專(zhuān)利名稱(chēng)：一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α－氨基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子的修飾與改造，尤其是蛋白質(zhì)分子的定點(diǎn)修飾與改造方法。
背景技術(shù)：
多肽、蛋白類(lèi)藥物主要通過(guò)降解、排泄、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等作用在體內(nèi)被清除，其中分子量小于20 kDa的多肽因子在代謝過(guò)程中易由腎小球?yàn)V過(guò)，在通過(guò)腎小管時(shí)多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。靜脈注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的清除半衰期為1～2小時(shí)，皮下注射則為2～3小時(shí)，為維持一定的療效需要每天應(yīng)用，不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。
化學(xué)修飾是延長(zhǎng)蛋白類(lèi)藥物半衰期的一個(gè)有效途徑，其中應(yīng)用最為廣泛的修飾劑是單甲氧基聚乙二醇(methoxypoly ethyleneglycol，簡(jiǎn)稱(chēng)mPEG)，其次是多糖類(lèi)如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等，也可應(yīng)用同源蛋白質(zhì)或人工合成多肽類(lèi)如白蛋白、聚丙氨酸等，另外長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)以及聚烯屬烴基化合物也可以作為修飾劑。
聚乙二醇(簡(jiǎn)稱(chēng)PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長(zhǎng)鏈高分子聚合物HO(CH2CH2O)nCH2CH2OH，n為聚合單元的個(gè)數(shù)，PEG分子量隨n的增加可由1kDa增至50kDa)，有線性和支鏈兩種構(gòu)型，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)作為多種藥物的安全載體。PEG通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接，可與蛋白質(zhì)分子中的α-氨基(位于氮末段)、ε氨基(位于賴(lài)氨酸殘基)反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行修飾，通過(guò)對(duì)蛋白表面氨基進(jìn)行修飾以有效地改變多肽、蛋白類(lèi)藥物在體內(nèi)的分布和藥物學(xué)特性。
目前PEG修飾已應(yīng)用于40多種不同蛋白的修飾，如豬血清白蛋白(BSA)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-2(ILr2)等。PEG修飾后藥物血漿半衰期一般可延長(zhǎng)幾倍至幾十倍甚至是上百倍，但大部分蛋白的免疫原性也有所降低，而蛋白的生物活性也有不同程度降低。這可能是由于PEG大分子在蛋白分子周?chē)纬梢粚油鈿?，阻礙了免疫細(xì)胞與蛋白的接觸，保護(hù)了蛋白，掩蓋了蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)避免蛋白酶降解的發(fā)生，但同時(shí)也使蛋白的活性位點(diǎn)受到影響。
修飾后的蛋白質(zhì)具有一些特殊的性質(zhì)①半衰期延長(zhǎng)。許多目前已得到廣泛應(yīng)用的蛋白藥物在體內(nèi)半衰期很短，使用時(shí)要間歇性、經(jīng)常性給藥，不方便而且增加了病人的痛苦。PEG化后的蛋白分子量增大，腎小球?yàn)V過(guò)減少，PEG分子的空間位阻作用使蛋白在體內(nèi)被蛋白酶降解速度減慢，從而使藥物體內(nèi)半衰期增長(zhǎng)，藥效更持久；②PEG化可以降低蛋白質(zhì)藥物抗原性，擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍；③PEG化還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物具有某些新的活性特征，比如PEG化的interleukin-6促進(jìn)血小板生成的活性增加，而其他方面的活性基本不變；④PEG化可影響蛋白質(zhì)藥物的一些物理、化學(xué)性質(zhì)(PEG的親水性可增加溶解性，空間位阻效應(yīng)減少蛋白酶解等)。
