專利名稱：重組人干擾素α1b的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含肽的醫(yī)藥配制品，特別是涉及蛋白質(zhì)的分離純化方法，尤其涉及重組人干擾素α1b的分離純化工藝。
背景技術(shù)：
干擾素具有廣泛的抗病毒活性，1957年Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了這種物質(zhì)用滅活的流感病毒作用于細(xì)胞后，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一種可溶性物質(zhì)，使得活病毒細(xì)胞的繁殖受到干擾，故稱之為干擾素(Interferon，簡寫IFN)。干擾素具有三大功能抑制病毒繁殖活性、抑制細(xì)胞分裂活性和抑制免疫調(diào)節(jié)活性。
干擾素是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)。根據(jù)抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同，分為α、β、γ、ω等型別。而在一特定的干擾素型別內(nèi)，再根據(jù)氨基酸序列或組成方面的差異，劃分出不同的亞型，比如HuIFN(人干擾素)α1、α2等。而在一特定的干擾素亞型內(nèi)，又會(huì)根據(jù)個(gè)別或少數(shù)氨基酸的變易，以a、b、c在亞型后面進(jìn)行標(biāo)記，比如HuIFNα1a，1b，2b等。
HuIFNα已經(jīng)可以通過基因重組和其他生物工程技術(shù)，進(jìn)行量產(chǎn)。而HuIFNα1b相對(duì)其他的諸如HuIFNα2來說，一個(gè)重要的區(qū)別在于，根據(jù)中國科學(xué)家多年的研究發(fā)現(xiàn)中國人白細(xì)胞經(jīng)病毒刺激后，誘生的所有干擾素中最主要的亞型是α1b。并且試驗(yàn)還證明，中國人使用干擾素后，產(chǎn)生中和抗體的幾率以α1b最低，所以α1b更符合中國人的自然狀態(tài)。目前在中國普遍采用的由本申請(qǐng)人，深圳科興生物工程股份有限公司生產(chǎn)的商品名稱為賽若金的HuIFNα1b是由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的候云德教授等于1982年首次利用新城疫病毒F株(NDV-F)刺激臍血白細(xì)胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，成功克隆了IFNα1b cDNA無性繁殖系，并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。
從干擾素的應(yīng)用現(xiàn)狀來看，HuIFNα型別應(yīng)用案例比較多，以HuIFNα1b為例，可用于治療病毒性疾病、惡性腫瘤、血液病等，尤其在慢性乙型、丙型病毒性肝炎的治療上，給藥途徑多采用肌肉注射，用藥量一般在100萬-600萬IU(國際單位)，有效率達(dá)到60％。通過國內(nèi)許多醫(yī)院的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，采用對(duì)HuIFNα1b超聲波霧化直接給藥，對(duì)病毒性上呼吸道感染、病毒性皰疹、病毒性咽喉炎以及慢性口腔潰瘍治療效果顯著。
在人α1b干擾素的生產(chǎn)過程中，工程菌經(jīng)過傳代培養(yǎng)和高密度發(fā)酵后，一道非常重要的工藝過程是蛋白質(zhì)的分離純化將人α1b干擾素從復(fù)雜的細(xì)菌表達(dá)環(huán)境中提取出來，去除各種雜質(zhì)，包括顆粒、細(xì)菌、內(nèi)毒素、核酸和各種雜蛋白等非目標(biāo)蛋白物，以達(dá)到政府藥監(jiān)當(dāng)局對(duì)該種生物制品要求的各項(xiàng)指標(biāo)，滿足臨床需要。
目前人α1b干擾素的分離純化主要步驟包括細(xì)菌破碎、初步純化和精制純化。因?yàn)樵谏鲜龅墓こ叹?，人?b干擾素為胞內(nèi)可溶表達(dá)，所以分離純化的第一步是破碎細(xì)菌，讓干擾素從胞內(nèi)釋放出來，才能進(jìn)行進(jìn)一步的純化。具體來說，初步純化包括如下步驟離心1→酸化→離心2→堿中和→鹽析1→離心3→鹽析2→離心4共9步工藝，包括4步離心和3步沉淀法1步鹽酸沉淀和2步(NH4)2SO4鹽析沉淀，以及Sephadex G-50脫鹽。精制純化則包括3步柱層析CM-Sepharose F.F離子交換層析、單克隆抗體親和層析、Sephacryl S-100分子篩?？梢钥闯觯麄€(gè)純化工藝相當(dāng)復(fù)雜，特別是初步純化部分，步驟繁多。
