專利名稱：從棉花組織中抽取rna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及棉花分子生物學技術領域。具體涉及從棉花組織中抽提與純化用于分子生物學的RNA的方法。
背景技術：
RNA的抽提是進行分子生物學研究的基礎。高質量RNA的獲得對于功能基因組學以及遺傳學研究具有重要意義。有關植物RNA的抽提方法較多，現(xiàn)有的方法主要有硫氰酸胍-酚-氯仿抽提和純化法、酚-SDS法和CTAB法等幾種，其中硫氰酸胍-酚-氯仿抽提和純化法在多種動、植物中抽提RNA上具有廣泛的應用，是種有效、經濟抽提RNA的方法。棉花是一種灌木類木本植物，起組織和器官中富含多酚、多糖和次生代謝物質，按照傳統(tǒng)方法抽提DNA、RNA和蛋白質等抽提方法在棉花上應用比較困難。
近年來有關棉花生物大分子(例如DNA、RNA和蛋白質等)的分離純化受到分子生物學技術領域科技人員的重視，有關DNA的抽提方法的改良促進了棉花分子生物學在DNA水平的發(fā)展。近年來國內外有關從棉花組織和器官中抽提RNA的方法已有較多的報道，如利用改良的熱硼法(YingRu Wu等.，Plant MolecularBiology Reporter 20213～218；李繼剛等，棉花學報，2004，16(1)3～7)；CTAB法(蔣建雄等，棉花學報，2003，15(3)166～167；溫小杰等，分子植物育種，2004，2(1)147～150)，酚SDS法(夏蘭芹等，棉花學報，2000，12(4)205～207)等。改良熱硼法結合了熱硼法的粗抽和RNA純化試劑盒的純化，從質量上保證了RNA以后的分子操作。但該方法抽提成本較高。蔣建雄等，李繼剛等，夏蘭芹等分別用改良的CTAB法、熱硼法和酚-SDS法來抽提棉花組織的總RNA，他們主要是通過多次高濃度的LiCl長時間或過夜的沉淀來提高RNA樣品的質量，因此整個抽提過程(時間)較長。由于抽提時間過長，將大大增加了RNA被降解的可能性。
硫氰酸胍-酚-氯仿的RNA抽提法在多種植物中廣泛應用，但蔣建雄，徐亞濃，夏蘭芹等多位學者在研究中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法在棉花中不能或不適合于RNA的抽提(蔣建雄等，棉花學報，2003，15(3)166～167；夏蘭芹等，棉花學報，2000，12(4)205～207)。王文鋒等針對棉花中次生物質(如多酚類)的生理生化特點提出了利用高pH值而非傳統(tǒng)的低pH值的來改良硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法以適應棉花組織。高pH值的應用對于棉花多酚的氧化有一定的效用，但抽提過程中DNA和RNA在高pH值的緩沖液同時存在，還需進一步去除DNA。
眾所周知，棉花中的多酚、多糖及次生代謝物的影響，相對于其它植物如水稻，油菜等作物，從富含多酚棉花在RNA抽提過程中會遇到較多的困難。這主要表現(xiàn)在多酚的氧化、多糖與核酸的共沉淀、次生代謝物及蛋白質的去除等幾個方面。多酚在細胞破裂后極易氧化并形成醌等衍生物，這些物質可以與核酸不可逆轉的結合并與核酸共沉淀或者被有機溶劑如氯仿和酚等抽提。這將大大影響RNA的質和量并對以后相關分子生物學操作形成障礙。由于未知因素的影響，在DNA和RNA抽提啟始階段不能利用苯酚來去除多糖和蛋白質。因此傳統(tǒng)硫氰酸胍-酚-氯仿抽提和純化法不能在棉花上有效應用。而單獨利用氯仿抽提得到的核糖核酸中含有較多的多糖和蛋白質，影響核糖核酸的質量。同時由于沒有利用酚的純化，利用所得到的核酸中同時會含有次生代謝物質，這可能是以后的分子操作如RNA的反轉錄效率低下的原因。由于這些客觀因素的限制，獲得高質量的核酸也就成了進行棉花分子生物學研究首要解決的問題。
現(xiàn)有的從棉花組織中抽提RNA的技術中普遍采用的硫氰酸胍--酚抽提--氯仿抽提順序不適合于棉花組織RNA的抽提，采用現(xiàn)有技術，在酚抽提過程中RNA容易流失，不能滿足棉花的分子生物學研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，建立一種新的從棉花組織中抽提高質量RNA的方法，該方法采用硫氰酸胍--氯仿抽提，樣品沉淀并溶解后再用酚純化，以獲取棉花組織高質量的RNA樣品。本發(fā)明的方法快速、經濟，適用于棉花分子生物學操作。利用本方法可以同時在裂解液中長期保存組織樣品，并較好地保證RNA樣品不被降解。
本發(fā)明人經過大量的研究對比和實驗，研制出滿足本發(fā)明目的的一種從棉花組織中抽提RNA的方法。它包括下述步驟(1)勻漿取1重量份的棉花組織，用清水洗凈后或直接于液氮或玻璃勻漿器中研磨成粉，組織材料以體積/重量計按比例1∶5-15與預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.0-6.5)混合并加入0-0.2份的β-巰基乙醇和0.8-1.2份體積的醋酸鈉(pH 