，我們顯示了證據(jù)，表明ACS相關(guān)的PAPP-A不與proMBP復(fù)合，因?yàn)樗鼉H能用抗PAPP-A亞基的抗體確定。這樣的結(jié)果被采用另外兩種proMBP亞基反應(yīng)性抗體即mabB5和B6(數(shù)據(jù)未示出)的分析所證實(shí)。第三，我們的結(jié)果顯示妊娠相關(guān)的PAPP-A的分子大小比ACS相關(guān)的PAPP-A要大，進(jìn)一步明確地表明ACS相關(guān)的PAPP-A不同于妊娠PAPP-A。有兩種原因能使被單克隆抗體A11識(shí)別的表位檢測(cè)不到。第一，表位消失，這可由于攜帶表位的亞基缺失或者由于修飾導(dǎo)致分子構(gòu)象發(fā)生改變所致。第二，表位與抗體的結(jié)合被表位與另一大分子物質(zhì)的共價(jià)連接或者僅僅存在于ACS血清中的干擾因子所阻斷。因?yàn)橥ㄟ^(guò)摻入妊娠PAPP-A到ACS血清樣品中獲得了正常的回收結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，干擾因子在ACS血清中存在的可能性可以被排除。并且，由于ACSPAPP-A分子明顯地小于妊娠PAPP-A，包括與另一物質(zhì)的橋接的PAPP-A/proMBP復(fù)合物的修飾似乎非常地不可能。因此，循環(huán)中的ACSPAPP-A顯然不與proMBP復(fù)合。循環(huán)中存在的ACSPAPP-A平均大約20mIU/L(22，23)，相當(dāng)于大約6μg/L(26)。這樣低的濃度使得難以直接用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡分析從血樣直接檢測(cè)ACSPAPP-A。所以，需要其它的高靈敏度和高特異性的檢測(cè)技術(shù)用于相關(guān)的研究中。鑭系螯合物的時(shí)間分辨的熒光術(shù)是目前存在的最靈敏的檢測(cè)技術(shù)之一(27)。應(yīng)用這種技術(shù)和特異性的抗體，建立了針對(duì)總PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A復(fù)合物的兩種免疫分析。正如所預(yù)測(cè)的一樣，這些分析的優(yōu)越的靈敏度使得直接從血樣檢測(cè)總PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A成為可能。妊娠中，循環(huán)中超過(guò)99％的PAPP-A是以二硫鍵結(jié)合的500kDa的以2∶2與proMBP復(fù)合的復(fù)合物形式存在，小于1％的PAPP-A是以二聚體的形式存在(5)。在PAPP-A/proMBP復(fù)合物中，通過(guò)一個(gè)單一的二硫鍵將PAPP-A二聚化，而proMBP是通過(guò)兩個(gè)二硫鍵二聚化的；每個(gè)PAPP-A亞基通過(guò)兩個(gè)二硫鍵與一個(gè)proMBP亞基相連接(32)。最近的研究顯示，共價(jià)結(jié)合對(duì)于proMBP抑制PAPP-A的催化活性是必要的，但是，具體的有關(guān)復(fù)合物形成的機(jī)制仍然在很大程度上不為所知。到目前為止，在循環(huán)中尚未發(fā)現(xiàn)游離形式的proMBP，盡管有報(bào)道proMBP的血清水平在分子基礎(chǔ)上超過(guò)PAPP-A水平4-10倍(14)。妊娠中其它循環(huán)proMBP以兩種復(fù)合物的形式存在，即一種是proMBP與血管緊張素原的2∶2二硫鍵結(jié)合的復(fù)合物，另一種是proMBP、血管緊張素原和補(bǔ)體C3dg的2∶2∶2復(fù)合物(14)。在本研究中，兩步法被用于以proMBP特異性抗體作為示蹤跡的分析中。這種形式的分析有效地防止存在于妊娠血清中的其它proMBP復(fù)合物與銪標(biāo)記的proMBP特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，因此，能夠特異性地測(cè)定PAPP-A/proMBP復(fù)合物。除妊娠外，PAPP-A也被發(fā)現(xiàn)可從多種培養(yǎng)的人細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞(15)，成骨細(xì)胞(15)，卵巢顆粒細(xì)胞(33)，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(13)和冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(34)分泌。并且，使用免疫組化和原位雜交分析，在卵巢(35)，血管斑塊(20)和愈合中的人皮膚(26)中體內(nèi)鑒定出PAPP-A的表達(dá)。不過(guò)，到目前為止，僅僅證明了從人成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基分離了PAPP-A，和重組表達(dá)為400kDa的二聚體(5，15)。已經(jīng)證明了由條件培養(yǎng)基中的上述細(xì)胞中分泌的PAPP-A具有蛋白水解活性。從所有這些體外來(lái)源產(chǎn)生的PAPP-A似乎以二聚體的形式存在。然而，將體外觀察結(jié)果外推到體內(nèi)情況是沒(méi)有證明的。