由于步驟繁多，工藝復(fù)雜，以及強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理就使得現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝存在以下問題由于在蛋白質(zhì)的純化過程中，每一步驟都會(huì)存在損失，從而必然導(dǎo)致總得率的降低；長時(shí)間的處理，導(dǎo)致生產(chǎn)效率的低下，再加上初步純化中大量敞口操作，還容易造成產(chǎn)品污染，影響產(chǎn)品質(zhì)量；步驟過多以及大量手工操作導(dǎo)致物料成本和人工成本過高，工藝經(jīng)濟(jì)性差。
另一方面，除了上述的蛋白沉淀和傳統(tǒng)柱層析等技術(shù)，擴(kuò)張床吸附技術(shù)開始應(yīng)用于蛋白純化處理。以Pharmacia的EBA系統(tǒng)(Expanded Bed Adsorption擴(kuò)張床吸附)為例，它采用了獨(dú)特的STREAMLINE凝膠及層析柱該凝膠是在普通瓊脂糖凝膠的基礎(chǔ)上結(jié)合了石英成分，從而增大了密度并且形成了一定的密度梯度；同時(shí)，設(shè)計(jì)了柱塞可自由升降又能保證密封的層析柱。這些獨(dú)特的設(shè)計(jì)使得STREAMLINE凝膠可在從下向上的平衡緩沖液的作用下形成穩(wěn)定的擴(kuò)張柱床，因此，可以將未經(jīng)澄清的帶雜質(zhì)的物料直接上樣，在上樣過程中，雜質(zhì)如細(xì)胞碎片從凝膠顆粒之間洗掉，而蛋白質(zhì)等生物分子則吸附在凝膠上。經(jīng)清洗后，再將凝膠沉降下來，從而洗脫目標(biāo)蛋白，達(dá)到純化的目的。
從擴(kuò)張床吸附原理可看出其優(yōu)勢(shì)在于可直接將未經(jīng)澄清帶雜質(zhì)的物料直接上樣，例如胞內(nèi)表達(dá)的基因工程產(chǎn)品在細(xì)胞破碎后可以不必通過離心或超濾去除細(xì)胞碎片就可以直接上樣，從而免除了離心或超濾的步驟。因此，擴(kuò)張床吸附一步就起到了澄清、濃縮和初步純化的作用。
是否能夠把擴(kuò)張床吸附技術(shù)應(yīng)用于干擾素的純化工藝？如何才能夠把擴(kuò)張床吸附技術(shù)應(yīng)用于干擾素的純化工藝，以達(dá)到簡化工藝過程，提高生產(chǎn)效率的目的？現(xiàn)有技術(shù)似乎并沒有這方面的考慮，也沒有給出相應(yīng)的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于避免上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提出一種能夠使生產(chǎn)效率提高，生產(chǎn)成本降低的干擾素純化工藝。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，提出一種重組人干擾素α1b的純化工藝，用于從具備人干擾素α1b表達(dá)的工程菌中提取重組人干擾素α1b，包括細(xì)菌破碎，以及目標(biāo)蛋白的捕獲、中間純化和精制過程，并且所述目標(biāo)蛋白的捕獲過程采用擴(kuò)張床吸附，中間純化過程采用親合層析，精制過程采用凝膠過濾。
所述細(xì)菌破碎是在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行；所述擴(kuò)張床吸附步驟中，選用陰離子凝膠，具體選用STREAMLINE DEAE；緩沖體系選用pH值為7.0-8.0，優(yōu)選值為7.4的Tris-HCl，并采用鹽濃度洗脫的方法；所述鹽濃度洗脫選用含0.2-0.5，優(yōu)選值為0.4MNaCl的pH7.450mM Tris-Hcl洗脫液一步洗脫。