目前，修飾藥用蛋白通常采用單甲基化的PEG(以防一個(gè)PEG分子連接兩個(gè)蛋白質(zhì)分子)，先將其OH端活化，引入親電基團(tuán)以便于和氨基的親核基團(tuán)反應(yīng)。PEG化修飾的方法很多，早期的方法中PEG化是隨機(jī)發(fā)生在任何可能反應(yīng)的氨基上的，因此得到的反應(yīng)產(chǎn)物是不同分子量(連接的PEG個(gè)數(shù)不同)的混合物，即使相同分子量的產(chǎn)物也存在修飾位點(diǎn)的異構(gòu)。而且，某些處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)或受體結(jié)合部位的賴(lài)氨酸被修飾后大大降低蛋白質(zhì)的活性。
Olaf B Kinstler等注意到蛋白質(zhì)中不同氨基的化學(xué)反應(yīng)性差異α-氨基與ε氨基的pKa(解離常數(shù))不同，α-氨基(位于氮末段)的pKa為7.8，ε氨基(位于賴(lài)氨酸殘基)的pKa為10.1。如果以醛基化的PEG(mPEG-aldehyde)進(jìn)行氨基修飾，pKa低的α-氨基比ε氨基更具有反應(yīng)優(yōu)勢(shì)，優(yōu)先進(jìn)行反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)氮端的優(yōu)勢(shì)反應(yīng)。因此他們以這種具有氮端反應(yīng)優(yōu)勢(shì)的活化PEG(mPEG-aldehyde)在低pH下(pH5.0)進(jìn)行rhG-CSf的修飾，大于70％的修飾產(chǎn)物為氮端特異性修飾，具有確定的分子量和分子結(jié)構(gòu)。但這種方法仍存在缺點(diǎn)①反應(yīng)緩慢，周期長(zhǎng)，一般需要10～16小時(shí)；②反應(yīng)只是優(yōu)先在氮端進(jìn)行PEG化，賴(lài)氨酸上氨基的PEG化仍能進(jìn)行，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)賴(lài)氨酸上被PEG化所占比例增加，因?yàn)檫@種方法只是通過(guò)降低反應(yīng)體系的pH值減慢反應(yīng)速度，從而拉大兩種不同氨基的反應(yīng)速度差，使反應(yīng)便于控制，但不能杜絕賴(lài)氨酸上氨基的進(jìn)一步PEG化。
目前常用PEG反應(yīng)條件下生成的交聯(lián)反應(yīng)物為非均一的PEG-蛋白質(zhì)分子(分子量不同，分子結(jié)構(gòu)不同，在蛋白質(zhì)分子不同的賴(lài)氨酸殘基上交聯(lián)PEG)，有悖于我國(guó)新藥評(píng)審的有關(guān)原則，無(wú)法應(yīng)用于臨床，為開(kāi)發(fā)出可以被接受的均一的PEG化蛋白質(zhì)分子，所以有必要尋求一種PEG大分子與蛋白N末端定點(diǎn)交聯(lián)反應(yīng)的條件。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，開(kāi)發(fā)出可以被接受的均一的PEG化蛋白質(zhì)分子，本發(fā)明公開(kāi)了一種PEG大分子與蛋白N末端定點(diǎn)交聯(lián)反應(yīng)的方法，可以對(duì)作為藥物的小分子量的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行快速的、定點(diǎn)的PEG化修飾的方法，得到均一的可以作為新藥進(jìn)入臨床應(yīng)用的PEG化蛋白質(zhì)分子，新分子較修飾前，其半衰期應(yīng)延長(zhǎng)、體外活性降低應(yīng)較少。
本發(fā)明人在對(duì)氨基的分布位置差異和化學(xué)反應(yīng)性差異進(jìn)行了綜合分析研究的基礎(chǔ)上，提出了采用氨基保護(hù)劑將處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位易于反應(yīng)的賴(lài)氨酸氨基封閉和選用具有氮端優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的聚乙二醇活化形式相結(jié)合的方式對(duì)蛋白質(zhì)氮端進(jìn)行特異性修飾技術(shù)方案，可以在更短的時(shí)間內(nèi)(pH高，反應(yīng)速度快)，高選擇性地完成蛋白質(zhì)的氮端特異性PEG化修飾。
本發(fā)明技術(shù)方案依次包括以下步驟(A)提供一種氨基保護(hù)劑封閉處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位的ε氨基；(B)提供一種活化后的聚乙二醇，對(duì)未封閉的蛋白質(zhì)氮端α-氨基進(jìn)行修飾；(C)去除氨基保護(hù)劑；(D)提純。
