專利名稱：人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及剪接異構(gòu)體及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及人自細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體及其編碼基因與其在制備腫瘤診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2000年，白細(xì)胞介素23(IL-23，Interleukin-23，p40p19)作為IL-12家族的新成員被發(fā)現(xiàn)，它是一個(gè)由與白細(xì)胞介素12(IL-12，p35p40)同源的p19亞單位以及IL-12的p40亞單位組成的異源二聚體細(xì)胞因子。研究表明，它可誘導(dǎo)干擾素γ產(chǎn)生重要的促炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)1型輔助性T細(xì)胞(T helper1，Th1)分化并且聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫反應(yīng)。2002年，IL-23的特異性受體(IL-23R)也被發(fā)現(xiàn)。IL-23受體和IL-12受體都屬于I類細(xì)胞因子受體家族的成員。作為IL-12細(xì)胞因子家族的新成員，IL-23受體除了與IL-12共用的可溶性受體亞單位IL-12Rβ1外，還有一個(gè)自身特有的信號傳導(dǎo)受體亞單位IL-23R；而IL-12受體則由IL-12Rβ1和IL-12β2組成。IL-23R由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。目前，對于IL-23及其受體的多數(shù)研究尚處于初始階段，對于IL-23R的分布和功能的研究大多也正在進(jìn)行中。
人IL-23的特異性受體(hIL-23R)基因位于染色體1p31.2-32.1，和hIL-12Rβ2的位置十分接近。hIL-23R的ORF(開放讀碼框)由分布在長92kb的人類基因組DNA上的12個(gè)外顯子組成。
在細(xì)胞核內(nèi)對基因產(chǎn)物(mRNA前體)進(jìn)行各種修飾、剪接和編輯，使編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分連接成為一個(gè)連續(xù)的開放閱讀框(open reading frame，ORF)的過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工。其中，在mRNA前體的剪接過程中，通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點(diǎn)組合)，參加剪接的外顯子可以不按其線性次序剪接，內(nèi)含子也可以不被切除而保留，即一個(gè)外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟mRNA中是可以選擇的，從而產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這種剪接方式稱為選擇性剪接(alternative splicing)。剪接過程受多種順式作用元件和反式作用因子相互作用調(diào)節(jié)。由來自一個(gè)基因的mRNA前體因選擇性剪接而產(chǎn)生多種mRNA(轉(zhuǎn)錄體)，并翻譯出的不同蛋白質(zhì)，稱為同源異構(gòu)體(isoform)。約60％的人類基因可在不同的組織或生理狀態(tài)下，通過選擇性剪接產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，這是造成真核生物高度異質(zhì)性的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體。
本發(fā)明所提供的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是人白細(xì)胞介素23特異性受體的mRNA前體通過選擇性剪接使信號肽序列、完整的第5外顯子、第9外顯子或完整第9和部分第11外顯子缺失后表達(dá)的物質(zhì)。
所述缺失完整第5外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，名稱為hIL-23RΔexon5(delta5)，是序列表中SEQ ID №1的DNA序列編碼的蛋白。
所述缺失完整第5外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體可具有序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №1由1618個(gè)堿基組成，自5’端第1-第414位堿基為第一閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №2由138個(gè)氨基酸殘基組成；序列表中的SEQ ID №1自5’端第494-第1618位堿基為第二閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID№3由375個(gè)氨基酸殘基組成。
所述缺失完整第9外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，名稱為hIL-23RΔexon(delta9)，是序列表中SEQ ID №4的DNA序列編碼的蛋白。
所述缺失完整第9外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體可具有序列表中SEQ ID №5或SEQ ID №6的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №4由1676個(gè)堿基組成，自5’端第1-第960位堿基為第一閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №5由320個(gè)氨基酸殘基組成；序列表中的SEQ ID №4自5’端第885-第1676位堿基為第三閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №6的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID№3由264個(gè)氨基酸殘基組成。
所述缺失第9和部分第11外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，名稱為hIL-23RΔexom9，11P(delta9，11p)，是是序列表中SEQ ID №7的DNA序列編碼的蛋白。
所述缺失第9和部分第11外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №7由1609個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-第960位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列的物質(zhì)，序列表中的SEQID №8由320個(gè)氨基酸殘基組成。
所述缺失信號肽序列的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，名稱為hIL-23RΔsp，是序列表中SEQ ID №9的DNA序列編碼的蛋白。
所述缺失信號肽序列的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID №9由1779個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-第1776位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列的物質(zhì)，序列表中的SEQID №10由592個(gè)氨基酸殘基組成。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
含有本發(fā)明人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體編碼的核苷酸序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增本發(fā)明人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體編碼的核苷酸序列中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
將本發(fā)明的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體編碼的全長或部分核苷酸序列克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可得到人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體的全部或部分。
所述大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選為pQE-30；所述大腸桿菌宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌M15；所述誘導(dǎo)物優(yōu)選為IPTG，濃度為0.3-0.5mmol/mL。
本發(fā)明的剪接異構(gòu)體在腫瘤細(xì)胞中分布廣泛，并在某些腫瘤組織中，如慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562、乳腺癌細(xì)胞CAM中有特異性表達(dá)方式，因此可用RT-PCR方法檢測這些表達(dá)標(biāo)記用于腫瘤的臨床診斷，此外，還可以按常規(guī)方法制備針對hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexong、hIL-23RΔexon9，11P和hIL-23RΔsp的特異性抗體，并用其作為標(biāo)記物檢測腫瘤的發(fā)生。