所述親和層析步驟中，選用α1b干擾素的單克隆抗體偶聯(lián)的凝膠；平衡液采用PBS，洗脫液采用0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1MGly-HCl，再生液采用0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1M Tris-HCl和0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1MNaAc-HAc。
所述凝膠過濾步驟中，緩沖體系選用PBS；并選用Sephacryl凝膠。
與以蛋白沉淀為主的舊工藝比較，本發(fā)明中用擴(kuò)張床吸附改造后的純化新工藝具有明顯的優(yōu)勢(shì)。具體體現(xiàn)在工藝周期縮短40％，純化得率提高70％，生產(chǎn)成本降低40-50％等多方面。
同現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明重組人干擾素α1b的純化工藝，生產(chǎn)效率可以大大提高，生產(chǎn)成本則大大降低。


圖1為本發(fā)明重組人干擾素α1b的純化工藝所采用擴(kuò)張床吸附層析原理圖。
圖2-1至2-8為擴(kuò)張床吸附操作系統(tǒng)閥門及管道原理圖。
圖3為擴(kuò)張床吸附層析曲線。
圖4為STREAMLINE DEAE凝膠吸附量測(cè)定曲線。
圖5為擴(kuò)張床吸附層析理論塔板數(shù)測(cè)定曲線。
圖6為親和層析曲線。
圖7為凝膠過濾曲線。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳盡說明。
為什么要選用擴(kuò)張床吸附技術(shù)？對(duì)純化工藝的改進(jìn)首先在于純化策略和思路的變化。重組蛋白純化的傳統(tǒng)思路是將純化分為初步純化和高度純化兩部分，這種思路的出發(fā)點(diǎn)是從生產(chǎn)管理的角度來安排純化生產(chǎn)工作，其弊端在于，從工藝技術(shù)的角度，這種分割并不具有明確的含義，分界處在那里？哪個(gè)單元是初步純化，哪個(gè)單元是高度純化。初步和高度純化的概念很難用來確定一條工藝路線，從菌體開始逐步純化獲得符合各種要求的目標(biāo)蛋白。一種新的純化策略是從技術(shù)的角度出發(fā)，將重組蛋白從菌體到純品的純化工藝分成三部分目標(biāo)蛋白捕獲→中間純化→精制。它的思路是首先從復(fù)雜的初始物料中將目標(biāo)蛋白捕獲出來，不要求高的純度，而要求高回收率和大副減少處理體積，以及去除雜質(zhì)顆粒。第二步中間純化是提高純度的關(guān)鍵步驟，將無顆粒和大幅減少體積后的物料采用高效的純化手段，去除大部分雜質(zhì)，大幅度提高目標(biāo)蛋白純度。第三步精制是將可能存在的小量雜質(zhì)如聚體和異構(gòu)體，以及前期純化中可能帶入的新雜質(zhì)去除，以達(dá)到要求的純度。
基于捕獲→中間純化→精制的純化策略，和現(xiàn)有純化工藝存在的問題，我們發(fā)現(xiàn)重要的是將原來低效復(fù)雜的初步純化工藝以高效簡單的手段代替。我們選用了Pharmacia的EBA系統(tǒng)(Expanded Bed Adsorption擴(kuò)張床吸附)來進(jìn)行此項(xiàng)改進(jìn)。
自從1993年問世以來，擴(kuò)張床吸附已廣泛應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的研究開發(fā)和生產(chǎn)。無論是大腸桿菌、酵母菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，都有大量應(yīng)用的實(shí)例。1998年，日本綠十字公司更將大規(guī)模擴(kuò)張床吸附用于迄今為止最大的基因工程產(chǎn)品-重組白蛋白的生產(chǎn)，可見其應(yīng)用之廣泛。
采用EBA系統(tǒng)后，我們可以將干擾素的純化工藝簡化為細(xì)菌破碎→EBA→親和層析→分子篩在細(xì)菌破碎后，只需要三步柱層析即可完成干擾素的分離純化工作，獲得符合質(zhì)量要求的干擾素純品。整個(gè)純化工藝從原來的13步簡化為4步，其中，EBA1步代替了舊工藝中的10步離心1→酸化→離心2→堿中和→鹽析1→離心3→鹽析2→離心4→脫鹽→離子交換。整個(gè)純化工藝被大大簡化，生產(chǎn)效率得以提高。
