專利名稱：：抗體及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及結合特定表位的抗體，所述表位存在于細胞，如癌細胞、轉移細胞、白血病細胞、白細胞和血小板上并且對于諸如細胞滾動(cellrolling)、轉移、炎癥和自身免疫病的多種生理現(xiàn)象是重要的.更具體地，所述抗體具有抗癌活性、抗轉移活性、抗白血病活性、抗病毒活性、抗感染活性，和/或針對其他疾病的活性，所述其他疾病例如炎性疾病、自身免疫病、HIV感染、心血管病，如心肌梗死、視網(wǎng)膜病，和由依賴碟酸化酪氡酸的蛋白質-蛋白質相互作用導致的疾病。此外，本發(fā)明的抗體可以用作靶向劑以將治療劑導向身體內的特定細胞或者部位，
背景技術：
：抗體、噬菌體展示和組織導向治療劑的組織選擇性導向是制藥業(yè)中正在興起的學科.已經(jīng)設計了基于導向的新的癌癥治療用以增加治療的特異性和效力同時減小毒性，從而增強總的功效。針對肺瘤相關抗原的小鼠單克隆抗體(MAb)已經(jīng)嘗試用于將毒素、放射性核素和化學治療綴合物導向腫瘤.此外，分化抗原，如CD19、CD20、CD22和CD25已經(jīng)用作治療造血惡性肺瘤中的癌特異性靶.盡管進行了廣泛研究，但是該方法仍然具有若干局限。一個局限是難以分離展示選擇性結合的適宜的MAb。第二個局限是需要高抗體免疫原性作為成功的抗體分離的前提條件.笫三個局限是終產物具有非人序列，其誘導免疫應答；例如，當對人給予小鼠MAb時，將產生人抗小鼠抗體(HAMA)應答.HAMA應答通常導致更短的血清半衷期和妨礙重復治療，從而降低了抗體的治療價值.該后一種局限已經(jīng)激起了在工程改造鼠來源的嵌合或者人源化單克隆抗體和發(fā)現(xiàn)人抗體方面的興趣。該方法的另一個局限是只能夠分離僅針對已知和純化抗原的一種抗體種類.而且，該方法到目前為止還不是選擇性的，因為該方法使得能夠分離針對存在于正常細胞以及惡性細胞上的細胞表8面標i&的抗體，存在許多因素影響用于治療癌癥的MAb的治療功效，這些因素包括胂瘤細胞上抗原表達的特異性和水平、抗原異質性和腫瘤塊的可及牧，，如^w^體兩治^更具響應性。MAb快速結合血流中的白血病和淋巴瘤細胞并且容易穿透淋巴組織中的惡性細胞，從而使得淋巴腫痗是基于MAb的治療的極好的候選者，理想的系統(tǒng)需要鑒定識別產生惡性后代細胞的干細胞的細胞表面上的標i己的MAb.噬菌體文庫用于選擇結合分離的、預定的靶蛋白質，如抗體、激素和受體的隨機單鏈可變片段(scFv).此外，通?？贵w展示文庫,尤其是噬菌體scFv文庫的使用促進了發(fā)現(xiàn)導向特異的、還未認識的和未確定的細胞表面部分的獨特分子的備選方法.白血病、淋巴瘤和骨號瘤是來源于骨拔和淋巴組織并且參與細胞的不受控制的生長的癌.急性成淋巴細胞性白血病(ALL)是由特定臨床和免疫學特征定義的異質性疾病.與ALL的其他形式類似，B細胞ALL(B-ALL)的大多數(shù)病例的確定原因還是未知的；盡管在許多病例中，該疾病由單個細胞DNA中的獲得性遣傳改變引起，所述遣傳改變導致異常和連續(xù)增殖.在兒童和成年人中，患有B-ALL的患者的預后比其他白血病患者的更嚴重.慢性淋巴細胞性白血病(CLL)是白血病的緩慢發(fā)展形式，其特征是淋巴細胞數(shù)目增加.急性徵細胞性白血病(AML)是贅生物的異質組，其中祖細胞在正常條件下產生髄細胞系的終末分化的細胞(紅細胞、粒細胞、單核細胞和血小板)。與其他形式的瘤形成一樣，AML與獲得性遣傳改變有關，所述遣傳改變導致正常分化的殖樣細胞被相對不分化的母細胞代替，從而顯示出一種或多種類型的早期骨錟分化，AML通常在骨拔中發(fā)展，且較低程度地在次級造血器官中發(fā)展.AML主要侵襲成年人，在15-40歲的發(fā)病率達到峰值，但是還已知AML侵襲兒童和老人.幾乎所有AML患者都需要診斷后立即治療以實現(xiàn)臨床減輕，其中沒有證據(jù)表明循環(huán)的未分化的母細胞的異常水平.迄今，已經(jīng)開發(fā)了誘導針對腫瘤細胞的細胞溶解活性的多種MAb,針對HER2的胞外結構域(P185)產生了鼠MAbmuMab4D5，并且發(fā)現(xiàn)其顯著抑制超表達HBR2的人腫瘤細胞的增殖，已經(jīng)將9muMab4D5人源化以產生藥物HERCEPTIN(司徒曼布)，其得到FDA批準并且當前用于治療人乳腺癌(美國專利號5,821,337和5，720，954)。結合后，所述抗體能夠抑制依賴HER2生長因子受體的腫瘤細胞的生長.此外，F(xiàn)DA最近批準了針對CD20的嵌合抗體Rituxan(利妥?，?，其導致外周B細胞(包括與淋巴瘤相關的外周B細胞)的快速耗竭(美國專利號5,843,439)。該抗體對把細胞的結合導致依賴補體的裂解.該產品當前已經(jīng)被批準并且當前用于臨床治療低級B細胞非何杰金淋巴瘤，一些其他人源化和嵌合抗體正處于開發(fā)或者臨床試驗中。此外，將與在正常號樣細胞以及大多數(shù)類型號樣白血病細胞上表達的CD33抗原特異反應的人源化免疫球蛋白(Ig)，綴合到抗癌藥物加利車霉素CMA-676(Sievers等>、，BloodSupp.308:504a(1997)).該綴合物稱作藥物MYL0TARG,最近已經(jīng)得到FDA批準(Caron等人，CancerSupp.73:1049-56(1994)),考慮到細胞溶解活性，將當前臨床試驗的另一種抗-CD33抗體(HumM195)綴合到幾種細胞毒性劑,包括白樹毒素(McGraw等人，CancerImmunol.Im咖nother.39:367-74(1994))和放射性同位素mI(Caron等人，Blood83:1760-68(1994))、9°Y(Jurcic等人，BloodSupp.92:613a(1998))和"3Bi(Humm等人，BloodSupplement38:231P(1997)),抗白細胞抗原CD45的嵌合抗體(cHuLym3)在臨床研究中用于治療人白血病和,淋巴瘤(Sun等人，CancerImmunol.Immunother.48:595-602(2000)).在體外測定中，在ADCC(依賴抗體的細胞介導細胞毒性)測定中觀察到特異細胞溶解(Henkart，Immunity1:343-46(1994);Squier和Cohen,CurrentOpin.Immunol.6:447-52(1994)),已經(jīng)將治療性抗體專門改造以使得對它們的靶有更高親和力、更穩(wěn)定和最佳的生物分布。見，例如，PresU，CurrentPharma.Biotechnol.，3:237-56(2002);Presta等人，Biochem.SocietyTransactions,30(4):487-90(2002)。與小鼠單克隆人源化和嵌合抗體的構建相比，使用噬菌體展示技術使得可以分離具有完整人序列的scFv。最近開發(fā)了基于來自噬菌體展示技術的scFv克隆的針對人TGFa-2受體的完全人抗體。該scFv被轉化成能夠竟爭結合TGFa-2的完全人IgG4(Thompson等人，J.Immunol.Meth.227:17-29(1999))，其具有強的抗增殖活性.本領域技術人員已知的噬菌體展示技術在下面的出版物中更具體地描述Smith,Science228:1315(1985);Scott等人，Science249:386-90(1990);Cwirla等人，PNAS87:6378-82(1990);Devlin等人，Science249:404-06(1990);Griffiths等人，EMBOJ.13(14):3245-60(1994);Bass等人，Proteins8:309-14(1990);McCafferty等人，Nature348:552-54(1990);Nissim等人，EMBOJ.13:692-98(1994);美國專利號5,427,908、5，432,018、5，223,409和5,403,484,分離的scFv抗體分子的配體血小板、血纖蛋白原、GPIb、選擇蛋白和PSGL-1(P-選擇蛋白糖蛋白配體-1)的每一種都在以下幾種致病條件或者疾病狀態(tài)中起重要作用，如異常炎癥或者致病性炎癥、異常免疫反應或者致病性免疫反應、自身免疫反應、轉移、異常粘連或者致病性粘連、血栓形成和/或再狹窄，和異常聚集或者致病性聚集.從而，與血小板和與這些分子交叉反應的抗體可以用于診斷和治療與這些和其他致病條件有關的疾病和病癥.血小板血小板是血液系統(tǒng)的良好表征的成分并且在止血、血栓形成和/或再狹窄中起若千重要的作用.對血管的損傷啟動稱作止血的過程，其特征是一系列的順序事件.對損傷血管的最初反應是血小板粘附到血管內表面上受影響的區(qū)域。下一步是許多層血小板在前面粘附的血小板上聚集，形成止血栓子并封閉血管壁.通過沉積血纖蛋白聚合物進一步加強止血栓子.僅當損傷被修復時血塊或者栓子得到降解.循環(huán)的血小板是從巨核細胞的外周釋放的細胞質顆粒.從而血小板在止血起重要作用.在血管損傷后，血小板粘附到受損的組織表面并相互附著(粘合)，該亊件序列快速發(fā)生，從而在血管損傷部位形成無結構的塊(通常稱作血小板栓子或者血栓)，該粘合現(xiàn)象(也稱作聚集)可以由多種物質、或者激動劑，如膠原、腺苷二鱗酸(ADP)、腎上腺素、5-羥色胺和利托菌素體外引起。聚集是所進行的多種體外試驗之一，用作血小板功能的量度。ii轉移中血小板的重要性腫瘤轉移可能是限制癌癥患者存活的最重要的因素.所積累的數(shù)據(jù)表明肝瘸細胞與宿f血小板相互作用的能力代表轉移中不可缺少的決定因素之一(Oleksowicz，ThrombosisRes.79:261-74(1995)),已經(jīng)證明腫瘤細胞聚集血小板的能力與腫瘤細胞的轉移潛力相關，并且已經(jīng)顯示抑制腫瘤誘導的血小板聚集與嚙齒動物模型中轉移的抑制相關.已經(jīng)證明腫瘤細胞與血小板的相互作用涉及膜粘著分子和激動劑分泌.已經(jīng)在肺瘤細胞系上鑒定了免疫相關的血小板糖蛋白的表達，還證明在乳腺腫瘤細胞系的表面上表達血小板免疫相關的糖蛋白、GPIb、GPIIb/IIIa、GPIb/IX和整聯(lián)蛋白av亞基(Oleksowicz，(1995)，同上；Kamiyama等人，J.Lab.Clin.Med.117(3):209-17(1991)),Gasic等人(PNAS61:46-52(1968))顯示抗體誘導的血小板減少顯著降低CT26結腸腺癌、Lewis肺癌和B16黑素瘤產生的轉移的數(shù)目和體積(Karpatkin等人，J.Clin.Invest.81(4):1012-19(1988);Clezardin等人，CancerRes.53(19):4695-700(1993))'此外，發(fā)現(xiàn)在HEL細胞的表面膜上表達單多肽鏈(60kd)，其與GPIb密切相關并且對應于不完全或者異常0-糖基化的GPIba亞基(Kieffer等人，J.Biol.Ctiem.261(34):15854-62(1986)),血小板也參與轉移過程。當轉移性癌細胞進入血流時，形成包被腫瘤細胞的多細胞復合體，它們由血小板和白細胞組成，這些復合體也可以稱作微栓塞，它們幫助腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng).血小板對腫瘤細胞的包被需要血小板表達P-選擇蛋白.GPIb復合體止血過程中的每一步都需要血小板表面上存在受體.對止血重要的一種受體是糖蛋白lb-IX復合體(也稱作CD42),該受體介導血小板通過結合內皮下膜中的vonWillebrand因子(vWF)在受傷部位粘著血管壁(最初的附著)。它在止血中重要的兩種其他血小板功能中也具有重要作用(a)在動脈狹窄區(qū)通過高剪切力誘導血小板的聚12集和(b)通過低濃度凝血酶誘導血小板激活.GPIb-IX復合體是血小板質膜的外表面的主要成分之一。GPIb-IX復合體包含三種跨膜多肽-GPIb的二疏鍵連接的130kDaa鏈和25kDaP鏈和非共價結合的GPIX(22kDa),為了CD4X合體的有效細胞表面表達和功能，所有亞基都以等摩爾量存在于血小板膜上，表明三種亞基正確裝配成復合體是在質膜上的完全表達所需要的，GPIb的a鏈由三種不同結構域組成，它們是(1)含有富含亮氨酸的重復序列和Cys_結合的側翼序列的球狀N-末端肽結構域；(2)高度糖基化的粘蛋白樣大糖肽結構域；和(3)膜結合的C-末端區(qū)，其含有連接GPIboc跨膜和細胞質序列的二疏鍵.一些證據(jù)表明vWF和GPIb-1X復合體的結合凝血酶的結構域存在于球狀區(qū)，其包括GPIba的氨基末端的約300個氨基酸.人血小板GPIb-IX復合體是關鍵的膜受體，其介導血小板功能和反應性。GPIb對內皮下結合的vWF的識別允許血小板粘附到受損的血管。此外，vWF對GPIba的結合還誘導血小板激活，其可以包括GPIb-IX的細胞質結構域與細胞骨架或者磷脂酶A2的相互作用。此外，GPIba含有a-凝血酶的高親和力結合位點，其通過當前還沒有較好定義的機制促進血小板激活.選擇蛋白和PSGL-1P-、E-和L-選擇蛋白是粘著分子家族成員，其除其他功能外，介導血管內皮上白細胞的滾動.P-選擇蛋白以顆粒儲存在血小板中并在由凝血酶、組胺、佛波醋或者其他刺激分子激活后轉運到表面。P-選擇蛋白也在激活的內皮細胞上表達。E-選擇蛋白在內皮細胞上表達，且L-選擇蛋白在嗜中性粒細胞、單核細胞、T細胞和B細胞上表達.PSGL-1(也稱作CD162)是P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白的粘蛋白糖蛋白配體，其與GPIb具有結構相似性(Afsha^-Kha^ghan等人(2001)，前述)，PSGL-1是二硫鍵連接的同型二聚體，其具有PACE(配對的堿性氨基酸轉化酶)切割位點.PSGL-1的細胞外部分含有三個N-連接的糖基化位點并具有許多唾液酸化、巖藻糖基化O-連接的寡糖分枝(Moore等人，J.Biol.Chem.118:445-56(1992)).大多數(shù)N-聚糖位點和許多0-聚糖位點都被占據(jù)。已經(jīng)測定了來自人HL-60細胞的PSGL-1的0-聚糖的結構.這些O-聚糖的亞型是結合選擇蛋白所需的核心-2、唾液酸化和巖藻糖基化結構，PSGL-I^TILM細胞中具有361個殘基，其中267個殘基為細胞外區(qū)、25個殘基為跨膜區(qū)和69個殘基為細胞內區(qū).PSGL-l在細胞表面上形成二疏鍵結合的同型二聚體或者異二聚體(Afshar-Kharghan等人，Blood97:3306-12(2001)),編碼PSGL-1的序列是單個外顯子，因此可變剪接是不可能的.然而，HL60細胞和大多數(shù)細胞系中的PSGL-1具有存在于細胞外區(qū)的10個殘基共有序列的15個連續(xù)重復序列，盡管在多形核白細胞、單核細胞和幾種其他細胞系(包括大多數(shù)天然白細胞)中存在該序列的14和16個重復.PSGL-1在嗜中性粒細胞中以二聚體表達，具有250kDa和160kDa的表觀分子量，而在HL60上，二聚體形式為約220kDa.當在還原條件下分析時，每個亞基減小一半.分子量的不同可能是由于存在不同數(shù)目的十聚體重復導致的分子多態(tài)性(LeukocyteTypingVI.T.Kishimoto等人編著(1997))PSGL-1還表達于大多數(shù)血液白細胞，如嗜中性粒細胞、單核細胞、白細胞、B細胞亞群和所有T細胞(Kishimoto等人(1997)，前述).PSGL-1介導白細胞在激活的內皮、激活的血小板和其他白細胞和炎性部位上的滾動，并介導嗜中性粒細胞在P-選擇蛋白上的滾動.PSGL-1也可以通過結合L-選擇蛋白介導嗜中性粒細胞-嗜中性粒細胞相互作用，從而介導炎癥(Snapp等人，Blood91(1):lS4-64(1998))。白細胞滾動在炎癥中是重要的，且P-選擇蛋白(由激活的內皮并且在血小板上表達，其可以在損傷部位固定化)和PSGL-1之間的相互作用對于血管壁上白細胞的粘連和滾動是有幫助的(Ramachandran等人，PNAS98(18):10166-71(2001);Afshar-Kharghan等人(2001)，前述).細胞滾動對于轉移也是重要的，且認為內皮細胞上P-和E-選擇蛋白結合轉移細胞，從而促進從血流外滲到周圍組織中.從而，已經(jīng)在所有白細胞嗜中性粒細胞、羊核細胞、淋巴細胞、激活的外周T細胞、粒細胞、嗜酸性粒細胞、血小板和在一些CD3414陽性干細胞和B細胞的某些亞群上發(fā)現(xiàn)了PSGL-1.P-選擇蛋白在激活的血小板和內皮細胞上選擇性表達。P-選擇蛋白和PSGL-1之間的相互作用促進血管壁上白細胞的滾動，且白細胞在血管部位的異常積累導致多種病理炎癥，PSGL-1上個體疏酸酪氨酸的立體特異貫獻對于P-選擇蛋白對PSGL-1的結合是重要的.電荷對于結合也是重要的減少NaCl(從150到50mM)增強了結合Ud約75nM),PSGL-1上的路氨酸疏酸化增強P-選擇蛋白上的PSGL-1粘著，但不是所述粘著最終需要的.PSGL-1路氨酸硪酸化支持在所有剪切率的較慢滾動粘附并且支持在更高剪切率的滾動粘附(Rodgers等人，Biophys.J.81:2001-09(2001)).此外，已經(jīng)提出血小板上PSGL-1表達為白細胞中的1/100-1/25(Frenette等人，J.Exp.Med.191(8):1413-22(2000)).已經(jīng)產生了針對人PSGL-1的通過商業(yè)途徑可獲得的單克隆抗體KPL1，并且顯示其抑制PSGL-1與P-選擇蛋白之間和PSGL-1與L-選擇蛋白之間的相互作用.將KPLl表位作困到PSGL-1的酪氦酸疏酸化區(qū)域(YEYLDYD)(SEQIDNO:1)(Snapp等人，Blood91(1):154-64(1998)),用O-唾液酸糖蛋白酶對腫瘤細胞的預處理也抑制腫瘤細胞-血小板復合體形成，所述預處理除去了唾液酸化、巖藻糖基化的粘蛋白配體.體內實驗表明這些處理的任一種導致單核細胞與循環(huán)的腫瘤細胞的更大的結合，表明減小血小板結合增加了免疫細胞對循環(huán)腫瘤細胞的接近(Varki和Varki，Braz.J.Biol.Res.34(6):711-17(2001))。血纖蛋白原有兩種形式的正常人血纖蛋白原-正常的(Y)和Y，，每一種都在正常個體中發(fā)現(xiàn).正常血纖蛋白原是更豐富的形式(身體中發(fā)現(xiàn)的總血纖蛋白原的約由兩條相同的55kDaP鏈、兩條相同的95kDaP鏈和兩條相同的49.5kDay鏈組成。正常的變體血纖蛋白原是較不豐富的形式(身體中發(fā)現(xiàn)的血纖蛋白原的約10%)，由兩條相同的55kDaP鏈、兩條相同的95kDaP鏈、一條49.5kDay鏈和一條變體50.5kDaY，鏈組成.y和Y，鏈由相同基因編碼，在3'末端15發(fā)生可變剪接.正常的Y鏈由氛基酸1-411組成，且正常的變體Y，鏈由427個氡基酸組成，其中氦基酸1-407與正常Y鏈中的氨基酸相同，而氨基酸408-427為VRPEHPAETEYDSLYPEDDL(SEQIDNO:2),該區(qū)域通常由凝血醉分子占據(jù).在離子化鈣的存在下通過凝血酶的作用將血纖蛋白原轉化成血纖蛋白而產生血液的凝固.血纖蛋白也是血栓和急性炎性滲出物的成分。蛋白質硪酸化蛋白質硫酸化是廣泛的翻譯后修飾，其包括^酸鹽酶促共價附著到糖側鏈或者多肽主鏈.該修飾在高爾基體外側室中發(fā)生.此類蛋白質包括分泌性蛋白質、導向顆粒的蛋白質，和質膜蛋白質的細胞外區(qū)域.輅氨酸是當前已知經(jīng)歷疏酸化的氨基酸殘基.Kehoe等人，Chem.Biol.7:R57-61(2000).其他氨基酸，例如，蘇氨酸，可以也經(jīng)歷疏酸化，尤其在患病細胞中經(jīng)歷疏酸化.關于GPIb，GIPb的帶負電荷N-末端球狀結構域含有已知經(jīng)歷硫酸化的三個酪氨酸殘基.GPIboc(CD42)由血小板和巨核細胞表達并且通過結合vWF介導血小板附著到內皮下膜和在內皮下膜上滾動，其也含有一簇在Asp-269和Asp-287之間的帶負電的氨基酸.認為這種高度酸性和親水環(huán)境是硫酸化的前提條件，因為路氨跣蛋白質磺基轉移酶特異識別并疏酸化與酸性氨基酸殘基相鄰的輅氨酸(Bundgaard等人，J.Biol.Chem.272:21700-05(1997))GPIbcx的酸性區(qū)域的完全硫酸化產生具有顯著負電荷密度的區(qū)域一一在19個氨基酸序列內13個帶負電荷，從而使得該區(qū)域是與其他蛋白質靜電相互作用的候選位點，一些證據(jù)表明在表達GPIb-IX復合體的經(jīng)轉染的CH0細胞和血小板GPIbct中，該結構域含有的三個酪氨酸殘基(Tyr-276、Tyr-278和Tyr-279)經(jīng)歷硫酸化。