專利名稱：D－熒光素化學(xué)合成方法及裝置的制作方法
專利說明D-熒光素化學(xué)合成方法及裝置 本發(fā)明屬化學(xué)合成領(lǐng)域，涉及D-熒光素的化學(xué)合成方法和反應(yīng)裝置。D-熒光素是依賴ATP的生物發(fā)光反應(yīng)的底物，生物發(fā)光的原理是螢光素酶在Mg2++、O2和ATP存在的條件下，催化D-熒光素形成氧化型熒光素，在反應(yīng)過程中發(fā)出光子的一個(gè)酶反應(yīng)過程，反應(yīng)式表示為
因反應(yīng)中的ATP是所有生物的能量來源，在一定條件下，發(fā)出光的強(qiáng)度與反應(yīng)系統(tǒng)中的ATP量成正比，因此生物發(fā)光法可廣泛應(yīng)用于生物材料的檢測(cè)，如法醫(yī)學(xué)中超微量的定量檢測(cè)和衛(wèi)生檢測(cè)中的衛(wèi)生狀況評(píng)估和微生物數(shù)量的快速檢測(cè)，另外由于熒光素酶基因作為一個(gè)報(bào)告基因，在分子生物學(xué)上有廣泛的應(yīng)用，因此，熒光素酶-熒光素生物發(fā)光的應(yīng)用具有很大的市場(chǎng)，D-熒光素作為一種生物發(fā)光反應(yīng)的底物，隨著生物發(fā)光方法應(yīng)用的增加，其需求量越來越大。因D-熒光素是一種立體異構(gòu)體，在一些溶劑中容易氧化解旋并見光分解，國(guó)際國(guó)內(nèi)產(chǎn)品不僅價(jià)格高，而且貨期長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品含量低，發(fā)光系數(shù)不高。
D-熒光素的化學(xué)合成最初由White等人于1963年用茴香胺(ρ-anisidine)通過八步法合成，總得率為5.8％。1963年Seto亦用茴香胺(ρ-anisidine)通過五步法合成了D-熒光素，總得率為6.5％。后來White等人從2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑通過四步法合成了D-熒光素，得率達(dá)到13.9％，這種方法于1978年被Seto等人證明為一種很方便的并可大規(guī)模制備D-熒光素的方法，其得率基本保持了小試的水平，此法必須先制備一種羧基試劑，實(shí)際上總共為五步。1992年，日本的Yoshiaki Toya等人從2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑通過三步法合成了D-熒光素，總得率達(dá)到36％，1993年，日本的Nobutaka Suzuki等人從2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑通過PEG助溶的四步法合成D-熒光素，總得率為49％。
在文獻(xiàn)資料中，關(guān)于D-熒光素的化學(xué)合成途徑較新的方法都是以2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑?yàn)樵?，在氰基化脫甲基化后通過與D-半胱氨酸進(jìn)行縮合而成，關(guān)于氰化反應(yīng)，YoshiakiToya等人的合成方法中，用無水氯化亞銅和isoAmNO(亞硝化異戊酯)來合成一種亞硝酰復(fù)合物(CuCl2.NO)，此物質(zhì)為乙腈(CH3CN)-聚乙二醇(PEG)200復(fù)合物中的2-氨基苯并噻唑的Sandmyer反應(yīng)服務(wù)。2-氨基苯并噻唑在乙腈溶液中不完全溶解，PEG的加入可使其完全溶解。乙腈(CH3CN)-聚乙二醇(PEG)200得到了最好的結(jié)果，當(dāng)用CuBr2代替CuCl2時(shí)，溴化反應(yīng)溫度(110℃)比氯化反應(yīng)時(shí)(140℃)低，氯化-氰化反應(yīng)的單步最高得率為79％，而溴化-氰化反應(yīng)的單步最高得率為70％。
對(duì)于脫甲基反應(yīng)，可用鹽酸吡啶法進(jìn)行，最初的方法是向吡啶溶液中通入新制的鹽酸氣體，并加入2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑進(jìn)行，而相對(duì)較新的方法是2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑與鹽酸吡啶在高溫(200℃)通氮?dú)獾拿芊夤苤蟹磻?yīng)45min進(jìn)行。
上述制備D-熒光素的反應(yīng)途徑復(fù)雜，要求反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)設(shè)備要求高，且難以控制，D-熒光素的總得率不高。針對(duì)目前制備D-熒光素的反應(yīng)所存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、在中等規(guī)模的條件下可高得率地合成D-熒光素的方法及反應(yīng)裝置。