與我們的純化策略相一致，三步柱層析分別對(duì)應(yīng)純化策略的三個(gè)階段。其中，EBA代替了離心、酸化、鹽析、脫鹽和離子交換的步驟，起到了樣品澄清、濃縮和初步純化的作用，將目標(biāo)干擾素有效捕獲，去除了細(xì)胞碎片等顆粒和部分雜蛋白、核酸，并且大大減少了物料體積。親和層析作為一種高效的純化手段，去除了大部分雜蛋白、核酸、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，并進(jìn)一步濃縮干擾素樣品。最后一步分子篩則起到精制作用，去除了干擾素殘存的少量雜蛋白、干擾素二聚體和可能從親和層析脫落的IgG，并且起到交換緩沖液的作用。
如何具體運(yùn)用擴(kuò)張床吸附技術(shù)？我們通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索，以確定有關(guān)的技術(shù)參數(shù)和指標(biāo)。
實(shí)施例1擴(kuò)張床吸附凝膠選擇和層析參數(shù)優(yōu)化
EBA的操作需要特殊的層析柱以產(chǎn)生穩(wěn)定的擴(kuò)張床。在工藝開發(fā)初期，首先采用裝填床的形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索。采用裝填床進(jìn)行凝膠選擇和參數(shù)優(yōu)化，是因?yàn)椋m然擴(kuò)張床的吸附效果比較好，但兩種方式凝膠吸附所需的條件是保持一致的，對(duì)于選擇凝膠和層析參數(shù)沒有影響，而且可以節(jié)省小規(guī)模擴(kuò)張床系統(tǒng)的投資。采用裝填床，由于不能去除顆粒雜質(zhì)，需要將樣品先進(jìn)行離心分離，以獲得澄清物料。
實(shí)驗(yàn)方案在XK16×10(mm×cm)層析柱內(nèi)進(jìn)行，柱床體積20ml。分別選擇一種陽離子凝膠STREAMLINE SP和一種陰離子凝膠STREAMLINE DEAE在不同的緩沖系統(tǒng)和不同的pH及離子強(qiáng)度條件下進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如下表

其中，STREAMLINE SP凝膠采用pH4.7的檸檬酸及醋酸緩沖液，pH6.0、pH6.4的磷酸緩沖液進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)?？梢娮詈玫慕Y(jié)果是采用pH6.4的磷酸緩沖液做為上樣及洗脫條件，二次實(shí)驗(yàn)得率分別為45.9％以及43.8％，平均44.8％。
STREAMLINE DEAE在pH6.4的磷酸緩沖液，pH7.4和7.8的Tris緩沖液條件下進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)?？梢妏H7.8的兩次實(shí)驗(yàn)，得率分別為35％和45％。PH7.4的兩次實(shí)驗(yàn)，得率分別為54％和50.2％，平均52.1％，回收率較高，且較穩(wěn)定。
分析以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可知pH6.4的STREAMLINE SP和pH7.4的STREAMLINE DEAE都可以獲得較好的結(jié)果，并且兩者相比，pH7.4的STREAMLINE DEAE得率相對(duì)高出16％。選擇何種條件，還要考慮的一個(gè)問題是前后工藝配合問題。由于菌體破碎是在pH7.8的Tris緩沖液中進(jìn)行，勻漿液最終pH在7.4左右，正與STREAMLINE DEAE條件相符，而且在pH中性環(huán)境下，干擾素應(yīng)最穩(wěn)定。因此，pH7.4的STREAMLINE DEAE是理想條件。從另一個(gè)角度看，如果選用pH6.4的STREAMLINE SP，則勻漿需要更換緩沖體系，在酸性條件下，會(huì)出現(xiàn)蛋白沉淀，也可能存在其它意料不到的問題。因此，決定選用DEAE-STEAMLINE凝膠，并使用pH7.4的Tris-HCl作為層析緩沖液。
實(shí)施例2使用STREAMLINE DEAE裝填床小柱進(jìn)行干擾素純化工藝摸索在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，使用XK16×10柱以裝填床的形式，選用STREAMLINE DEAE和pH7.4的Tris緩沖液，用與舊工藝相同批的菌體勻漿液沿新工藝路線生產(chǎn)至干擾素純品。新舊工藝比較中，舊工藝的數(shù)據(jù)取自實(shí)際生產(chǎn)。