本發(fā)明將在腫瘤診斷中發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為hIL-23R的完整cDNA序列及其編碼蛋白的序列2為RT-PCR擴(kuò)增hIL-23R基因的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為pGEM-T-1890nt，pGEM-T-18900經(jīng)PstI酶切鑒定結(jié)果圖4為pGEM-T-1890nt，pGEM-T-18900經(jīng)EcoRI、EcoRV酶切鑒定結(jié)果圖5為hIL-23R的新型剪接異構(gòu)體的核苷酸序列比對結(jié)果圖6為hIL-23R的新型剪接異構(gòu)體的氨基酸序列比對結(jié)果圖7為hIL-23R新型剪接異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)示意8為7株腫瘤相關(guān)細(xì)胞系總RNA的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖9為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中除外顯子1，2的hIL-23R基因片段的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖10為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞外區(qū)基因片段的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖11為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞內(nèi)區(qū)基因片段的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖12為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中除外顯子1，2的hIL-23R基因片段的Southernblot分析結(jié)果圖13為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞外區(qū)基因片段的Southern blot分析結(jié)果圖14為RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞內(nèi)區(qū)基因片段的Southern blot分析結(jié)果圖15為巢式PCR法鑒定hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P在腫瘤細(xì)胞中的分布情況的結(jié)果圖16為檢測hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P在正常細(xì)胞中的分布情況的RT-PCR檢測結(jié)果圖17為IPTG誘導(dǎo)pQE-30-hIL-23R胞外區(qū)蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生物工程公司合成。
實(shí)施例1、人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體的獲得一、人白細(xì)胞介素23特異性受體(hIL-23R)基因的克隆根據(jù)Genbank中公布的hIL-23R完整的cDNA序列(gi|24430211|)，如圖1所示，設(shè)計(jì)一對常規(guī)PCR引物擴(kuò)增不含信號肽序列的hIL-23R的cDNA，引物序列如下引物1(上游)5’-GTAGAACCAGCCACAATTTT-3’引物2(下游)5’-CAATAGGATTTCACTCTTGGAAAAG-3’提取靜息外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的總RNA，經(jīng)mRNA純化試劑盒(Clontech公司)處理得到其mRNA，再以此mRNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，合成不含信號肽序列的hIL-23R的cDNA，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為Marker)，在分子量約1.8Kb處有一明顯條帶，與不含信號肽序列的hIL-23R的cDNA長度一致，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物長1778bp，其編碼序列為自5’端第1-第1776位堿基，編碼由592個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，IL-23R由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成，其中，自5’端第1-第953位堿基為胞外區(qū)的編碼序列，編碼317個(gè)氨基酸，存在7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)和一個(gè)I類細(xì)胞因子受體的特征性基序WQPWS，自5’端第954-第1020位堿基為跨膜區(qū)的編碼序列，編碼23個(gè)氨基酸，由外顯子7編碼，自5’端第1021-第1776位堿基為胞內(nèi)區(qū)的編碼序列，編碼253個(gè)氨基酸。與Genbank中公布的不含信號肽的hIL-23R基因的核苷酸序列一致，證明克隆到了序列正確的hIL-23R基因。
二、酶切鑒定人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體根據(jù)Genbank中公布的hIL-23R胞外區(qū)的cDNA序列設(shè)計(jì)一對常規(guī)PCR引物擴(kuò)增hIL-23R胞外區(qū)的cDNA，引物序列如下
引物1(上游)5’-GTAGAACCAGCCACAATTTT-3’引物3(下游)5’-AATGTCTCCTCTGTTGTC-3’用與步驟一相同的方法，分別在hIL-23R除信號肽的全長引物(引物1和引物2)和針對hIL-23R胞外區(qū)的引物(引物1和引物3)的引導(dǎo)下，擴(kuò)增不含信號肽的hIL-23R基因和hIL-23R胞外區(qū)的DNA片段；再將兩種PCR產(chǎn)物分別亞克隆到載體pGEM-T easy(Promega公司)中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到陽性克隆，挑選12個(gè)陽性克隆搖菌提質(zhì)粒，將含有不含信號肽的全長hIL-23R基因的質(zhì)粒載體命名為pGEM-T-1890nt，將含有hIL-23R胞外區(qū)的基因片段的質(zhì)粒載體命名為pGEM-T-18900；將上述兩種質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶PstI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，PstI酶切產(chǎn)物的檢測結(jié)果如圖3所示，泳道1-4為pGEM-T-1890nt經(jīng)PstI酶切的鑒定結(jié)果，泳道5-8為pGEM-T-18900經(jīng)PstI酶切的鑒定結(jié)果，泳道M為Marker。用PstI酶切正常的hIL-23R基因應(yīng)釋放兩個(gè)DNA片段分別為正向插入釋放長度為1224bp的DNA片段，反向插入釋放長度為666bp的DNA片段。但是由圖3可以看出，除了預(yù)期的666bp的釋放片段形式外(泳道1)，應(yīng)該釋放1224bp的位置，泳道2，3和4釋放片段的大小并不完全相同，此外，hIL-23R胞外區(qū)的PstI酶切片段大小也不完全相同(至少存在兩種不同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物)，表明無論是hIL-23R胞外區(qū)的亞克隆還是除信號肽以外的亞克隆均存在幾種不同的選擇性剪接形式，經(jīng)初步推斷用全長引物(引物1和引物2)所得的RT-PCR產(chǎn)物存在3種選擇性剪接形式；將pGEM-T-1890nt和pGEM-T-18900先后用EcoRI和EcoRV做進(jìn)一步的酶切鑒定，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切產(chǎn)物的檢測結(jié)果如圖4所示，泳道1-4為pGEM-T-1890nt經(jīng)EcoRI酶切的鑒定結(jié)果，泳道5-8為pGEM-T-18900經(jīng)EcoRI酶切的鑒定結(jié)果，泳道1’-4’為pGEM-T-1890nt經(jīng)EcoRV酶切的鑒定結(jié)果，泳道5’-8’為pGEM-T-18900經(jīng)EcoRV酶切的鑒定結(jié)果，泳道M為Marker，進(jìn)一步證明確實(shí)存在幾種不同的hIL-23R剪接異構(gòu)體。
三、用測序方法鑒定hIL-23R四種新型剪接異構(gòu)體對步驟二經(jīng)初步酶切鑒定具有hIL-23R不同選擇性剪接形式的陽性克隆進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與hIL-23R基因序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明IL-23R存在四種新的剪接異構(gòu)體。再將測序結(jié)果與染色體基因組進(jìn)行比對，結(jié)果表明上述四種新型剪接異構(gòu)體分別缺失了信號肽序列、外顯子5(Δexon5)、外顯子9(Δexon9)和外顯子9及部分外顯子12(Δexon9，11p)，將其分別命名為hIL-23RΔsp，hIL-23RΔexon5(delta5)，hIL-23RΔexon9(delta9)和hIL-23RΔexon9，11P(delta9，11p)。hIL-23RΔexon5是序列表中SEQ ID №1的DNA序列編碼的蛋白，序列表中的SEQ ID №1由1618個(gè)堿基組成，自5’端第1-第414位堿基為第一閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №2由138個(gè)氨基酸殘基組成；自5’端第494-第1618位堿基為第二閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №3由375個(gè)氨基酸殘基組成。hIL-23RΔexon9是序列表中SEQ ID№4的DNA序列編碼的蛋白，序列表中的SEQ ID №4由1676個(gè)堿基組成，自5’端第1-第960位堿基為第一閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №5由320個(gè)氨基酸殘基組成；自5’端第885-第1676位堿基為第三閱讀框，編碼序列表中SEQ ID №6的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №3由264個(gè)氨基酸殘基組成。hIL-23RΔexo9，11P是序列表中SEQ ID №7的DNA序列編碼的蛋白，序列表中的SEQ ID №7由1609個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-第960位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列的物質(zhì)，序列表中的SEQ ID №8由320個(gè)氨基酸殘基組成。hIL-23RΔsp是序列表中SEQ ID №9的DNA序列編碼的蛋白，序列表中的SEQ ID №9由1779個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-第1776位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列的物質(zhì)，序列表中的SEQ ID №10由592個(gè)氨基酸殘基組成。用clustal W程序?qū)ι鲜鲂滦蚳IL-23R剪接體與hIL-23R全長基因進(jìn)行核苷酸序列比對分析，結(jié)果如圖5所示，與hIL-23R基因全長序列相比，delta5缺失了完整的外顯子5序列(161nt)，delta9缺失了完整的外顯子9序列(103nt)，delta9，11p缺失了完整的外顯子9序列(103nt)及外顯子11的部分序列(64nt)。用genedoc軟件對上述四種新型hIL-23R剪接體與hIL-23R進(jìn)行氨基酸序列比對分析，結(jié)果如圖6所示，外顯子5或9缺失均可誘導(dǎo)產(chǎn)生提前的終止密碼子，從而導(dǎo)致蛋白的翻譯在胞外區(qū)終止(跨膜區(qū)位于外顯子10)，即若可以形成蛋白，應(yīng)均為可溶性受體形式，并可能在拮抗特異性IL-23配體上發(fā)揮作用；外顯子5或9缺失也可誘導(dǎo)產(chǎn)生翻譯閱讀框的移碼突變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后僅翻譯IL-23R胞內(nèi)區(qū)，這種變異蛋白的表達(dá)可能直接影響細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳遞。delta5，delta9和delta9，11p三種剪接異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖7所示，翻譯蛋白的分析結(jié)果如表1所示表1外顯子缺失產(chǎn)生新的剪接形式的結(jié)構(gòu)示意圖