本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)在較為簡(jiǎn)便的條件下高效合成D-熒光素，且發(fā)光系數(shù)高于國(guó)內(nèi)產(chǎn)品，達(dá)到Sigma公司L-9504熒光素產(chǎn)品的水平，而價(jià)格大大低于Sigma公司的熒光素產(chǎn)品。
本發(fā)明按以下步驟進(jìn)行1.D-熒光素化學(xué)合成的簡(jiǎn)便反應(yīng)裝置本反應(yīng)裝置包括一置于一高溫油浴加熱裝置上的三口燒瓶，三口燒瓶一側(cè)邊開口接有抽真空和通氮?dú)獾墓艿?，另一?cè)邊開口密封，中間開口接一冷凝管，冷凝管的廢氣出口連接有一廢氣吸收器。
2.D-熒光素的合成方法將2-氰基-6-甲基苯并噻唑(2-Cyano-6-methoxybenzothiazoe)(C9H6N2OS，F(xiàn)W＝190.2)(99％)和鹽酸吡啶(Pyridine hydrochloride)(98％)在高溫下反應(yīng)脫甲基后，通過提取和柱層析純化后，再與水合D-半胱氨酸(D-Cystine.HCl.H2O)在堿性混合溶劑中縮合成D-熒光素(C11H8N2O3S2，F(xiàn)W＝280.3)，酸化提取后，通過離心真空干燥即可合成可用的D-熒光素，總得率達(dá)到40％以上。
具體步驟如下2.1脫甲基反應(yīng)D-熒光素的反應(yīng)原材料為2-氰基-6甲氧基苯并噻唑(99％，NEW JERSEY，USA1-800-ACROS-01)鹽酸吡啶(98％，ACROS ORGANICS)，反應(yīng)比例為2-氰基-6甲氧基苯并噻唑∶鹽酸吡啶＝1∶(1～3)，反應(yīng)溫度為180～250℃，環(huán)境為抽真空通氮?dú)?，反?yīng)時(shí)間為0.5～3h。
2.2脫甲基目標(biāo)產(chǎn)物的提取脫甲基反應(yīng)后的產(chǎn)物用1∶(1～3)的乙酸乙酯和冰水洗滌反應(yīng)后混合物三次，每次的用量約為反應(yīng)原材料的50～100倍。通過萃取有機(jī)層后用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮干燥。
2.3脫甲基產(chǎn)物的純化脫甲基后的目標(biāo)產(chǎn)物純化是用80～400目的粗孔硅膠進(jìn)行柱層析，層析柱最好用帶三通的可加壓式層析純化柱。用5∶(1～3)氯仿/乙酸乙酯做洗脫溶劑，對(duì)直徑為25mm高為250mm的層析柱，洗脫流速為1～10ml/min，通過HTLC(高效薄層層析)檢測(cè)，收集目標(biāo)產(chǎn)物純度較高的部份，合并之后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮干燥。
2.4純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸水合物在堿性混合溶劑中于室溫下避光反應(yīng)10～30min，用鹽酸調(diào)pH至1～6，通過1000～15000r/min室溫條件下離心10～20min.收集沉淀，并將此沉淀在真空條件下干燥，即可得純度為40～60％的D-熒光素產(chǎn)品。
2.5合成的D-熒光素產(chǎn)品的成份分析用氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行成份分析。
2.6合成的D-熒光素產(chǎn)品的發(fā)光分析用50mmol/L，pH為7.8的甘氨酰甘氨酸緩沖液配成0.5mg/mL的溶液，并抽真空通氮?dú)夂?，避光條件下-20℃低溫保存，用時(shí)解凍后在發(fā)光系統(tǒng)中加入60μL0.5mg/mL的熒光素溶液，立即置于生物發(fā)光儀中檢測(cè)發(fā)光值。實(shí)施例1關(guān)于D-熒光素的簡(jiǎn)便合成裝置本反應(yīng)裝置由一個(gè)可在較大范圍內(nèi)較為精確調(diào)節(jié)(0～300℃)的溫控裝置和高溫油浴加溫系統(tǒng)、抽真空通氮?dú)鈿怏w調(diào)節(jié)系統(tǒng)和帶冷凝管4和廢氣吸收裝置的三口燒瓶2反應(yīng)系統(tǒng)組成。整個(gè)反應(yīng)裝置除氮?dú)夤?yīng)瓶、抽真空裝置和溫度調(diào)控裝置外，其余均置于通風(fēng)櫥中。
如

圖1所示，其中的高溫油浴系統(tǒng)，可用在可調(diào)電爐1(500W)上用不銹鋼鍋6盛蓖麻油(約2000mL)，通過溫度傳感器3來精細(xì)調(diào)節(jié)溫度；用三口燒瓶2(500mL)的左邊開口進(jìn)行抽真空通氮?dú)猓虚g開口用來加樣和冷卻循環(huán)，右邊開口用來取樣檢測(cè)(孔C檢測(cè))；冷卻循環(huán)用一般的水冷凝管4即可，廢氣吸收可用干燥的氯化鈣5來進(jìn)行。