實(shí)驗(yàn)材料1.設(shè)備層析柱XK16×10，凝膠STREAMLINE DEAE，層析系統(tǒng)Pharmacia GP-250梯度控制儀2.緩沖液平衡液pH7.4 50mM Tris-HCl，洗脫液0-0.5MNaCl pH7.450mM Tris-HCl實(shí)驗(yàn)程序1.裝柱采用20ml/min的流速在平衡緩沖液體系中裝柱，裝柱體積20ml2.平衡采用10ml/min的流速，10個(gè)柱床體積的平衡液平衡柱床3.上樣菌體勻漿液1000ml在10ml/min流速下上樣，收集流穿4.清洗采用平衡液在10ml/min的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基線5.洗脫采用0-0.5MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，收集主峰6.再生采用多種CIP清洗液再生凝膠7.保存采用20％乙醇保存凝膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表，新工藝比舊工藝平均提高得率108％。
其中，Yn/Yo新工藝得率/舊工藝得率 At總活性

實(shí)施例3擴(kuò)張床吸附手動(dòng)純化系統(tǒng)的建立在由實(shí)驗(yàn)規(guī)模向生產(chǎn)規(guī)模放大的過程中，面臨著建立擴(kuò)張床吸附純化系統(tǒng)的問題?；诮档屯顿Y的考慮，我們與層析柱供應(yīng)商一起建立擴(kuò)張床吸附的手動(dòng)純化系統(tǒng)。
根據(jù)圖2擴(kuò)張床吸附操作原理圖，擴(kuò)張床吸附的步驟包括平衡擴(kuò)張、樣品上樣、柱清洗、沉降洗脫，柱再生。為同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張和層析兩個(gè)功能，必須采用雙泵系統(tǒng)。一個(gè)泵負(fù)責(zé)柱床的擴(kuò)張和沉降，另一個(gè)泵負(fù)責(zé)平衡、上樣、洗脫、再生。同時(shí)，由于存在多種液體的更換，因此，需要較為復(fù)雜的閥門和管路系統(tǒng)。另外，需要基本的檢測(cè)和記錄系統(tǒng)。
根據(jù)以上分析，首先是確定在不同層析狀態(tài)下，各種流體的流程圖。如圖2-1到2-8，分別包括初始狀態(tài)、平衡擴(kuò)張、柱塞上升、上樣、清洗、柱塞下降、洗脫、再生等不同狀態(tài)的流程圖。其中，1-9為手動(dòng)閥。A指初始緩沖液，B指洗脫緩沖液。在所有流程圖中，黑線及箭頭表示的路徑是液體在該狀態(tài)下的流動(dòng)路程。如圖2-4，上樣流程圖中，樣品經(jīng)過閥3、閥2、泵1、閥4、閥5、閥6、閥8進(jìn)入層析柱內(nèi)，上樣產(chǎn)生的流穿從柱頂流出，經(jīng)過閥7、閥6進(jìn)入紫外檢測(cè)儀，檢測(cè)紫外吸收信號(hào)，再作為廢液排走。
根據(jù)以上流程，選用了相應(yīng)設(shè)備STREAMLINE200層析柱，WASTON-MARLOW蠕動(dòng)泵兩臺(tái)，紫外檢測(cè)儀及數(shù)據(jù)記錄儀，手動(dòng)閥門以及管道。將所有組件，根據(jù)工藝流程安裝起來，形成了擴(kuò)張床吸附的手動(dòng)純化系統(tǒng)。
實(shí)施例4擴(kuò)張床吸附純化干擾素新工藝的生產(chǎn)規(guī)模放大將實(shí)驗(yàn)規(guī)模的XK16/10小柱中摸索的條件直接放大至STREAMLINE200擴(kuò)張柱，柱床體積由20ml放大到4.5L，為225倍一步放大。
實(shí)驗(yàn)材料1.設(shè)備層析柱STREAMLINE200，凝膠STREAMLINE DEAE4.5L，層析系統(tǒng)擴(kuò)張床吸附手動(dòng)純化系統(tǒng)2.緩沖液平衡液pH7.450mM Tris-HCl，洗脫液0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl，再生液0.5MNaOH-1MNaCl，WFI，30％異丙醇、25％醋酸、20％乙醇實(shí)驗(yàn)程序1.裝柱在平衡緩沖液體系中裝柱，直接將凝膠裝入層析柱內(nèi)，裝柱體積4.5L2.平衡采用300CM/H的流速，10個(gè)柱床體積的平衡液平衡柱床3.上樣菌體勻漿液100L在300CM/H流速下上樣，收集流穿4.清洗采用平衡液在300CM/H的流速下清洗柱床，洗至紫外吸收接近基線5.洗脫采用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris-HCl以100CM/H進(jìn)行一步洗脫，收集洗脫峰