實(shí)施例2、hIL-23R剪接異構(gòu)體在7種腫瘤相關(guān)細(xì)胞及正常細(xì)胞中的分布情況一、從多種不同腫瘤細(xì)胞系提取總RNA用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取A549(肺癌細(xì)胞系)，caM(乳腺癌細(xì)胞系)，capI(胰腺癌細(xì)胞系)，Hep2(喉癌細(xì)胞系)，K562(紅白血病細(xì)胞系)，BEL 7402(肝癌細(xì)胞系)和3D5(EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系)這7株腫瘤相關(guān)細(xì)胞系的總RNA，對提取的總RNA進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖8所示，泳道1-7分別代表提取的BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、caM和A549腫瘤細(xì)胞系的總RNA，28s和18s條帶清晰，亮度基本上呈1.5∶1的比例，表明獲得的總RNA質(zhì)量良好。
二、RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中除外顯子1，2的hIL-23R基因片段根據(jù)已知的hIL-23R的cDNA序列設(shè)計(jì)一對常規(guī)PCR引物擴(kuò)增除外顯子1，2的hIL-23R的cDNA，引物序列如下引物P1(上游)5’-GAACCAGCCACAATTTTTAAG-3’引物P2(下游)5’-CTTTTCCAAGAGTGAAATCCTATTG-3’分別以步驟一提取的7種腫瘤細(xì)胞的總RNA為模板，在引物P1和引物P2的引導(dǎo)下，RT-PCR擴(kuò)增除外顯子1，2的hIL-23R的基因片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖9所示，泳道1-7依次為以BEL 7402、3D5、K562、Hep2、CapI、CaM和A549腫瘤細(xì)胞總RNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為Marker，可以看到從7種腫瘤細(xì)胞中均擴(kuò)增出了1890bp大小的條帶，與預(yù)期的除外顯子1，2的hIL-23R基因片段大小一致，其中還從K562擴(kuò)增出了一條1130bp的小分子量條帶。
三、RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞外區(qū)的基因片段分別以步驟一提取的7種腫瘤細(xì)胞的總RNA為模板，在引物1和引物3的引導(dǎo)下，RT-PCR擴(kuò)增hIL-23R胞外區(qū)的基因片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖10所示，泳道1-7依次為以BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、caM和A549腫瘤細(xì)胞總RNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為Marker，表明從3D5、K562、Hep2及Cam腫瘤細(xì)胞中均擴(kuò)增出了700-900bp大小的條帶，其中900bp大小為預(yù)測片段大小，其他條帶推測可能是為未知的剪接異構(gòu)體或是DNA降解產(chǎn)物。
四、RT-PCR擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞中hIL-23R胞內(nèi)區(qū)的基因片段根據(jù)已知的hIL-23R的cDNA序列設(shè)計(jì)一對常規(guī)PCR引物擴(kuò)增hIL-23R胞內(nèi)區(qū)的cDNA，引物序列如下引物4(上游)5’-AACAGATCATTCCGAACTGGGA-3’引物2(下游)5’-CAATAGGATTTCACTCTTGGAAAAG-3’分別以步驟一提取的7種腫瘤細(xì)胞的總RNA為模板，在引物4和引物2的引導(dǎo)下，RT-PCR擴(kuò)增hIL-23R胞內(nèi)區(qū)的基因片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖11所示，泳道1-7依次為以BEL 7402、3D5、K562、Hep2、CapI、CaM和A549腫瘤細(xì)胞總RNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為Marker，可以看到從除caM外的其余6種腫瘤細(xì)胞中均擴(kuò)增出了約800bp大小的條帶，與預(yù)期的hIL-23R胞內(nèi)區(qū)的基因片段大小(814bp)一致。
五、對上述RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析以序列表中的SEQ ID №8為模板合成探針，對步驟二的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析，分析結(jié)果如圖12所示，泳道1-6依次代表BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、和caM腫瘤細(xì)胞；以SEQ ID№8為模板合成探針，對步驟三的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析，分析結(jié)果如圖13所示，泳道1-7依次代表BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、caM和A549腫瘤細(xì)胞；以序列表中的SEQ ID №8為模板合成探針，對步驟四的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot分析，分析結(jié)果如圖14所示，泳道1-7依次代表BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、caM和A549腫瘤細(xì)胞；上述結(jié)果表明步驟二、三和四擴(kuò)增的DNA片段確實(shí)和hIL-23R基因具有較大的序列相關(guān)性，而且對RT-PCR的檢測結(jié)果和Southern blot的分析結(jié)果基本吻合。
六、巢式PCR法鑒定hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P在腫瘤細(xì)胞中的分布情況根據(jù)hIL-23R外顯子4緊鄰?fù)怙@子5處的序列和hIL-23RΔexon9，11P外顯子11缺失部分的3’端序列設(shè)計(jì)一對引物，用巢式PCR的方能鑒定hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P在7種腫瘤細(xì)胞中的分布情況，引物序列如下引物55’-AATGCTGGGAAGCTCACCTACATA-3’引物65’-GCTTGTGTTCTGGGATGAAGATTTC-3’先分別以步驟一提取的7種腫瘤細(xì)胞的總RNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，RT-PCR擴(kuò)增不含信號肽的hIL-23R的基因片段；再以上述RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在引物5和引物6的引導(dǎo)下，進(jìn)行巢式PCR，同時(shí)以測序鑒定的整合有不含信號肽的hIL-23R基因片段的重組載體pGEM-T hIL-23R以及實(shí)施例一獲得的hIL-23R的三種剪接異構(gòu)體hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexon9、hIL-23RΔexon9，11P基因的引物5和引物6的巢式PCR產(chǎn)物為對照，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖15所示，泳道1-11依次為pGEM-T hIL-23R，hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9，hIL-23RΔexon9，11P，BEL 7402、3D5、K562、Hep2、capI、caM和A549，表明除caM外在腫瘤細(xì)胞中普遍存在3種PCR產(chǎn)物，其中缺少外顯子5應(yīng)該得到662bp大小的PCR產(chǎn)物，缺少外顯子9應(yīng)該得到720bp大小的PCR產(chǎn)物，缺少外顯子9和部分外顯子11應(yīng)該得到645bp的PCR產(chǎn)物，這三種PCR產(chǎn)物的分子量大小與已經(jīng)測序的選擇性剪接亞克隆巢式PCR產(chǎn)物的分子量大小接近，證明確實(shí)存在多種選擇性剪接方式。
七、腫瘤細(xì)胞系BEL 7402的部分PCR測序結(jié)果對腫瘤細(xì)胞系BEL 7402的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果序列表中SEQ ID №9為hIL-23R-7402的核苷酸序列，將測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，表明其hIL-23R屬于hIL-23RΔexon5這種選擇性剪接形式，與hIL-23RΔexon5基因序列有100％的一致性。