本發(fā)明技術(shù)方案適用的蛋白質(zhì)為其氮端不處于活性位點(diǎn)或受體結(jié)合部位的蛋白。
本發(fā)明技術(shù)方案所提供的氨基保護(hù)劑為二甲基馬來(lái)酸酐(Dimethylmaleic anhydride，簡(jiǎn)稱(chēng)DMMAn)，該保護(hù)劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)的易于反應(yīng)的非α-氨基，將處于最利于反應(yīng)位置(蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)或受體結(jié)合部位)的賴(lài)氨酸封閉，使其后的PEG化修飾反應(yīng)更專(zhuān)一，不必?fù)?dān)心出現(xiàn)非α-氨基修飾物，得到的產(chǎn)物生物活性降低較小，而且PEG化修飾反應(yīng)可以快速進(jìn)行。
氨基保護(hù)劑二甲基馬來(lái)酸酐的用量為蛋白質(zhì)α-氨基與ε氨基之和的8～12倍(mol比)。
上述封閉處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位的ε氨基的反應(yīng)在0.1M磷酸鹽緩沖液(PH8.5)中進(jìn)行。更換蛋白質(zhì)緩沖溶液為0.1M磷酸鹽緩沖液是為了提高體系PH，滿足反應(yīng)所需條件。
本發(fā)明技術(shù)方案所用的聚乙二醇活化形式為醛基化的單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy PEG aldehyde，簡(jiǎn)稱(chēng)mPEG-aldehyde)，該活化形式的PEG具有蛋白質(zhì)氮端的反應(yīng)優(yōu)勢(shì)，與氨基保護(hù)劑結(jié)合使用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)氮端α-氨基專(zhuān)一、定點(diǎn)的特異性修飾。醛基化的單甲氧基聚乙二醇的用量為蛋白質(zhì)α-氨基的3～12倍(mol比)。
本發(fā)明技術(shù)方案所述的PEG化修飾反應(yīng)需要有催化劑NaBH3CN存在，其用量與PEG等量(mol)。
本發(fā)明技術(shù)方案所述的去除氨基保護(hù)劑是將反應(yīng)混合物加入0.1M HCl調(diào)pH的方式實(shí)施的。
本發(fā)明所述技術(shù)方案具體操作步驟和條件如下a.更換蛋白質(zhì)緩沖溶液為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，加入8～12倍于可反應(yīng)氨基數(shù)量的DMMAn，在0℃下持續(xù)30分鐘。
b.在上述反應(yīng)混合物中加入3～12倍于可反應(yīng)氨基數(shù)量的mPEG-aldehyde和NaBH3CN，反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)。
c.以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH5.5～6.5，在35～40℃下持續(xù)20～40分鐘。
d.反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換凝膠SP Sepharose Big Beads和分子篩凝膠Superdex 75提純，去除游離的PEG、NaBH3CN和未反應(yīng)蛋白，得到純的聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)(mPEG-Protein)。
應(yīng)用本發(fā)明所述修飾蛋白質(zhì)的方法可用于制備聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(mPEG-rhG-CSF)、聚乙二醇化干擾素(mPEG-IFN)、聚乙二醇化腫瘤壞死因子(mPEG-TNF)。
應(yīng)用本發(fā)明所述修飾蛋白質(zhì)的方法制備的mPEG20000-rhG-CSF，分子量為39kD增加了20kD，其在體內(nèi)的半衰期大大延長(zhǎng)，達(dá)到45小時(shí)以上，藥效更加持久，其體外活性為5×107U/mg，幾乎未降低本發(fā)明產(chǎn)品mPEG20000-rhG-CSF和rhG-CSFcssf比較

*肺癌病人化療后24小時(shí)按100μg/kg劑量單次皮下注射與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品相比使用本發(fā)明方法反應(yīng)時(shí)間短，轉(zhuǎn)化率高，藥效持效期長(zhǎng)。