實(shí)施例2關(guān)于D-熒光素的合成方法1.脫甲基反應(yīng)稱取940mg 2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(2-Cyano-6-methoxybenzothiazoe)(99％)和1000～3060mg鹽酸吡啶(Pyridine hydrochloride)(98％)放入小試管中，抽真空通氮?dú)夂蠓湃肟烧{(diào)溫的高溫油浴反應(yīng)瓶中，在190～220℃保溫1～3小時(shí)后，停止加溫終止反應(yīng)，待冷卻后進(jìn)行脫甲基目標(biāo)產(chǎn)物的提取。
2.脫甲基目標(biāo)產(chǎn)物的提取用200mL～400mL冰水加入上述反應(yīng)管中，并加入100mL～200mL乙酸乙酯，振勻之后，用分液漏斗萃取有機(jī)層，水層再用100mL～200mL乙酸乙酯進(jìn)行兩次提取，用200mL～400mL冰水洗滌有機(jī)層一次，合并有機(jī)層后，通過旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀干燥得1480mg黃紅色物質(zhì)。
3.脫甲基產(chǎn)物的純化在直徑為20mm高為350mm的有機(jī)可加壓層析柱中加入80～120目的粗孔硅膠，制成純化用層析柱，將上述干燥后的黃紅色脫甲基產(chǎn)物(810mg)混合少量硅膠置于層析柱的頂端，用氯仿∶乙酸乙酯為5∶1～3的混合溶劑作為洗脫溶劑，在流速為2.5ml/min的條件下收集50管，每管10mL，真空濃縮并用薄層層析法(簡(jiǎn)稱TLC)檢測(cè)，合并第9～14管得淡黃色物質(zhì)380mg，在TLC板上呈單一斑點(diǎn)，合并其它管得黃色物質(zhì)409mg，在TLC板上為兩個(gè)斑點(diǎn)，兩者共789mg，回收率達(dá)97.4％。
4.純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)稱取(100～160)mg D-Cystine.HCl.H2O(C3H7NO2S.HCl，F(xiàn)W＝175.6)和100mg上述柱層析純化后脫甲基產(chǎn)物，抽真空通氮?dú)夂螅?.5mL～4mL堿性乙醇溶劑(亦須抽真空通氮?dú)?在室溫下避光反應(yīng)10～60min，用鹽酸調(diào)pH至1～6，通過10000r/min室溫條件下離心10min.收集沉淀，并將此沉淀在避光的真空條件下干燥，即可得154.6mg D-熒光素產(chǎn)品，得率為103.6％。
5.合成的D-熒光素產(chǎn)品的成份分析將合成的D-熒光素產(chǎn)品(1#和2#)和Sigma L9504D-熒光素和上海熒光素樣品進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用成份分析，其結(jié)果如下表1合成的D-熒光素產(chǎn)品氣質(zhì)聯(lián)用分析
注R.T表示物質(zhì)的保留時(shí)間，M表示物分子量，236+44表示分子量為280的物質(zhì)，D-熒光素的分子量為280.2。
結(jié)果表明合成熒光素中M為236+44組份的物質(zhì)比SigmaL9504更多，而上海熒光素測(cè)不出M為236+44組份的物質(zhì)。
6.合成的D-熒光素產(chǎn)品的發(fā)光分析將SigmaL9504D-熒光素、上海產(chǎn)熒光素和自合成的D-熒光素(1#和2#)，用50mmol/LGB(甘氨酰甘氨酸緩沖液)配成0.5mg/mL的溶液，并抽真空通氮?dú)夂?，避光條件下-20℃低溫保存，在發(fā)光系統(tǒng)中加入60μl熒光素溶液，并于生物發(fā)光儀中檢測(cè)發(fā)光值，其結(jié)果見表2。
表2合成D-熒光素鈉發(fā)光活力測(cè)定
注表中數(shù)據(jù)為*1#為于-20℃放置2天的1#，再和新配的Sigma L9504 D-熒光素同時(shí)測(cè)量的發(fā)光值。
結(jié)果表明自合成的D-熒光素鈉的發(fā)光活力比上海產(chǎn)熒光素鈉發(fā)光比活力強(qiáng)許多，和Sigma L9504 D-熒光素相比，比活力更好一些或至少不低于Sigma L9504 D-熒光素。
實(shí)施例3關(guān)于D-熒光素的合成方法1.甲基反應(yīng)(2002，6/17)稱取949mg 2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(2-Cyano-6-methoxybenzothiazoe)(99％)和1000mg鹽酸吡啶(Pyridine hydrochloride)(98％)放入小試管中，抽真空通氮?dú)夂蠓湃肟烧{(diào)溫的高溫油浴反應(yīng)瓶中，在200℃保溫1小時(shí)后，停止加溫終止反應(yīng)，待冷卻后進(jìn)行脫甲基目標(biāo)產(chǎn)物的提取。
2.甲基目標(biāo)產(chǎn)物的提取用200mL冰水加入上述反應(yīng)管中，并加入100mL乙酸乙酯，振勻之后，用分液漏斗萃取有機(jī)層，水層再用100mL乙酸乙酯進(jìn)行兩次提取，用200mL冰水洗滌有機(jī)層一次，合并有機(jī)層后，通過旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀干燥得776mg黃紅色物質(zhì)。