八、檢測hIL-23RΔexon5，hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P在正常細(xì)胞中的分布情況提取293細(xì)胞和靜息的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)總RNA，并分別用下述引物組合不含信號肽的hIL-23R基因片段的引物(引物1和引物2)、引物5和引物6、擴(kuò)增β-actin的引物(引物75′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′和引物85’-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3’)、引物95′-CAGGTTGAAAGAGGGAAACAGTCT-3′和引物105′-GAGGCAGAATTCAATTTCTATTGCA-3′(擴(kuò)增的片段從hIL-23R全長編碼序列起始密碼子ATG上游40個(gè)堿基到hIL-23R全長編碼序列終止密碼子TGA下游85位堿基)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖16所示，泳道1為293細(xì)胞引物5和引物6引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為從293細(xì)胞中擴(kuò)增引物7和引物8引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道3為293細(xì)胞在引物1和引物2引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道4為293細(xì)胞在引物9和引物10引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道5為PBMC在引物7和引物8引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道6為從PBMC中擴(kuò)增在引物5和引物6引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道7為PBMC在引物1和引物2引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物，泳道8為PBMC細(xì)胞在引物9和引物10引導(dǎo)下的RT-PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明在293細(xì)胞中hIL-23R沒有表達(dá)，用針對hIL-23R不同外顯子設(shè)計(jì)的不同引物對擴(kuò)增均未得到陽性結(jié)果，而在靜息的PBMC中除了包含外顯子1，2的全長hIL-23R未擴(kuò)增出外，其余三種PCR產(chǎn)物均可得到。
實(shí)施例3、hIL-23RΔsp、hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P胞外區(qū)的表達(dá)及抗體制備與腫瘤檢測一、hIL-23RΔsp、hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P胞外區(qū)蛋白的表達(dá)1、含有不含信號肽的hIL-23R基因片段的重組載體pGEM-T-hIL-23的構(gòu)建提取靜息外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的總RNA，經(jīng)mRNA純化試劑盒(Clontech公司)處理得到其mRNA，再以此mRNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，合成不含信號肽序列的hIL-23R的cDNA，將hIL-23R的cDNA與載體pGEM-T(Promega公司)用T4DNA連接酶連接，得到含有不含信號肽的hIL-23R基因片段的重組載體，將其命名為pGEM-T-hIL-23。
2、hIL-23RΔsp、hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P胞外區(qū)蛋白的表達(dá)以整合有不含信號肽的hIL-23R基因片段的重組載體pGEM-T-hIL-23R為模板，在加上BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的引物1和引物3的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增得到hIL-23R胞外區(qū)的片段，將PCR產(chǎn)物用BamHI和HindII酶切后，與用相同酶酶切的載體pQE-30用T4DNA連接酶連接，得到含有hIL-23R胞外區(qū)基因片段的重組表達(dá)載體，將其命名為pQE-30-hIL-23R。然后將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取單克隆經(jīng)BamHI和HindII進(jìn)行酶切鑒定后，將構(gòu)建正確的含有hIL-23R胞外區(qū)基因片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，用0.4mmol/mL IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳檢測(以IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有空載體pQE-30的M15大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物，無IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有空載體pQE-30的大腸桿菌M15的表達(dá)產(chǎn)物和無IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有載體pQE-30-hIL-23R胞外區(qū)的大腸桿菌M15表達(dá)產(chǎn)物為對照)，經(jīng)考馬斯亮蘭染色和脫色后如圖17所示，泳道4為IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有空載體pQE-30的大腸桿菌M15的表達(dá)產(chǎn)物，泳道3為無IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有空載體pQE-30的大腸桿菌M15的表達(dá)產(chǎn)物，泳道2為IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化載體pQE-30-hIL-23R胞外區(qū)的大腸桿菌M15表達(dá)產(chǎn)物，泳道1為無IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化載體pQE-30-hIL-23R胞外區(qū)的大腸桿菌M15的表達(dá)產(chǎn)物，表明實(shí)驗(yàn)組用IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)有分子量為35.6kDa的帶有his標(biāo)簽的蛋白。hIL-23Δexon5、hIL-23RΔexon9和hIL-23RΔexon9，11P三種剪接異構(gòu)體的胞外區(qū)可按上述相同的方法進(jìn)行表達(dá)，其中含有hIL-23RΔexon5胞外區(qū)DNA片段的重組表達(dá)載體命名為pQE-30-hIL-23RΔexon5，含有hIL-23RΔexon9胞外區(qū)DNA片段的重組表達(dá)載體命名為pQE-30-hIL-23RΔexon9，含有hIL-23RΔexon9，11胞外區(qū)DNA片段的重組表達(dá)載體命名為pQE-30-hIL-23RΔexon9，11。
二、hIL-23RΔsp、hIL-23RΔexon5、hIL-23Δexon9和hIL-23RΔexon9，11P的抗體制備與腫瘤檢測上述四種剪接異構(gòu)體在腫瘤細(xì)胞中分布廣泛，并在某些腫瘤組織中，如慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562、乳腺癌細(xì)胞CAM中有特異性表達(dá)方式，本發(fā)明因此可用RT-PCR方法檢測這些表達(dá)標(biāo)記用于腫瘤的臨床診斷，具體的檢測和診斷方法可依據(jù)現(xiàn)有的臨床診斷技術(shù)進(jìn)行，可以進(jìn)行大規(guī)模臨床樣品檢測，并在此基礎(chǔ)上研制診斷試劑盒用于疾病診斷；此外，本發(fā)明可以按常規(guī)方法制備針對用步驟一的方法表達(dá)的hIL-23RΔexon5、hIL-23RΔexon9、hIL-23RΔexon9，11P和hIL-23RΔsp的特異性抗體，檢測腫瘤的發(fā)生，上述四種剪接異構(gòu)體可作為腫瘤診斷標(biāo)記物直接用于腫瘤的臨床診斷，具體方法是將剪接異構(gòu)體編碼蛋白進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，將純化蛋白免疫家兔或小白鼠以制備多克隆抗體，同時(shí)也可進(jìn)行單克隆抗體的制備，通過分子水平檢測建立特異性剪接異構(gòu)體的表達(dá)與腫瘤的相關(guān)性，在臨床上可運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行大規(guī)模腫瘤樣品檢測，開發(fā)成為臨床診斷的檢測指標(biāo)或輔助診斷的指標(biāo)。
序列表<160>11<210>1<211>1618<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1gaaccagcca caatttttaa gatgggtacg aatatctcta tatattgcca agcagcaatt 60aagaactgcc aaccaaggaa acttcatttt tataaaaatg gcatcaaaga aagatttcaa 120atcacaagga ttaataaaac aacagctcgg ctttggtata aaaactttct ggaaccacat 180gcttctatgt actgcactgc tgaatgtccc aaacattttc aagagacact gatatgtgga 240aaagacattt cttctggata tccgccagat attcctgatg aagtaacctg tgtcatttat 300gaatattcag gcaacatgac ttgcacctgg aatgctggga agctcaccta catagacaca 360aaatacgtgg tacatgtgaa gagtgatacc ttctgcagcc gtcatttcca gggctgagac 420tataaatgct acagtgccca agaccataat ttattgggat agtcaaacaa caattgaaaa 480ggtttcctgt gaaatgagat acaaggctac aacaaaccaa acttggaatg ttaaagaatt 540tgacaccaat tttacatatg tgcaacagtc agaattctac ttggagccaa acattaagta 600cgtatttcaa gtgagatgtc aagaaacagg caaaaggtac tggcagcctt ggagttcacc 660gttttttcat aaaacacctg aaacagttcc ccaggtcaca tcaaaagcat tccaacatga 720cacatggaat tctgggctaa cagttgcttc catctctaca gggcacctta cttctgacaa 780cagaggagac attggacttt tattgggaat gatcgtcttt gctgttatgt tgtcaattct 840ttctttgatt gggatattta acagatcatt ccgaactggg attaaaagaa ggatcttatt 900gttaatacca aagtggcttt atgaagatat tcctaatatg aaaaacagca atgttgtgaa 960aatgctacag gaaaatagtg aacttatgaa taataattcc agtgagcagg tcctatatgt1020tgatcccatg attacagaga taaaggaaat cttcatccca gaacacaagc ctacagacta1080caagaaggag aatacaggac ccctggagac aagagactac ccgcaaaact cgctattcga1140caatactaca gttgcatata ttcctgatct cgacactgga tataaacccc aaatttcaaa1200ttttctgcct gagggaagcc atctcagcaa taataatgaa attacttcct taacacttaa1260accaccagtt gattccttag actcaggaaa taatcccagg ttacaaaagc atcctaattt1320tgctttttct gtttcaagtg tgaattcact aagcaacaca atatttcttg gagaattaag1380cctcatatta aatcaaggag aatgcagttc tcctgacata caaaactcag tagaggagga1440aaccaccatg cttttggaaa atgattcacc cagtgaaact attccagaac agaccctgct1500tcctgatgaa tttgtctcct gtttggggat cgtgaatgag gagttgccat ctattaatac1560ttattttcca caaaatattt tggaaagcca cttcaatagg atttcactct tggaaaag 1618<210>2<211>138