關于PSGL-1，該蛋白質具有三個潛在的疏酸化位點(分子的N-末端結構域中三個賂氨酸殘基的每一個上)，接著是10一16個十聚體重復序列，它們富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸.已知PSGL-1的疏酸化與P-選擇蛋白的結合有關，且PSGL-1上個體疏酸輅氨酸的立體特異貢獻對于P-選擇蛋白對PSGL-1的結合是重要的，然而，有一些跡象表明僅一個酪氨酸殘基的硫酸化就足夠P-選擇蛋白結合(J.Biol.Chem.，巻273，12,7078-87),PSGL-1的路氨酸硫酸化支持在所有剪切率的較慢滾動粘附并且支持在高得多的^W率的^npPM^頂odgersF人，Biophys.J.81:2001-09(2001)).還認為疏酸化的N-末端酪氡酸影響CC-趨化因子受體如CCR5的作用，所述受體作為人和猿猴免疫缺陷病毒(Hn-l、HIV-2和SIV)進入把細胞的相關的七跨膜片段(7TMS)受體的共同受體.例如，認為疏酸化的N-末端輅氨酸有助于CCR5結合MIP-1ct、MIP-1P和HIV-1gpl20/CD4復合體并且有助于HIV-1進入表達CCR5和CD4的細胞的能力.CXCR4是另一種重要的HIV-1共同受體，其也被硫酸化(Farzan等人，Cell96(5):667-76(1999)).酪氨酸疏酸化在依賴CXCR4的HIV-1進入中的作用沒有依賴CCR5的進入中的作用重要；從而證明了酪氨酸疏酸化在CXC-趨化因子家族中的可能作用并且強調了CCR5和CXCR4的HIV-利用中一般性差別(Farzan等人，J.Biol.Chem.，277(33):29,484-89(2002)),使用噬菌體文庫鑒定了結合PSGL-1和/或GPIb的抗體，并在美國申請?zhí)?0/032,423、10/032,037、10/029,988、10/029,926、09/751,181、10,189,032和60/258,948和國際申請?zhí)朠CT/US01/49，442和PCT/US01/49,440中公開.這些申請中公開的抗體的特定實例包括Y1、Y17和L32抗體.>^種系(DP32)分離了這些抗體并且發(fā)現(xiàn)它們特異結合在造血細胞的蛋白質上發(fā)現(xiàn)的表位，該表位在N-末端酪氨酸經(jīng)疏酸化并且認為其參與細胞遷移，例如，腫瘤轉移，以前鑒定為結合Y1/Y17/L32的疏酸化表位的特征是存在硫酸化部分，如疏酸化酪氨酸殘基或者疏酸化糖或脂類部分，所述部分優(yōu)選在配體和受體中發(fā)現(xiàn)的兩個或更多個酸性氨基酸的簇內，其中所述配體和受體在諸如炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移、粘附、血栓形成和/或再狹窄、細胞滾動和聚集的多種過程中起重要作用，在患病細胞，如T-ALL細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨鏈瘸細胞和轉移細胞上也發(fā)現(xiàn)了此類表位.這些表位是這些過程(以及導向刑)的治療性藥療法和診斷方法的有用靶.目的;^^dT的一個n^!IC^^多肽，所述抗體和多肽結合在諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移和HIV進入的過程中起作用的多種分子上存在的表位。本發(fā)明的另一目的是提供抗體和多肽，所述抗體和多肽結合參與諸如粘附、血栓形成和/或再狹窄和血小板聚集的過程的表位，并且所述抗體和多肽可以用于治療心血管疾病，如心肌梗死和再狹窄和用于治療炎性疾病.本發(fā)明的另一目的是將抗體和多肽用于個體的多種疾病狀態(tài)的診斷、預后或分期的方法中，所述疾病狀態(tài)為例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多發(fā)性骨鈦瘤、轉移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所迷其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用.此外，本發(fā)明的這些抗體可以用作導向劑將治療劑導向特定細胞或者部位.本發(fā)明的另一個目的是提供治療多種疾病狀態(tài)的方法，所述疾病狀態(tài)為例如AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多發(fā)性骨號瘤、轉移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所迷其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用.本發(fā)明的另一目的是提供清除腫瘤細胞的方法。本發(fā)明的另一目的是提供抗體和多肽用于生產治療多種疾病狀態(tài)的藥物，所述疾病狀態(tài)為例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多發(fā)性骨tt瘤、轉移、HIV感染、再灌注損傷和動脈粥樣硬化的心血管疾病，或者其他疾病，在所述其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用.本發(fā)明的一個目的是提供抗體和多肽，所述抗體和多肽刺激T-細胞、NK細胞和/或刺激依賴抗體的細胞毒性和/或細胞凋亡，本發(fā)明的一個目的是提供多肽、表達栽體和重組宿主細胞，其表18達參與諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移、HIV進入、粘附、血栓形成、再狹窄和血小板聚集的過程的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供免疫球蛋白結合結構域，特別是scFv分子的文庫.本文提供了本發(fā)明的這些和其他目的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含共有序列X廣X廣X廣Pro-X廣L(SEQIDNO:3)的抗體和多肽，其中X,和X6為疏水氨基酸，且X2、X3和X5為任意氛基酸，其中L優(yōu)選為堿性氨基酸，且其中共有序列從N-末端到C-末端排列或者從C-末端到N-末端排列。共有序列優(yōu)選在抗體的高變區(qū)內，更優(yōu)選在CDR3區(qū)內.優(yōu)選地，共有序列排除包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的CDR3區(qū)，本發(fā)明還提供了具有SEQIDNO:5或SEQID.N0:6的scFv抗體的結合能力的抗體和多肽.本發(fā)明還提供了產生抗體或多肽的方法，其包括如下步艱提供噬菌體展示文庫，提供SEQIDNO:7的肽，其結合具有SEQIDNO:4的scFv抗體片段的結合能力的抗體或者多肽，對噬菌體展示文庫淘選結合SEQIDNO:7的肽的scFv抗體片段，和產生包含結合SEQIDNO:7的肽的scFv抗體片段的抗體或多肽。本發(fā)明還提供了免疫球蛋白結合結構域，特別是scFv分子的文庫，其包含用于互補結合的多樣的抗原結合結構域，其中所迷文庫僅在重鏈CDR3中具有多樣性。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的抗體和多肽的藥物組合物.這些藥物組合物可以用于治療、診斷、預后或考分期多種狀況，所述狀況涉及或者累及細胞滾動、炎癥、自身免疫病、血小板聚集、再狹窄、HIV感染、轉移、腫瘤細胞的生長和/或復制；和白血病細胞的生長和/或復制.這些藥物組合物可以用于抑制細胞滾動、抑制炎癥、抑制自身免疫病、抑制血小板聚集、抑制再狹窄、抑制HIV感染、抑制轉移、抑制腫瘤細胞的生長和/或復制、增加腫瘤細胞的死亡率、抑制白血病細胞的生長和/或復制、增加白血病細胞的死亡率、改變患病細胞被抗疾病刑損傷的易感性；增加胂瘤細胞對抗癌刑損傷的易感性；增加白血病細胞對抗白血病劑損傷的易感性；抑制肺瘤患者中腫瘤細胞數(shù)的增加；減少癌癥患者中腫瘸細胞數(shù)目；抑制白血病患者中白血病細胞數(shù)的增加；和減少白血病患者中白血病細胞的數(shù)目。本發(fā)明還提供了生產用于治療多種疾病狀態(tài)的藥物的方法，所述疾病狀態(tài)為例如，AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL細胞、前-B-AtL、多發(fā)性骨號瘤、轉移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用.本發(fā)明還提供了診斷、預后或者分期患者中疾病的方法，通過下述步壤實現(xiàn)提供含有來自所述患者的細胞的樣品，并確定本發(fā)明的抗體或者多肽是否結合患者的細胞，從而表明所述患者有危險患有或者已經(jīng)患有所述疾病.本發(fā)明還提供了從患者清除腫瘤細胞的方法，其通過提供含有來自所述患者的細胞的樣品，并將來自所述患者的細胞與本發(fā)明的抗體或者多肽溫育來實現(xiàn)，定義抗體(Abs)或者免疫球蛋白(Igs)是結合抗原的蛋白質分子。天然發(fā)生的抗體的每種功能結合單位由通過二疏鍵連接在一起的四條多肽鏈(2條重鏈和2條輕鏈)的單位組成.每條鏈具有恒定區(qū)和可變區(qū)，可以將天然發(fā)生的抗體基于它們的重鏈成分分成幾類，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE,IgG類包括幾種亞類，包括但不限于，IgG"IgG"IgGs和IgG"B-淋巴細胞在體內產生免疫球蛋白，且每種此類分子識別特定外來抗原決定簇并且促進該抗原的清除?？梢砸远喾N形式(包括抗體復合體)產生和使用抗體。文中所用術語"抗體復合體"或"多種抗體復合體"用于指一個或多個抗體與另一種抗體或者與一個或多個抗體片段的復合體，或者兩個或更多個抗體片段的復合體.抗體片段的實例包括Fv、Fab、F(ab，h、Fc和Fd片段，因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括抗體或者其片段的復合體。如本說明書和權利要求中所用的，將Fv定義為由人抗體的重鏈可變區(qū)和人抗體的輕鏈可變區(qū)組成的分子，其可以相同或不同，并且其中重鏈可變區(qū)連接、連結、融合或者共價附著或者結合輕鏈的可變區(qū).Fv可以是單鏈Fv(scFv)或者二疏鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv).scFv由抗20體的每條重鏈和輕鏈的可變結構域組成，所述可變結構域通過柔性氨基酸多肽間隔臂或者接頭連接.接頭可以是分枝或不分枝的，優(yōu)選地，接頭為0-15個氨基酸殘基，最優(yōu)選接頭為(Gly4Ser)3(SEQIDFv分子自身由第一條鏈和第二條鏈組成，每條鏈具有第一、第二和第三高變區(qū).輕鏈和重鏈的可變結構域內的高變環(huán)稱作互補決定區(qū)(CDR).每條重鏈和輕鏈內有CDR1、CDR2和CDR3.認為這些區(qū)形成抗原結合部位并且可以被特異修飾以產生增強的結合活性.實際上這些區(qū)的最可變的是重鏈的CDR3.將CDR3理解為Ig分子的最暴露的區(qū)域，并且，如本文所示和提供的，是主要負責所觀察到的選擇性和/或特異結合特征的部位，將Fv分子的片段定義為小于最初Fv但是仍然保持最初Fv的選擇性和/或特異結合特征的任一分子，此類片段的實例包括但不限于(l)微型抗體(minibody)，其包含僅Fv的重鏈的片段，(2)微體，其包含抗體重鏈可變區(qū)的小部分單位(國際申請?zhí)朠CT/IL99/00581),(3)具有輕鏈的片段的類似體，和(4)具有輕鏈可變區(qū)的功能單位的類似體.文中所用術語"Fab片段"是免疫球蛋白的單價抗原結合片段.Fab片段由輕鏈和部分重鏈組成.F(ab，)2片段是通過胃蛋白酶消化得到的免疫球蛋白的二價抗原結合片段.它舍有兩條輕鏈和兩條重鏈的部分.Fc片段是免疫球蛋白的非抗原結合部分。它含有重鏈的羧基末端部分和Fc受體的結合部位.Fd片段是免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)和第一個恒定區(qū).多克隆抗體是免疫應答的產物并且由許多不同的B-淋巴細胞形成.單克隆抗體來自一個克隆B細胞.疏水氨基酸通常為緗氨酸(V)、異亮氨酸U)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)和甘氨酸(G)。堿性氨基酸通常為精氨酸、組氨酸和賴氨酸-應用于多肽的并且如本發(fā)明定義的，盒指連續(xù)氨基酸的給定序列，其作為構架并且被認為是一個單位并且被同樣地進行操作.可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸。同樣，可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸序列.文中所用的術語"表位"指抗原決定簇或識別位點或者抗原位點，其與抗體、抗體片段、抗體復合體或者具有其結合片段的復合體或者T細胞受體相互作用。術語表位在本文與術語配體、結構域和結合區(qū)可以互換使用.選擇性在文中定義為導向分子選擇并結合實體或者實體狀態(tài)混合物中的一個實體或者細胞狀態(tài)的能力，所有實體或者實體狀態(tài)可以都對導向分子特異.文中所用術語"親和力"是結合分子(例如，抗體上的一個結合部位)和配體(例如，抗原決定簇)之間的結合強度(結合常數(shù))的量度。抗體上單個抗原結合部位和單個表位之間非共價相互作用總和的強度是該抗體對所述表位的親和力.低親和力抗體結合抗原弱并且傾向于容易地解離，而高親和力抗體更緊密結合抗原并且更長時間保持結合。術語"親合力"與親和力不同，因為親合力反映了抗原-抗體相互作用的效價.抗體-抗原相互作用的特異性盡管抗原-抗體反應是特異的，但是在一些情況中，一種抗原引起的抗體可以與另一種不相關抗原交叉反應.如果兩種不同的抗原共有同源或者類似的結構、表位或者其锘定區(qū)，或者如果對一個表位特異的抗體結合具有相似的結構構象或者化學性質的不相關表位，那么發(fā)生此類交叉反應.血小板是巨核細胞的盤狀胞質片段，其在骨拔竇中流出并隨后在外周血流中循環(huán)，血小板具有幾種生理功能，包括凝血中的主要作用。血小板含有位于中心的顆粒和外周透明原生質，但是沒有確定的核。文中所用凝集指導致懸浮的細菌、細胞、盤、或者具有類似大小的其他顆?？梢哉掣交蛘咝纬蓤F的過程。該過程類似于沉淀但是顆粒更大并且處于懸浮液而不是在溶液中。術語聚集指體外誘導的血小板聚集，以及作為順序機制的一部分的凝血酶和膠原的聚集，導致形成血栓或者止血栓子。將保守氨基酸替代定義為通過改變肽、多肽或者蛋白質或者其片段的一個或兩個氨基酸改變氨基酸組成.替代是被通常相似性質的氨22基酸(例如，酸性、堿性、芳族、大小、帶正電荷或負電荷、極性、非極性)所替代的，從而該替代不相當大地改變肽、多肽或者蛋白質特征(例如，電荷、等電點、親和力、親合力、構象、溶解性)或活性.可以^^pr^yre^，杼的一般替代可以在如下氨基酸組中甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)和異亮氛酸(I)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)組氨酸(H)、賴泉酸(K)和精氨酸(R)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)可以在例如，主要負責分子的選擇性和/或特異結合特征的高變區(qū)側翼區(qū)域，以及分子的其他部分，例如，可變重鏈盒中進行保守氨基酸替代.額外或備選地，可以通過重建分子形成完全大小的抗體、雙鏈抗體(diabody)(二聚體)、三鏈抗體(triabody)(三聚體)和/或四鏈抗體(tetrabody)(四聚體)或者形成微型抗體或者微體來實現(xiàn)修飾。啟動子是DNA上的一個區(qū)域，RNA聚合蘇在該區(qū)域結合并啟動轉錄.噬菌體展示文庫(也稱作噬菌體肽/抗體文庫、噬菌體文庫或者肽/抗體文庫)包含噬菌體的大群體(108或更大)，每個噬菌體顆粒展示一個肽序列.藥物組合物指制劑，其包含本發(fā)明的肽或多肽和其藥學上可接受的栽體、賦形劑或者稀釋劑，或者抗體-藥物試劑(抗體-試劑)復合體和其藥學上可接受的栽體、賦形劑或者稀釋劑.試劑指可用于哺乳動物的活動性疾病治療、預防性治療或者診斷的試劑，所述哺乳動物包括但不限于，人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或者任意其他溫血動物.試劑選自放射性同位素、毒素、寡核苷酸、重組蛋白質、抗體片段、藥物試劑、抗癌劑、抗白血病刑、抗轉移劑、抗腫瘤劑、抗疾病劑、抗粘附刑、抗血栓形成劑、抗再狹窄劑、抗自身免疫劑、抗聚集劑、抗細菌劑、抗病毒劑和消炎藥，此類試劑的其他實例包括，但不限于抗病毒刑，包括無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成/再狹窄刑，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞維肝素鈉和阿司匹林；消炎藥包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙酜基水楊酸17、iBNM^鈉、#芬、^^芬、#*^t、萘普生、氨托美丁、塞來昔布、吲哚美辛、羅非克西和尼美舒利；抗自身免疫刑包括來象洛米、昂他克(denileukindiftifox)、subreum、WinRhoSDF、去纖苷和環(huán)轔酰胺；抗粘附/抗聚集劑包括利馬羅斯特、clorcromene和透明質酸，和它們的衍生物、組合和修飾.抗白血病刑是具有抗白血病活性的試劑。例如，抗白血病刑包括抑制或者終止白血病或者未成熟的前白血病細胞生長的試刑、殺死白血病或者前白血病細胞的試劑、增加白血病或前白血病細胞對其他抗白血病劑的易感性的試劑，和抑制白血病細胞轉移的試劑，在本發(fā)明中，抗白血病劑還可以是具有防止、抑制、延遲或者終止腫瘤血管化的抗血管生成活性的試劑.抗癌劑是具有抗癌活性的試刑，例如，抗癌刑包括抑制或者終止癌性或者未成熟前癌細胞生長的試劑、殺死癌性或者前癌細胞的試劑、增加癌性或前癌細胞對其他抗癌劑易感性的試劑，和抑制癌細胞轉移的試刑.在本發(fā)明中，抗癌劑還可以是具有防止、抑制、延遲或者終止肺瘤血管化的抗血管生成活性的試劑。通過分析在多種條件、特定時間、多種組織等中產生的基因產物的量可研究基因的表達模式.當基因產物的量高于在正常對照，例如未患病對照中發(fā)現(xiàn)的量時，認為基因"超表達".給定細胞可以在其表面表達具有給定抗體的結合部位(或者表位)的蛋白質，但是該結合部位可以以隱藏形式(例如，空間位阻的或者封閉的，或者缺少抗體結合所需的特征)在細胞中以一種狀態(tài)存在，所述狀態(tài)可以稱作笫一階段(階段I).階段I可以是例如，正常、健康的未患病狀態(tài).當表位以隱藏形式存在時，它不被給定抗體識別，即，不存在抗體對該表位或者對階段I的給定細胞的結合，然而，表位可以通過例如經(jīng)歷自身修飾得以暴露，或者因為附近或者結合的分子受到修飾或者因為一個區(qū)域經(jīng)歷構象改變而被去封閉從而得以暴露.修飾的實例包括折疊的改變、翻譯后修飾的改變、磷脂化改變、疏酸化改變、糖基化改變等等.當細胞進入不同狀態(tài)時可以發(fā)生此類修飾，所迷狀態(tài)可以稱作第二階段(階段n),笫二狀態(tài)或者階段的實例包括激活、增殖、轉化，或者處于惡性狀態(tài).在被修飾后，表位可以暴露，從而抗體可以結合該表位，肽模擬物(peptido-mimetics)(肽模擬物)是氨基酸之間不再含有任何肽鍵，即酰胺鍵的分子；然而，在本發(fā)明上下文中，術語肽模擬物意在包括本質上不再完全是肽的分子，如假肽、半肽和類肽。不管是完全還是部分非肽，根據(jù)本發(fā)明的肽模擬物提供了反應性化學部分的空間排列，其與肽模擬物所基于的肽中活性基團的三維排列非常類似。這些分子包括小分子、脂類、多糖或者其綴合物。附圖簡述圖1描繪用于分析與PSGL-1的結合的根據(jù)本發(fā)明的所選克隆的噬菌體ELISA的數(shù)字數(shù)據(jù).