專利名稱：獨活提取物、其制備方法及含有該提取物的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獨活提取物、其制備方法以及含有該提取物的藥物，具體而言，本發(fā)明涉及用于治療類風濕性關節(jié)炎的獨活提取物，通過超臨界提取工藝制備該提取物的方法，以及含有該提取物的藥物特別是軟膠囊。
背景技術：
類風濕性關節(jié)炎(RA)是常見病、多發(fā)病，人群廣，有效藥物少，西醫(yī)治療類風濕常用非甾體抗炎藥，慢作用抗炎藥及糖皮質(zhì)激素等。雖然在改善癥狀方面有一定療效，但副作用明顯，愈后多不理想。
類風濕性關節(jié)炎是一種以關節(jié)病變?yōu)橹鞯穆宰陨砻庖咝约膊。瑢儆谥嗅t(yī)痹病范疇。部頒標準中藥成方制劑和國家藥典中，用于風寒濕痹的中藥制劑較多，而用于類風濕性關節(jié)炎的中成藥極少，國家藥典中收載的昆明山海棠片由昆明山海棠一味組成，具有祛風除濕，舒筋活絡，清熱解毒功能，用于風濕、類風濕性關節(jié)炎的治療。目前市售的治療類風濕性關節(jié)炎的中成藥除昆明山海棠片外，還包括雷公藤片、風濕圣藥膠囊等，其中雷公藤因毒性大，已引起廣泛注意；而風濕圣藥膠囊為硬膠囊，處方中有川烏、草烏等毒性藥材。
獨活為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubecens的干燥根，具有祛風除濕，通痹止痛的功能，為中醫(yī)臨床用于類風濕性關節(jié)炎常用之品。經(jīng)藥效學證明，獨活具有祛風除濕、免疫調(diào)節(jié)、溫經(jīng)止痛和活血通絡作用。古今文獻對獨活治療類風濕性關節(jié)炎均有報道，根據(jù)《普濟方》數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)檢索，我國古代醫(yī)家已廣泛應用配伍獨活治療風寒濕痹，其中用于治療與痹病和類風濕性關節(jié)炎密切相關的古代病癥的處方達到230首。目前已有很多關于含獨活的方劑治療類風濕性關節(jié)炎方面的報道(邱聯(lián)群，湖南中醫(yī)藥導報2000，6(10)22；劉維君等，天津中醫(yī)2000，17(5)19；王祿海等，陜西中醫(yī)學院學報2000，23(6)27；韓振貴等，河北中醫(yī)2000，22(12)906)。
中醫(yī)運用獨活配伍治療類風濕性關節(jié)炎相當普遍。歸結起來，目前運用獨活治療類風濕性關節(jié)炎具有如下幾個特點1、所用處方普遍為多味中藥的大復方，藥物組合大而雜；2、從所設基本方的構成情況可以明確看出祛風除濕、散寒止痛、溫經(jīng)通脈、行氣活血、舒筋活絡、強壯筋骨為基本治療方法，臨床表現(xiàn)上為數(shù)法合用，而以祛風除濕、散寒止痛、溫經(jīng)通脈的藥物應用更為廣泛。但這些復方制劑均存在配劑復雜的問題。
由此可知，目前為止應用獨活治療類風濕性關節(jié)炎的中藥制劑均為復方制劑，尚沒有單獨應用獨活治療類風濕性關節(jié)炎的藥物，且對于獨活中含有的藥理活性成分也沒有詳細的有關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藥理活性成分確定的獨活提取物、該提取物的制備方法以及含有該獨活提取物作為有效成分的類風濕性關節(jié)炎治療藥，特別是含有獨活提取物的軟膠囊及該軟膠囊的制備方法。
本發(fā)明人通過對獨活的有效部位進行分離研究，結果發(fā)現(xiàn)在獨活提取物中含有二氫歐山芹素(Columbianedin)、甲氧基歐芹素(Osthol)、二氫歐山芹醇乙酸酯(Columbianetin acetate)、花椒內(nèi)酯(Xanthotoxin)和二氫歐山芹醇(Columbianetin)等活性成分，并確定了各成分的結構。
另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過采用超臨界CO2萃取法，將萃取壓力、萃取溫度、萃取時間控制在一定范圍內(nèi)，可以使得到的獨活提取物中上述各活性成分的合計含量達到提取物干燥重量的50％以上。