<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Thr Asn Ile Ser Ile Tyr Cys1 5 10 15Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys20 25 30Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr35 40 45Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala Ser Met Tyr50 55 60Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly65 70 75 80Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr85 90 95Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala100 105 110Gly Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser115 120 125Asp Thr Phe Cys Ser Arg His Phe Gln Gly130 135<210>3<211>375<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>3Met Arg Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe1 5 10 15Asp Thr Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro20 25 30Asn Ile Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg35 40 45Tyr Trp Gln Pro Trp Ser Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr50 55 60Val Pro Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser65 70 75 80Gly Leu Thr Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn
85 90 95Arg Gly Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met100 105 110Leu Ser Ile Leu Ser Leu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr115 120 125Gly Ile Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp LeuTyr Glu130 135 140Asp Ile Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu145 150 155 160Asn Ser Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val165 170 175Asp Pro Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys180 185 190Pro Thr Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp195 200 205Tyr Pro Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Ala Tyr Ile Pro210 215 220Asp Leu Asp Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu225 230 235 240Glv Ser His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys245 250 255Pro Pro Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys260 265 270His Pro Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn275 280 285Thr Ile Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys290 295 300Ser Ser Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu305 310 315 320Leu Glu Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu325 330 335Pro Asp Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro340 345 350Ser Ile Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Ser His Phe Asn355 360 365Arg Ile Ser Leu Leu Glu Lys370 375<210>4<211>1676
<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>4gaaccagcca caatttttaa gatgggtatg aatatctcta tatattgcca agcagcaatt 60aagaactgcc aaccaaggaa acttcatttt tataaaaatg gcatcaaaga aagatttcaa120atcacaagga ttaataaaac aacagctcgg ctttggtata aaaactttct ggaaccacat180gcttctatgt actgcactgc tgaatgtccc aaacattttc aagagacact gatatgtgga240aaagacattt cttctggata tccgccagat attcctgatg aagtaacccg tgtcatttat300gaatattcag gcaacatgac ttgcacctgg aatgctggga agctcaccta catagacaca360aaatacgtgg tacatgtgaa gagtttagag acagaagaag agcaacagta tctcacctca420agctatatta acatctccac tgattcatta caaggtggca agaagtactt ggtttgggtc480caagcagcaa acgcactagg catggaagag tcaaaacaac tgcaaattca cctggatgat540atagtgatac cttctgcagc cgtcatttcc agggctgaga ctataaatgc tacagtgccc600aagaccataa tttattggga tagtcaaaca acaattgaaa aggtttcctg tgaaatgaga660tacaaggcta caacaaacca aacttggaat gttaaagaat ttgacaccaa ttttacatat720gtgcaacagt cagaattcta cttggagcca aacattaagt acgtatttca agtgagatgt780caagaaacag gcaaagggta ctggcagcct tggagttcac cgttttttca taaaacacct840gaaacagttc cccaggtcac atcaaaagca ttccaacatg acacatggaa ttctgggcta900acagttgctt ccatctctac agggcacctt acttctggat taaaagaagg atcttattgt960taataccaaa gtggctttat gaagatattc ctaatatgaa aaacagcaat gttgtgaaaa 1020tgctacagga aaatagtgaa cttatgaata ataattccag tgagcaggtc ctatatgttg 1080atcccatgat tacagagata aaagaaatct tcatcccaga acacaagcct acagactaca 1140agaaggagaa tacaggaccc ctggagacaa gagactaccc gcaaaactcg ctattcgaca 1200atactacagt tgtatatatt cctgatctca acactggata taaaccccaa atttcaaatt 1260ttctgcctga gggaagccat ctcagcaata ataatgaaat tacttcctta acacttaaac 1320caccagttga ttccttagac tcaggaaata atcccaggtt acaaaagcat cctaattttg 1380ctttttctgt ctcaagtgtg aattcactaa gcaacacaat atttcttgga gaattaagcc 1440tcatattaaa tcaaggagaa tgcagttctc ctgacataca aaactcagta gaggaggaaa 1500ccaccatgct tttggaaaat gattcaccca gggaaactat tccagaacag accctgcttc 1560ctgatgaatt tgtctcctgt ttggggatcg tgaatgagga gttgccatct attaatactt 1620attttccaca aaatattttg gaaagccact tcaataggat ttcactcttg gaaaag 1676<210>5<211>320<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>5Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile Ser Ile Tyr Cys