圖2描繪了用于分析與PSGL-1的結合的根據(jù)本發(fā)明的所選克隆的scFvELISA的數(shù)字數(shù)據(jù)。圖3描繪用于分析與表達PSGL-1的ML-2細胞的結合的來自根據(jù)本發(fā)明的所選克隆和L32的scFv的FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù).困4描繪了用于分析與glycocalicin的結合的來自根據(jù)本發(fā)明的所選克隆和L32的scFv的ELISA的數(shù)字數(shù)據(jù).圖5描繪了用于分析與血小板和粒細胞結合的來自根據(jù)本發(fā)明的所選克隆的scFv的FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù).圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的所選克隆和L32的粒細胞/血小板結合比的比較，圖7描繪了在KPL-1存在和不存在下S15與ML-2細胞的結合的分析結果。圖8描繪了來自FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù)，提供了PBS中純化的scFv與ML-2細胞的結合的比較。困9描繪了來自FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù)，提供了PBS中純化的scFv與ML-2細胞的結合的比較.圖IO描繪了來自FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù)，提供了50%血漿中純化的scFv與ML-2細胞的結合的比較.圖ll描繪了來自FACS分析的數(shù)字數(shù)據(jù)，提供了50%血漿中純25化的scFv與ML-2細胞的結合的比較.困12描繪了純化的scFv對ML-2細胞的刑量反應的FACS分析.圖13描繪了所選噬菌體克隆與GPlb和PSGL-1疏酸化肽的結合。困14顯示了scFv與glycocalicin的結合*圖15是使用流式細胞術確定的不斷增加濃度的多種scFv與洗滌的血小板結合的困.圖16描繪了通過ELISA測定法確定的多種scFv與glycocalicin的結合.圖17描繪了A3RscFv對利托菌素誘導的血小板聚集的影響，困18描繪了使用CPA測定法確定的YlscFv、A3RscFv和對照PBS對血小板對聚苯乙蜂的粘附的影響.圖19描繪了快速濃注后A3RscFv與豚鼠血小板結合的水平，困20描繪了快速濃注后豚鼠中A3RscFv的血漿濃度。困21描繪了scFv與基于PSGL-1、GPIb和CCR5的疏酸化區(qū)的肽的直接結合的數(shù)字數(shù)據(jù)。困22描繪了在B-CLL患者樣品中S15IgG謙導的ADCC.困23描繪了不同的效應細胞群體參與B-CLL患者樣品中S15IgG謙導的ADCC,困24描繪了S15IgG和利妥?，斦T導B-CLL患者樣品中細胞凋亡的能力，發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含共有序列X!-X廣X3-Pro-X廣X6(SEQIDNO:3)的抗體或者其片段，其中L和L是疏水氨基酸，X"X3和X5是任意氨基酸，其中L優(yōu)選為堿性氨基酸，且其中共有序列從N-末端到C-末端排列或者從C-末端到N-末端排列(這種抗體通常在本文稱作共有抗體).在本發(fā)明的共有抗體的一個實施方案中，L選自精氨酸和賴氨酸，Xt和L選自亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和異亮氛酸，優(yōu)選地，該實施方案的共有抗體包含選自SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的共有序列.更優(yōu)選地，在該實施方案中，共有抗體26包含SEQIDNO:5(CDR3序列是SEQIDNO:9)并且此類共有抗體在本文命名為并稱作S15.備選地，該實施方案中共有抗體更優(yōu)選為SEQIDNO:6(CDR3序列為SEQIDNO:10)并且此類共有抗體在本文命名為并稱作A3R.在本發(fā)明的共有抗體的另一實施方案中，L和X3為精氛酸和疏水氨基酸，X6優(yōu)選為異亮氨酸.優(yōu)選地，該另一實施方案的共有抗體包含選自SEQIDN0:9和SBQIDN0:10的共有序列，更優(yōu)選地，該另一實施方案的共有抗體為A3R和/或S15,在本發(fā)明的共有抗體的另一實施方案中，L選自亮氨酸和甲疏氨酸，L和X3為精氡酸，Xs選自絲氨酸和幾氨酸，且X6為異亮氛酸.優(yōu)選地，該另一實施方案的共有抗體包含選自SEQIDNO:9和SEQIDNO:IO的共有序列.在本發(fā)明的共有抗體的另一實施方案中，X!為亮氨酸、L選自堿性氛基酸，且X6選自疏水氨基酸。該實施方案的優(yōu)選的共有抗體包含SBQIDNO:11到SEQIDNO:16的D系列抗體.更優(yōu)選地，該實施方案的共有抗體為Dl(CDR3區(qū)為SEQIDNO:14并且完整scFv為SEQIDN0:55)或者D3(CDR3區(qū)為SEQIDNO:13并且完整scFv為SEQIDNO:56)。本發(fā)明的共有抗體優(yōu)選相對于笫二表位優(yōu)先結合第一表位，其中第一和笫二表位的至少一個被疏酸化.第一和笫二表位的實例包括PSGL-1表位和GPIb表位。更優(yōu)選地，共有抗體結合PSGL-1和GPIb的表位，并且優(yōu)選顯示出以對PSGL-1表位比對GPIb表位更強的親和力結合或者以對GPIb表位比對PSGL-1表位更強的親和力結合.備選地，共有抗體以相似的親和力結合笫一和笫二表位(例如，PSGL-1和GPIb),以相似親和力結合PSGL-1和GPIb的適宜的抗體的實例包括D1和D3，其為完整scFv或者CDR3區(qū)。在其中共有抗體為A3R的實施方案中，優(yōu)選地，共有抗體結合疏酸化GPIb的表位比它對疏酸化PSGL-1表位的結合具有更強的親和力。特別地，關于相似濃度的S15和A3R的結合性質的比較，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A3R比S15以更強親和力結合健康GPIb血小板.還發(fā)現(xiàn)在相似濃度下，S15比A3R以更強親和力結合健康的全血細胞(含有粒細胞、淋巴細胞和表達PSGL-1的單核細胞)。27從而，本發(fā)明提供了抗體，其以與S15的親和力基本相似的親和力特異結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb，并且優(yōu)選對PSGL-1的結合親和力大于對GPIb的結合親和力，更優(yōu)選地，所述抗體結合在51征笫三個P末i^氨酸殘基硫酸化的硫酸化PSGL-1表位。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體特異結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb,其結合親和力與A3R的基本上相似，并且本發(fā)明抗體結合GPIb的親和力優(yōu)選強于結合PSGL-1的親和力.更優(yōu)選地，該實施方案的抗體結合在46位笫一個N-末端酪氛酸殘基疏酸化的疏酸化GPIb表位。備選地，本發(fā)明提供了特異結合硫酸化PSGL-1(優(yōu)選在Tyr-51的第三個N-末端酪氨酸殘基疏酸化)和疏酸化GPIb(優(yōu)選在Tyr-276的第一個N-末端酪氨酸殘基疏酸化)的抗體，其中結合的親和力基本上類似于Dl和/或D3的結合親和力。由于本發(fā)明的多種抗體(例如，S15和A3R)對疏酸化PSGL-1和GPIb的親和力差異，且因為這兩種抗體在共有序列的X!和Xs位上不同，所以本發(fā)明的共有抗體的共有序列的Xi和Xs有助于共有抗體與酪氨酸硫酸化位點的結合，因此，取決于導向結合的具體硫酸化表位，可以具體選擇共有序列的X!和Xs位的氨基酸.換句話說，可以改變X!和Xs位以使得抗體適合特異結合特定疏酸化表位。此外，因為S15優(yōu)選結合包含在笫三個N-末端酪氨酸的硫酸化修飾的PSGL-1表位，并且A3R優(yōu)選結合在第一個N-末端路氨酸具有疏酸化修飾的GPIb表位(而Dl和D3相等地結合PSGL-1和A3R兩者)，所以共有序列的L和Xs可能與S15和A3R分別與PSGL-1和GPIb的笫三個和笫一個硫酸化酪氨酸的結合相關。使用噬菌體文庫鑒定了結合PSGL-1和/或GPIb的抗體，并且所述抗體公開在美國申請?zhí)?0/032,423、10/032,037、10/029,988、10/029,926、09/751,181、10，189，032和60/258，948和國際申請?zhí)朠CT/US01/49,442和PCT/US01/49,440中.這些申請中公開的抗體的特定實例包括Y1、Y17和L32抗體.這些抗體分離自種系(DP32)，并且發(fā)現(xiàn)它們特異結合在造血細胞的蛋白質上發(fā)現(xiàn)的表位，所迷表位在N-末端酪氨酸疏酸化并且認為該表位參與細胞遷移，例如，腫瘤轉移.以前鑒定為結合Y1/Y17/L32的硫酸化表位的特征是存在疏酸化部分，如硫酸化酪氨酸殘基或者硫酸化糖或者脂類部分，其優(yōu)選在兩個或更多個酸性氦基酸簇內，其發(fā)現(xiàn)于在多種過程中起重要作用的配體和受體上，所述多種過程例如炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、、轱拊、it^X^/或再狹窄、細胞滾動和聚集。在患病細胞，如T-ALL細胞、B-CLL細胞、AML細胞、多發(fā)性骨髄瘤細胞和轉移細胞中也發(fā)現(xiàn)了此類表位，從DP32家族分離的本發(fā)明的共有抗體結合具有硫酸化酪氨酸位點的蛋白質，此類蛋白質包括但不限于，PSGL-1、GPIb、cx-2-抗纖溶酶；氨肽酶B;CC趨化因子受體，如CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b;七跨膜片段(7TMS)受體；凝血因子，如因子V、VIII和IX;血纖蛋白原y鏈；肝素輔因子II;分泌粒蛋白，如分泌粒蛋白I和II;玻連蛋白、淀粉狀蛋白前體、ot-2-抗纖溶酶；縮膽嚢素；ct-絨毛膜促性腺激素；補體C4;疏酸皮膚素蛋白聚糖；纖連蛋白；和castrin。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的共有抗體結合硫酸化CC趨化因子受體，如CCR5、CXCR4和CCR2b。疏酸化酪氨酸可以有助于CCR5與MIP-1a、MIPP和HIV-1gpl20/CD4的結合和有助于HIV-1進入表達CCR5和CD4的細胞的能力，此外，本發(fā)明抗體的結合取決于細胞的發(fā)育階段(基于法國-美國-英國系統(tǒng)對AML亞型分類，其中使用在常規(guī)處理和細胞化學染色下觀察到的形態(tài)學).抗體可以結合M3或者以上亞型的AML細胞，但是不結合M0或Ml亞型細胞。此外，所述抗體可以結合或不結合M2亞型細胞，因此，本發(fā)明的抗體顯示出對正常的健康骨號(例如，0034+細胞)的低結合.認為此類差異是基于PSGL-1表達和/或硫酸化的改變，以及暴露稍微不同的表位的PSGL-1的可能的構象改變的.因此，共有抗體不結合骨髄中未分化的細胞，如Mn、M"M2和M3細胞.認為共有抗體結合的PSGL-1在這些未分化細胞上不以顯著水平表達或者不碗酸化。本發(fā)明的共有抗體還可以不結合健康骨號細胞(如CD34+細胞)，在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的共有抗體結合硫酸化PSGL-1。具體地，S15抗體顯示出對疏酸化PSGL-1的增強的選擇性。參與炎癥的白細胞，如單核細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞主要由疾病(如動脈粥樣硬化)炎癥過程中的四種粘著分子PSGL-1、P-選擇蛋白、29VLA-4和VCAM-1募集(Huo和Ley,ActaPhysiol.Scand,,173:35-43(2001);Libby，Sci.Am.May:48-55(2002);Wang等人，J.Am.Coll.Cardiol.38:577-582(2001)),共有抗體，尤其S15對這些中心分子任"^W^PW^^體在^除^r^中的潛在作用。特別地，P-選擇蛋白控制細胞附著和滾動.此外，P-選擇蛋白-PSGL-1相互作用激活細胞上的許多其他分子，它們整體與腫瘤發(fā)生(當涉及惡性細胞時)和炎癥反應(當涉及白細胞時)相關(Shebuski和Kilgore，J.Pharmacol.Bxp.Ther.300:729-735(2002))a基于對P-選擇蛋白調節(jié)細胞過程的能力的理解，顯然，共有抗體和S15對硫酸化PSGL-1的增強的scFv選擇性使得它們成為治療多種惡性和炎性疾病的極好的分子，此外，惡性疾病的模型已經(jīng)表明P-選擇蛋白與惡性細胞的結合需要PSGL-1的碗酸化(Ma和Geng，J.Immunol.168:1690-1696(2002)),該需要類似于共有抗體的結合，尤其S15結合的要求.從而，人們可以預期共有抗體，且尤其S15可以消除P-選擇蛋白對進行性惡性疾病的促進.本發(fā)明的共有抗體，尤其在其中L和X3為精氡酸，且X6為異亮氨酸且優(yōu)選A3R的實施方案中，也顯示出對硫酸化GPIb的增強的選擇性.GPIb參與血小板聚集，其涉及動脈狹窄區(qū)的高剪切和低濃度凝血酶誘導的血小板激活?；趯PIb的該理解，顯然，共有抗體和A3R對疏酸化GPIb的增強的scFv選擇性使得它是治療多種心血管和炎性疾病的極好的分子.優(yōu)選地，本發(fā)明的共有抗體結合參與炎癥或者腫瘤發(fā)生的至少一種細胞類型上存在的表位，所述細胞類型包括T-ALL細胞、AML細胞、前-B-ALL細胞、B-白血病細胞、B-CLL細胞、多發(fā)性骨敗瘤細胞和轉移細胞.此外，優(yōu)選地，本發(fā)明的共有抗體可以結合脂類、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位.此類表位優(yōu)選具有至少一個硫酸化部分。備選地，但也是優(yōu)選地，本發(fā)明的共有抗體與兩個或更多個表位交叉反應，每個表位都具有一個或多個硫酸化路氨酸殘基，和至少一簇兩個或更多個酸性氛基酸，它的一個實例是PSGL-1。本發(fā)明的這些抗體或者其片段可以例如，在結合PSGL-1后內化到AML細胞.此類內化可以通過胞吞和主動過程發(fā)生，所述主動30過程是依賴于過程、時間和溫度的。根據(jù)本發(fā)明的共有抗體和以與S15、A3R、Sl、Sll、D1和D3基本上相同的親和力結合的抗體的高變區(qū)參與形成抗原結合部位?？乖Y合部位與抗體結合的表位的結構互補，1W，^T結合部位稱作立補決定區(qū)(CDRs).在抗體的每條輕鏈和重鏈上有三個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)，每個CDR都位于連接Vn和Vt結構域的&鏈的環(huán)上。這些區(qū)中最可變的是重鏈的CDR3區(qū)，將該CDR3區(qū)被理解為Ig分子的最暴露的區(qū)并且，如本文提供的，在決定所觀察到的選擇性和/或特異結合特征中具有中心作用.DP32是存在于噬菌體展示文庫中的49種種系之一，是噬菌體文庫的特異種系，從該種系分離本發(fā)明的共有抗體。因此，DP32提供了本發(fā)明的抗體，其具有至少重鏈和輕鏈構架可變區(qū)、輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，和/或重鏈CDR1和CDR2.DP32也提供了高變區(qū)適應的三維結構.公知抗體的特異性由其三維構象決定.從而，DP32強加的限制性在決定本發(fā)明抗體的特異性中具有重要作用。此外，DP32具有多種帶電的氨基酸，它們在抗體的抗原識別中具有結構作用。根據(jù)本發(fā)明，還可以將CDR插入到盒中以產生抗體。應用于多肽并且如本發(fā)明中定義的盒指連續(xù)氨基酸的給定序列，其作為構架并且被認為是一個單位并且同樣地進行搮作.可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸，同樣，可以替代、插入、除去或者在一端或兩端附著氨基酸序列.盒的氨基酸序列可以在表面上看是固定的，而替代、插入或者附著的序列可以高度變化.所述盒可以由幾個結構域組成，每一個都包括對最終構建體關鍵的功能.本發(fā)明的特定實施方案的盒包含(從N端起)構架區(qū)1(FR1)、CDR1、構架區(qū)2(FR2)、CDR2、構架區(qū)3(FR3)和構架區(qū)4(FR4),在本發(fā)明的一個實施方案中，可能替代盒內的不同區(qū)。例如，通過非保守，或優(yōu)選保守氨基酸替代來替代或者修飾盒的CDR2和CDR1高變區(qū)。在本發(fā)明中，共有抗體和以與A3R和S15基本相同的親和力結合的抗體具有重鏈和輕鏈，且每條鏈具有第一、第二和第三高變區(qū)，它31們分別是CDR3、CDR2和CDR1區(qū).結合選擇性和特異性具體通過鏈的CDR3區(qū)，可能通過輕鏈的CDR3區(qū)，且優(yōu)選通過重鏈的CDR3區(qū)，并且其次通過輕鏈，且優(yōu)選重鏈的CDR2和CDR1區(qū)決定。結合選擇性和特異性還可以其次受到第一、第二和/或第三高變區(qū)側翼的上游或下游區(qū)的影響.優(yōu)選地，共有抗體的共有序列在共有抗體的高變區(qū)內的。具體地，共有序列可以在共有抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.所有或者僅一部分共有序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。例如，共有序列可以重疊兩個高變區(qū)或者可以部分位于一個或多個高變區(qū)內并且部分位于共有抗體的可變區(qū)的另一部分內.優(yōu)選地，共有序列在CDR3區(qū)內，還優(yōu)選地，共有序列排除包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的CDR3區(qū).具體地，在一個實施方案中，共有抗體優(yōu)選包括SEQIDNO:9、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列。在備選實施方案中，共有序列優(yōu)選包括SEQIDNO:IO、SBQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列。氨基酸序列優(yōu)選在共有抗體的高變區(qū)內.具體地，氛基酸序列可以在共有抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.所有或者僅一部分氣基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDRl區(qū)內.優(yōu)選地，SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的氨基酸序列可以在共有抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDNO:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內.本發(fā)明還提供了以與S15、A3R、Sl、Sll、D1和/或D3基本上相同的親和力結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb的抗體.在一個實施方案中，抗體以與S15基本上相同的親和力結合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在該實施方案中，抗體優(yōu)選包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列。優(yōu)選地，這些氛基酸序列在抗體的高變區(qū)內.