另外，本發(fā)明人將由上述提取方法得到的獨活提取物用于制備軟膠囊，結果得到了一種生物利用度高、刺激性低的用于治療類風濕性關節(jié)炎的軟膠囊。
具體而言，本發(fā)明涉及一種獨活提取物，其中含有以下(1)-(5)種化學活性成分中的至少一種，
本發(fā)明還涉及一種獨活提取物的提取方法，其特征在于包括以下步驟將一定粒度的獨活粉碎物加入CO2超臨界萃取釜中，對萃取釜和解析釜進行加熱；當溫度達到萃取溫度和解析溫度時，對萃取釜和解析釜進行加壓，當壓力分別達到萃取壓力和解析壓力時，開始進行循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓；萃取一定時間后，從解析釜的出料口出料，得獨活提取物。
在上述提取方法中，獨活提取物的粒度優(yōu)選為通過60目篩，萃取溫度為35～50℃，優(yōu)選為40℃，解析溫度為55～75℃左右，優(yōu)選為65℃，萃取壓力為15～25MPa，優(yōu)選為20MPa，解析壓力為2～10MPa，優(yōu)選為5Mpa，萃取時間為2～5小時，優(yōu)選為3小時。
本發(fā)明還涉及一種獨活軟膠囊，由內(nèi)容物及囊殼組成，內(nèi)容物由獨活提取物及其溶劑、潤濕劑、助懸劑組成，各組分的重量比為獨活提取物溶劑∶潤濕劑∶助懸劑＝1∶3～5∶0.4～0.6∶0.06～0.08。
在上述獨活軟膠囊中，溶劑為能溶解提取物的物質(zhì)，優(yōu)選使用大豆油，潤濕劑一般為表面活性劑，可以使用吐溫類、司盤類等，優(yōu)選使用聚乙二醇400、聚山梨酯80，助懸劑可以使用能增加分散介質(zhì)粘度的固體物質(zhì)，如蜂蠟、單硬脂酸鋁、乙基纖維素等，優(yōu)選使用蜂蠟。
本發(fā)明優(yōu)選的一種獨活軟膠囊以1000粒計的軟膠囊內(nèi)容物組成如下獨活提取物100克大豆油350克聚乙二醇-400 50克聚山梨酯804克蜂蠟 6克具體實施方式
(獨活提取物的制備)由于獨活中含有的用于治療風濕的活性成分為香豆素類化合物，多為一些極性小的化合物，因此本發(fā)明采用超臨界CO2流體萃取的工藝制備獨活提取物。
本發(fā)明制備獨活提取物的具體方法如下取獨活藥材(傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubecens的干燥根)粉碎通過60目篩，投入超臨界萃取釜中，對萃取釜和解析釜進行加熱，當萃取溫度和解析溫度分別達到35～50℃和55～75℃時，通過壓縮泵對萃取釜和解析釜進行加壓，當萃取壓力和解析壓力分別達到15～25Mpa和2～10Mpa時，開始進行循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓萃取2～5小時后，從解析釜的出料口出料，得獨活提取物。去除上層水分，下層浸膏于50～75℃減壓干燥至密度為1.130，得提取物。
(對獨活提取物中所含有效活性成分的確認)取上述制得的提取物，用薄層層析法進行分離，可見5個以上熒光斑點，然后用硅膠柱層析法分離得到5個主要活性成分，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜及核磁共振光譜進行鑒定，確證各活性成分的結構。
(1)二氫歐山芹素(Columbianedin)(C19H20O5)
無色針晶(石油醚-醋酸乙酯)，mp 115-117℃；紫外光下呈藍紫色熒光；UVλnm326，260，250；IRν(KBr)(cm-1)1727，1618，1267，1113，1066，834；EIMS m/z(％)328(M+)，228，213(100)，83，551H-NMR(CDCl3)δppm1.59(3H，s)，1.63(3H，s)，1.67(3H，s)，1.89(3H，d，J＝8Hz)，3.38(2H，d，J＝9Hz)，5.12(1H，t，J＝9Hz)，5.97(1H，q，J＝8Hz)，6.21(1H，d，J＝9Hz)，6.73(1H，d，J＝8Hz)，7.26(1H，d，J＝8Hz)，7.62(1H，d，J＝9Hz)；13C-NMR(CDCl3)δppm167.1，164.1，161.1，151.3，143.9，137.6，128.9，128.6，113.5，112.9，112.2，106.7，89.2，82.0，27.6，22.3，21.2，20.5，15.6。