5.0-5.2)上下顛倒以混勻，放置冰上，得到樣品混合液；(2)將步驟(1)得到的樣品混合液中加入等體積的氯仿，上下顛倒使混勻成一相，冰上放置10-15分鐘后于4℃離心15分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的上清液，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇，上下顛倒混勻，在-20℃中放置0.5-1小時來沉淀RNA，4℃離心15分鐘得到沉淀物；(4)用1-5體積份的RNA抽提緩沖液(pH6.0-6.5)將步驟(3)所得沉淀物徹底溶解，再加入1-5體積份的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴10-15分鐘，4℃離心15分鐘，回收上清液；(5)在步驟(4)的上清液中加入1-5體積份氯仿溶液，混勻并冰浴10-15分鐘，4℃離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.0-5.2)和2.5-3倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5-1小時來沉淀RNA，4℃離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗步驟(6)的沉淀2-3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
其中所述的RNA抽提緩沖液是用472.64克的硫氰酸胍，7.352克的檸檬酸鈉，5-10克的十二烷基肌氨酸鈉，0.5-20克聚乙烯吡咯烷酮4000(PVP4000)加水至950毫升，調pH6.0-6.5后加水定容到一升抽提得到的；所述的醋酸鈉溶液是用408克的醋酸鈉用水溶解，用冰醋酸調pH 5.0-5.2并加水定容到一升，經高壓滅菌后抽提得到；所述的離心為9000×g-12000×g；所述的氯仿溶液為24體積份的氯仿和1體積份的異戊醇混合而成；所述的酸酚溶液(pH4.7-5.2)為1體積份的水飽和酚(pH4.7-5.2)和1體積份的上述氯仿溶液混合而成；
所述的75％的乙醇是由3份的無水乙醇和1份的水混合而成；所述的水為用0.1％的DEPC處理并經高壓滅菌的純水。
優(yōu)選地，所用的棉花組織材料是新鮮的，健康的，對于根組織則應先用清水洗凈。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對傳統(tǒng)的硫氰酸胍-酚-氯仿RNA抽提法作1了許多改進工作在RNA抽提緩沖液中加入了聚乙烯吡咯烷酮4000，并可根據(jù)材料中多酚的含量適當調整其用量，并且還利用了β-巰基乙醇有效防止了多酚的氧化。
在組織樣品與RNA抽提緩沖液混合后可以在超低溫冰箱長時間保存并保證了RNA的完整性，解決了RNA只能利用新鮮組織的限制。
在利用氯仿溶液對樣品混合液進行了第一次的抽提后利用異丙醇進行了一次RNA粗抽物的沉淀，一方面有效減少了后續(xù)操作中溶液的體積，同時通過氯仿的抽提減少了溶液中次生代謝物質的含量。
與傳統(tǒng)的硫氰酸胍-酚-氯仿不同，本發(fā)明創(chuàng)新之處在于先用氯仿抽提，再用異丙醇沉淀得到粗提物RNA后再利用酸酚和氯仿抽提來純化，最后用乙醇沉淀還有效減少了多糖的共沉淀，提高了RNA的質量。
本發(fā)明對于棉花的不同組織都適用。已經利用本發(fā)明從棉花的葉片(例如子葉，真葉)，根，愈傷組織，花(花瓣或花蕾)，下胚軸，纖維等不同組織中成功抽提出高質量的RNA。
本發(fā)明經濟，高效。本發(fā)明所使用的藥品大都為普通的生化試劑，價格低廉，沒有利用試劑盒或昂貴的藥品。從時間上來看，沒有過夜沉淀或長時間處理，一般一個工作日內即可完成全部實驗。


圖1海島棉幼苗接種黃萎病菌后從根部抽提的總RNA在非變性的瓊脂糖膠上的電泳(1X TAE，1.5％)圖2棉花不同組織來源的總RNA在變性的瓊脂糖膠上的電泳(1x MOPS，1.5％)。圖中的組織來源分別為1-6為根，7-8為下胚軸，9-12為真葉。
圖3棉花根部總cDNA的電泳圖。1為總cDNA，M為分子量標準(#SM0321，MBI)。
圖4根部全長cDNA文庫部分克隆的插入片段電泳。圖中1到32為不同的克隆cDNA插入片段，M為分子量標準(#SM0321，MBI)。
圖5棉花抗病相關基因基因(AY560551)的RT-PCR和基因組PCR檢測。樣品1-10為cDNA模板，樣品11為基因組DNA模板；M為分子量標準(#SM0321，MBI)。
圖6棉花線蟲誘導表達基因MIC-3受黃萎病誘導表達的northern blotting結果。1為棉花未接種病源對照；2-9分別為棉花接種黃萎病后1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時時的表達情況。
具體實施例方式
實施例1利用棉花根抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花根2克，用清水洗凈后用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉移至離心管中，并加入20毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.0)(含0.5％PVP4000)和200微升β-巰基乙醇，上下顛倒以混合均勻，加入2毫升的醋酸鈉，混合均勻；
(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(3)取上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置30分鐘，4℃，10000×g離心15分鐘；(4)棄去上清液，將沉淀用3mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入3毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入3毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.0)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5小時來沉淀RNA，4℃，10000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌2次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