具體地，所述氛基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.所有或者僅一部分氨基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。優(yōu)選地，SEQIDNO:9的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDNO:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內，在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體以與A3R基本上相同的親和力32結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb，并且在該實施方案中，該抗體優(yōu)選包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列.優(yōu)選地，這些氨基酸序列在抗體的高變區(qū)內.具體地，所述氨基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。所有或者僅一部分氨基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。優(yōu)選地，SEQIDNO:10的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDN0:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內,在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體以與SI基本上相同的親和力結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb，并且在該實施方案中，該抗體優(yōu)選包含SEQIDNO:28、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列。優(yōu)選地，這些氨基酸序列在抗體的高變區(qū)內。具體地，所述氨基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。所有或者僅一部分氨基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.優(yōu)選地，SEQIDNO:28的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDNO:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體以與Sll基本上相同的親和力結合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在該實施方案中，該抗體優(yōu)選包含SBQIDNO:31、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列。優(yōu)選地，這些氨基酸序列在抗體的高變區(qū)內.具體地，所述氨基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。所有或者僅一部分氨基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.優(yōu)選地，SEQIDNO:31的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDNO:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內,在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體以與Dl基本上相同的親和力結合硫酸化PSGL-1和/或硫酸化GPIb，并且在該實施方案中，該抗體優(yōu)選包含SEQIDNO:14、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氨基酸序列.優(yōu)選地，這些氨基酸序列在抗體的高變區(qū)內。具體地，所述氨基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.所有或者僅一部分氨基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)33內.優(yōu)選地，SEQIDN0:14的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDN0:17的氨基酸序列在CDR2區(qū)內，且SBQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內.在另一^^jt申，本^^^以與D3基本上相同的親和力結合疏酸化PSGL-1和/或疏酸化GPIb，并且在該實施方案中，該抗體優(yōu)選包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的一個或多個氦基酸序列.優(yōu)選地，這些氨基酸序列在抗體的高變區(qū)內，具體地，所述氛基酸序列可以在抗體的CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內.所有或者僅一部分氛基酸序列可以在CDR3區(qū)、CDR2區(qū)或者CDR1區(qū)內。優(yōu)選地，SEQIDNO:13的氨基酸序列在抗體的CDR3區(qū)內，SEQIDN0:17的氦基酸序列在CDR2區(qū)內，且SEQIDNO:18的氨基酸序列在CDR1區(qū)內.對于本文描述和詳述的<25個氨基酸殘基的所有氨基酸序列(例如，CDR、CDR側翼區(qū))，將下述情形理解并考慮為本發(fā)明的另一實施方案這些氨基酸序列在它們的范圍內包括一個或兩個氛基酸替代，并且優(yōu)選地，所述替代是保守氨基酸替代.對于本文描述和詳述的>25個氨基酸殘基的所有氨基酸序列，將下述情形理解并考慮為本發(fā)明的一個實施方案這些氛基酸序列在它們的范圍內包括與原始序列具有290%序列相似性的氨基酸序列(AUschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-402(1997)).類似或者同源氨基酸定義為不相同的氨基酸，其顯示出相似的性質，即酸性、械性、芳香性、大小、帶正電或負電、極性、非極性.通過比較兩種不同肽或多肽的氨基酸序列確定氨基酸相似性或者同源性或者序列相似性的百分數(shù).通過DNA測序測定抗體序列.比對兩條序列，通常使用為該目的而設計的多種計算機程序之一，并比較每個位置上的氨基酸殘基，然后確定氨基酸同一性或者同源性.然后應用算法以確定氨基酸相似性的百分數(shù).通常優(yōu)選比較氨基酸序列，這是因為檢測肽、多肽或者蛋白質分子之間精細關系的靈敏性極大地增加.蛋白質比較可以考慮保守氨基酸替代的存在，從而如果不相同的氨基酸具有相似的物理和/或化學性質，那么錯配可以產生正得分(Altschul等人(1997)，如前)。在本發(fā)明的一個實施方案中，每條輕鏈和重鏈的三個高變區(qū)可以34在兩條鏈之間和在鏈內和/或鏈間的三個高變部位間互換，根據(jù)本發(fā)明，共有抗體和以與S15、A3R和/或Dl/D3基本上相同的親和力結合的抗體包括IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗體.IgG類包括一些亞類，包括Igd、IgG!、Igd3和Ig&,可以以多種形式，如片段、復合體和多聚體形式提供抗體。根據(jù)本發(fā)明，抗體片段包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab!和Fd分子。較小的抗體片段，如Fv的片段和Fab的片段也包括在術語"片段"中，只要它們保持原始抗體或者較大片段的結合特征即可.此類片段的實例將為(l)微型抗體，其包含僅Fv的重鏈的片段，(2)微體，其包含抗體重鏈可變區(qū)的小部分單位(國際申請?zhí)朠CT/IL99/00581)，(3)具有輕鏈的片段的類似體，和(4)具有輕鏈可變區(qū)的功能單位的類似體。構建體包括，例如，多聚體，如雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體.除非特別指出或基于上下文和/或本領域知識指出，術語"抗體"意在包括所有這些分子，以及它們的衍生物、組合、修飾、同系物、模擬物和變體，已經(jīng)確定scFv穿透組織并且比完全大小的抗體更快地從血中清除，因為它們尺寸更小(Adams等人，Br.J.Cancer77:1405-12(1988);Hudson,Curr.Opin.Immunol.11(5):548一557(1999);Wu等人，TumorTargeting4:47(1999)),從而，scFv通常用于涉及放射性標記的診斷、預后或者分期，如腫瘤顯像，以允許放射性標記從身體更快地清除。最近許多癌導向scFv多聚體已經(jīng)經(jīng)歷體內穩(wěn)定性和功效的臨床前評估(Adams等人(1988),如前；Wu(1999)，如前)，通常，設計scFv單體，其中Va結構域的C-末端被多肽接頭粘連在Vl的N-末端殘基。任選地，使用相反取向VL結構域的C-末端通過多肽接頭粘連在Vh的N-末端殘基(Power等人，J.Immun.Meth.242:193-204(2000))。多肽接頭通常長為約15個氨基酸，當接頭減小到約3到7個氨基酸時，scFv不能折疊成功能Fv結構域而是與第二個scFv結合形成雙鏈抗體。此外，將接頭的長度減小到小于3個氨基酸迫使scFv結合成三聚體或四聚體，這取決于接頭長度、組成和Fv結構域取向(Powers(2000),如前)，最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多價抗體片段如scFv二聚體、三聚體和四聚體通常提供了比親代抗體與靶結合更高的親和力.該更高的親和力提供了潛在優(yōu)點，包括對腫瘤導向應用的改善的藥物代謝動力學.此外，在研究P-選擇蛋白及其配體PSGL-1(它們參與白細胞的粘連和滾動)中，科學家已經(jīng)推斷表達psgl-i的二聚體形式的知胞西^m^高的結合親和力而建立更穗定的滾動粘附.這些粘附更具剪切抗性并且在滾動速度中顯示出較小波動(Ramachandran等人，PNAS，98(18):10166-71(2001)).這些多價形式的更大的結合親和力在診斷和治療方案中是有益的。例如，scFv可以用作結合靶受體的阻斷劑并從而阻斷"天然"配體的結合。在此類實例中，希望scFv和受體間具有更高親和力的結合以減小解離的機會，這可能使得天然配體和靶具有不希望的結合。此外，當靶受體參與粘附和滾動或者當細胞上靶受體存在于高剪切流的區(qū)域，如血小板中時，該更高的親和力是有用的.一旦已經(jīng)選擇和/或開發(fā)了具有所希望的結合能力的抗體，本領域技術人員就能夠使用本文提供的指導產生保持最初抗體的特征的構建體和片段.例如，可以產生保持最初所選或開發(fā)的抗體的所希望的特征的完整抗體分子、Fv片段、Fab片段、Fab2片段、二聚體、三聚體和其他構建體。如果希望替代氨基酸，但是仍然保持抗體的特征，本領域技術人員則可以進行保守氨基酸替代，也可以對抗體進行諸如綴合多種試刑的修飾而不改變它們的結合特征.也可以對抗體或片段進行其他修飾，如產生更穩(wěn)定的修飾而不改變它們的特異性.例如，可以進行類肽修飾、半類肽修飾、環(huán)肽修飾、N-末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾、主鏈修飾和殘基修飾.本領域技術人員能夠按照本說明書的教導測試經(jīng)修飾的抗體或者片段以評估它們的結合特征是否已經(jīng)受到改變。同樣，本領域技術人員能夠使用本文提供的教導改變抗體的結合特征，以得到具有更希望的特征的分子。例如，一旦鑒定了具有所希望性質的抗體，就可以用隨機或者定向誘變產生抗體的變體，并且可以對那些變體篩選所希望的特征。使用本領域已知的常規(guī)方法，技術人員將能夠確定具有共有抗體的結合能力和/或特異結合碟酸化PSGL-1或疏酸化GPIb并且以與36S15和A3R基本上相似的親和力的額外抗體。例如，使用本文描述的生物淘選(biopanning)方法可以分離諸如Dl和D3的額外抗體，其中共有抗體結合的分子或細胞用于篩選特定的噬菌體展示文庫，尤其從白血病、淋巴瘤和骨號瘤患者制備的丈庫.根據(jù)本發(fā)明的抗體還可以具有標記，其可以插入或者附著到該抗體以幫助制備和筌定所述抗體，和用于診斷中.可以以后從所述分子除去所述標記，有用的標記的實例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S-TAG、T7、V5和VSV-G(Jarvik和Telmer，Aim.Rev.Gen.,32，601-18(1998))。標記可以優(yōu)選為c-myc或者KAK.本發(fā)明提供了scFv抗體。文中所用的scFv定義為由人抗體的重鏈的可變區(qū)和人抗體的輕鏈可變區(qū)組成的分子，所述分子可以相同或不同，并且其中重鏈可變區(qū)連接、連結、融合或者共價附著或者結合輕鏈的可變區(qū)，scFv構建體可以是摻入抗體的一個或多個高變結構域的scFv分子的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體等).所有scFv來源的構建體和片段都保持增強的結合特征，從而可選擇性和/或特異性地結合有利于其他細胞的靶細胞。主要通過高變區(qū)確定結合選擇性和/或特異性.可以構建本發(fā)明的抗體以折疊成多價Fv形式，其可以提高結合親和力和特異性和增加的血液中半表期，別人已經(jīng)設計和產生了scFv的多價形式.一種方法是用接頭連接兩個scFv.另一方法涉及使用兩個scFv之間的二硫鍵進行連接.Holliger等人，PNAS90:6444-48(1993)和Kortt等人，ProteinEng.10:423-33(1997)報導了產生二聚體或三聚體Fv的最簡單的方法。設計一種此類方法以用于通過加入F0S和JUN蛋白質區(qū)的序列以在它們和scFv的c末端之間形成亮氨酸拉鏈來產生scFv的二聚體(Kostelny等人，JImmunol.148(5):1547-53(1992);DeKruif等人，JBiolChem,271(13):7630-34(1996)).設計另一種方法用于通過在scFv的c末端加入鏈審抗生物素蛋白編碼序列來產生四聚體.鏈審抗生物素蛋白由4個亞基組成，從而當scFv-鏈審抗生物素蛋白折疊時，4個亞基適應它們而形成四聚體(Kipriyanov等人，HumAntibodiesHybridomas6(3):93-101(1995)).在再一個方法中，為了產生二聚體、三聚體和四聚體，將游離半胱氨酸導入目的蛋白質。用具有可變數(shù)目(2到4)的馬來耽亞胺基團的基于肽的交聯(lián)劑將目的蛋白質交聯(lián)到游離半胱氨酸(Cochran等人，Immunity12(3):241-50(2000)),在該系統(tǒng)中，可以設計噬菌體文庫(如上文描述的)以用于展示scFv，其可以折疊成抗體的Fv區(qū)的單價形式.此外，并且也在上文中討論的，所述構建體適于細菌表達.遺傳工程改造的scFv包含通過連續(xù)編碼的15個氨基酸柔性肽間隔臂連接的重鏈和輕鏈可變區(qū).優(yōu)選的間隔臂是(GlpSer)3(SEQIDNO:8)。該間隔臂的長度以及其氨基酸成分提供了不龐大的間隔臂，其允i午Vh和Vl區(qū)折疊成功能'性Fv結構域，該結構域提供了對其靶的有效結合.改變間隔臂的長度是形成二聚體、三聚體和triamers(通常在本領域中分別稱作雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體)的另一優(yōu)選方法.在其中連接scFv的兩個可變鏈的間隔臂縮短到通常5-12個氨基酸殘基的條件下形成了二聚體.該縮短的間隔臂防止來自相同分子的兩個可變鏈折疊成功能性Fv結構域.相反，所述結構域被迫使與另一分子的互補結構域配對以產生兩個結合結構域.在優(yōu)選方法中，用僅5個氡基酸(GlpSer)(SEQIDNO:19)的間隔臂進行雙鏈抗體構建.可以從兩個相同的scFv，或者從scFv的兩個不同的群體形成該二聚體，并且所述二聚體保持親本scFv的選擇性和/或特異增強的結合活性，和/或顯示出增加的結合強度或親和力.以類似方式，在其中連接scFv的兩個可變鏈的間隔臂縮短到通常小于5個氨基酸殘基的條件下形成三鏈抗體，從而防止來自相同分子的兩條可變鏈折疊成功能性Fv結構域.相反，三個分開的scFv分子結合形成三聚體.在優(yōu)選方法中，通過完全除去該柔性間隔臂得到三鏈抗體.可以從三個相同的scFv，或者從scFv的兩個或三個不同群體形成三鏈抗體，并且所述三鏈抗體保持親本scFv的選擇性和/或特異增強的結合活性，和/或顯示出增加的結合強度或親和力。在其中連接scFv的兩個可變鏈的間隔臂縮短到通常小于5個氨基酸殘基的條件下類似地形成四鏈抗體，從而防止來自相同分子的兩條可變鏈折疊成功能性Fv結構域.相反，四個分開的scFv分子結合形成四聚體。可以從四個相同的scFv，或者從scFv的不同群體的1-4個個體單位形成四鏈抗體，并且所述四鏈抗體應該保持親本scFv的選擇性和/或特異增強的結合活性，和/或顯示出增加的結合強度或親和力.在其中間隔臂通常小于5個氨基酸長的條件下形成三鏈抗體還是四鏈抗體取決于混合物中具體scFv的氨基酸序列和反應條件，本發(fā)明還提供了包含共有序列X廣X廣X廣Pro-X廣X6(SEQIDN0:3)的多肽，其中X,和X6為疏水氨基酸，X"X3和X5為任意氨基酸。在所述多肽的一個實施方案中，L選自精氨酸、賴氨酸，且L和X6選自亮氨酸、纈氨酸、甲疏泉酸、丙氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸，所述多肽可以優(yōu)選包含SEQID.NO:5'備選地，所述多肽可以包含SEQIDN0:6。在根據(jù)本發(fā)明的多肽的另一實施方案中，X2和Xs是精氨酸并且疏水氦基酸X6優(yōu)選為異亮氦酸.在根據(jù)本發(fā)明的多肽的另一實施方案中，^選自亮氨酸和甲疏氨酸，L和X3是精氨酸，X:選自絲氨酸和翔氨酸，且L為異亮氡酸.本發(fā)明的多肽可以基本上是環(huán)狀或成環(huán)的.本發(fā)明還提供了特異結合PSGL-1的多肽，其中所述多肽以基本上類似S15的親和力結合.備選地或額外地，所述多肽可以以基本上類似于A3R的親和力特異性地結合GPIb。本發(fā)明還提供了分離或純化的多肽，如編碼本發(fā)明的抗體和多肽的重組核酸.此類分離或純化的多肽可以在原核或真核表達系統(tǒng)中產生.此類表達系統(tǒng)包括表達栽體和用此類表達栽體轉染的宿主細胞.在原核和真核系統(tǒng)中產生抗體和多肽的方法是本領域公知的，所迷方法包括在允許此類抗體表達的條件培養(yǎng)重組宿主細胞，并從重組宿主細胞或者從培養(yǎng)基分離或純化此類抗體.如本發(fā)明中定義或如所討論的真核細胞系統(tǒng)指用于通過遣傳工程方法產生肽或多肽的表達系統(tǒng)，其中宿主細胞是真核細胞。真核表達系統(tǒng)可以是哺乳動物系統(tǒng)，并且哺乳動物表達系統(tǒng)中產生的肽或多肽經(jīng)純化后優(yōu)選基本上無哺乳動物污染物。有用的真核表達系統(tǒng)的其他實例包括酵母表達系統(tǒng).用于產生本發(fā)明的肽或多肽的優(yōu)選的原核系統(tǒng)使用大腸桿菌(及cro/Z)作為表達栽體的宿主.大腸桿菌系統(tǒng)中產生的肽或多肽經(jīng)純化后基本上無大脈桿菌污染性蛋白質。原核表達系統(tǒng)的使用可以導致在提供用于本發(fā)明的一些或所有序列的N-末端加入甲硫氨酸殘基?？梢匀绫绢I域已知的進行肽或多肽產生后N-末端曱疏氨酸殘基的除去，以允許肽或多肽的完全表達，一個實例是在適宜的條件下使用氣單胞菌屬(Jer咖o/7")氨肽酶(美國專利號5,763,215)。本發(fā)明還提供了選擇結合疏酸化表位的實體的方法，所迷實體如抗體或者其片段或備選地小無機化學實體.