(2)甲氧基歐芹素(Osthol)(C15H16O3)
無色針晶(無水乙醇)，mp 82.2-82.8℃，紫外光下呈藍色熒光；UVλnm257，322；IRν(KBr)(cm-1)1720，1605，1560，1480；EIMS m/z(％)244(M+，100)，228，201，189；1H-NMR(CDCl3)δppm1.66(3H，s)，1.83(3H，s)，3.53(2H，d，J＝7.2Hz)，3.90(3H，s)，5.20(1H，t，J＝7.2Hz)，6.22(1H，d，J＝9Hz)，6.83(1H，d，J＝8Hz)，7.27(1H，d，J＝8Hz)，7.59(1H，d，J＝9Hz)；13C-NMR(CDCl3)δppm161.2，160.3，152.9，143.7，132.6，126.2，121.1，118.1，113.0，113.1，107.3，56.0，25.7，21.9，17.9。
(3)二氫歐山芹醇乙酸酯(Columbianetin acetate)(C16H16O5) 無色棱晶(無水乙醇)，mp.133-134℃，紫外光下呈藍紫色熒光；UVλnm250，260，325；IRν(KBr)(cm-1)1741，1617，1453，1251，841；EIMS m/z(％)288(M+)，228，213(100)，187，159，131；1H-NMR(CDCl3)δppm1.52(3H，s)，1.57(3H，s)，1.99(3H，s)，3.28(2H，m)，5.15(1H，t)，6.20(1H，d，J＝9.5Hz)，6.74(1H，d，J＝8Hz)，7.27(1H，d，J＝8Hz)，7.64(1H，d，J＝9.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δppm170.1，163.9，161.0，151.3，143.9，128.8，114.5，113.1，112.2，106.6，88.7，82.0，27.5，22.2，21.9，20.9。
(4)花椒內(nèi)酯(Xanthotoxin)(C12H8O4) 無色針晶(無水乙醇)，mp.142.8-143.6℃，紫外光下呈黃色熒光；UV λnm299，248；IRν(KBr)(cm-1)1705，1675，1580；EIMSm/z(％)216(M+，100)，201，188，173，145，89，63；1H-NMR(CDCl3)δppm4.30(3H，s)，6.37(1H，d，J＝9Hz)，6.82(1H，d，J＝2.5Hz)，7.35(1H，s)，7.68(1H，d，J＝2.5Hz)，7.75(1H，d，J＝9Hz)；13C-NMR(CDCl3)δppm160.4，147.7，146.6，144.3，143.0，132.8，126.1，116.5，114.8，112.9，106.7，61.3。
(5)二氫歐山芹醇(Columbianetin)(C14H14O4)
無色柱晶(無水乙醇)，mp.157.8-158.6℃，紫外光下呈藍紫色熒光；UV λnm328，261；IRν(KBr)(cm-1)3500，1700，1610；EIMS m/z(％)246(M+)，228，213，187(100)，131，59；1H-NMR(CDCl3)δppm1.24(3H，s)，1.36(3H，s)，1.73(1H，s，加入D2O后消失，-OH)，3.31(2H，m)，4.79(1H，t)，6.19(1H，d，J＝9.5Hz)，6.74(1H，d，J＝8Hz)，7.25(1H，d，J＝8Hz)，7.61(1H，d，J＝9.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δppm163.7，160.9，151.3，143.9，128.7，114.0，113.1，112.3，106.6，91.4，71.8，27.6，26.0，24.0。