僅僅具有蛋白酶活性并不能用作PAPP-A是以游離形式存在的證據(jù)。在妊娠期間，盡管超過(guò)99％的PAPP-A是以復(fù)合物的形式存在，妊娠血清和純化的妊娠PAPP-A被證明具有蛋白酶活性(5，15，37)。妊娠血清或妊娠PAPP-A具有可測(cè)的蛋白酶活性的原因被歸因于少于1％的不受抑制的PAPP-A二聚體的存在或者是來(lái)自不能被完全抑制的2∶1PAPP-A/proMBP復(fù)合物(5)。妊娠期間，proMBP在胎盤X細(xì)胞中合成，而PAPP-A主要在合胞滋養(yǎng)層中合成(6)。所以，共價(jià)的PAPP-A/proMBP復(fù)合物必須在分泌后在細(xì)胞外腔室內(nèi)形成。PAPP-A蛋白酶活性可能受到局部環(huán)境中的旁分泌作用的調(diào)節(jié)(13)。在非妊娠的情況下，proMBP已被證實(shí)僅僅存在于發(fā)育中的嗜酸性細(xì)胞中，而不是存在于成熟的嗜酸性細(xì)胞中(38)。但是最近，proMBP的免疫反應(yīng)性也被在體外受精患者的雌激素占優(yōu)勢(shì)的卵泡液中檢測(cè)到(33)，并且，proMBP的來(lái)源可能與多種卵巢細(xì)胞相關(guān)(39)。此外，有報(bào)道使用β-佛波醇12，13二癸酸酯(β-PDD)進(jìn)行處理，能誘導(dǎo)培養(yǎng)的產(chǎn)生PAPP-A的人成纖維細(xì)胞表達(dá)proMBP，從而導(dǎo)致細(xì)胞條件培養(yǎng)液中的PAPP-A蛋白酶活性受到抑制(40)，表明PAPP-A蛋白酶活性在體內(nèi)也可能受到自分泌作用的調(diào)節(jié)。但是，目前尚不清楚為什么proMBP的抑制作用需要復(fù)合結(jié)構(gòu)。以前，動(dòng)脈粥樣硬化被視為“管道”問(wèn)題。但是近來(lái)的研究顯示，炎癥在動(dòng)脈病變的發(fā)展中起作關(guān)鍵性的作用(41)。和穩(wěn)定斑塊相比，破裂的斑塊含有許多炎癥細(xì)胞(42)。PAPP-A被顯示為存在于動(dòng)脈粥樣硬化的不穩(wěn)定斑塊中，但是不存在于穩(wěn)定的斑塊(20)。細(xì)胞因子，如來(lái)自炎癥細(xì)胞的TNFα能顯著地增加PAPP-A的表達(dá)(43)。PAPP-A可能在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，從而有助于動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。最近我們報(bào)道了主要的心臟終點(diǎn)的累積危險(xiǎn)性與循環(huán)PAPP-A水平成正相關(guān)(23)。該結(jié)果至少間接地支持這樣的觀點(diǎn)，即PAPP-A(獨(dú)自或通過(guò)IGF)是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的不良事件的介質(zhì)。我們的發(fā)現(xiàn)，即循環(huán)中源于ACS的PAPP-A不與proMBP復(fù)合，可能具有重要的臨床意義。在非ACS個(gè)體中不同的PAPP-A水平可被測(cè)量(22，26，44)。這種免疫反應(yīng)性的來(lái)源尚不清楚，但它們或許源自已被報(bào)道存在PAPP-A表達(dá)的精液、卵泡液、黃體、睪丸以及其它的器官/組織中(45)。從80例非ACS的年齡為50-69歲的男性受試者中測(cè)到的PAPP-A濃度為1.51到7.59mIU/L，其97.5％參考上限為5.68mIU/L(22)。在ACS中PAPP-A濃度增加的程度廣泛變化，但通常低于30mIU/L(22，23)。使用參考上限作為判斷限，表明顯著比例的ACS患者會(huì)被漏診。我們以前已經(jīng)報(bào)道過(guò)(22)，14例心?；颊咧械?例患者的PAPP-A值低于參考上限，但隨時(shí)間顯示明顯的動(dòng)力學(xué)改變。最理想的是找出不受個(gè)體基礎(chǔ)PAPP-A濃度差異影響的判斷限。這里顯示的我們的初步觀察結(jié)果揭示在沒(méi)有ACS的情況下，基礎(chǔ)PAPP-A值大多數(shù)情況下被用于總PAPP-A測(cè)量的分析T和用于PAPP-A/proMBP復(fù)合物測(cè)量的分析C同等地檢測(cè)出來(lái)，提示PAPP-A的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)性由PAPP-A/proMBP復(fù)合物所致。低水平(＜4mIU/L)的這種復(fù)合形式的PAPP-A也在心?；颊咧袦y(cè)到，但在急性狀況中沒(méi)有顯示或僅顯示少許的動(dòng)力學(xué)變化。很明顯，與ACS相關(guān)的PAPP-A并不與proMBP形成復(fù)合物。然而，到目前為止用于ACS的PAPP-A的分析都是測(cè)量總的PAPP-A，不論P(yáng)APP-A是與還是不與proMBP復(fù)合。這種狀況對(duì)于評(píng)價(jià)ACS中的PAPP-A構(gòu)成主要的限制。正如已經(jīng)顯示的，一種用于測(cè)定ACS相關(guān)的PAPP-A的方法是計(jì)算測(cè)量到的總PAPP-A和測(cè)量到的與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差(Δ值)。