這些方法包括針對具有硫酸化表位的肽淘選文庫(例如，淘選噬菌體展示文庫以薟定抗體或者其片段和淘選組合文庫以鑒定小無機化學實體).用于淘選的適宜的疏酸化表位可以基于或者來源于例如，PSGL-1、GPIb、a-2-抗纖溶酶；氨肽酶B;CC趨化因子受體，如CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b;七跨膜片段(7TMS)受體；凝血因子，如因子V、VIII和IX;血纖蛋白原Y鏈；肝素輔因子n;分泌粒蛋白，如分泌粒蛋白I和II;玻連蛋白、淀粉狀蛋白前體、oc-2-抗纖溶酶；縮膽囊素；cc-絨毛膜促性腺激素；補體C4;硫酸皮膚素蛋白聚糖；纖連蛋白；或castrin.此類肽可以在任意位置硫酸化.優(yōu)選地，包含疏酸化表位的所述肽來源于或基于PSGL-1(特別當在從N-末端51位璐氨酸殘基硫酸化時)、GPIb(特別當在276位的酪氨酸殘基硫酸化時，且在較低程度上在279位酪氨酸殘基疏酸化時)或CCR5(特別當在10位酪氨酸殘基硫酸化時)的區(qū)，在一個實施方案中，所述方法包括將肽固定在固體支持體上。任選地，所述方法包括使用非疏酸化的可溶肽或者在備選酪氨酸位置疏酸化的可溶肽的竟爭性淘選，淘選適宜的組合文庫以筌定小無機化學實體當然可以用于實施這些方法.在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用于產生結合疏酸化表位(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的實體的方法包括步驟U)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供SEQIDNO:7的PSGL-1的肽；(c)淘選文庫以選擇結合SEQIDN0:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDN0:7的肽的所選實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供PSGL-1(SEQIDNO:7)的固定化的肽；(c)在可溶性非硫酸化PSGL-1肽(SEQIDNO:26)的存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDNO:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SBQIDN0:7的肽的所選實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體和多肽)的方法包括，(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供PSGL-1(SEQIDNO:7)的固定化肽；(c)在可溶性疏酸化GPIb肽(SEQIDN0:44和/或50)的存在下對文庫進行淘逸，以選擇結合SEQIDN0:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:7的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步碟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供PSGL-1(SEQIDNO:7)的固定化肽；(c)在可溶性疏酸化GPIb肽(SEQIDNO:44和/或50)或非硫酸化PSGL-1肽(SEQIDN0:26)的存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SBQIDNO:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDN0:7的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供PSGL-1(SEQIDNO:7)的固定化肽；(c)在可溶性疏酸化GPIb肽(SEQIDNO:44和/或50)和可溶性非硤酸化GPIb肽(SEQIDN0:43)的存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDN0:7的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供PSGL-1(SEQIDNO:7)的固定化肽；(c)在可溶性疏酸化GPIb肽(選自SEQIDN0:44、50、57和58或它們的組合)和/或非疏酸化PSGL-1肽(SEQIDNO:43)的存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:7的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:7的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟U)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫);(b)提供GPIb肽(SEQIDNO:44)的固定化肽；(c)對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(<I)產生結合卿n)ND:科的肽的實體(例如，^或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟U)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫);(b)提供GPIb肽(SBQIDNO:44)的固定化肽；(c)在可溶性非疏酸化GPIb肽(SEQIDNO:43)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDNO:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:44的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟U)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供GPIb肽(SEQIDNO:44)的固定化肽；(c)在SEQIDNO:7、48、49或59的一種或多種可溶性疏酸化PSGL-1肽存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:44的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供GPIb肽(SEQIDNO:44)的固定化肽；(c)在SEQIDNO:7、48、49或59的一種或多種可溶性硫酸化PSGL-1肽和可溶性非疏酸化PSGL-1肽(SEQIDNO:26)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDNO:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:44的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟U)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供GPIb肽(SEQIDNO:44)的固定化肽；(c)在SEQIDNO:7、48、49或59的一種或多種可溶性硫酸化PSGL-1肽和可溶性非硫酸化GPIb舦(SEQIDNO:43)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDN0:44的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步稞(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫);(b)提供GPIb肽(SEQIDNO:44)的固定化肽；(c)在SEQIDNO:7、財、矜或5T的一秤或多秤可溶性疏酸化PSGL-1肽和一種或多種可溶性疏酸化GPIb肽(SEQIDNO:44和/或50)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:44的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:44的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫);(b)提供CCR5(SEQIDNO:53)的固定化肽；(c)對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:53的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:53的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多欣)，在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供CCR5(SEQIDNO:53)的固定化肽；(c)在可溶性非疏酸化GPIb肽(SEQIDN0:43)和/或非硫酸化可溶性PSGL-1肽(SEQIDNO:26)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:53的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:53的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步猓(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供CCR5(SEQIDNO:53)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SEQIDNO:44和/或50)和/或可溶性疏酸化PSGL-1肽(SBQIDNO:7、48、49和/或59)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDNO:53的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:53的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫)；(b)提供CCR5(SEQIDNO:53)的固定化肽；(c)在可溶性疏酸化GPIb肽(SEQIDNO:44和/或50)和/或非疏酸化可溶性PSGL-1肽(SEQ43IDN0:26)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SEQIDN0:53的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SEQIDNO:53的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽).在本發(fā)明的另一實施方案中，產生實體(例如，本發(fā)明的抗體或者多肽)的方法包括步驟(a)提供文庫(例如，噬菌體展示文庫);(b)提供CCR5(SEQIDNO:53)的固定化肽；(c)在可溶性硫酸化GPIb肽(SBQIDNO:44和/或50)和/或非疏酸化可溶性GPIb肽(SEQIDNO:43)存在下對文庫進行淘選，以選擇結合SBQIDN0:53的固定化肽的實體(例如，噬菌體顆粒)；和(d)產生結合SBQIDNO:53的肽的實體(例如，抗體或包含scFv抗體的多肽)。在治療性導向蛋白質如GPIb和PSGL-l上存在的疏酸化酪氨酸表位的備選方法中，通過篩選適宜的組合文庫可以鑒定小無機化學實體.此類化學實體相對于基于scFv或者IgG的治療劑而言具有許多優(yōu)點.例如，無機化學實體可以經(jīng)口施用并且具有增強的生物安全性譜，包括減小的免疫交叉反應性.它可以提供針對靶的增強的選擇性，尤其按照合理的藥物設計以最優(yōu)化最初選擇的先導化合物。其他優(yōu)點包括更低的生產成本、更長的貯存期間和較不復雜的管理機構批準過程。因為已經(jīng)鑒定了例如GPIb和PSGL-1上本發(fā)明表位的許多實施方案，所以可以采用配體驅動的方法鑒定無機化學實體，其具有非常窄的特異性，或者備選地，對于諸如再灌注損傷的疾病狀態(tài)導向一種以上的硫酸化酪氨酸表位，所述再灌注損傷涉及一種以上的不同把，每種靶都具有此類表位。配體驅動的方法顯著縮短了鑒定用于治療性介入的把的篩選過程，并且使得可以用引導物最優(yōu)化同時進行靶確認，可以用一系列聚焦的(focused)文庫實施靶確認。首先通過分析抗體如Yl及其已知靶如GPIb的殘基硫酸化Tyr-276和Asp-277之間的三維相互作用可以設計和開發(fā)專門用于導向硫酸化輅氨酸表位的無機化學實體的文庫，通過計算機輔助組合文庫設計可以開發(fā)由模擬Yl結合位點并且提供對靶的增加的親和力的實體組成的化學文庫.本發(fā)明還提供了用于鑒定結合疏酸化表位的人抗體的文庫.所述文庫為免疫球蛋白結合結構域文庫，其包含用于互補結合的多種抗原結合結構域，其中所述文庫僅在重鏈CDR3具有多樣性，優(yōu)選地，免疫球蛋白結合結構域為scFv分子.還優(yōu)選地，免疫球蛋白結合結構域具有來自DP32的重鏈互補決定區(qū)(CDRs)1和2，且更優(yōu)選地，還具有來自DP32的輕鏈可變區(qū).本文庫的免疫球蛋白結合結構域可以在任意適宜栽體，如絲狀噬菌體顆粒的表面上展示.在一個實施方案中，本發(fā)明的文庫可以用于選擇疏酸化基序或者表位.本發(fā)明的抗體和其結合片段可以結合、組合、融合或者連接多種試刑，如藥物、毒素、藥物和放射性同位素與任選地，藥學上有效的栽體以形成具有抗病和/或抗癌活性的藥物-肽組合物、融合物或綴合物.此類綴合物和融合物還可以用于診斷、預后或分期目的.可以用于本發(fā)明的栽體的實例包括葡聚糖、HPMA(親水聚合物)、或者任意其他聚合物，如親水聚合物，以及其衍生物、組合和修飾.備選地，可以使用經(jīng)裝飾的脂質體，如用scFvYl分子裝飾的脂質體，如Doxil，其是含有大量阿審素的通過商業(yè)途徑可得到的脂質體.可以制備此類脂質體以含有一種或多種所希望的試劑，和與本發(fā)明的抗體混合以提供高的藥物與抗體比。備選地，抗體或多肽和試劑之間的連接可以是直接連接。兩個或更多個相鄰分子之間的直接連接可以通過分子中元素或者元素的基團之間的化學鍵產生.化學鍵可以是例如，離子鍵、共價鍵、疏水鍵、親水鍵、靜電鍵或者氬鍵，鍵可以是例如，酕胺、二硫化碳、肽和/或二疏鍵.為了將抗體附著到試劑或接頭，如本領域中已知的，可以使用胺、羧基、羥基、疏醇和醋官能團來形成共價鍵.可以通過接頭化合物產生肽和試劑之間或者肽和栽體之間或者栽體和試劑之間的連接，本文所用接頭化合物定義為連接兩個或更多個部分的化合物.接頭可以是直鏈或分枝的。分枝的接頭化合物可以由雙分枝、三分枝或者四分枝或更多分枝的化合物組成.可用于本發(fā)明的接頭化合物包括選自二羧酸、馬來酰亞胺跣肼、PDPH、羧酸酰肼和小肽的那些化合物.根據(jù)本發(fā)明，接頭化合物的更特定的實例包括(a)二羧酸，如琥珀酸、戊二酸和己二酸；(b)馬來酰亞胺酰肼，如N-[馬來酰亞胺己酸]跣肼、4-[N-馬來耽亞胺甲基]環(huán)己烷-l-羧基酰肼和N-[馬來酰亞胺十一烷酸]酰肼；(c)(3-[2-吡啶基二硫代]丙?；ｋ?；和(d)45選自2-5個碳原子的羧酸跣肼和其衍生物、組合、修飾和類似物.使用小肽接頭通過直接偶聯(lián)進行連接也是有用的.例如，使用小肽可以實現(xiàn)例如抗癌藥物阿審素的游離糖和scFv之間的直接偶聯(lián)。小肽的實例包括AU1、AU5、BTag、c-myc、FLAG、Glu-Glu、HA、His6、HSV、HTTPHH、IRS、KT3、C蛋白、S_TAG、T7、V5、VSV-G和KAK。本發(fā)明的抗體和多肽可以結合、綴合、復合或者另外結合顯像劑(也稱作指示性標記)，如放射性同位素，并且這些綴合物可以用于診斷、預后或分期和顯像目的.提供了具有此類放射性同位素-抗體(或片段)綴合物的試刑盒.可以用于診斷、預后、分期和顯像的放射性同位素的實例包括m銦、113銦、"'錸、195錸、m錸、"'锝、""碲、'"'碲、""碲、"5銩、"7锫、"8銩、123碘、t"碘、！"碘、133祺、'"氪、"氣、9。釔、"3敘、"溴、"氣、"釕、"釕、"3釕、185釕、107汞、2°3汞、"鎵和"鎵，優(yōu)選的放射性同位素對X射線或者任意適宜的順磁離子不透.指示性標記分子還可以是熒光標記分子.熒光標記分子的實例包括熒光素、藻紅蛋白或者羅丹明，或者其修飾或綴合物.綴合指示性標記的抗體和多肽可以用于診斷、預后或分期疾病狀態(tài).此外，本發(fā)明還提供了從患者清除腫瘤細胞的方法，通過提供含有來自所述患者的細胞的樣品并將來自所述患者的細胞與本發(fā)明的抗體溫育來實現(xiàn)所述方法.可以在體內、體外或者離體("實施此類活動.當在體內或離體實施診斷、預后或分期時，顯像刑優(yōu)選為生理上可接受的，因為它不對患者造成不可接受的水平的傷害。臨床醫(yī)生使用諸如疾病的嚴重性的標準和其他選擇的可用性可以確定傷害的可接受水平。從而，本發(fā)明提供了診斷試劑盒，其用于在治療之前、期間或之后體外分析治療功效，所述試劑盒具有顯像劑，其具有連接到指示性標記分子或者顯像劑的本發(fā)明的肽.本發(fā)明還提供了使用顯像劑用于癌癥，更具體地腫瘤的診斷定位和顯像的方法，所述方法具有如下步驟(a)將細胞與組合物接觸；(b)測量結合所述細胞的放射性；和因此(c)顯示腫瘤.適宜的顯像劑的實例包括熒光染料，如FITC、PE等等，和熒光蛋白質，如綠色熒光蛋白，其他實例包括放射性分子和酶，所述酶與46底物反應產生可識別的改變，如顏色改變，在一個實例中，試劑盒的顯像劑為熒光染料，如FITC,并且試劑盒提供了對癌，更具體地，血液相關癌，例如，白血病、淋巴瘸和骨號瘤的治療功效的分析。例如，在診斷后、治療期間、緩和^W復發(fā)期間，用FACS分析測定通過顯像劑染色的細胞百分數(shù)和疾病的每個階段染色的強度.本發(fā)明還提供了診斷、預后或分期患者中的疾病的方法，通過提供含有來自所述患者的細胞的樣品并確定本發(fā)明的抗體是否結合患者的細胞，從而指出該患者有危險患有或者已經(jīng)患有所述疾病來實現(xiàn)所述方法?？梢栽隗w內、體外或者離體實施此類活動，當在體內或離體實施時，顯像劑優(yōu)選為生理上可接受的，因為它不對患者造成不可接受的水平的傷害.臨床醫(yī)生使用諸如疾病的嚴重性的標準和其他選擇的可用性可以確定傷害的可接受水平。對于癌癥，分期患者中的疾病通常包括基于腫瘤的大小、類型、位置和侵襲力確定疾病的分類.通過腫瘤特征分類癌癥的一種分類系統(tǒng)是"TNMClassificationofMalignantTumours"(第六版)(L.H.Sobin,編著)，將其引用作為本文參考，并且所述分類系統(tǒng)將癌癥階段分類成T、N和M類，其中T根據(jù)其大小和位置描述原發(fā)腫瘤，N描述局部淋巴結，且M描述遠的轉移。此外，數(shù)字I、II、III和IV用于指出階段，并且每個數(shù)字指TNM因子的可能的組合.例如，I期乳腺癌由TMN組定義Tl、N0、MO,其指Tl-腫瘤直徑為2cm或更小，NO-無局部淋巴結轉移，MO-無遠的轉移.另一種系統(tǒng)用于分期AML,基于法國-美國-英國系統(tǒng)使用在常規(guī)處理和細胞化學染色下觀察到的形態(tài)學對亞型分類.此外，造血和淋巴樣組織的肺瘤疾病的最近提出的世界衛(wèi)生組織(WHO)分期或分類包括(特別對于AML)疾病的常規(guī)FAB型分類以及額外的疾病類型，其與特定細胞遺傳學發(fā)現(xiàn)和與脊髄發(fā)育不良有關的AML相關。其他人也已經(jīng)提出病理分類.例如，AML特異的一種提議包括疾病類型，其與特異細胞遣傳學易位相關并且可以通過形態(tài)評估和免疫分型可靠地識別，并且并入相關的脊髄發(fā)育不良改變的重要性。該系統(tǒng)將得到細胞遣傳學或分子遣傳學研究支持并且隨著描述新的可識別的臨床病理實體而擴大(Arber,Am.J.Clin.Pathol.11547(4):552-60(2001)),本發(fā)明的抗體和多肽可以結合、綴合或者另外結合抗癌劑、抗腫瘤劑、抗病毒刑、抗轉移劑、消炎藥、抗血栓形成刑、抗再狹窄刑、^目、抗自身免疫f[、抗^W刑、抗心血管疾病飛、藥物試刑或者其他抗疾病刑.