歡迎用本實施例，得到棉花RNA樣品總量為820微克，產率為410微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.85，滿足分子生物學實驗需要。
實施例2利用棉花真葉抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花真葉1克，用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉移至離心管中，并加入15毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.5)(含2％PVP4000)和200微升β-巰基乙醇，上下顛倒以混合均勻，加入1毫升的醋酸鈉，混合均勻；(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置1小時，4℃，12000×g離心15分鐘，回收沉淀；(4)棄去上清液，將沉淀用5mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入5毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入5毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH5.2)和3倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5小時來沉淀RNA，4℃12000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例得到棉花RNA樣品總量為730微克，產率為730微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.74，滿足分子生物學實驗需要。
實施例3從棉花愈傷組織中抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花愈傷0.3克放入玻璃勻漿器，并加入3毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.3)(含0.5％PVP4000)，將其研磨，加入0.24毫升的醋酸鈉，混合均勻，倒入離心管中；
(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置10分鐘，4℃，12000×g離心10分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置0.5小時，4℃，10000×g離心10分鐘，回收沉淀；(4)棄去上清液，將沉淀用0.5mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入0.5毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴10分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入0.5毫升氯仿溶液，混勻并冰浴10分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.0)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置1小時來沉淀RNA，4℃10000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌2次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例得到棉花RNA樣品總量為338微克，產率為1014微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.92，滿足分子生物學實驗需要。
實施例4從棉花花中抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花花瓣0.8克，用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉移至離心管中，并加入12毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.4)(含2％PVP4000)，加160微升β-巰基乙醇，上下顛倒以混合均勻，加入0.9毫升的醋酸鈉，混合均勻；(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心10分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置0.5小時，4℃，10000×g離心15分鐘，回收沉淀；(4)棄去上清液，將沉淀用6mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入6毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入6毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.2)和3倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置1小時來沉淀RNA，4℃10000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例得到棉花RNA樣品總量為435微克，產率為544微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，A260/280＝1.83，滿足分子生物學實驗需要。