另一種可行的選擇是應(yīng)用正如表1所示的優(yōu)選用于游離PAPP-A的分析。我們預(yù)測(cè)，被設(shè)計(jì)出來(lái)用于測(cè)量特異性地從不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊釋放的循環(huán)形式的PAPP-A的免疫分析很可能會(huì)改進(jìn)PAPP-A作為心臟危險(xiǎn)性標(biāo)志物的臨床特異性和靈敏度?？傊覀兊慕Y(jié)果提供了第一手證據(jù)，即循環(huán)的ACS相關(guān)PAPP-A不同于循環(huán)的妊娠相關(guān)PAPP-A，因?yàn)樗慌cproMBP復(fù)合。由于早期測(cè)量循環(huán)的PAPP-A可能對(duì)于疑為ACS的患者具有診斷和預(yù)后價(jià)值，上面的發(fā)現(xiàn)因此對(duì)于精確測(cè)量循環(huán)中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)血漿蛋白(AAPP-A)的分析的設(shè)計(jì)具有重要的臨床意義。可以理解，本發(fā)明的方法可以整合為多種實(shí)施方案的形式，在這里僅僅公開(kāi)了其中的一些。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白，存在其它不偏離本發(fā)明精神的實(shí)施方案。因此，此處描述的實(shí)施方案是說(shuō)明性的，不應(yīng)該解釋為限制性的。注星號(hào)表示抗體是銪標(biāo)記的形式。參考文獻(xiàn)1)LinTM，GalbertSP，KieferD，SpellacyWN，GallS.Characterizationoffourhumanpregnancy-associatedplasmaproteins.AmJObstetGynecol1974；118223-236.2)FolkersenJ，GrudzinskasJG，HinderssonP，TeisnerB，WestergaardJG.Pregnancy-associatedplasmaproteinAcirculatinglevelsduringnormalpregnancy.AmJObstetGynecol.1981；139910-4.3)SinosichMJ.Molecularcharacterizationofpregnancy-associatedplasmaprotein-Abyelectrophoresis.Electrophoresis.1990Jan；1170-8.4)OxvigC，SandO，KristensenT，GleichGJ，Sottrup-JensenL.Circulatinghumanpregnancy-associatedplasmaprotein-Aisdisulfide-bridgedtotheproformofeosinophilmajorbasicprotein.JBiolChem1993；26812243-12246.5)OvergaardMT，HaaningJ，BoldtHB，OlsenIM，LaursenLS，ChristiansenM，etal.Expressionofrecombinanthumanpregnancy-associatedplasmaprotein-Aandidentificationoftheproformofeosinophilmajorbasicproteinasitsphysiologicalinhibitor.JBiolChem2000；27531128-31133.6)BonnoM，OxvigC，KephartGM，WagnerJM，KristensenT，Sottrup-JensenL，GleichGJ.Localizationofpregnancy-associatedplasmaprotein-Aandcolocalizationofpregnancy-associatedplasmaprotein-Amessengerribonucleicacidandeosinophilgranulemajorbasicproteinmessengerribonucleicacidinplacenta.LabInvest.1994；71560-6.7)KristensenT，OxvigC，SandO，MollerNP，Sottrup-JensenL.Aminoacidsequenceofhumanpregnancy-associatedplasmaprotein-AderivedfromclonedcDNA.Biochemistry1994；331592-1598.8)BoldtHB，OvergaardMT，LaursenLS，WeyerK，Sottrup-JensenL，OxvigC.Mutationalanalysisoftheproteolyticdomainofpregnancy-associatedplasmaprotein-A(PAPP-A)classificationasametzincin.BiochemJ.2001；358359-67.9)BarkerRL，GleichGJ，PeaseLR.AcidicprecursorrevealedinhumaneosinophilgranulemajorbasicproteincDNA.JExpMed1988；1681493-1498.10)WasmoenTL，BellMP，