(含有獨活提取物的軟膠囊的制備)本發(fā)明的獨活提取物可以按常用方法制成通常的口服制劑，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等劑型。但由于獨活的超臨界提取物為疏水性成分，在將其作為中間提取物制成制劑過程中，提高其活性成分的生物利用度是需考慮解決的技術問題，本發(fā)明考慮到普通固體口服制劑存在溶解度小、口服后吸收較差，從而對血藥濃度產(chǎn)生影響，難以達到預期的臨床療效的缺陷。而軟膠囊是由親水性的明膠膠皮包裹著液體狀的疏水性藥物，這些藥物基本是以油溶液、混懸液、糊狀物或聚乙二醇溶液等形式所組成?？诜竽芎芸斓卦谙纼?nèi)崩解，崩解后的藥液迅速廣泛地粘附于組織表面，促進活性成分的吸收，從而獲得較高的生物利用度。實驗證實，軟膠囊的生物利用度優(yōu)于合顆粒的硬膠囊更優(yōu)于片劑及包衣片。另外軟膠囊因其獨特的包埋和掩蓋作用，制成后還可降低其刺激性。基于上述考慮，本發(fā)明將獨活提取物制成含混懸液的軟膠囊。
本發(fā)明獨活軟膠囊內(nèi)容物為獨活提取物(活性成分)與基質(zhì)制成的混懸液，其中基質(zhì)為在作為溶劑的大豆油中加入輔料而形成的。由于獨活提取物常溫下非常粘稠，基質(zhì)加入量不宜過少，為保證在較好的流動性的前提下盡量少加基質(zhì)，本發(fā)明提出獨活提取物與基質(zhì)的用量比為(以重量計)約1∶3～5。此外由于獨活的超臨界CO2提取物室溫下為非常粘稠的膠狀物，只能部分溶解在大豆油中，故需加入適當?shù)妮o料——潤濕劑和助懸劑，制成混懸液，在加入輔料的情況下各組分的重量比優(yōu)選為獨活提取物溶劑∶潤濕劑∶助懸劑＝1∶3～5∶0.4～0.6∶0.06～0.08。潤濕劑一般為表面活性劑，如吐溫類，司盤類等。助懸劑可選用能增加分散介質(zhì)粘度的固體物質(zhì)，如蜂蠟、單硬酯酸鋁、乙基纖維素等。一般潤濕劑與助懸劑適當配合較單一助懸劑的效果好。本發(fā)明優(yōu)選采用聚乙二醇-400及聚山梨酯80為潤濕劑，使用蜂蠟作為助懸劑。本發(fā)明獨活軟膠囊內(nèi)容物的優(yōu)選配方如下(以1000粒計)獨活提取物100克大豆油350克聚乙二醇400 50克聚山梨酯804克蜂蠟 6克本發(fā)明獨活軟膠囊囊殼可以使用常用的囊殼，以明膠為膠料，甘油為增塑劑，尼泊金乙酯作防腐劑，以紅氧化鐵作遮光劑。
本發(fā)明獨活軟膠囊具體可以采用以下制備方法1、獨活軟膠囊內(nèi)容物的制備按配方稱取各配料，在大豆油中加入助懸劑，加熱使助懸劑熔融，放冷后成凝膠狀；取獨活提取物用潤濕劑稀釋、攪勻，一并加入凝膠狀溶液中，置膠體磨中研勻，得膠囊內(nèi)容物，備用。
2、獨活軟膠囊囊殼的制備取尼泊金乙酯用乙醇稀釋(優(yōu)選至濃度為16％)，與明膠、甘油、紅氧化鐵一并加水浸泡(優(yōu)選2小時)，使明膠膨脹，然后，置膠鍋中加熱(優(yōu)選加熱至65℃)，混合均勻，抽真空至沒有氣泡，用不銹鋼篩網(wǎng)(優(yōu)選使用100目篩)過濾，濾液置貯膠桶中靜置(優(yōu)選在50℃下保持3-4小時)，使泡沫上浮，刮去上浮的泡襪，取下面的膠作為囊殼，保溫待用。
3、將上述的軟膠囊內(nèi)容物和囊殼膠液經(jīng)軟膠囊機軋制成軟膠囊。
(藥理試驗)下述藥效試驗例中所用的藥品與試劑包括本發(fā)明獨活軟膠囊(0.42g/粒，每粒含提取物84mg，相當于生藥量3.36g)；吉林省輝南天泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的風濕圣藥膠囊(陽性對照藥)；沈陽藥科大學制藥廠生產(chǎn)的角叉菜膠；沈陽試劑廠生產(chǎn)的醋酸；上海試劑廠生產(chǎn)的2，4-二硝基氯苯(DNCB)；上海市生物制品廠生產(chǎn)的晶體牛血清蛋白(BSA)；除特別說明外，試驗用藥液的溶劑為生理鹽水。