3.脫甲基產(chǎn)物的純化在直徑為25mm高為25cm的有機(jī)可加壓層析柱中加入200～300目的粗孔硅膠，制成純化用層析柱，將上述干燥后的黃紅色脫甲基產(chǎn)物(739mg)混合少量硅膠置于層析柱的頂端，用氯仿∶乙酸乙酯為5∶1的混合溶劑作為洗脫溶劑，在流速為1.0ml/min的條件下收集30管，每管10mL，真空濃縮并用薄層層析法(簡(jiǎn)稱TLC)檢測(cè)，合并第13-14管得淡黃色物質(zhì)199mg，在TLC板上呈單一斑點(diǎn)，第1 5～22管物質(zhì)干燥后得497 mg，兩者共696mg，回收率達(dá)94.2％。
4.純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)及提取稱取100mg D-Cystine.HCl.H2O和120mg上述柱層析純化后脫甲基產(chǎn)物，抽真空通氮?dú)夂?，?.0mL堿性甲醇溶劑(亦須抽真空通氮?dú)?在室溫下避光反應(yīng)10min，用鹽酸調(diào)pH至1.0，通過10000r/min室溫條件下離心10min.收集沉淀，并將此沉淀在避光的真空條件下干燥，即可得165.7mgD-熒光素產(chǎn)品，實(shí)際得率為理論值的104.1％(簡(jiǎn)稱3#)。
5.合成的D-熒光素產(chǎn)品的數(shù)據(jù)分析將Sigma L9504D-熒光素、上海產(chǎn)熒光素和合成的)熒光素，用50mmol/LGB(甘氨酰甘氨酸緩沖液)配成0.5mg/mL的溶液，并抽真空通氮?dú)夂螅芄鈼l件下-20℃低溫保存，在發(fā)光系統(tǒng)中加入60μl熒光素溶液，并于生物發(fā)光儀中檢測(cè)發(fā)光值，另外將Sigma L9504D-熒光素、上海產(chǎn)熒光素和合成的D-熒光素取樣進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用成份分析其結(jié)果見表3。
表3合成D-熒光素發(fā)光活力測(cè)定
注R.T表示物質(zhì)的保留時(shí)間，M表示物分子量，280和236(+44)表示分子量為280或可能為280的物質(zhì)(因在高溫下，280的物質(zhì)能變成236的物質(zhì)，同時(shí)放出分子量為44(CO2)的物質(zhì))，兩者均可為D-熒光素。
結(jié)果表明自合成的D-熒光素的發(fā)光活力比上海產(chǎn)熒光素發(fā)光比活力強(qiáng)許多，和SigmaL9504 D-熒光素相比，發(fā)光比活力更好一些或稍低于Sigma L9504 D-熒光素的發(fā)光活力，這與反應(yīng)和提取條件有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于首先它由2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和鹽酸吡啶進(jìn)行高溫脫甲基反應(yīng)，然后提取脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化，最后將純化的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)后即可獲得D-熒光素產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1所述的D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于脫甲基反應(yīng)的比例為2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑∶鹽酸吡啶＝1∶(1～3)，反應(yīng)條件是抽真空通入氮?dú)猓磻?yīng)溫度為180～250℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3h。
3.權(quán)利要求1或2所述的D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物的提取、純化過程為(1)用乙酸乙酯和冰水加入脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物，振勻后萃取有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層最后再用冰水洗滌有機(jī)層，有機(jī)層物質(zhì)通過旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀干燥得黃紅色物質(zhì)；(2)用80～400目粗孔硅膠制成純化用層析柱，用5∶(1～3)的氯仿∶乙酸乙酯作洗脫溶劑，收集洗脫液，用薄層層析法檢測(cè)，收集目標(biāo)產(chǎn)物純度較高的部分，合并之后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮干燥。