實施例5從棉花的下胚軸中抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花下胚軸0.2克，放入玻璃勻漿器，并加入3毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.5)(含1％PVP4000)和40微升β-巰基乙醇，將其研磨，加入0.2毫升的醋酸鈉，混合均勻，倒入離心管中；
(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)得到的上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置0.5小時，4℃，12000×g離心15分鐘，回收沉淀；(4)棄去步驟(3)剩余的上清液，將沉淀用0.6mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入0.6毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用步驟(4)的得到的上清液中加入0.6毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(7)用步驟(5)得到的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.0)和3倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5小時來沉淀RNA，4℃10000×g離心15分鐘得到沉淀物；7用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例，得到棉花RNA樣品總量為95微克，產率為475微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.78，滿足分子生物學實驗需要。
實施例6從新鮮棉纖維中抽提RNA樣品(1)從新鮮的棉鈴中剝取受粉后10天的棉花纖維0.2克，放入玻璃勻漿器，并加入3毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.4)(含1％PVP4000)和30微升β-巰基乙醇，將其研磨，加入0.2毫升的醋酸鈉，混合均勻，倒入離心管中；(2)加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，同收上清液；(3)取步驟(2)的上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置0.5小時，4℃，12000×g離心15分鐘，回收沉淀；(4)棄去上清液，將沉淀用0.6mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入0.6毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入0.6毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.1)和2.5倍體積的無水乙醇混勻，在-20℃中放置0.5小時來沉淀RNA，4℃10000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例，得到RNA總量為96微克，產率為480微克/克質量檢測RNA保持完整，A260/280＝1.88，滿足分子生物學實驗需要。
實施例7從棉花幼苗中抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花幼苗整株3克，用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉移至離心管中，并加入45毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.2)(含2％PVP4000)和600微升β-巰基乙醇，上下顛倒以混合均勻，加入4.5毫升的醋酸鈉，混合均勻；(2)將步驟(1)中的混合液平分為兩等份，每份放于一新管中，每管中加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的兩管上清液到兩新管中，分別加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置1小時，4℃，12000×g離心15分鐘，回收沉淀；(4)棄去上清液，將每管沉淀用7.5mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，將兩管溶液合并為一管，加入15毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入15毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置1小時來沉淀RNA，4℃12000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例，得到棉花根RNA總量為1650微克，產率為550微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.77，滿足分子生物學實驗需要。