試驗動物為由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供的昆明種小鼠，體重18-22g；Wistar大鼠雄性，體重140g-160g；家兔(北京大耳白)體重2.0-2.5kg。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對佐劑性關節(jié)炎的抑制作用試驗)取大鼠60只，雄性，體重140-160g，每組10只，隨機分成6組，即對照組(0.5g/kg生理鹽水(每kg大鼠用0.5g生理鹽水)，以下類同)、風濕圣藥預防組(0.5g/kg)、鳳濕圣藥治療組(0.5g/kg)，獨活預防組(0.15g/kg，含提取物30mg，相當于生藥1.2g)、獨活治療I組(0.15g/kg，含提取物30mg，相當于生藥1.2g)、獨活治療II組(0.30g/kg，含提取物60mg，相當于生藥2.4g)。每只大鼠在右足皮內(nèi)注射Frenumd’s完全佐劑(自制)0.05ml(內(nèi)含死結核桿菌0.5mg)，注射佐劑當日即開始給藥的為預防組，第8天開始給藥的為治療組，采用灌胃給藥，連續(xù)觀察21天，停藥后繼續(xù)觀察3天。注射佐劑前及后3小時且每隔3日用玻管容積法各測左右足容積1次，同側足給佐劑前后容積之差值為腫脹度，計算出各組腫脹度均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表1。
表1本發(fā)明獨活軟膠囊對大鼠佐劑性炎癥的影響n＝10

與對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01
由表1可以看出，本發(fā)明獨活預防組能明顯抑制佐劑引起的早期炎癥反應(第6天后)，并能明顯抑制12天以后的再度腫脹，又能抑制另側足因遲發(fā)性超敏反應引起腫脹，作用強度與風濕圣藥相當。獨活治療組(I、II)給藥后明顯抑制了注射佐劑側足腫脹，并使再度腫脹的程度明顯下降，對另側遲發(fā)性超敏反應足腫脹亦有明顯的抑制作用，其作用強度與風濕圣藥相當。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對角叉菜膠引起的足腫脹的抑制作用試驗)取雄性大鼠50只，體重140g-160g，每組10只，隨機分成5組，即對照組(同容量生理鹽水)、獨活軟膠囊低、中、高劑量組(分別為0.15g/kg、0.30g/kg、0.60g/kg)、風濕圣藥組(0.5g/kg)，用玻璃容器法測量右后足正常足容積。采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3天，未次給藥30分鐘后，分別在大鼠右后足皮下注射1％角叉菜膠0.1ml/只致炎，隨后1h、2h、4h、6h，按上法測每鼠足容積。并按下述公式分別計算腫脹率(％)和抑制率(％) 計算出各組腫脹率均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表2。
表2 本發(fā)明獨活軟膠囊對角叉菜膠引起的大鼠足腫脹的影響

與對照組比較**P＜0.01；( )為抑制率。
由表2可以看出，本發(fā)明獨活軟膠囊低、中、高劑量組可明顯抑制角叉菜膠引起的大鼠足腫脹，與對照組比較，差異非常顯著，且有一定量效依存關系，其作用與風濕圣藥相當略強。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對蛋清引起的大鼠足腫脹的抑制作用試驗)取雄性大鼠50只，體重140g-160g，每組10只，隨機分成5組，參照上述獨活軟膠囊對角叉菜膠引起的足腫脹的抑制作用試驗方法的實驗劑量及方法給藥，未次給藥30分鐘后，分別在大鼠右后足皮下注射蛋清0.1ml/只致炎，隨后1h、2h、4h、6h，按實施例4方法分別測大鼠右后足容積，并分別計算腫脹率(％)和抑制率(％)，求出各組腫脹率均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表3。