試劑指可用于預防性治療或者診斷哺乳動物的試劑，所述哺乳動物包括但不限于，人、牛、馬、豬、鼠、犬、貓或者任意其他的溫血動物。此類試劑的實例包括，但不限于，抗病毒刑，包括包括無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和齊多夫定；抗血栓形成/再狹窄劑，包括西洛他唑、達肝素鈉、瑞維肝素鈉和阿司匹林；消炎藥包括扎托洛芬、普拉洛芬、哚昔康、乙酰基水楊酸17、雙氯芬酸鈉、布洛芬、右布洛芬、舒林酸、萘普生、氨托美丁、塞來昔布、吲哚美辛、羅非克西和尼美舒利；抗自身免疫劑包括來氟洛米、昂他克、subreum、WinRhoSDF、去纖苷和環(huán)砩酰胺；且抗粘附/抗聚集劑包括利馬羅斯特、clorcromene和透明質酸，和它們的衍生物、組合和修飾，示例性藥物試刑包括蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素(阿審素)、柔紅審素、伊達比星、二乙氣醋酰阿審素、去甲柔紅莓素、表柔比星、去羥阿霉素、嗎啉代阿審素、嗎啉代柔紅審素、曱氧基嗎啉基阿霉素、甲氣基嗎啉代柔紅霉素和甲氣基嗎啉基阿霉素和它們的取代的衍生物、組合和修飾，其他示例性藥物試刑包括順鉑、紫杉醇、加利車審素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)磷跣胺、潑尼松、氣達拉濱、伊達比星、苯丁酸氮芥、干擾素ot、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來審素，和它們的衍生物、組合和修飾.癌細胞生長的抑制包括例如，(i)防止癌性或者轉移生長，(ii)減慢癌性或者轉移生長，(iii)總體防止癌細胞生長過程或者轉移過程，而保持讓細胞完整和存活，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或者(v)殺死癌細胞。白血病細胞生長的抑制包括，例如，(i)防止白血病或轉移生長，(ii)減慢白血病或者轉移生長，(iii)總體防止白血病細胞生長過程或者轉移過程，而保持讓細胞完整和存活，(iv)干擾癌細胞與微環(huán)境的接觸，或者(v)殺死白血病細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過使用本發(fā)明抗體誘導或者激活ADCC的方法.因此，本發(fā)明的共有抗體和以與S15和A3R基本上相同的親和力結合的抗體可以激活ADCC和/或剌激自然殺傷(NK)細胞(例如，CD56+)、Y&T細胞和/或單核細胞，這可以導致細胞溶解。通常，施用包含抗體的Fc區(qū)或者部分的抗體后，抗體結合效應細胞，例如NK細胞上的Fc受體(FcR),從而引發(fā)釋放穿孔素和粒酶B和/或誘導FasL表達，其然后導致細胞凋亡.效應細胞上表達的FasL與靶細胞表面上Fas受體的結合可以通過Fas受體信號轉導途徑的激活誘導靶細胞的細胞凋亡，在一個實施方案中，包含本發(fā)明的共有序列的IgG抗體誘導效應細胞上FasL表達，多種因素可以影響ADCC，包括有關的效應細胞的類型、細胞因子(例如，IL-2和G-CSF)、溫育時間、細胞表面上存在的受體數(shù)和抗體親和力.本發(fā)明的抗體和多肽可以有用地連接的抗疾病、抗癌和抗白血病劑的實例包括毒素、放射性同位素和藥物.毒素的實例包括白樹毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PB)、PE40、PB38、白喉毒素、蓖麻毒蛋白或者其衍生物、組合和修飾，放射性同位素的實例包括可以用于定位和/或治療的Y-發(fā)射體、正電子發(fā)射體和X射線發(fā)射體，和可以用于治療的p-發(fā)射體和a-發(fā)射體.前面描述的用于診斷的放射性同位素也可以用于治療，抗癌或者抗白血病劑的非限制性實例包括蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素(阿審素)、柔紅審素、伊達比星、二乙氣醋耽阿審素、去甲柔紅霉素、表柔比星、去羥阿審素、嗎啉代阿霉素、嗎啉代柔紅審素、甲氧基嗎啉基阿審素、曱氧基嗎啉代柔紅霉素和甲氣基嗎啉基阿霉素和它們的取代的衍生物、組合和修飾.示例性藥物試劑包括順鉑、紫杉醇、加利車審素、長春新堿、阿糖胞苷(Ara-C)、環(huán)辨酰胺、潑尼松、柔紅審素、伊達比星、氣達拉濱、苯丁酸氮芥、干擾素oc、羥基脲、替莫唑胺、沙利度胺和博來霉素，和它們的衍生物、組合和修飾，在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物具有包含本發(fā)明的任一共有序列的抗體或多肽和藥學上可接受的栽體。所述抗體或多肽存在的量可以有效抑制腫瘤細胞或者白血病細胞的細胞滾動、炎癥、自身免疫病、轉移、生長和/或復制，或者抑制腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)目49或者白血病患者中白血病細胞數(shù)目的增加.備選地，所述抗體或者多肽可以以有效增加肺瘤細胞或者白血病細胞的死亡率的量存在.還備選地，所述抗體或多肽可以以有效改變患病細胞對抗疾病刑傷害的易感性、肺瘤細胞對抗癌刑傷害的易感性或^it^fel^nfe^傷害的易感性的量存在.進一步備選地，所述抗體或多肽可以以有效減少腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)的量存在.還備選地，所述抗體或多肽可以以有效抑制再狹窄的重存在，在該情況中共有抗體優(yōu)選包含A3R.所述抗體或多肽還可以以有效抑制HIV進入和/或治療HIV感染的量存在.備選地，所述抗體或多肽可以用作導向劑將治療劑導向特定細胞或部位.可以將本發(fā)明的抗體和多肽通過任意適宜的方法施用于需要其的患者.示例性方法包括靜脈內、肌內、皮下、局部、氣管內、鞘內、腹膜內、淋巴管內、鼻、舌下、經(jīng)口、直腸、陰道、呼吸道、口的、皮內、經(jīng)皮或者胸膜內施用.對于靜脈內施用，將優(yōu)選制備制刑從而施用于患者的量將是所希望的組合物的從約0.lmg到約lOOOmg的有效量.更優(yōu)選地，所施用的重將是所希望的組合物的從約lmg到約500mg的范圍內.本發(fā)明的組合物在寬刑量范圍內有效并且取決于多種因素，諸如所治療的疾病的詳情、基于肽或者多肽的藥物組合物在患者身體內的半衰期、與抗體或者其片段復合的任何試劑和藥物組合物的物理和化學特征、藥物組合物的施用方式、待治療或診斷的患者的詳情，以及治療醫(yī)生認為重要的其他參數(shù).用于經(jīng)口施用的藥物組合物可以是任意適宜的形式.實例包括片劑、液體、乳劑、懸浮液、糖漿、丸劑、囊片(caplet)和膠囊，制備藥物組合物的方法是本領域公知的(見，例如，Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.Gennaro(編著)Lippincott，WilliamsftWilkins(pub))。還可以配制藥物組合物以便方便定時、持續(xù)、脈沖或連續(xù)釋放。還可以以裝置，如定時、持續(xù)、脈沖或持續(xù)釋放裝置施用藥物組合物.用于局部施用的藥物組合物可以是任意適宜的形式，如乳貪、軟骨、洗劑、貼劑、溶液、懸浮液、凍干物和凝膠，具有本發(fā)明的抗體和多肽的組合物可以包含常規(guī)的藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑、栽體等等。片劑、丸劑、囊片和膠囊可以包括常規(guī)賦形劑，如乳糖、淀粉和硬脂酸鎂，栓劑可以包括賦形劑，如蠟和甘油，注射液包括無菌無致熱原介質，如鹽水，并且可以包括緩沖劑、穩(wěn)定劑或者防腐刑.還可以使^M^^C。本發(fā)明的抗體和多肽和其藥物組合物可以用于治療需要其的患者中疾病的方法中(例如，治療可以包括減輕疾病的影響、防止疾病或者抑制疾病進展)。此類方法包括抑制肺瘤細胞或者白血病細胞的細胞滾動、炎癥、自身免疫病、轉移、生長和/或復制，或者抑制腫瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)的增加。此外，此類方法包括增加腫瘤細胞或者白血病細胞的死亡率，改變患病細胞對抗疾病劑傷害的易感性、腫瘤細胞對抗癌劑傷害的易感性或者白血病細胞對抗癌劑傷害的易感性.此類方法還包括減少肺瘤患者中腫瘤細胞數(shù)或者白血病患者中白血病細胞數(shù)。此類方法還包括抑制或減少細胞中HIV進入和，由于此類抑制導致的阻斷HIV的復制，并從而治療HIV感染。此類方法還包括預防或抑制心血管疾病，如再狹窄，本發(fā)明還提供了用于生產治療多種疾病狀態(tài)的藥物的抗體和多肽，所述疾病狀態(tài)為例如AML、T-ALL、B-白血病、B-CLL、前-B-ALL、多發(fā)性骨號瘤、轉移、HIV感染、心血管疾病或者其他疾病，在所述其他疾病中諸如細胞滾動、炎癥、免疫反應、感染、自身免疫反應、轉移的細胞功能或者活動起重要作用。此類藥物包含本發(fā)明的抗體和多肽。在該申請全文中，已經(jīng)參考了多種出版物、專利和專利申請。這些出版物、專利和專利申請的教導和公開內容在此全文引用作為本申請的參考，以更完整地描述本發(fā)明所屬的技術水平。實施例給出下面的實施例以幫助理解和進一步闡明本發(fā)明，但是不意在并且不理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。盡管描述了具體試劑和反應條件，但是可以做出修改，它們包括在本發(fā)明的范圍內.實施例1本實施例闡明S15scFv抗體片段的選擇、產生和最初表征，包括S15抗體片段的結合能力。簡言之，用基于具有6個氨基酸的隨機51CDR3-VH的VH-VL的特定支架的噬菌體展示文庫來鑒定結合疏酸化PSGL-1的scFv抗體。通過對具有成熟PSGL-1分子的從N-末端到C-末端或者從C-末端到N-末端的氨基酸l-17的序列(相應于不成熟PSGL-1分子的氨基酸42-58，即，包括^TT^列7^T合成的硫酸化肽進行淘選可以得到scFv抗體。用流式細胞術，尤其熒光激活細胞分類術(FACS)和ELISA鑒定和表征結合合成的硫酸化肽或者表達PSGL-1的完整細胞的特定噬菌體克隆.從pHEN栽體中的組合噬菌體抗體文庫(CAT)分離的克隆的支架構建嗌菌體展示文庫，所述支架含有VH3(l-3,3-20)和VL(ll-7),通過長為6個氣基酸的CDR3高變環(huán)的隨機化構建文庫。為了提供在CDR3的5，區(qū)具有單個Eagl位點的構建體(而不是如在pHEN-Yl中發(fā)現(xiàn)的兩個Eagl位點)，通過從p服N-Yl切除Xmal-Notl片段并插入具有Notl位點的連接部分突變的新片段(通過SEQIDNO:20的寡核普酸與SEQIDNO:21的寡核苷酸退火)將VL的3，末端的Bagl限制位點突變。為了產生兩個獨特位點(Eagl和Xmal)和導入具有相同大小但是具有隨機化CDR3的PCR產物，需要所述突變.連接后，在插入?yún)^(qū)對質粒測序并證實了突變，用Bagl和Xmal限制酶切新的p服N-Yl-mut并且大片段是用于隨后連接的栽體。通過PCR使用SEQIDNO:22的寡核苷酸和SEQIDNO:23的寡核苷酸制備用于制備可變CDR3的模板.從SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產物(模板A)并純化以用于進一步擴增.用寡核苷酸SEQIDNO:24和SEQIDNO:23擴增模板A，純化產物并將其命名為模板B,用SEQIDNO:25和SEQIDNO:23的寡核苷酸擴增模板B,將其純化并用Eagl和Xmal限制酶限制酶切.純化用Eagl和Xmal限制酶切的栽體pHEN-n-邁ut并將其連接到用相同酶限制酶切的最終PCR產物.將連接產物用于轉化TGI細胞，從3次連接得到的轉化得率得到了2,4x106個獨立的集落生成單位(CFU)。通過在10個(13cm)SOBAG(20g細菌用胰蛋白胨，5g細菌用酵母，8.5mMNaCl，lOmMMgCl"0.1M葡萄糖，0.1mg/ml氛芐青霉素/升；15g細菌培養(yǎng)用瓊脂用于平板)平板中鋪平板擴增文庫.將來自平板的細菌重懸浮在SOBAG培養(yǎng)基中并在20y。甘油中于-70TC保存.所擴增文庫的效價為1.5x109CFU/ml.將擴增文庫的等分試樣(約1Q8CFU)用輔助噬菌體M13K0752感染以便拯救噬菌體形式的文庫以實施生物淘選實驗.與含有206或者6.4x107個成員的理論文庫相反，該文庫含有2.5x106個成員。通過將SEQIDN0:7的固定化肽與噬菌體展示文庫溫育，通過洗涂除去未結合的噬菌體，并特異洗脫結合的噬菌體來買施生物jam.任選在擴增洗脫的噬菌體克隆后，進行額外輪的結合和任選擴增，富集有利于攜帶最佳結合所述肽的抗體片段的那些噬菌體克隆的特定序列庫.幾輪淘選后，表征單個噬菌體克隆，并測定克隆的序列.在本發(fā)明中，通過在溶液中用結合SEQIDN0:7的生物素化疏酸化肽的鏈審抗生物素蛋白-磁珠淘選噬菌體展示文庫來鑒定S15抗體克隆.該肽通過化學合成并且基于在PSGL-1內氨基酸42—58中發(fā)現(xiàn)的高度酸性序列，其中包括笫三個酪氛酸殘基的疏酸化。將合成肽的N-末端用氨基己酸延伸并且在己酸的氛基進行生物素化以避免硫酸化表位的空間位阻.通過溫育過量肽，然后用PBST(PBS+0.05XTween-20)洗滌并用PBST-M(補加5%低脂乳的PBST)封閉，將合成的SEQIDNO:7的疏酸化肽固定在鏈霉抗生物素蛋白-磁珠(Djrnal)上.為了進行淘選，將肽結合的珠子與2xIO"個噬菌體溫育.將既沒有生物素化也沒有疏酸化的相同線性序列(SEQIDNO:45)的肽加入淘選溶液中以遲免分離結合非疏酸化肽的scFv克隆.在PBST中用高嚴格洗滌進行三輪淘選(每次在37TC20分鐘).洗滌后，結合的噬菌體用甘氨酸0.2M(pH2.2)洗脫并用Tris1M(pH9.1)中和.將洗脫的噬菌體通過感染TG1細菌進行擴增并通過輔助噬菌體M13K07進行拯救。在三輪淘選后實現(xiàn)了最高達5000倍的富集，在笫三輪淘選后，對單個克隆分析CDR3區(qū)中的氨基酸序列.那些所選克隆的CDR3區(qū)氛基酸序列(SEQID.NOS:9、27-33、35、4)在表1中列出.表1<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>MRAPVI(SEQ歸0:4)表l中所示結果表明得到了強共有序列在所有CDR3序列中，笫一和第六位是疏水殘基，通常笫二位是堿性殘基，且笫四位是脯氨酸.為了進一步基于PSGL-1的硫酸化部分分析對合成的硫酸化肽的結合，實施了ELISA分析，該分析使用來自淘選的和所選克隆的噬菌體(圖1)和未純化的scFv上清液(圖2),這些實驗包括scFv抗體Y1和L32的分析，二者都是以前鑒定的，并發(fā)現(xiàn)它們都結合PSGL-1。Yl在美國專利申請?zhí)?0/029,926和國際專利申請?zhí)朠CT/US01/49，440中描述，而L32在美國申請?zhí)?0/189,032中描述)。用SEQIDNO:7的合成的硫酸化肽在"測試"孔中并用SEQIDN0:26的合成的非疏酸化肽在"背景"孔中平行進行ELISA分析。按照生產商推薦的將肽包被在NH-CovaLinkTM平板(冊NC)上，從測試孔中相應系統(tǒng)得到的結合數(shù)據(jù)減去從背景孔得到的結合數(shù)據(jù)，以產生圖1和2中所示的結果.將隨機選擇的噬菌體克隆用作與合成的硫酸化肽結合的陰性對照(NC)。圍1表明所測試的所有經(jīng)淘選和選擇的噬菌體克隆都特異結合合成的疏酸化肽。圖2表明3輪淘選后選擇的克隆上表達的所有scFv都特異結合合成的疏酸化肽.表2提供了用于實施例1的研究中的所有克隆和它們的CDR3區(qū)的氨基酸序列的總結.54表2克Hr名稱CDR3序列SEQIDNO3.1RDPIM(SEQIDNO:27)F(SEQIDNO:28)3.13(S15)RRPSI(SEQIDNO:9)S6TYPH(SEQIDNO:29)S20乙KWPH(SEQEDNO:30)SllRYPFF(SEQIDNO:31)3.2RSPV(SEQIDNO:32)3.4VRHPIM(SEQBDNO:33)S9RHPVA(SEQIDNO:34)YlMRAPVI(SEQIDNO:4)2.12RFPIA(SEQH)NO:36)2.14RSPVL(SEQE)NO:37)2.15RSPpI(SEQIDNO:38)2.17APFG(SBQIDNO:39)2.18MRSPYK(SEQE)NO:40)2.19FSSPHA(SEQIDNO:41)NCPSFRV(SEQIDNO:42)通過FACS分析了來自所選克隆的scFv以評估對ML-2上PSGL-1的結合，所述ML-2是表達PSGL-1的一種AMLM4細胞系.如閨3中所示，來自所有所選克隆的scFv以及L32都以不同靈敏性結合ML-2細胞上的PSGL-l,用來自淘選和所選克隆的未純化的scFv上清液進行ELISA分析，以分析對表達在血小板上的一種糖蛋白glycocalicin的結合。閨4中所示結果表明具有SEQIDNO:9的CDR3序列并且命名為S15的一個克隆與其他所選克隆和先前鑒定的scFvL32相比對glycocalicin具有低親和力，一起考慮，困3和4中所示結果表明基于與glycocalicin的結合，S15顯示出對表達PSGL-1的ML-2細胞的高親和力和對血小板的低親和力.通過結合粒細胞(其為表達PSGL-1的細胞)和血小板的scFv的FACS分析證實了該結論，結果在圖5中顯示，困5清楚地表明S15強烈結合粒細胞，但是僅微弱結合完整血小板.圖6顯示了scFv的粒細胞/血小板結合比的比較.顯然，S15的粒細胞/血小板結合比顯著高于Sll、S9、Sl、S20、3,4、3.1、Yl和L32的所述結合比.圖7顯示了在針對PSGL-1的鼠抗體KPL-1的存在和不存在時，S15結合ML-2細胞上PSGL-1的分析結果。不存在KPL-1時，S15以高親和力結合ML-2細胞，但是存在KPL-1時此類結合基本上被消除，這些結果證實了S15結合ML-2細胞上PSGL-1細胞的特異性'在A蛋白親和柱上純化S15以用于實施例2中描述的進一#^驗.實施例2該實施例描述純化的S15scFv抗體的進一步表征，包括與類似純化的L32和Y1scFv相比，S15scFv抗體的結合能力。實施FACS分析以分析在PBS存在下經(jīng)純化的S15、Y1和L32scFv與ML-2細胞的結合.圖8和9中所示結果表明與L32和Y1相比，S15顯示出與ML-2細胞的至少IOO倍的結合.實施FACS分析以分析在存在50%血漿時，經(jīng)純化的S15、Yl和L32scFv與ML-2細胞的結合。圖10和11中所示結果表明與L32和Yl相比，S15結合的絕對值顯著更高(至少IO倍)，還分析經(jīng)純化的S15scFv與ML-2細胞結合的劑量反應并將其與L32和Yl的相比較.如圖12中所示，甚至在10納克(ng)下，S15的劑量反應也顯著大于L32和Yl的.實施例3該實施例描述包含共有序列的兩種類外抗體的鑒定，通過針對相應于GPIb的殘基268-285的合成肽(包括笫一個酪氨酸位置硫酸化)淘選實施例1中描述的文庫得到所述抗體。本實施例闡明了D1和D3scFv抗體片段的選擇、產生和最初表征，包括D1和D3抗體片段的結合能力.簡言之，用基于具有6個氨基酸的隨機CDR3-VH的VH-VL的特定支架的噬菌體展示文庫來鑒定結合疏酸化GPIb的scFv抗體。針對具有成熟GPIb分子的從N-末端到C-末端的氨基酸268-285的序列(GDEGDTDLYDYYPEEDTE)(SEQIDNO:44)(相應于未成熟GPIb的氨基酸284-301，即包括信號序列)的合成的硫酸化肽淘選得到了scFv抗體.用流式細胞術，尤其熒光激活細胞分類術(FACS)和ELISA鑒定和表征結合合成的疏酸化肽或者表達GPIb的血小板的特定噬菌體克隆。在實施例1中描述了所用的嗷菌體展示文庫.通過將SEQIDNO:44(GDEGDTDLYSDYYPEBDTE)的固定化肽與噬菌體文庫溫育，通過洗滌除去未結合的噬菌體，并特異洗脫結合的噬菌體，來實施生物淘選.在任選擴增洗脫的噬菌體充隆后，S^f銀外輪的結合和任選的擴增，從而富集有利于攜帶具有最佳結合所述肽的的抗體片段的那些噬菌體克隆的特定序列庫.