LoegeringDA，GleichGJ，PrendergastFG，McKeanDJ.Biochemicalandaminoacidsequenceanalysisofhumaneosinophilgranulemajorbasicprotein.JBiolChem1988；26312559-12563.11)Popken-HarrisP，CheckelJ，LoegeringD，MaddenB，SpringettM，KephartG，GleichGJ.Regulationandprocessingofaprecursorformofeosinophilgranulemajorbasicprotein(ProMBP)indifferentiatingeosinophils.Blood1998；92623-631.12)GleichGJ，AdolphsonCR，LeifermanKM.Thebiologyoftheeosinophilicleukocyte.AnnuRevMed1993；4485-101.13)GiudiceLC，ConoverCA，BaleL，F(xiàn)aessenGH，IlgK，SunI，etal.IdentificationandregulationoftheIGFBP-4proteascanditsphysiologicalinhibitorinhumantrophoblastsandendometrialstromaevidenceforparacrineregulationofIGF-IIbioavailabilityintheplacentalbedduringhumanimplantation.JClinEndocrinolMetab.2002；872359-66.14)OxvigC，HaaningJ，KristensenL，WagnerJM，RubinI，StigbrandT，GleichGJ，Sottrup-JensenL.IdentificationofangiotensinogenandcomplementC3dgasnovelproteinsbindingtheproformofeosinophilmajorbasicproteininhumanpregnancyserumandplasma.JBiolChem1995；27013645-1365115)LawrenceJB，OxvigC，OvergaardMT，Sottrup-JensenL，GleichGJ，HaysLG，etal.Theinsulin-likegrowthfactor(IGF)-dependentIGFbindingprotein-4proteasesecretedbyhumanfibroblastsispregnancy-associatedplasmaprotein-A.ProcNatlAcadSciUSA1999；963149-3153.16)LaursenLS，OvergaardMT，SoeR，BoldtHB，Sottrup-JensenL，GiudiceLC，etal.Pregnancy-associatedplasmaprotein-A(PAPP-A)cleavesinsulin-likegrowthfactorbindingprotein(IGFBP)-5independentofIGFimplicationsforthemechanismofIGFBP-4proteolysisbyPAPP-A.FEBSLett2001；50436-40.17)HwaV，OhY，RosenfeldRG.Theinsulin-likegrowthfactor-bindingprotein(IGFBP)superfamily.EndocrRev.1999；20761-87.18)WaldN，StoneR，CuckleHS，GrudzinskasJG，BarkaiG，BrambatiB，TeisnerB，F(xiàn)uhrmannW.FirsttrimesterconcentrationsofpregnancyassociatedplasmaproteinAandplacentalprotein14inDown′ssyndrome.BMJ.1992Jul4；30528.19)WapnerR，ThomE，SimpsonJL，PergamentE，SilverR，F(xiàn)ilkinsK，etal.First-trimesterscreeningfortrisomies21and18.NEnglJMed.2003；3491405-13.20)Bayes-GenisA，ConoverCA，OvergaardMT，BaileyKR，ChristiansenM，HolmesDRJr，etal.Pregnancy-associatedplasmaproteinAasamarkerofacutecoronarysyndromes.NEnglJMed.2001；3451022-9.21)BeaudeuxJL，BurcL，Imbert-BismutF，GiralP，BernardM，BruckertE，etal.Serumplasmapregnancy-associatedproteinAapotentialmarkerofechogeniccarotidatheroscleroticplaquesinasymptomatichyperlipidemicsubjectsathighcardiovascularrisk.ArteriosclerThrombVascBiol.2003；237-10.22)QinQP，LaitinenP，Majamaa-VolttiK，ErikssonS，KumpulaEK，PetterssonK.ReleasepatternsofpregnancyassociatedplasmaproteinA(PAPP-A)inpatientswithacutecoronarysyndromes.ScandCardiovascJ.2002；36358-61.23)LundJ，QinQP，IlvaT，PetterssonK，Voipio-PulkkiLM，PorelaP，etal.CirculatingpregnancyassociatedplasmaproteinA(PAPP-A)predictsoutcomeinpatientswithacutecoronarysyndromesbutnoTroponinIelevation.Circulation.2003；1081924-6.24)Bayes-GenisA，ConoverCA，SchwartzRS.Theinsulin-likegrowthfactoraxisAreviewofatherosclerosisandrestenosis.CircRes.2000；86125-30.25)QinQP，ChristiansenM，PetterssonK.Point-of-caretime-resolvedimmunofluorometricassayforhumanpregnancy-associatedplasmaproteinAuseinfirst-trimesterscreeningforDownsyndrome.ClinChem.2002；48473-83.26)QinQP，ChristiansenM，OxvigC，PetterssonK，Sottrup-JensenL，KochC，Norgaard-PedersenB.Double-monoclonalimmunofluorometricassaysforpregnancy-associatedplasmaproteinA/proeosinophilmajorbasicprotein(PAPP-A/proMBP)complexinfirst-trimestermaternalserumscreeningforDownsyndrome.ClinChem.1997；432323-32.27)KhosraviJ，DiamandiA，KrishnaRG，BodaniU，MistryJ，KhajaN.Pregnancyassociatedplasmaprotein-Aultrasensitiveimmunoassayanddeterminationincoronaryheartdisease.ClinBiochem.2002；35531-8.28)PetterssonK，SoderholmJR.Ultrasensitivetwo-siteimmunometricassayofhumanlutropinbytime-resolvedfluorometry.ClinChem1990；361928-1933.29)TakaloH，MukkalaVM，MikolaH，LiittiP，HemmilaI.Synthesisofeuropium(III)chelatessuitableforlabelingofbioactivemolecules.BioconjChem1994；5278-282.30)QinQP，LovgrenT，PetterssonK.Developmentofhighlyfluorescentdetectionreagentsfortheconstructionofultrasensitiveimmunoassays.AnalChem.2001；731521-9.31)QinQP.MaternalserumscreeningforDownsyndromeinthefirsttrimesterwithspecialemphasisonpregnancyassociatedplasmaproteinA[PhDthesis].1998144ppUniversityofTurkuTurku，F(xiàn)inland.32)OvergaardMT，SorensenES，StachowiakD，BoldtHB，KristensenL，Sottrup-JensenL，etal.Complexofpregnancy-associatedplasmaprotein-Aandtheproformofeosinophilmajorbasicprotein.Disulfidestructureandcarbohydrateattachment.JBiolChem.2003；2782106-1733)ConoverCA，F(xiàn)aessenGF，IlgKE，ChandrasekherYA，ChristiansenM，OvergaardMT，etal.Pregnancy-associatedplasmaprotein-aistheinsulin-likegrowthfactorbindingprotein-4proteasesecretedbyhumanovariangranulosacellsandisamarkerofdominantfollicleselectionandthecorpusluteum.Endocrinology.2001；1422155.34)Bayes-GenisA，SchwartzRS，LewisDA，OvergaardMT，ChristiansenM，OxvigC，etal.Insulin-likegrowthfactorbindingprotein-4proteaseproducedbysmoothmusclecellsincreasesinthecoronaryarteryafterangioplasty.ArteriosclerThrombVascBiol2001；21335-341.35)HourvitzA，WidgerAE，F(xiàn)ilhoFL，ChangRJ，AdashiEY，EricksonGF.Pregnancy-associatedplasmaprotein-Ageneexpressioninhumanovariesisrestrictedtohealthyfolliclesandcorporalutea.JClinEndocrinolMetab.2000；854916-20.36)ChenBK，LeifermanKM，PittelkowMR，OvergaardMT，OxvigC，ConoverCA.Localizationandregulationofpregnancy-associatedplasmaproteinaexpressioninhealinghumanskin.JClinEndocrinolMetab.2003；884465-71.37)QinX，ByunD，LauKH，BaylinkDJ，MohanS.Evidencethattheinteractionbetweeninsulin-likegrowthfactor(IGF)-IIandIGFbindingprotein(IGFBP)-4isessentialfortheactionoftheIGF-II-dependentIGFBP-4protease.ArchBiochemBiophys.2000；379209-16.38)Popken-HarrisP，CheckelJ，LoegeringD，MaddenB，SpringettM，KephartG，GleichGJ.Regulationandprocessingofaprecursorformofeosinophilgranulemajorbasicprotein(ProMBP)indifferentiatingeosinophils.Blood.1998；92623-31.39)Rhoton-VlasakA，GleichGJ，BischofP，CheginiN.Localizationandcellulardistributionofpregnancy-associatedplasmaprotein-aandmajorbasicproteininhumanovaryandcorporaluteathroughoutthemenstrualcycle.FertilSteri1.2003；791149-53.40)ChenBK，OvergaardMT，BaleLK，ReschZT，ChristiansenM，OxvigC，ConoverCA.MolecularregulationoftheIGF-bindingprotein-4proteasesysteminhumanfibroblastsidentificationofanovelinducibleinhibitor.Endocrinology.2002；1431199-205.41)LibbyP，AikawaM.Stabilizationofatheroscleroticplaquesnewmechanismsandclinicaltargets.NatMed.2002，81257-62.42)ChyuKY，ShahPK.Theroleofinflammationinplaquedisruptionandthrombosis.RevCardiovascMed.2001；282-91.43)ReschZT，ChenBK，BaleLK，OxvigC，OvergaardMT，ConoverCA.Pregnancy-associatedplasmaproteinAgeneexpressionasatargetofinflamatorycytokines.Endocrinology2004；1451124-9.44)QinQP，NguyenTH，ChristiansenM，LarsenSO，Norgaard-PedersenB.Time-resolvedimmunofluorometricassayofpregnancy-associatedplasmaproteinAinmaternalserumscreeningforDown′ssyndromeinfirsttrimesterofpregnancy.ClinChimActa.1996，29；254113-29.45)BischofP.Threepregnancyproteins(PP12，PP14，andPAPP-A)theirbiologicalandclinicalrelevance.AmJPerinatol1989；6110-116.權(quán)利要求1.用于定量測(cè)定樣品中的游離PAPP-A的生物親和性分析，所述游離PAPP-A定義為未與主要堿性蛋白的原形(proMBP)結(jié)合的妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)，其中游離PAPP-Ai)確定為計(jì)算出的測(cè)量的總PAPP-A和測(cè)量的與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差，或ii)通過(guò)僅僅測(cè)量游離PAPP-A的直接生物親和性分析而確定。