表3 本發(fā)明獨活軟膠囊對蛋清引起的大鼠足腫脹的影響

與對照組比較**P＜0.01；( )為抑制率。
由表3可以看出，本發(fā)明獨活軟膠囊低、中、高劑量組對蛋清引起的大鼠足腫脹有非常明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關系，其作用強度與風濕圣藥相當略強。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對牛血清白蛋白(BSA)引起的III型超敏反應的影響試驗)取北京大耳白家免30只，雌雄各半，體重2.0g-2.5kg，每組6只，隨機分成5組，即對照組(同容量生理鹽水)，獨活軟膠囊低劑量組(78.9mg/kg、含提取物6.6mg，相當于生藥0.3g)，獨活軟膠囊中劑量組(157.8mg/kg、含提取物13.2mg，相當于生藥0.6g)，獨活軟膠囊高劑量組(315.6mg/kg、含提取物26.4mg，相當于生藥1.2g)風濕圣藥組(240mg/kg)。各組動物分別一次耳緣靜脈注射牛血清白蛋白(BSA)250mg/kg，3天后重復注射一次，致家兔急性血清病(III型超敏反應)，其癥狀為家兔排出大量的蛋白尿。采用灌胃驗藥，每天1次。連續(xù)用藥10天，10天后，采用雙縮脲法測定尿蛋白的含量(mg/10ml)，搜集家兔24小時尿量(ml/日)。計算出各組家兔尿蛋白均值，尿量均值，各給藥組與對照組比較，并進行t檢驗，結果見表4。
表4本發(fā)明獨活軟膠囊對BSA引起的家兔III型超敏反應的影響(X±SD)

與對照組比較**P＜0.01由表4可以看出，本發(fā)明獨活軟膠囊低、中、高劑量組對BSA引起的家兔III型超敏反應尿蛋白排出量有明顯的抑制作用，與對照組比較差異非常顯著，其作用強度與風濕圣藥相當，對尿量無明顯影響。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對DNCB引起的小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響試驗)取昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，每組10只，隨機分成5組，即對照組(同容量生理鹽水)，獨活膠軟囊低劑量(0.22g/kg，含提取物18.3mg，相當生藥0.86g)，獨活軟膠囊中劑量(0.44g/kg，含提取物36.6mg，相當生藥1.72g)，獨活軟膠囊高劑量(0.88g/kg，含提取物73.2mg，相當生藥3.44g)，風濕圣藥組(0.7g/kg)。分別用5％的2，4-二硝基氯苯(DNCB)乙醇液涂于小鼠腹部皮膚致敏，致敏前一天各組動物采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)9天，致敏前7天后用1％的DNCB(溶于橄欖油中)分別涂于小鼠右耳，一天后分別處死小鼠，稱量兩耳重量，以小鼠兩耳重之差為遲發(fā)性超敏反應值，計算出各組小鼠兩耳重差值均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表5表5本發(fā)明獨活風濕膠囊對DNCB引起的小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響

與對照組比較**P＜0.01由表5可以看出，本發(fā)明獨活軟膠囊低、中、高劑量組對DNCB引起的小鼠遲發(fā)性超敏反應有明顯的抑制作用，且有一定量效依存關系，其作用與風濕圣藥相當略強。