1 5 10 15Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys20 25 30Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr35 40 45Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala SerMet Tyr50 55 60Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly65 70 75 80Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr85 90 95Arg Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala100 105 110Gly Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser115 120 125Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Asn130 135 140Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Val Trp Val145 150 155 160Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys Gln Leu Gln Ile165 170 175His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val Ile Ser Arg Ala180 185 190Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile Tyr Trp Asp Ser195 200 205Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg Tyr Lys Ala Thr210 215 220Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr Asn Phe Thr Tyr225 230 235 240Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile Lys Tyr Val Phe245 250 255Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Gly Tyr Trp Gln Pro Trp Ser260 265 270Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro Gln Val Thr Ser275 280 285Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu Thr Val Ala Ser290 295 300Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Gly Leu Lys Glu Gly Ser Tyr Cys305 310 315 320
<210>6<211>264<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>6Met Glu Phe Trp Ala Asn Ser Cys Phe His Leu Tyr Arg Ala Pro Tyr1 5 10 15Phe Trp Ile Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr20 25 30Glu Asp Ile Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln35 40 45Glu Asn Ser Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr50 55 60Val Asp Pro Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His65 70 75 80Lys Pro Thr Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg85 90 95Asp Tyr Pro Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile100 105 110Pro Asp Leu Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro115 120 125Glu Gly Ser His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu130 135 140Lys Pro Pro Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln145 150 155 160Lys His Pro Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser165 170 175Asn Thr Ile Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu180 185 190Cys Ser Ser Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met195 200 205Leu Leu Glu Asn Asp Ser Pro Arg Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu210 215 220Leu Pro Asp Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu225 230 235 240Pro Ser Ile Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Ser His Phe245 250 255Asn Arg Ile Ser Leu Leu Glu Lys260
<210>7<211>1609<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>7gaaccagcca caatttttaa gatgggtatg aatatctcta tatattgcca agcagcaatt 60aagaactgcc aaccaaggaa acttcatttt tataaaaatg gcatcaaaga aagatttcaa120atcacaagga ttaataaaac aacagctcgg ctttggtata aaaactttct ggaaccacat180gcttctatgt actgcactgc tgaatgtccc aaacattttc aagagacact gatatgtgga240aaagacattt cttctggata tccgccagat attcctgatg aagtaacctg tgtcatttat300gaatattcag gcaacatgac ttgcacctgg aatgctggga agctcaccta catagacaca360aaatacgtgg tacatgtgaa gagtttagag acagaagaag agcaacagta tctcacctca420agctatatta acatctccac tgattcatta caaggtggca agaagtactt ggtttgggtc480caagcagcaa acgcactagg catggaagag tcaaaacaac tgcaaattca cctggatgat540atagtgatac cttctgcagc cgtcatttcc agggctgaga ctataaatgc tacagtgccc600aagaccataa tttattggga tagtcaaaca acaattgaaa aggtttcctg tgaaatgaga660tacaaggcta caacaaacca aacttggaat gttaaagaat ttgacaccaa ttttacatat720gtgcaacagt cagaattcta cttggagcca aacattaagt acgtatttca agtgagatgt780caagaaacag gcaaaaggta ctggcagcct tggagttcac cgttttttca taaaacacct840gaaacagttc cccaggtcac atcaaaagca ttccaacatg acacatggaa ttctgggcta900acagttgctt ccatctctac agggcacctt acttctggat taaaagaagg atcttattgt960taataccaaa gtggctttat gaagatattc ctaatatgaa aaacagcaat gttgtgaaaa 1020tgctacagag ataaaagaaa tcttcatccc agaacacaag cctacagact acaagaagga 1080gaatacagga cccctggaga caagagacta cccgcaaaac tcgctattcg acaatactac 1140agttgtatat attcctgatc tcaacactgg atataaaccc caaatttcaa attttctgcc 1200tgagggaagc catctcagca ataataatga aattacttcc ttaacactta aaccaccagt 1260tgattcctta gactcaggaa ataatcccag gttacaaaag catcctaatt ttgctttttc 1320tgtttcaagt gtgaattcac taagcaacac aatatttctt ggagaattaa gcctcatatt 1380aaatcaagga gaatgcagtt ctcctgacat acaaaactca gtagaggagg aaaccaccat 1440gcttttggaa aatgattcac ccagtgaaac tattccagaa cagaccctgc ttcctgatga 1500atttgtctcc tgtttgggga tcgtgaatga ggagttgcca tctattaata cttattttcc 1560acaaaatatt ttggaaagcc acttcaatag gatttcactc ttggaaaag 1609<210>8<211>320<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)