4.權(quán)利要求3所述的D-熒光素化學(xué)合成方法，其特征在于脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物的提取過程所采用的乙酸乙酯和冰水的比例為1∶(1～3)，每次的用量為反應(yīng)材料的50～100倍；(2)層析柱用帶三通的可加壓式層析柱，流速為1～5ml/min。
5.權(quán)利要求1或2所述的D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)為將純化后的脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物與D-半胱氨酸水合物在堿性乙醇溶劑中抽真空通入氮?dú)鈼l件下于室溫下避光反應(yīng)10～30min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～6，在1000～15000r/min下高速離心10～20min，收集沉淀，避光真空干燥。
6.權(quán)利要求3所述的D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)為將純化后的脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物與D-半胱氨酸水合物在堿性乙醇溶劑中抽真空通入氮?dú)鈼l件下于室溫下避光反應(yīng)10～30min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～6，在1000～15000r/min下高速離心10～20min，收集沉淀，避光真空干燥。
7.權(quán)利要求4所述的D-熒光素化學(xué)合成的方法，其特征在于純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸的縮合反應(yīng)為將純化后的脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物與D-半胱氨酸水合物在堿性乙醇溶劑中抽真空通入氮?dú)鈼l件下于室溫下避光反應(yīng)10～30min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～6，在1000～15000r/min下高速離心10～20min，收集沉淀，避光真空干燥。
8.一種完成權(quán)利要求1所述的D-熒光素化學(xué)合成的反應(yīng)裝置，其特征在于包括一置于高溫油浴加熱裝置上的三口燒瓶(500mL)，三口燒瓶一側(cè)邊開口接有抽真空和通氮?dú)獾墓艿?，另一?cè)邊開口密封，中間開口接一冷凝管，冷凝管的廢氣出口連接有一廢氣吸收器。
9.權(quán)利要求8所述的D-熒光素化學(xué)合成的反應(yīng)裝置，其特征在于高溫油浴系統(tǒng)，可用在可調(diào)電爐(1)(500W)上用不銹鋼鍋(6)盛蓖麻油(約2000mL)，通過溫度傳感器(3)來精細(xì)調(diào)節(jié)溫度；用三口燒瓶(2)(500mL)的左邊開口進(jìn)行抽真空通氮?dú)猓虚g開口用來加樣和冷卻循環(huán)，右邊開口用來取樣檢測(cè)；冷卻循環(huán)用一般的水冷凝管(4)即可，廢氣吸收可用干燥的氯化鈣(5)來進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化學(xué)合成D－熒光素的方法及合成裝置，屬化學(xué)合成領(lǐng)域。本發(fā)明通過將高純度的2－氰基－6－甲氧基苯并噻唑和鹽酸吡啶進(jìn)行高溫脫甲基反應(yīng)，然后提取脫甲基反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)柱層析純化，最后將純化的脫甲基產(chǎn)物與D－半胱氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)后即可獲得D－熒光素產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)捷、在中等規(guī)模條件下可高得率地合成D－熒光素的方法及其反應(yīng)裝置，克服了目前D－熒光素反應(yīng)途徑復(fù)雜，反應(yīng)條件要求苛刻，反應(yīng)設(shè)備要求高，且難以控制的特點(diǎn)，D－熒光素的得率可以達(dá)到60％以上，純度達(dá)50％以上，發(fā)光系數(shù)高于國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品，達(dá)到Sigma L－9504產(chǎn)品的水平，但價(jià)格大大低于Sigma公司的D－熒光素產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07D311/00GK1754881SQ20041005170
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者吳慧清, 吳清平, 張菊梅, 郭偉鵬, 李程思 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司