(本發(fā)明獨活軟膠囊的鎮(zhèn)痛作用試驗)取體重18-22g小鼠50只，雌雄各半，每組10只，隨機分成5組，各組給藥劑量同小鼠超敏反應實驗。采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3天，末次給藥30分鐘，每只小鼠分別注射0.6％醋酸0.2ml/只，然后觀察15分鐘內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，計算各組小鼠扭體次數(shù)均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表6。
表6獨活風濕膠囊對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響

與對照組比較**P＜0.01由表6可以看出，本發(fā)明獨活軟膠囊低、中、高劑量組對醋酸引起的小鼠的扭體反應有明顯的抑制作用，其作用強度與風濕圣藥相當略強。
(本發(fā)明獨活軟膠囊對棉球肉芽腫形成的影響試驗)取Wistar大鼠40只，體重140-160g，每組8只，隨機分成5組，各組給藥劑量同獨活軟膠囊對角叉菜膠引起的足腫脹的抑制作用試驗。用戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，膝部用碘酒及75％酒精消毒后，切大約1cm的小口，用滅菌消毒的眼科鑷子將20mg重的高壓滅菌棉球(用青霉素和鏈霉素混合液0.2ml浸泡烘干)，由切口處放入皮下，隨即縫合皮膚。各組均采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)用藥7天，第8天打開原切口，將棉球連同結締組織一起取出，放入烘箱中70℃烘干，稱重。將稱得的重量減去棉球重量即為肉芽腫重量。計算出各組肉芽腫重量均值，各給藥組與對照組比較并進行t檢驗，實驗結果見表7。
表7本發(fā)明獨活風濕膠囊對大鼠棉球肉芽腫的影響

與對照組比較**P＜0.01由表7可以看出，獨活軟膠囊低、中、高劑量組對對大鼠棉球肉芽腫的形成有明顯的抑制作用，其作用強度與風濕圣藥相當略強。
由以上藥理試驗可知，本發(fā)明獨活軟膠囊對佐劑性炎癥有非常明顯的預防和治療作用，對角叉菜膠、新鮮蛋清引起的炎癥反應也有明顯的抑制作用，有很好的抗炎作用。對DNCB所致遲發(fā)性超敏反應和BSA引起的III型超敏反應有明顯的抑制作用，有很好的抑制免疫反應的作用。對熱刺激和醋酸刺激引起的疼痛反應有明顯的抑制作用，有很好的鎮(zhèn)痛作用。對棉球肉芽腫的形成有明顯的抑制作用，有很好的抑制增生作用。綜上所述，可以認為以上藥理試驗結果與本發(fā)明獨活軟膠囊的祛風除濕、通痹止痛的功能相符，說明本發(fā)明的獨活軟膠囊是一種對類風濕性關節(jié)炎有效的藥物。
(實施例)下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并限于這些實施例。
實施例1獨活提取物的制備稱取3360g獨活(按中國藥典2000年版第215頁，購自四川省藥材公司)，粉碎通過60目篩，投入超臨界萃取釜(所用的萃取儀器為美國惠普公司生產(chǎn)的HP7680A超臨界流體萃取儀)中，對萃取釜和解析釜進行加熱，當萃取溫度和解析溫度分別達到40℃和65℃時，通過壓縮泵對萃取釜和解析釜進行加壓，當萃取壓力和解析壓力分別達到20MPa和5Mpa時，開始進行循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓。萃取3小時后，從解析釜的出料口出料，得獨活提取物。去除上層水分，下層浸膏70℃干燥至密度為1.130，制得100克提取物。經(jīng)檢測，每克本提取物中總香豆素的含量不低于500mg，甲氧基歐芹素的含量不低于60mg，二氫歐山芹素的含量不低于120mg。