幾輪淘選后，表征單個噬菌體克隆，并確定克隆的序列.在本發(fā)明中，通過在溶液中用共價結合磁珠的SEQIDNO:44的化學合成的碗酸化肽淘選噬菌體展示文庫來鑒定Dl和D3抗體克隆，SEQIDNO:44的疏酸化肽基于在成熟GPIb內氛基S^268一285發(fā)現(xiàn)的高度酸性序列，其中包括第一個酪氨酸殘基的疏酸化，根據(jù)生產商的教導，通過包括EDC/NHS的反應將SEQIDNO:44的合成的硫酸化肽共價結合到胺-磁珠(Dynal)。將珠子用PBST(PBS+0.05%Tween-20)洗滌并用PBST-M(補加5%低脂乳的PBST)封閉.為了進行淘選，將肽結合的珠子與2xl0"個噬菌體溫育.將具有相同線性序列(SEQIDNO:43)但是缺少疏酸化的肽加入淘選溶液中以避免分離結合非疏酸化肽的scFv克隆。在PBST中用高嚴格洗滌進行三輪淘選(每次在371C20分鐘).洗滌后，結合的噬菌體用甘氨酸0.2M(pH2.2)洗脫并用Tris1M(pH9.1)中和.將洗脫的噬菌體通過感染TGI細菌進行擴增并通過輔助噬菌體M13K07進行拯救.在三輪淘選后實現(xiàn)了最高達5000倍的富集。在第三輪淘選后，對單個克隆分析CDR3區(qū)中的氨基酸序列。那些所選克隆的CDR3區(qū)氨基酸序列(SEQID.NOS:11-16)在表3中列出。表3克隆的序列克喹SEO歸O:VMPVM(50%)D2SEQIDNO:llwYPFG麵D5SE0IDN0:12.RVPFD3S抑IDN0:13RSPFG(10%)DlSEQIDNO:14SPPIF(5%)E)9SEQIDN0:15PPYG(5%》D16SEQIDNO:16表3中所示結果表明得到了強共有序列在所有CDR3序列中，第一和笫六位是疏水殘基，通常笫二位是堿性殘基，且笫四位是脯氨酸。為了進一步基于GPIb的硫酸化部分分析對合成的硫酸化肽的結合，實施了ELISA分析，該分杯使用來自^#^^**^1|#(圖13),用SEQIDNO:44GPIb硫酸化(GDEGDTDLYSDYYPEEDTE)的合成的疏酸化肽在"測試"孔中并用SEQIDNO:43(GDEGDTDLYDYYPEEDTE)的合成的GPIb非疏酸化肽在"背景"孔中以及來自PSGL1-1的疏酸化和非疏酸化肽(分別為SEQIDNO:7(QATEYEYLDYSDFLPETE)和SEQIDNO:26(QATEYEYLDYDFLPETE))平行進行ELISA分析.按照生產商推薦的將肽包被在NH-CovaLinkTM平板(NUNC)上。從測試孔中相應系統(tǒng)得到的結合數(shù)據(jù)減去從背景孔得到的結合數(shù)據(jù)，以產生圖13中所示結果，將隨機選擇的噬菌體克隆用作結合合成的疏酸化肽的陰性對照(NC).圖13表明每一個選擇的噬菌體克隆都特異結合兩種合成的硫酸化肽，即GPIb和PSGL-1,盡管所述克隆顯示出對合成的疏酸4匕肽的一系列結合強度，但是每個克隆對GPIb和PSGL-1都顯示出大概相同的行為。通過ELISA分析來自所選克隆的scFv以評估與glycocalicin(來源于血小板中表達的GPIb的外部膜部分)的結合.如圖14中所示，scFvsDl和D3顯示出顯著結合，而D2和D16顯示出弱結合，且D5和D9類似于陰性對照.通過FACS分析來自所選克隆的scFv(每次實驗1mg)以評估與表達PSGL-1的AMLM4細胞系ML-2的結合.如表4中所示，所有scFv都以不同靈敏性結合ML-2細胞。Dl和D3顯示出對ML-2的強力結合，該結合可能是通過與PSGL-1的表位的相互作用，表4克隆幾何平均值陰性4.4Dl26.7D218.7D344.1D55,14D910.5D1617.0實施例4本實施例闡明具有本發(fā)明共有序列范圍內的CDR3序列的幾種scFv抗體的結合.簡言之，使用Yl-scFv的CDR3序列作為支架，產STjFv^f^t^tW結合血小板和粒細胞的影響，使用Yl-scFv的重鏈(CDR3H)的CDR3中的定點誘變，產生落入共有序列內的類外的CDR3區(qū).然后試驗這些額外的scFv以確定對血小板和粒細胞的相對結合，已知Yl-scFv結合血小板上發(fā)現(xiàn)的帶負電荷的GPIbct表位.在包含Yl的CDR3H的6個氨基酸序列中，在第二位有精氛酸殘基，即帶正電荷的氨基酸.為了檢查該精氨酸殘基在與GPIbcx結合中的可能的靜電影響，構建了四種突變體scFv.突變體R2A用丙氨酸替代精氨酸殘基；突變體A3R在第三位具有額外的精氨酸，其替代丙氛酸；突變體V5R在笫5位用類外的精氨酸，其替代纈氨酸，第四種scFv為混亂的突變體.在表5中概述scFv突變體.表5MAbCDR3序列序列標識號YlMRAPVI(SBQIDNO:4)S2AMAAPVI(SBO歸0:45)A3RMRRPVI(SEQIDNO:IO)V5RMRAPRI(SEQIDNO:46)混亂的IPMARV(SEO歸0:47)通過如下FACS分析實施四種突變體scFv和YlscFv在結合血小板中的比較分析.用scFv的400pg混合物免疫兔產生抗-scFv抗體，并用PhycoHnkTMR-藻紅蛋白綴合試刑盒(ProZy邁e，SanLeandro，CA)根據(jù)生產商的教導標記所述抗體.室溫下將scFv的等分試樣(10yg/mL)與107個經(jīng)洗滌的血小板溫育1小時.然后在含有1%BSA的PBS中洗滌血小板并與R—藻紅蛋白-抗-scFv抗體在室溫溫育1小時。然后洗滌血小板，將其重懸浮在PBS中，并通過FACS(VACScan,Becton-Dickinson，CA)分析樣品(104個血小板)，圖15顯示了使用來自不同供體的血小板的3個實驗的平均結合+SEM.與Yl親代scFv相比，突變體R2A不顯示出與血小板的結合，從而表明CDR3H的第二位精氨酸在血小板結合功能中起作用，在1到10ng/ml濃度范圍內，突變體V5R以類似于野生型Yl-scFv的方式結合血小板.然而，在20ng/ml濃度下，V5R的結合是Y1scFv的兩倍(困15).相反，與在所有試驗的濃度下的YlscFv相比，突變體A3RscFv顯示出9倍的與血小板的結合，從而表明在靠近2位精氨酸殘基的另一精氡酸氨基可以增加與血小板的結合.混亂的scFv不能結合血小板(困15),如從該突變體在第2位缺少精氨酸所預計的。還使用ELISA測定分析了scFv與純化的glycocalicin和GPIboc衍生肽的結合能力.困16將這些結果顯示為來自2個實驗的5jLig/mlscFv的平均結合+STDV.突變體R2AscFv和混亂的scFv不結合純化的GPIba，也不結合任一種GPIba衍生肽。V5R以類似于Yl的方式結合純化的glycocalicin和GPIba衍生肽.突變體A3R與Yl相比顯示出與glycocalicin的增強的結合。在如下進行的研究中評估了突變體scFv對血小板聚集的影響。在生物發(fā)光凝集測定儀(Chronolog，Havertown，PA)中371c下以500轉/分鐘攪拌經(jīng)洗滌的血小板.將通過血小板懸浮液和懸浮介質的光投射的差異作為100%聚集.通過將多種濃度的邁Ab-scFvs在室溫下溫育2分鐘后加入激動刑并記錄聚集4分鐘來評估m(xù)Ab-scFvs對血小板聚集的影響，發(fā)現(xiàn)A3RscFv對血小板聚集的影響與其增強的血小板結合能力一致.困17表明與Y1scFv相比，該突變體顯示出更有效抑制經(jīng)洗滌的血小板中利托菌素誘導的、vWF依賴性的血小板聚集(ICs。分別為0.2mM和0.8nM),一起考慮，這些實驗表明Y1-CDR3H中2位的精氨酸殘基可能與對血小板GPIboc的結合有關。此外，此類結合可能涉及靜電相互作用，因為在3位加入類外的精氨酸殘基增大了血小板結合能力和抗聚集功能.實施例5還用ConeandPlate(let)Analyzer(CPA)測定法進一步評估了A3R和Y1scFvs的生物活性，所述CPA測定法是臨床評估在高剪切率，從而模擬生理條件下的聚苯乙烯表面上全血血小板粘附和聚集60的新方法(Varon等人，(1997)Thromb.Res.85(4):283-294;Shenkman等人，(2000)Thromb.Res.99(4):353-361)。如下進行這些實驗.將血樣(0.2ml)置于非組織培養(yǎng)四孔聚苯乙沐^T(Nunc，Kocm3e，丹JET上并在1300s—T的剪切下流動1分鐘，其中使用旋轉特氣隆錐體，其是為該系統(tǒng)專門設計的.所述錐體具有14mm的直徑和2.45°的角，其在整個平板表面產生恒定的流體剪切應力。然后用PBS充分洗滌孔，用May-Grunwald染料染色并用倒置光學顯微鏡(01ympus，Tokyo,日本)分析，該顯微鏡連接圖像分析系統(tǒng)(Galai,MigdalHaemek，以色列).進行CPA測定以評估cpa測定中1mM(25jig/ml)和2pM(50yg/ml)scFv抗體對血小板粘附的影響.如圖18中所示，盡管A3R突變體顯示出表面覆蓋度從對照中的13%降低到分別在1mM和2nM濃度下的7%和3%。相比而言，Yl-scFv對表面覆蓋度沒有影響并且在兩種濃度下都類似于對照中.這些結果表明在CPA的流動條件下，A3R突變體通過其與血小板上GPIb受體的結合抑制血小板對聚苯乙烯表面的粘附.兩種抗體的平均大小(AS)稍微減小(數(shù)據(jù)未顯示).這些結果表明在流動條件下，A3RscFv可以通過其與血小板上GPIb受體的結合抑制血小板對聚苯乙烯表面的粘附.基于如下觀察，即在高剪切應力條件(如在小動脈中發(fā)生的或者由動脈狹窄產生的)下，A3R結合硫酸化GPIb并且防止GPIb和vWF之間的相互作用，該抗體可以治療性用于預防和/或治療動脈粥樣硬化病，實施例6本實施例描述了S15、A3R和Yl對健康的富含血小板的血漿(PRP)的結合特征的比較.對從兩名健康供體制備的PRP樣品進行FACS分析，以分析不同濃度Y1、A3R和S15對血小板的結合，其結果在表6中描繪。表6PRP樣品#10.1鵬0.5tgl貼2pgYl(P03)N紹NegNegative18線NegN戰(zhàn)126S15NegNeg30l加Neg"代表陰性并且定義為當幾何平均值低于10時。PRP樣品并20.1"g0.5tig1MS2f^Yl(P03>N鄰N瞎13A3RNegN瞎96S15NegN瞎2368表6中結果表明在lug濃度下，A3R以比S15更強親和力結合血小板，S15以比Yl更強親和力結合血小板，在lMg時，兩種PRP樣品的平均幾何平均值對于A3R為116，對于S15為26，且對于Yl為陰性.通過FACS分析了所逸scFv(每個實驗0.5jig)以評估對表達GPIb的PRP(富含血小板的血漿)的結合，如表7中所示，D1和D3顯示出對PRP的顯著結合，其中Dl以相對更大的程度結合，Dl結合PRP的水平類似于scFvSll(LRYPFF)(SEQIDNO:31)所顯示的水平，所述scFvS11的選擇在USSN10/611,238的實施例1中描述。表7克隆幾何平均值Dl33.0D319.6Sll36.2實施例7本實施例描述了S15、A3R和Yl對含有粒細胞(G)、淋巴細胞(L)和單核細胞(M)的健康全血細胞的結合特征的比較.對來自兩名健康供體的人全血樣品進行FACS分析，以分析不同濃度Y1、A3R和S15與全血細胞的結合，結果在表8中描繪，表8全血樣品#162抗體0.1叫LGM0.5叫LGM1WLGM2wLGMYl(P03)蜀鄉(xiāng)卿卿.n戰(zhàn)卿3020:30r57A3R養(yǎng)卿1130341856ND"ST5w2e分Sli0e魄120!56299全血樣品#2抗體0.1將LGM0.5嗎LGMl|igLGM2jigLGMYl(P03)卿卿加g卿加fc加g.加gn瞎20122062A3R富蓄c卿14302553120NDS1518446978151248112220340飽和的表8的結果表明S15對全血細胞的結合親和力高于A3R和Yl的結合親和力，在0.lpg濃度下，S15結合兩種全血樣品的平均幾何平均值為中到高，而在0.5ng下，兩種全血樣品的A3R和Yl的平均幾何平均值為負或者稍微正。通過FACS分析scFvDl、D3和Sll(每個實驗0.5ng)以評估對全血(在淋巴細胞、單核細胞和血小板上門控的)的結合。如表9中所示，相對于其他兩種scFv，Dl顯示出對所有細胞類型的最大結合。表9血小板Dl23卯36D33.8216Sll123817實施例8該實施例描述為了進一步研究包含所述共有序列的抗體的性質，開發(fā)了非人體內動物模型系統(tǒng).最初目標是鑒定非人哺乳動物物種，其中一種(或多種)抗體(a)結合血小板和(b)能夠抑制血小板聚集.通過FACS分析確定多種scFv抗體結合從不同哺乳動物物種分離的血小板的能力，在表IO中總結相對結合結果。表1063血小板來源YlA3RS15SllSIDl人+I111t1Mi*i狗+++ND1，M,M1豬+ND++NDNDND豚鼠+++如—'H-ri'+1條子-NDNDNDND小鼠NDNDNDND鳥-ND++++ND-未確定的.在所試驗的每個物種內，在包含共有序列的抗體中，scFvYl顯示出最弱的相對結合。該觀察支持如下結論，即突變體(A3R)和文庫選擇的(S15、Sll、S1和D1)scFv都具有對如血小板GPIb上發(fā)生的硫酸化表位的增強的結合能力.例如，scFvsA3R和S15顯示出對人和豚鼠血小板的5-9倍(相對于Yl)的結合能力，而Sll、SI和Dl對那些種類的結合能力是Yl的約25倍，對于scFv組結合的非人血小板的種類陣列，Sll、Sl和Dl每種都結合來自狗、豚鼠和兔的血小板，S15結合來自狗(最高親和力)、豚鼠和豬的血小板，但是不結合來自兔、小鼠或猴(狒狒和獼猴)的血小板.重要的是，豚鼠是所鑒定的其中包含共有序列的所有抗體都能夠結合血小板的唯一非人物種.對血小板聚集的影響盡管Sl、Sll和Dl相對于S15以高得多的親和力結合來自豚鼠的血小板，但是所有這些ScFv對于抑制血小板聚集都顯示出相似的能力。發(fā)現(xiàn)scFvs15對豚鼠血小板聚集的抑制效果(ICs。80-160mg/邁l)為其對人來源的血小板的抑制效果的約1/10-1/8。這可能是由于scFvS15抗體對豚鼠來源的血小板的相對較低的結合，發(fā)現(xiàn)IgGlS15和IgGYl抗體對人和對狗來源的血小板的結合是相似的.兩種抗體在相同濃度下都誘導人和狗來源的血小板中血小板的聚集。豚鼠中scFv的藥物代謝動力學為了評估豚鼠中scFv抗體的藥物代謝動力學，將10mg/kgscFvA3R以快速濃注靜脈內施用于豚鼠.用ELISA測定法測定不同時間點時豚鼠血液中scFvA3R的水平，并使用FACS分析測定血小板結合的scFv的水平.用氯胺稱(50mg/kg)與甲苯噻喚(20mg/kg)的混合物腹膜內注射麻醉三只雄性豚鼠(體重約500g).通過以10mg/kg(約5mg/豚鼠)靜脈內快速濃注施用scFvA3R,抗體施用后在時間0(施用抗體前)和3、10、20、30、60、90、120、180和360分鐘收集血樣。在每個時間點，抽取0.5ml血液。將3.8X的檸檬酸鈉用作抗凝刑.通過以3000xg離心血樣15分鐘得到血漿并將其在-20TC保存，并通過以150xg離心血樣10分鐘得到PRP.通過FACS分析使用抗-scFvPE標記的抗體在豚鼠PRP中測試血小板結合的A3RscFv。通過特定ELISA測定血漿A3RscFv抗體濃度.用FACS分析評估快速濃注施用后不同時間點時結合豚鼠血小板的scFv-A3R抗體的水平.結果(困19)表明快速濃注施用10mg/kgscFv-A3R后IO分鐘，結合血小板的scFv的水平為最大水平的40-80%,并且在120分鐘后達到最大水平。scFv-A3R抗體對血小板的結合在快速濃注施用后360分鐘(6小時)內保持高水平，且到24小時時降低了90%。使用用在Tyr-276具有疏酸化酪氨酸的GPIb肽包被的平板(ljiM/孔)通過ELISA測量A3R-scFv的血漿水平。通過加入兔抗-VL(可變輕)抗體，然后通過抗兔HRP(Sigma)和3，3，，5，5，-四甲基-聯(lián)苯胺(TMB)(Sig肌，StLouis，MO)底物檢測結合的scFv,通過ELISA平板讀出器(Anthos,Salzburg)在0.D.450讀取產生的顏色的強度。通過將已知量的這些抗體加入到豚鼠血漿或者加入到含有0.05%Tween20和2%脫脂乳的PBS中構建標準曲線，從標準曲線計算每個樣品中scFv的血漿濃度。結果表明快速濃注后3分鐘scFvA3R的血漿濃度達到峰值并且在6小時內逐漸下降(圖20)。豚鼠中A3R的半衰期為139士9分鐘。總之，基于靶血小板上飽和水平的快速實現(xiàn)和相對長的半衰期，上面的研究提供了初步指示，即A3R具有有利的藥物代謝動力學特征.65實施例9BIAcore生物傳感器使用表面等離子體共振檢測并且允許兩種相互作用種類的實時動力學分析.該系統(tǒng)用于MscFvTT、m^St5對來源于血小板GPIb的一種多肽glycocalicin的結合動力學。用BUcore3000儀器(BIAcore，Uppsala，瑞士)測定抗體對glycocalicin的結合親和力。在10niM乙酸鈉溶液(pH4.6)中，以20m1/分鐘的流速，將glycocalicin(固定的配體)共價固定到CM5芯片(BIAcore)上。在包含0.005%(v/v)非離子去污劑P20(聚氣乙烯山梨聚糖)的HBS緩沖液，pH7.4(10mMHEPES，150mMNaC1,3.4mMEDTA)中進行所有結合實驗.用BHevaluation3.1軟件(BIAcore),從平均K(結合速率)和Kd(解離速率)動力學測定抗體與glycocalicin的結合親和力(L>)。A3R-scFv以比Yl-scFv更高的親和力(約7倍)結合血小板glycocalicin,如通過A3R-scFv的更快的結合速率所示的(表ll).這些結果符合對完整血小板的FACS分析所得的結果.S15-scFv也以高于Yl-scFv但是寸氐于A3R的親和力結合glycocalicin.表ll固定的配體分析物表現(xiàn)表觀GlycocalicinYl.scFv2.7x10s1.2x10"4.5xl(T7Glycocalicina3r-scFvGlycocalicinS15鄰Fv2.4x10。1.8xl(T7實施例10該實施例描述包含共有序列的抗體與基于PSGL-1、GPIb和CCR5的經(jīng)歷酪氨酸殘基硫酸化的那些區(qū)域的合成肽的直接結合.所用的合成肽如下。PSGL-1(殘基42-58)衍生的QATEYEYLDYDFLPETE沐碟酸化)犯QH)NO:26QATEY8EYLDYDFLPETE(在第l個酪氨酸位里碟酸化)SEQIDNO:4gQATEYEYLDYSDFLPETE(在第3個路氨酸位置碟酸化)SEQIDNO:7GPIb(殘基268-285)衍生的GDEGDTDLYDYYPEEDTE(未碟酸化)SEQE)NO:43GDEGDTDLYSDYYPEEDTE(在第1個路泉酸位置碟酸化)SEQIDNO:44GDBGDTDLYDYYSPEEDTE(在第3個酪A酸位置碟酸化)SEQIDNO:50CCR5(殘基1-18)衍生的MDYQVSSPIYDINYYTSB(未碟酸化)SEQIDNO:51MDY'QVSSPIYDINYYTSE(在第l個酪氨酸位罝碟酸化)SEQIDNO:52MDYQVSSPIY，DINYYTSE(在第2個路氨酸位罝碟酸化)SEQIDNO:53MDYQVSSPIYDINY'YTSE(在第3個酪氨酸位罝磕酸化)SEQE)NO:54所用的scFv是N06(陰性對照)、Y1(P03)、S15、Sll、Sl、S9、s.c.3.1和Sll,將NHCovaLinkTM微量滴定板(Nunc，丹麥)用磺基-NHS(3.48邁g/ml)和EDC(3.07mg/ml)在室溫預處理30分鐘后，將多種硫酸化和非疏酸化肽附著到所述板，然后用水洗滌1次，并用含有0.05%Tween的PBS洗滌三次，用含有5%脫脂乳和0.05%Tween的PBS緩沖液通過在室溫溫和振蕩1小時封閉板.加入合成肽(每孔IOOmM)，然后用含有0.05VTween的PBS緩沖液洗滌5次，并在室溫干燥板。對于結合，將A蛋白-純化的scFv抗體(0.5)Lig/孔)加入板中在室溫溫育1小時。對于ELISA，將封閉緩沖液中的兔抗人Vl多克隆抗體(抗-scFv)加入板中以在251C溫育60分鐘.通過用含有0.05%Tween的PBS緩沖液洗滌5次除去過量抗-scFv.加入封閉緩沖液中的山羊抗兔HRP-標記的抗體以在室溫溫育1小時，并通過洗滌10次除去過量物.加入TMB顯影劑5分鐘并用0.5MIhS04(100nl/孔)中和.通過ELISA平板讀出器在450nm波長讀出顏色反應。