<400>8Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile Ser Ile Tyr Cys1 5 10 15Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys20 25 30Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr35 40 45Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala Ser Met Tyr50 55 60Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly65 70 75 80Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr85 90 95Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala100 105 110Gly Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser115 120 125Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Asn130 135 140Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Val Trp Val145 150 155 160Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys Gln Leu Gln Ile165 170 175His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val Ile Ser Arg Ala180 185 190Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile Tyr Trp Asp Ser195 200 205Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg Tyr Lys Ala Thr210 215 220Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr Asn Phe Thr Tyr225 230 235 240Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile Lys Tyr Val Phe245 250 255Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp Gln Pro Trp Ser260 265 270Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro Gln Val Thr Ser275 280 285Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu Thr Val Ala Ser290 295 300Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Gly Leu Lys Glu Gly Ser Tyr Cys
305 310 315 320<210>9<211>1779<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>9gaaccagcca caatttttaa gatgggtatg aatatctcta tatattgcca agcagcaatt 60aagaactgcc aaccaaggaa actccatttt tataaaaatg gcatcaaaga aagatttcaa120atcacaagga ttaataaaac aacagctcgg ctttggtata aaaactttct ggaaccacat180gcttctatgt actgcactgc tgaatgtccc aaacattttc aagagacact gatatgtgga240aaagacattt cttctggata tccgccagat attcctgatg aagtaacctg tgtcatttat300gaatattcag gcaacatgac ttgcacctgg aatgctggga agctcaccta catagacacg360aaatacgtgg tacatgtgaa gagtttagag acagaagaag agcaacagta tctcacctca420agctatatta acatctccac tgattcatta caaggtggca agaagtactt ggtttgggtc480caagcagcaa acgcactagg catggaagag tcaaaacaac tgcaaattca cctggatgat540atagtgatac cttctgcagc cgtcatttcc agggctgaga ctataaatgc tacagtgccc600aagaccataa tttattggga tagtcaaaca acaattgaaa aggtttcctg tgaaatgaga660tacaaggcta caacaaacca aacttggaat gttaaagaat ttgacaccaa ttttacatat720gtgcaacagt cagaattcta cttggagcca aacattaagt acgtatttca agtgagatgt780caagaaacag gcaaaaggta ctggcagcct tggagttcac cgttttttca taaaacacct840gaaacagttc cccaggtcac atcaaaagca ttccaacatg acacatggaa ttctgggcta900acagttgctt ccatctctac agggcacctt acttctgaca acagaggaga cattggactt960ttattgggaa tgatcgtctt tgctgttatg ttgtcaattc tttctttgat tgggatattt 1020aacagatcat tccgaactgg gattaaaaga aggatcttgt tgttaatacc aaagtggctt 1080tatgaagata ttcctaatat gaaaaacagc aatgttgtga aaatgctaca ggaaaatagt 1140gaacttatga ataataattc cagtgagcag gtcctatatg ttgatcccat gattacagag 1200ataaaagaaa tcttcatccc agaacacaag cctacagact acaagaagga gaatacagga 1260cccctggaga caagagacta cccgcaaaac tcgctattcg acaatactacagttgtatat1320attcctgatc tcaacactgg atataaaccc caaatttcaa attttctgcc tgagggaagc 1380catctcagca ataataatga aattacttcc ttaacactta aaccaccagt tgattcctta 1440gactcaggaa ataatcccag gttacaaaag catcctaatt ttgctttttc tgtttcaagt 1500gtgaattcac taagcaacac aatatttctt ggagaattaa gcctcatatt aaatcaagga 1560gaatgcagtt ctcctgacat acaaaactca gtagaggagg aaaccaccat gcttttggaa 1620aatgattcac ccagtgaaac tattccagaa cagaccctgc ttcctgatga atttgtctcc 1680tgtttgggga tcgtgaatga ggagttgcca tctattaata cttattttcc acaaaatatt 1740ttggaaagcc acttcaatag gatttcactc ttggaaaag 1779<210>10
<211>592<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>10Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile Ser Ile Tyr Cys1 5 10 15Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys20 25 30Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr35 40 45Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala Ser Met Tyr50 55 60Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly65 70 75 80Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr85 90 95Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala100 105 110Gly Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser115 120 125Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Asn130 135 140Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Val Trp Val145 150 155 160Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys Gln Leu Gln Ile165 170 175His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val Ile Ser Arg Ala180 185 190Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile Tyr Trp Asp Ser195 200 205Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg Tyr Lys Ala Thr210 215 220Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr Asn Phe Thr Tyr225 230 235 240Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile Lys Tyr Val Phe245 250 255Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp Gln Pro Trp Ser260 265 270Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro Gln Val Thr Ser