實施例2獨活軟膠囊的制備(所用試劑均為市售食品級或藥用級)在350ml大豆油中加入6g蜂蠟，加熱使蜂蠟熔融，放冷后成凝膠狀；取由實施例1制備的100g獨活提取物用50ml聚乙二醇-400稀釋，加入4ml聚山梨酯80攪勻，一并加入凝膠狀溶液中，置膠體磨中研勻，得膠囊內(nèi)容物備用。取尼泊金內(nèi)酯0.2g，用乙醇稀釋至濃度為16％與明膠250g、甘油85g、紅氧化鐵3.8g一并加水300ml浸泡2小時，然后加熱至65℃，攪拌均勻，抽真空至沒有氣泡，用100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液至貯膠桶中放置3-4小時(保持溫度在50℃)，至氣泡都浮在表面，取下面的膠作為囊殼備用。將上述的膠囊內(nèi)容物和囊殼膠液經(jīng)軟囊機軋制軟膠囊，制成每粒420mg的軟膠囊1000粒。經(jīng)檢測，每粒軟膠囊中總香豆素的含量不低于40mg，甲氧基歐芹素的含量不低于6mg。
權利要求
1.獨活提取物，其中含有下式(1)-(5)表示的化學活性成分中的至少一種，
2.權利要求1所述的獨活提取物的提取方法，其特征在于包括以下步驟將一定粒度的獨活粉碎物加入CO2超臨界萃取釜中，對萃取釜和解析釜進行加熱；當溫度達到萃取溫度和解析溫度時，對萃取釜和解析釜進行加壓，當壓力分別達到萃取壓力和解析壓力時，開始進行循環(huán)萃取，并保持恒溫恒壓；萃取一定時間后，從解析釜的出料口出料，得獨活提取物。
3.如權利要求2所述的提取方法，其中獨活提取物的粒度為通過60目篩，萃取溫度為35～50℃，解析溫度為55～75℃左右，萃取壓力為15～25MPa，解析壓力為2～10MPa，萃取時間為2～5小時。
4.如權利要求3所述的提取方法，其中萃取溫度為40℃，解析溫度為65℃，萃取壓力為20Mpa，解析壓力為5MPa，萃取時間為3小時。
5.獨活軟膠囊，由內(nèi)容物及囊殼組成，內(nèi)容物由獨活提取物、溶劑、潤濕劑、助懸劑組成，各組分的重量比為獨活提取物∶溶劑∶潤濕劑∶助懸劑＝1∶3～5∶0.4～0.6∶0.06～0.08，所述獨活提取物為權利要求1所述的獨活提取物。
6.獨活軟膠囊，由內(nèi)容物及囊殼組成，內(nèi)容物由獨活提取物、溶劑、潤濕劑、助懸劑組成，各組分的重量比為獨活提取物∶溶劑∶潤濕劑∶助懸劑＝1∶3～5∶0.4～0.6∶0.06～0.08，所述獨活提取物為權利要求2-4中任一項所述的提取方法制得的提取物。
7.如權利要求5或6所述的獨活軟膠囊，其中溶劑使用大豆油，潤濕劑使用吐溫類、司盤類，助懸劑使用蜂蠟、單硬脂酸鋁、乙基纖維素。
8.根據(jù)權利要求7所述的獨活軟膠囊，其特征在于1000粒計的軟膠囊內(nèi)容物的組成如下獨活提取物 100克大豆油 0.35克聚乙二醇-400 0.05克聚山梨酯80 0.004克蜂蠟 6克
9.權利要求5或6所述的獨活軟膠囊的制備方法，包括以下步驟(1)獨活軟膠囊內(nèi)容物的制備按配方稱取各配料，在大豆油中加入助懸劑，加熱使助懸劑熔融，放冷后成凝膠狀，取獨活提取物用潤濕劑稀釋、攪勻，一并加入凝膠狀溶液中，置膠體磨中研勻，得膠囊內(nèi)容物，備用；(2)獨活軟膠囊囊殼的制備取尼泊金乙酯用乙醇稀釋，與明膠、甘油、紅氧化鐵一并加水浸泡，使明膠膨脹，然后，置膠鍋中加熱，混合均勻，抽真空至沒有氣泡，用不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液置貯膠桶中靜置，使泡沫上浮，刮去上浮的泡襪，取下面的膠作為囊殼，保溫待用；(3)將上述的膠囊內(nèi)容物和囊殼膠液經(jīng)軟膠囊機軋制成軟膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及獨活提取物、其制備方法以及含有該提取物的藥物，具體而言，本發(fā)明涉及用于治療類風濕性關節(jié)炎的獨活提取物，通過超臨界提取工藝制備該提取物的方法，以及含有該提取物的藥物特別是軟膠囊。
文檔編號C07D307/00GK1718578SQ20041006880
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月5日 優(yōu)先權日2004年7月5日
發(fā)明者陸蕾, 楊劍, 付霞仙 申請人:上海森泰醫(yī)藥科技有限公司