本發(fā)明產(chǎn)品mPEG20000-rhG-CSF和國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品比較

*肺癌病人化療后24小時(shí)按100μg/kg劑量單次皮下注射由于本發(fā)明采用氨基保護(hù)劑將處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位易于反應(yīng)的賴(lài)氨酸氨基封閉和選用具有氮端優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的聚乙二醇活化形式相結(jié)合的技術(shù)方案，因而在蛋白質(zhì)修飾方面獲得了顯著的有益效果，對(duì)采用上述方法形成的蛋白分子進(jìn)行檢驗(yàn)，得到如下結(jié)果①反應(yīng)率高，90％～95％；②分子量與結(jié)構(gòu)均一，均為蛋白質(zhì)α-氨基N末端連接一個(gè)PEG分子，沒(méi)有一個(gè)蛋白分子連接幾個(gè)PEG的產(chǎn)物，也沒(méi)有其他位點(diǎn)連接PEG的異構(gòu)現(xiàn)象；③體外比活性降低很少，基本保持不變；④體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)明顯長(zhǎng)效，在正常小鼠體內(nèi)藥效中較rhG-CSF的ANC升高延長(zhǎng)約2.5倍，ANC升高幅度明顯。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
mPEG20000-rhG-CSF的制備工藝①超濾濃縮GC溶液，更換緩沖體系為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，得到濃度5mg/ml的GC溶液1000ml。
②加入1.66gDMMAn，冰浴保持反應(yīng)體系溫度為0℃，維持反應(yīng)30min。
③在反應(yīng)體系中加入52.6g mPEG20000-acetaldehyde，攪拌溶解，升溫至37℃，加入0.16g NaBH3CN，反應(yīng)1小時(shí)。以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH6.0，37℃持續(xù)30分鐘。
④將反應(yīng)產(chǎn)物上樣，經(jīng)10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)平衡過(guò)的SPSepharose Big Beads離子柱，以10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)、0～0.45M氯化鈉線性梯度洗脫6柱體積，收集主峰為mPEG20000-rhG-CSF。經(jīng)過(guò)Superdex 75柱去鹽，并更換緩沖液為10mM乙酸鈉(pH4.0)，即得到mPEG20000-rhG-CSF原液。
轉(zhuǎn)化率95％分子量39kD半衰期45.7小時(shí)體外活性5×107U/mg。
實(shí)施例2mPEG30000-rhG-CSF的制備工藝①超濾濃縮GC溶液，更換緩沖體系為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)，得到濃度5mg/ml的GC溶液1000ml。
②加入1.83gDMMAn，冰浴保持反應(yīng)體系溫度為0℃，維持反應(yīng)30min。
③在反應(yīng)體系中加入86.8gmPEG20000-acetaldehyde，攪拌溶解，升溫至39℃，加入0.176g NaBH3CN，反應(yīng)1.5小時(shí)。以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH6.2，35℃持續(xù)40分鐘。
④將反應(yīng)產(chǎn)物上樣，經(jīng)10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)平衡過(guò)的SPSepharose Big Beads離子柱，以10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)、0～0.6M氯化鈉線性梯度洗脫10柱體積，收集主峰為mPEG20000-rhG-CSF。經(jīng)過(guò)Superdex 75柱去鹽，并更換緩沖液為10mM乙酸鈉(pH4.0)，即得到mPEG20000-rhG-CSF原液。
轉(zhuǎn)化率90％分子量49kD半衰期58小時(shí)體外活性1×107U/mg。
實(shí)施例3.