275 280 285Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu Thr Val Ala Ser290 295 300Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg GlyAsp Ile Gly Leu305 310 315 320Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser Ile Leu Ser Leu325 330 335Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile Lys Arg Arg Ile340 345 350Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile Pro Asn Met Lys355 360 365Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser Glu Leu Met Asn370 375 380Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro Met Ile Thr Glu385 390 395 400Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr Asp Tyr Lys Lys405 410 415Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro Gln Asn Ser Leu420 425 430Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu Asn Thr Gly Tyr435 440 445Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser His Leu Ser Asn450 455 460Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro Val Asp Ser Leu465 470 475 480Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro Asn Phe Ala Phe485 490 495Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile Phe Leu Gly Glu500 505 510Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser Pro Asp Ile Gln515 520 525Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu Asn Asp Ser Pro530 535 540Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp Glu Phe Val Ser545 550 555 560Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile Asn Thr Tyr Phe565 570 575Pro Gln Asn Phe Trp Lys Ala Thr Ser Ile Gly Phe His Ser Trp Lys580 585 590
<210>11<211>1617<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>11aaccagccac aatttttaag atgggtacga atatctctat atattgccaa gcagcaatta 60agaactgcca accaaggaaa cttcattttt ataaaaatgg catcaaagaa agatttcaaa120tcacaaggat taataaaaca acagctcggc tttggtataa aaactttctg gaaccacatg180cttctatgta ctgcactgct gaatgtccca aacattttca agagacactg atatgtggaa240aagacatttc ttctggatat ccgccagata ttcctgatga agtaacctgt gtcatttatg300aatattcagg caacatgact tgcacctgga atgctgggaa gctcacctac atagacacaa360aatacgtggt acatgtgaag agtgatacct tctgcagccg tcatttccag ggctgagact420ataaatgcta cagtgcccaa gaccataatt tattgggata gtcaaacaac aattgaaaag480gtttcctgtg aaatgagata caaggctaca acaaaccaaa cttggaatgt taaagaattt540gacaccaatt ttacatatgt gcaacagtca gaattctact tggagccaaa cattaagtac600gtatttcaag tgagatgtca agaaacaggc aaaaggtact ggcagccttg gagttcaccg660ttttttcata aaacacctga aacagttccc caggtcacat caaaagcatt ccaacatgac720acatggaatt ctgggctaac agttgcttcc atctctacag ggcaccttac ttctgacaac780agaggagaca ttggactttt attgggaatg atcgtctttg ctgttatgtt gtcaattctt840tctttgattg ggatatttaa cagatcattc cgaactggga ttaaaagaag gatcttattg900ttaataccaa agtggcttta tgaagatatt cctaatatga aaaacagcaa tgttgtgaaa960atgctacagg aaaatagtga acttatgaat aataattcca gtgagcaggt cctatatgtt 1020gatcccatga ttacagagat aaaggaaatc ttcatcccag aacacaagcc tacagactac 1080aagaaggaga atacaggacc cctggagaca agagactacc cgcaaaactc gctattcgac 1140aatactacag ttgcatatat tcctgatctc gacactggat ataaacccca aatttcaaat 1200tttctgcctg agggaagcca tctcagcaat aataatgaaa ttacttcctt aacacttaaa 1260ccaccagttg attccttaga ctcaggaaat aatcccaggt tacaaaagca tcctaatttt 1320gctttttctg tttcaagtgt gaattcacta agcaacacaa tatttcttgg agaattaagc 1380ctcatattaa atcaaggaga atgcagttct cctgacatac aaaactcagt agaggaggaa 1440accaccatgc ttttggaaaa tgattcaccc agtgaaacta ttccagaaca gaccctgctt 1500cctgatgaat ttgtctcctg tttggggatc gtgaatgagg agttgccatc tattaatact 1560tattttccac aaaatatttt ggaaagccac ttcaatagga tttcactctt ggaaaag 161權(quán)利要求
1.人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是人白細(xì)胞介素23特異性受體的mRNA前體通過選擇性剪接使信號肽序列、完整的第5外顯子、第9外顯子、或完整第9和部分第12外顯子缺失后表達(dá)的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失完整第5外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是序列表中SEQ ID №1的DNA序列編碼的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失完整第5外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失完整第9外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是序列表中SEQ ID №4的DNA序列編碼的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失完整第9外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №5或SEQ ID №6的氨基酸殘基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失第9和部分第11外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是序列表中SEQ ID №7的DNA序列編碼的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失第9和部分第11外顯子的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №8的氨基酸殘基序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失信號肽序列的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是序列表中SEQ ID №9的DNA序列編碼的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的剪接異構(gòu)體，其特征在于所述缺失信號肽序列的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體具有序列表中SEQ ID №10的氨基酸殘基序列。
10.權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素23特異性受體的選擇性剪接異構(gòu)體編碼下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；3)序列表中SEQ ID №7的DNA序列；4)序列表中SEQ ID №9的DNA序列。
11.含有權(quán)利要求10所述的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體編碼的核苷酸序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
12.權(quán)利要求1-9任一所述的人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體在制備腫瘤診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體及其編碼基因與其在制備腫瘤診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用。該人白細(xì)胞介素23特異性受體的剪接異構(gòu)體，是人白細(xì)胞介素23特異性受體的mRNA前體通過選擇性剪接使信號肽序列、完整的第5外顯子、第9外顯子或完整第9和部分第11外顯子缺失后表達(dá)的物質(zhì)。本發(fā)明的剪接異構(gòu)體在腫瘤細(xì)胞中分布廣泛，并在某些腫瘤組織中有特異性表達(dá)方式，因此可用RT－PCR方法檢測這些表達(dá)標(biāo)記用于腫瘤的臨床診斷。本發(fā)明將在腫瘤診斷中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C07K1/107GK1824677SQ200510008610
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者張香月, 劉力, 王樹蕙, 張?jiān)?申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所