一式兩份測定每種樣品并計算平均數(shù)。表12碟酸化1"1^13rdGPIbl"3rdCCR53ni麗P030.070.080.080.500.070.500.100.070.070.100,07S150.17.0200.200.600.200.600.300.120.120,300.16Sll0.010.160.120.700.100.600.300.080.120.700.11SI.0.070.100.080.800.070,800.150.060.070.300.07S90.070.090.080.800.08O.抑(U30,070.070.180.07s.c3,10.070.090,090.800.08O.肌0.130.070.080.250.08表12和困21表明所試驗的包含共有序列的所有scFv抗體都顯著結合在笫三個酪氨酸位置疏酸化的PSGL-1衍生肽，但是不結合在第一或者第二個酪氨酸位置疏酸化的肽。單鏈抗體S1、S9和3.l顯示出對在笫三個酪氛酸位置硫酸化的PSGL-1衍生肽的最強結合，這些抗體還結合在第一個酪氨酸位置疏酸化的GPIb-衍生肽，其中scFvSl、S9和3.1顯示出對在第三個酪氨酸位置疏酸化的GPIb衍生肽的最強結合，而scFvS15和Sll顯示出對在笫三個酪氨酸位置疏酸化的GPIb衍生肽的中等結合，也觀察到這些抗體與在第二個酪氨酸位置疏酸化的CCR5衍生肽的顯著結合，但是不結合在第一或第三個輅氨酸位置疏酸化的CCR5衍生肽.單鏈抗體Sll顯示出與在在笫二個酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽的最強結合.用對照抗體scFv沒有觀察到結合.用在笫二個酪氨酸位置硫酸化的CCR5衍生肽得到的結果表明至少scFvSll和可能地包含共有序列的其他抗體具有作為人細胞中HIV感染性抑制劑的潛力.實施例11進行研究以闡明包含本發(fā)明的共有序列的IgG抗體能夠介導靶細胞，尤其來自患者樣品的B-CLL細胞的依賴抗體的細胞毒性(ADCC)。此外，S15-IgG與第二抗-人Fc抗體的超交聯(lián)表明細胞凋亡機制也促進細胞殺傷.依賴抗體的細胞毒性(ADCC)實驗如下.在FIC0LI^上分離單核效應細胞和靶細胞，然后用PKH26標記靶細胞，其中PKH26在細胞膜的脂質區(qū)穗定摻入熒光染料。然后洗滌細胞并將其與效應細胞以多種效應物把(E:T)比，在不同濃度的S15IgG或者對照抗體的不存在或存在下溫育24小時.死亡細胞經(jīng)T0PR0(Molecular丄robes,Inc.,Eugene,OR)染色并通過FACS在門控靶細胞上進行分來自健康供體的單核效應細胞和來自三名患者的B-CLL靶細胞以多種E:T比例在S15IgG存在和不存在下溫育24小時，然后進行FACS分析.圖22B表明S15IgG介導所有三種樣品中的效應細胞細胞毒性，與對照相比具有30-50%ADCC.S15-IgGADCC由自然殺傷細胞和單核細胞介導，分析效應細胞實現(xiàn)B-CLL細胞的S15-IgG介導的ADCC的能力.用通過商業(yè)途徑可得到的磁珠分離來自正常供體和B-CLL患者的自然殺傷(CD56+)細胞和單核(CD14+)細胞.困23表明來自正常供體和B-CLL患者的NK細胞能夠實現(xiàn)ADCC,從而分別導致約50%和35%殺傷。來自正常供體和來自B-CLL患者的單核細胞也能夠實現(xiàn)ADCC(約5-13%).然而，CD56+NK細胞組成了B-CLL細胞的S15IgG介導的ADCC的更重要的效應細胞群體.細胞凋亡實驗如下，在FICOLI^上分離來自B-CLL患者的單核細胞并在存在或不存在S15一IgG或者對照抗體的條件下在371C溫育細胞IO分鐘.然后加入抗人Fc抗體并在37t:溫育4-24小時。然后用細胞凋亡標記膜聯(lián)蛋白和TOPR(^對患病細胞(CD19+，CD5+)進行染色并通過FACS進行分析.S15-IgG誘導細胞凋亡.FACS分析表明在S15-IgG存在下溫育的來自B-CLL患者的單核細胞(CD19+,CD5+)在5小時內顯示出約10%細胞凋亡(困24),加入與S15-IgG交聯(lián)的第二抗體引起在5小時內類外的50%細胞凋亡(困24)。這構成了強有力證據(jù)證明針對PSGL-1上硫酸化表位的抗體的交聯(lián)引發(fā)了原代B-CLL細胞的細胞凋亡的信號。這暗示PSGL1可以是體內誘導B-CLL患者中細胞凋亡的靶，其中通過具有Fc受體的細胞，例如單核細胞、CD56+NK細胞和y5+1"細胞可以介導交聯(lián)效應。與S15-IgG相反，人抗體利妥?，斣诮宦?lián)后不顯示出細胞凋亡的增大(圍25)，其中利妥希瑪廣泛用于包括B-CLL的多種淋巴樣惡性肺瘤的治療.使用針對PSGL-1的鼠抗體KPL1可以抑制上述對于S15-IgG描迷的細胞凋亡和交聯(lián)效果，PSGL-1自身不誘導細胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。這證實細胞凋亡信號通過PSGL-1上的表位介導.此外，F(xiàn)ACS分析表明S15-IgG結合所試驗的所有B-CLL樣品，這與它僅最低限度結合正常B-細胞形成對照.一并考慮，這些結果表明S15-IgG是作為治療B-CLL的治療刑的有希望的候逸物，因為它的細胞毒性和細胞凋亡效杲通過表達于患病細胞上的PSGL-1疏酸化表位的特異識別介導.實施例8無機化合物文庫的篩選.用通過諸如己酸的短接頭偶聯(lián)到合成肽的生物素標記(生物素化的)可以制備來自特定受體(蛋白質)的合成的硫酸化肽(在肽的已知氨基酸序列內的給定特定駱氨酸殘基上硫酸化)，使用相同的合成肽可以制備沒有疏酸化和沒有生物素標記("B")的對照舦.此外，可以制備來自其他不相關蛋白質的合成的硫酸化肽作為額外對照，其沒有生物素標記("C")?？梢詫⑸厦娴纳锼鼗?"A")偶聯(lián)到鏈審抗生物素蛋白包被的磁珠并洗除過量未結合的生物素化肽。可以在大量過量非硫酸化對照肽("B")的存在下在生理條件(37t:，pH7.0-7.4，鹽濃度，電導率等等)針對小分子化學實體文庫篩選生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物("D")以選擇結合"A"的分子.然后用緩沖液洗涂偶聯(lián)的磁珠兩次，每次進行離心以除去過量未結合的分子。結合磁珠的分子("B")可以經(jīng)洗脫、化學鑒定并以更大量制備以用于進一步嬸選，通過其他篩選方法可以證實所選化合物("E")對生物素化疏酸化肽的結合。所述方法包括與生物素化的不相關硫酸化肽竟爭(方法l)或者與特異結合生物素化肽"A"的抗體或者其片段(例如，scFv)竟爭(方法2).通過與不相關生物素化硫酸化肽竟爭進行再次篩選(方法1)。為了確?；衔锾禺惤Y合"A"，可以實施第二輪篩選?？梢杂盟x化合物"E"，在過量不相關生物素化疏酸化肽"C"的存在下再次篩選生物素-鏈審抗生物素蛋白肽綴合物("D").然后離心所述管，用緩沖液洗滌生物素-鏈審抗生物素蛋白肽綴合物偶聯(lián)的磁珠兩次并每70次進行離心以除去過量未結合的分子。可以洗脫結合磁珠的化合物用于化學鑒定.可以制備更大量化合物以用于進一步研究，如對"A"的選擇性結合的驗證，和體外和體內功效試驗.通過與特異的scfv抗-瓶酸化抗體的竟爭的再次m(^^n如下.在大量過量特異識別和結合"A"的特定scFv抗體的存在下，通過竟爭生物素-鏈霉抗生物素蛋白肽綴合物("D")與每種所選化合物"E"的結合可以再次篩選與"A"具有優(yōu)選結合親和力的化合物?？梢灾苽涮禺愐种苨cFv抗體與"A"的結合的化合物以用于進一步研究，如對"Aw的選擇性結合的驗證，和體外和體內功效試驗.已經(jīng)給出的前面的描述和實施例僅用于闡明本發(fā)明并且不意在進行限制。因為本領域技術人員可以想到整合本發(fā)明精神和實質的所公開實施方案的修改方案，所以應該理解本發(fā)明包括所附權利要求及其等同方案范圍內的任何內容。7權利要求1.包含共有序列X1-X2-X3-Pro-X5-X6的抗體或其片段，其中X1和X6為疏水氨基酸，且X2、X3和X5為任意氨基酸。2.權利要求1的抗體或其片段，其中所述疏水氨基酸選自亮氨酸、纈氨酸、曱硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸.3.權利要求1的抗體或其片段，其中X2是堿性氨基酸。4.權利要求3的抗體或其片段，其中所述堿性氛基酸選自精氨酸和賴氨酸.5.權利要求1的抗體或其片段，其中X2和X3是精氨酸，6.權利要求1的抗體或其片段，其中L是異亮氨酸.7.權利要求1的抗體或其片段，其中X!選自亮氡酸和甲疏氨酸，并且X5選自絲氨酸和纈氨酸，8，權利要求1的抗體或其片段，其中所述共有序列在抗體或者其片段的高變區(qū)內，9.權利要求1的抗體或其片段，其中互補決定區(qū)(CDR)包含所述共有序列的至少一部分。10.權利要求9的抗體或其片段，其中所述CDR是所述抗體或者其片段的重鏈.11.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段包含重鏈互補決定區(qū)(CDR),該重鏈互補決定區(qū)包含選自SEQIDNO:9、10、13、14、28和31的氨基酸序列。12.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段包含重鏈互補決定區(qū)(CDR)，該重鏈互補決定區(qū)具有選自SEQIDNO:17和SEQIDN0:18的氨基酸序列.13.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段包含選自SEQIDNO:9、10、13、14、28和31的第一個重鏈互補決定區(qū)(CDR);包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的第二個重鏈CDR和包含SEQIDN0:18的氨基酸序列的笫三個重鏈CDR.14.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段包含選自SEQIDNO:5、6、55、56、60和61的序列，15.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段結合PSGL-1、GPIb和/或CCR5的硫酸化表位。16.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段與兩種或更多種表位交叉反應，其中每種表位具有一個或多個疏酸化酪氨酸殘基，17.權利要求15的抗體或其片段，其中每個表位包含兩個或更多個酸性氨基酸的至少一簇.18.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段結合在存在于蛋白質上的一個或多個位置硫酸化的一種或多種表位，所述蛋白質選自ct-2-抗纖溶酶；氨肽酶B;CC趨化因子受體；七跨膜片段(7TMS)受體；凝血因子V、VIII和IX;血纖蛋白原y鏈；肝素輔因子II;分泌粒蛋白I和II;玻連蛋白、淀粉狀蛋白前體、oc-2-抗纖溶酶；縮膽囊素；a-絨毛膜促性腺激素；補體C4;疏酸皮膚素蛋白聚糖；纖連蛋白；和castrin.19.權利要求18的抗體或其片段，其中所述CC-細胞因子受體選自CCR2、CCR5、CCR3、CXCR3、CXCR4、CCR8和CCR2b'20.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段結合選自前-B-ALL細胞、CLL細胞、多發(fā)性骨tt瘤細胞、轉移細胞、T-ALL細胞、AML細胞、血小板、粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的至少一種細胞類型上的表位.21.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段結合和抑制血小板聚集.22.權利要求21的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段包含SEQIDNO:9、10、28和31的至少一部分，23.權利要求1的抗體或其片段，其中所述抗體或者其片段還結合脂類、糖、肽、糖脂、糖蛋白、脂蛋白和/或脂多糖分子上的表位。24.藥物組合物，其包含權利要求1的抗體或者其片段和藥學上可接受的栽體.25.診斷、預后或分期試劑盒，其包含權利要求1的抗體或其片段和顯像劑.26.分離或純化的DNA序列，其編碼權利要求1的抗體或其片段。27.表達栽體，其包含權利要求24的分離或純化的DNA序列。28.重組宿主細胞，其包含權利要求27的表達栽體。29.權利要求28的重組宿主細胞，或者其后代，其中所述重組宿主細胞表達所述抗體或其片段.30.產生抗體或其片段的方法，其包括在允許表達所述抗體或其片段的條件下培養(yǎng)權利要求28的重組宿主細胞，31，權利要求30的方法，其還包括從重組宿主細胞或者重組宿主細胞的培養(yǎng)基分離或純化所述抗體或其片段.32.包含共有序列X廣X「X廣Pro-X5-Xs的多肽，其中X!和Xs為疏水氨基酸，且Xz、X3和X5為任意氨基酸。33.權利要求32的多肽，其中所述多肽基本上為環(huán)狀或成環(huán)的，34.權利要求32的多肽，其中所述多肽結合碟酸化PSGL-l、GPlb和/或CCR5，并且其中所述多肽以基本類似于SEQIDN0:5、6、55、56、60或61的scFv抗體或其片段的親和力結合.35.疾病治療方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.36.治療細胞滾動的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.37.治療感染的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.38.權利要求37的方法，其中所述感染由HIV導致。39.權利要求37的方法，其中所述施用防止HIV進入。40.治療炎癥的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物。41.抑制自身免疫病的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.42.抑制轉移的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.43.抑制腫瘤細胞生長和/或復制的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.44.增加肺瘤細胞的死亡率的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.45.抑制白血病細胞生長和/或復制的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物。46.增加白血病細胞的死亡率的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.47.抑制B-CLL細胞生長和/或復銜的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.48.增加白血病細胞的死亡率的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物，49.改變患病細胞對抗疾病劑的傷害的易感性的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.50.增加肺瘤細胞對抗癌劑的傷害的易感性的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.51.增加白血病細胞對抗白血病劑的傷害的易感性的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.52.增加B-CLL細胞對抗白血病劑的傷害的易感性的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.53.抑制血小板聚集的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物。54.抑制再狹窄的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.55.引起依賴抗體的細胞介導細胞毒性(ADCC)的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.56.權利要求55的方法，其中通過由自然殺傷細胞(NK)或者單核細胞組成的效應細胞介導所述ADCC.57.引起白血病細胞的細胞凋亡的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物.58.刺激自然殺傷細胞(NK)或者T細胞的方法，其包括對需要其的患者施用權利要求24的藥物組合物。59.權利要求24的藥物組合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途.60.診斷、預后或分期患者中疾病的方法，其包括提供含有來自所述患者的細胞的樣品和確定權利要求1的抗體或者其片段是否結合患者的細胞，從而表明所述患者有危險患有或者已經(jīng)患有所述疾病.61.從患者清除腫瘸細胞的方法，其包括提供含有來自所述患者的細胞的樣品；和將來自所迷患者的細胞與權利要求1的抗體或者其片段溫育。62.權利要求61的方法，其中離體發(fā)生所述清除.63.選擇抗體或者其片段或多肽的方法，其包括步驟(a)提供噬菌體展示文庫；(b)提供選自SEQIDNO:7、44和53的肽；(c)淘選所述噬菌體展示文庫以選擇結合選自SEQIDNO:7、44、50和53的肽的scFv抗體或者其片段；和(d)產生所選的scFv抗體或者其片段。64.權利要求63的方法，其中所選的scFv抗體或者其片段結合選自SEQIDNO:7、44和53的肽.65.權利要求63的方法，其中將所述肽固定化，66.權利要求65的方法，其中步稞(c)還包括在選自SEQIDNO:26、43、44、48、49、50、51、52、54、57、58和59的至少一種可溶性肽的存在下進行淘選.67.權利要求65的方法，其中所選的抗體或者其片段不結合SEQIDNO:26、48或49,68.權利要求65的方法，其中所選的抗體或者其片段不結合SBQIDNO:43,69.權利要求65的方法，其中所選的抗體或者其片段不結合SEQIDNO:51、52或54,70.根據(jù)權利要求63的方法產生的抗體或者其片段.71.免疫球蛋白結合結構域文庫，所述結構域包含用于互補結合的多樣的抗原結合結構域，其中所述文庫僅在重鏈CDR3中具有多樣性。72.權利要求71的文庫，其中所述免疫球蛋白結合結構域是scFv分子。73.權利要求71的文庫，其中所述免疫球蛋白結合結構域包含來自DP32的重鏈互補決定區(qū)(CDR)1和2,74.權利要求71的文庫，其中所述免疫球蛋白結合結構域包含來自DP32的輕鏈可變區(qū).75.權利要求71的文庫，其中所述免疫球蛋白結合結構域在絲狀噬菌體顆粒的表面上展示.76.選摔械酸化表位的力法，其包括步驟:提供權利要求71的文庫；淘選所述文庫以選擇結合所述抗原結合結構域的硫酸化表位；和分離所述硫酸化表位.77.小無機分子，其中所述小分子結合PSGL-l、GPIb和/或CCR5的疏酸化表位，78.藥物組合物，其包含權利要求77的小無機分子.全文摘要本發(fā)明提供了抗體或者其片段，所述抗體或者其片段結合癌細胞并且對于諸如細胞滾動和轉移的生理現(xiàn)象是重要的。還提供了使用此類抗體或其片段的治療和診斷方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物可以用于導向治療劑和疾病的診斷、預后和分期以及治療中，所述疾病如癌癥，包括腫瘤生長和轉移、白血病、自身免疫病和炎性疾病。還提供了免疫球蛋白結合結構域文庫，所述結構域具有用于互補結合的多樣的抗原結合結構域，其中所述文庫僅在重鏈CDR3中具有多樣性。文檔編號C07K16/28GK101300021SQ200480024914公開日2008年11月5日申請日期2004年6月30日優(yōu)先權日2003年6月30日發(fā)明者A·萊瓦農,D·普拉克辛,E·桑頓,R·本-萊維,Y·哈蓋,Y·坎菲,Y·尼斯加夫申請人:生物技術通用(以色列)有限公司