mPEG20000-IFNα-2b(干擾素)的制備工藝①以0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)溶解干擾素IFNα-2b，得到濃度2mg/ml的IFNα-2b溶液1000ml。
②上述溶液冰浴保持溫度為0℃，在緩慢攪拌的條件下加入0.664gDMMAn，溶解后維持反應(yīng)30min。
③上述反應(yīng)體系升溫至37℃，在緩慢攪拌的條件下加入26.3gmPEG20000-acetaldehyde，溶解后加入0.032g NaBH3CN，溶解后保持反應(yīng)0.5小時(shí)。以0.1M HCl調(diào)節(jié)上述反應(yīng)混合物至pH6.0，37℃持續(xù)30分鐘。
④反應(yīng)混合物經(jīng)電泳(SDS-PAGE)和反相HPLC(C18)測(cè)定～91％IFNα-2b已經(jīng)被修飾。
⑤以20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)平衡SP Sepharose Big Beads離子柱。將反應(yīng)產(chǎn)物以20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)稀釋100倍后上樣，以0～45％的20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)1M氯化鈉線性梯度洗脫6柱體積，收集主峰為mPEG20000-IFNα-2b。經(jīng)過(guò)Superdex 75柱精提純，并更換緩沖液為10mM磷酸鈉(pH7.0)，即得到mPEG20000-IFNα-2b原液。
轉(zhuǎn)化率91％ 分子量39kD半衰期58小時(shí)體外活性1×107U/mg純度99％。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于采用氨基保護(hù)劑將處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位易于反應(yīng)的賴(lài)氨酸氨基封閉和選用具有氮端優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的聚乙二醇活化形式相結(jié)合的方式對(duì)蛋白質(zhì)氮端進(jìn)行特異性修飾；它依次包括以下步驟(A)提供一種氨基保護(hù)劑封閉處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位的ε氨基；(B)提供一種活化后的聚乙二醇，對(duì)未封閉的蛋白質(zhì)氮端α-氨基進(jìn)行修飾；(C)去除氨基保護(hù)劑。(D)提純。
2.如權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于適用的蛋白質(zhì)為其氮端不處于活性位點(diǎn)或受體結(jié)合部位的蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于氨基保護(hù)劑為二甲基馬來(lái)酸酐(Dimethylmaleicanhydride)，用量為蛋白質(zhì)α-氨基與ε氨基之和的8～12倍(mol比)。
4.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于封閉處于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)及受體結(jié)合部位的ε氨基的反應(yīng)在0.1M磷酸鹽緩沖液中，0℃下持續(xù)30分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于所用聚乙二醇活化形式為醛基化的單甲氧基聚乙二醇(Monomethoxy PEG aldehyde)，用量為蛋白質(zhì)α-氨基的3～12倍(mol比)。
6.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于聚乙二醇化修飾反應(yīng)需要有與聚乙二醇等量(mol)的NaBH3CN存在，反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于將上步反應(yīng)混合物以0.1M HCl調(diào)pH至5.5～6.5，35～40℃持續(xù)20～40分鐘去除氨基保護(hù)劑。
8.如權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法，其特征在于可用于制備聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(mPEG-rhG-CSF)、聚乙二醇化干擾素(mPEG-IFN)、聚乙二醇化腫瘤壞死因子(mPEG-TNF)。
9.采用權(quán)利要求1所述一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α-氨基的方法制備的產(chǎn)品mPEG20000-rhG-CSF，其分子量39kD，半衰期45.7小時(shí)，體外活性5×107U/mg；轉(zhuǎn)化率為90～95％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α－氨基的方法。利用氨基保護(hù)劑將蛋白質(zhì)中能與PEG反應(yīng)的賴(lài)氨酸ε氨基封閉，以活化的具有與α氨基優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的PEG進(jìn)行氨基修飾，再將氨基保護(hù)劑去除，得到氮端特異性PEG修飾的蛋白質(zhì)衍生物。該方法所得產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率高，90％～95％；分子量與結(jié)構(gòu)均一，均為蛋白質(zhì)α－氨基N末端連接一個(gè)PEG分子，沒(méi)有一個(gè)蛋白連接幾個(gè)PEG的產(chǎn)物，也沒(méi)有其他位點(diǎn)連接PEG的異構(gòu)現(xiàn)象；體外活性降低很少，基本保持不變；體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)明顯長(zhǎng)效，ANC升高幅度明顯。
文檔編號(hào)C07K1/107GK1687106SQ20051004258
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者張雪山, 徐宜鐵 申請(qǐng)人:山東格蘭百克生物制藥有限公司