2.權(quán)利要求1的分析，其中游離PAPP-A是根據(jù)選項(xiàng)i)測(cè)定的，并且進(jìn)行了兩次分析，其中樣品的一份等分樣品暴露于與總PAPP-A結(jié)合的結(jié)合劑，并且檢測(cè)該結(jié)合劑，所述樣品的另一份等分樣品暴露于僅僅結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的結(jié)合劑，并且檢測(cè)該結(jié)合劑，游離PAPP-A的量計(jì)算為測(cè)定的總PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A的差。3.權(quán)利要求2的分析，其中所述分析是非競(jìng)爭(zhēng)性?shī)A心分析。4.權(quán)利要求3的分析，其中所述結(jié)合劑是捕獲結(jié)合劑。5.權(quán)利要求3的分析，其中所述結(jié)合劑是標(biāo)記的結(jié)合劑。6.權(quán)利要求1的分析，其中游離PAPP-A是根據(jù)作為單次雙分析物分析的選項(xiàng)i)測(cè)定的，其中將樣品暴露于與總PAPP-A結(jié)合的捕獲結(jié)合劑和用不同標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的兩種檢測(cè)性結(jié)合劑，使得用第一種標(biāo)記物標(biāo)記的第一種檢測(cè)性結(jié)合劑針對(duì)任何PAPP-A分子中存在的表位，其中第一種標(biāo)記物的信號(hào)用于得到總PAPP-A，而用第二種標(biāo)記物標(biāo)記的第二種檢測(cè)性結(jié)合劑針對(duì)分子的proMBP亞基中的表位，其中第二種標(biāo)記物的信號(hào)被用于得到與proMBP復(fù)合的PAPP-A。7.權(quán)利要求1的分析，其中游離PAPP-A是根據(jù)選項(xiàng)ii)測(cè)定的，是通過(guò)將樣品暴露于與游離PAPP-A結(jié)合但不結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的結(jié)合劑，并且檢測(cè)所述結(jié)合劑結(jié)合的游離PAPP-A。8.權(quán)利要求1的分析，其中游離PAPP-A是根據(jù)選項(xiàng)ii)測(cè)定的，是通過(guò)使PAPP-A與不能參與生物親和性反應(yīng)的proMBP復(fù)合，所述反應(yīng)中將樣品暴露于與總PAPP-A結(jié)合的結(jié)合劑。9.權(quán)利要求8的分析，其中與proMBP復(fù)合的PAPP-A被阻斷或預(yù)先吸附。10.權(quán)利要求2-9中任何一項(xiàng)的分析，其中所述結(jié)合劑是抗體、抗體片段或適體。11.用游離PAPP-A或一種比值作為標(biāo)志物來(lái)診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征的方法，所述比值是游離PAPP-A/總PAPP-A，游離PAPP-A/與proMBP復(fù)合的PAPP-A，或與proMBP復(fù)合的PAPP-A/總PAPP-A。12.權(quán)利要求11的方法，其中游離PAPP-A是根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任何一項(xiàng)測(cè)定的。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中總PAPP-A和與proMBP復(fù)合的PAPP-A是通過(guò)權(quán)利要求2-5的兩次不同分析或權(quán)利要求6的一個(gè)單次分析而測(cè)定的。14.權(quán)利要求11或12的方法，其中游離PAPP-A是根據(jù)權(quán)利要求7-10中的任何一項(xiàng)測(cè)定的。15.與游離PAPP-A結(jié)合但不結(jié)合于與proMBP復(fù)合的PAPP-A的結(jié)合劑。16.權(quán)利要求15的結(jié)合劑，其是抗體、抗體片段或適體。全文摘要本發(fā)明涉及用于定量測(cè)定樣品中游離PAPP－A的生物親和性分析，游離PAPP－A定義為未與主要堿性蛋白的原形(proMBP)復(fù)合的妊娠相關(guān)的血漿蛋白A(PAPP－A)，其中游離PAPP－Ai)確定為計(jì)算出的測(cè)量的總PAPP－A和測(cè)量的與proMBP復(fù)合的PAPP－A的差，或ii)通過(guò)僅僅測(cè)量游離PAPP－A的直接生物親和性分析而確定。此外，本發(fā)明涉及用游離PAPP－A或一種比值作為標(biāo)志物來(lái)診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征的方法，所述比值是游離PAPP－A/總PAPP－A，游離PAPP－A/與proMBP復(fù)合的PAPP－A，或與proMBP復(fù)合的PAPP－A/總PAPP－A。文檔編號(hào)C07K16/40GK1934449SQ200580003271公開(kāi)日2007年3月21日申請(qǐng)日期2005年1月19日優(yōu)先權(quán)日2004年1月28日發(fā)明者Q·－P·秦,K·彼得森申請(qǐng)人:圖爾庫(kù)大學(xué)