實施例8從長期保存在裂解液中棉花根中抽提RNA樣品(1)取新鮮的棉花根1克，用清水洗凈后用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉移至離心管中，并加入10毫升預冷的RNA抽提緩沖液(pH6.5)和200微升β-巰基乙醇，上下顛倒以混合均勻，將其用液氮快速冷凍后放入-73℃冰箱中保存15天；(2)將冷凍的材料混和液放于冰上融化，加入1毫升醋酸鈉，加入等體積的氯仿溶液，上下顛倒混勻使其成為均勻的一相，于冰上放置15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(3)取上清液到新管中，加入等體積的冷凍(-20℃)異丙醇來沉淀RNA，于-20℃冰箱中放置30分鐘，4℃，10000×g離心15分鐘；(4)棄去上清液，將沉淀用2mlRNA抽提緩沖液徹底溶解，再加入2毫升的酸酚溶液(pH 4.7-5.2)，上下顛倒混勻，冰浴15分鐘，4℃，12000×g離心15分鐘，回收上清液；(5)用在步驟(4)的上清液中加入2毫升氯仿溶液，混勻并冰浴15分鐘，4℃12000×g離心15分鐘，回收上清液；(6)在步驟(5)的上清液中加入上清液中加入1/10體積的醋酸鈉(pH 5.0)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5小時來沉淀RNA，4℃，10000×g離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇洗對步驟(6)的沉淀洗滌2次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，這樣得到本發(fā)明的純RNA。
應用本實施例，得到RNA總量為370微克，產率為370微克/克質量檢測RNA經電泳檢測保持完整，其A260/280＝1.82，滿足分子生物學實驗需要。
權利要求
1.一種從棉花組織抽提RNA的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將1重量份的棉花組織，用清水洗凈后或直接于液氮或玻璃勻漿器中研磨成粉，組織材料以體積/重量計按比例1∶5-15與預冷的RNA抽提緩沖液混合并加入0-0.2份的β-巰基乙醇和0.8-1.2份體積的醋酸鈉上下顛倒以混勻，放置冰上，得到樣品混合液；(2)將步驟(1)得到的混合液中加入等體積的氯仿，上下顛倒使混勻成一相，冰上放置10-15分鐘后于4℃離心15分鐘，回收上清液；(3)取步驟(2)的上清液，加入等體積的經-20℃的異丙醇，上下顛倒混勻，在-20℃中放置0.5-1小時來沉淀RNA，4℃離心15分鐘得到沉淀物；(4)用1-5體積份的RNA抽提緩沖液將步驟(3)所得沉淀物徹底溶解，再加入1-5體積份的酸酚溶液，上下顛倒混勻，冰浴10-15分鐘，4℃離心15分鐘，回收上清液；(5)在步驟(4)的上清液中加入1-5體積份氯仿溶液，混勻并冰浴10-15分鐘，4℃離心15分鐘，回收上清；(6)在步驟(5)的上清中加入1/10體積的醋酸鈉和2.5-3倍體積的無水乙醇，混勻，在-20℃中放置0.5-1小時來沉淀RNA，4℃離心15分鐘得到沉淀物；(7)用75％的乙醇溶液洗步驟(6)的沉淀物2-3次，然后于室溫放置5-10分鐘使其干燥，得到純RNA；其中所述的RNA抽提緩沖液是用472.64克的硫氰酸胍，7.352克的檸檬酸鈉，5-10克的十二烷基肌氨酸鈉，0.5-20克聚乙烯吡咯烷酮4000(PVP4000)加水至950毫升，用冰醋酸調pH6.0-6.5后加水定容到一升制備得到的；所述的醋酸鈉溶液是用408克的醋酸鈉用水溶解，用冰醋酸調pH到5.0-5.2并加水定容到一升，經高壓滅菌后制備得到；所述的離心為9000×g-12000×g；所述的氯仿溶液為24體積份的氯仿和1體積份的異戊醇混合而成；所述的酸酚溶液為1體積份的水飽和酚(pH4.7-5.2)和1體積份的上述氯仿溶液混合而成；所述的75％的乙醇是由3份的無水乙醇和1份的水混合而成；所述的水為用0.1％的DEPC處理并經高壓滅菌的純水。
2.根據(jù)權利要求1所述的從棉花組織中抽提RNA的方法，其特征在于，其中的棉花組織選自棉花的根、下胚軸，葉片、幼苗、花、愈傷組織和纖維。
3.權利要求1所述的從棉花組織中抽提RNA的方法在棉花分子生物學上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于棉花分子生物學中RNA抽提技術領域。公開了一種新的利用硫氰酸胍－氯仿抽提，酚純化棉花RNA的抽提方法。針對棉花的酚類、多糖類等和次生代謝物質對抽提純化高質量RNA樣品的影響，制備了新的裂解液和抽提工藝。利用高濃度的硫氰酸胍裂解細胞同時抑制細胞內源核酸酶的活性.該裂解液中含有聚乙烯吡咯烷酮4000和β－巰基乙醇，用于抑制棉花中多酚類物質的氧化。利用氯仿抽提以除去部分多糖，多酚和蛋白質。將粗提物用裂解液溶解后利用水飽和酚以更有效地去除多糖和蛋白質。本發(fā)明具有經濟、快速、穩(wěn)定的特點，抽提的RNA樣品質量較高。
文檔編號C07H1/08GK1727357SQ20041006063
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月27日 優(yōu)先權日2004年7月27日
發(fā)明者張獻龍, 朱龍付, 涂禮莉, 聶以春, 郭小平, 曾范昌, 劉迪秋 申請人:華中農業(yè)大學