6.再生采用多種CIP清洗液再生凝膠7.保存采用20％乙醇保存凝膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)張床吸附層析曲線如圖3。檢定數(shù)據(jù)如下表，新工藝比舊工藝平均提高得率82％。
其中，Yn/Yo新工藝得率/舊工藝得率 At總活性

實(shí)施例5STREAMLINE DEAE凝膠負(fù)載測(cè)試實(shí)驗(yàn)材料層析柱XK16/6.9，采用裝填床的形式裝填13.8ml STREAMLINE DEAE凝膠。
平衡液pH7.450mM Tris緩沖液上樣采用干擾素菌體勻漿液離心去除顆粒，作為上樣液實(shí)驗(yàn)程序1.用緩沖液平衡10個(gè)柱床2.以270CM/H的速度上樣1000ML3.對(duì)流穿定點(diǎn)取樣，流穿收集點(diǎn)為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ML4.檢測(cè)各流穿收集點(diǎn)的干擾素濃度C，除以上樣中干擾素濃度Co，得到C/Co值，C/Co最大為1。
5.以C/Co值對(duì)響應(yīng)的收集體積作圖，如圖4。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖4可以看出，上樣達(dá)到400ml時(shí)，干擾素流穿C/Co＝0.28，尚可接受。上樣500ml時(shí)，C/Co＝0.44，已經(jīng)完全不可接受。因此，以400ml點(diǎn)作為凝膠最大吸附量。計(jì)算STREAMLINEDEAE凝膠吸附量如下。
1.凝膠最大菌體負(fù)載＝400ml×50gcell/1000ml/13.8mlgel＝1.45gcell/ml gel2.凝膠最大菌體干擾素負(fù)載＝400ml×0.0252mg IFN/ml/13.8ml gel＝0.725mg IFN/ml gel根據(jù)以上凝膠負(fù)載，STEAMLINE200柱所裝4.5L凝膠，其最大菌體上樣量為6.5Kg菌體，按最大負(fù)載80％上樣，上樣量為5.2Kg干擾素菌體。
實(shí)施例6STREAMLLINE200柱床穩(wěn)定性檢測(cè)1.目檢對(duì)玻璃制的擴(kuò)張床柱，目檢是檢測(cè)柱床穩(wěn)定性的重要步驟。在柱床平衡擴(kuò)張后，進(jìn)行目檢。穩(wěn)定的柱床中，懸浮的凝膠顆粒只在原地做小的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。如果出現(xiàn)紊流或溝流，會(huì)導(dǎo)致吸附效果不理想。柱床上部大的回旋運(yùn)動(dòng)，可能是柱子沒有處于垂直的位置。柱床下部的溝流提示柱底的分布器中存在氣泡或者分布系統(tǒng)部分堵塞。
2.柱床擴(kuò)張倍數(shù)檢測(cè)擴(kuò)張倍數(shù)是擴(kuò)張后柱床的高度H與沉降后柱床的高度Ho的比值，H/Ho。理想狀態(tài)下，擴(kuò)張倍數(shù)與流速，緩沖體系，溫度有關(guān)，這三個(gè)指標(biāo)確定的情況下，擴(kuò)張倍數(shù)得以確定。異常情況下，擴(kuò)張倍數(shù)的下降可能意味著分布板中存在氣泡或堵塞，凝膠被污染，柱子不垂直等問題。
在STREAMLINE200柱中，使用STREAMLINE DEAE凝膠，50mM pH7.4的Tris緩沖液，20℃的工作溫度，和300CM/H的平衡速度，擴(kuò)張倍數(shù)＝H/Ho＝43.6/14.5＝3.0，為合理值。
3.理論塔板數(shù)檢測(cè)保留時(shí)間分布實(shí)驗(yàn)可以用來確定理論塔板數(shù)，以評(píng)估擴(kuò)張床中凝膠軸向分布的情況。將稀釋的丙酮溶液上樣到擴(kuò)張好的柱內(nèi)，同時(shí)檢測(cè)流出物中丙酮的紫外吸收信號(hào)，根據(jù)層析圖譜計(jì)算理論塔板數(shù)。具體程序如下(1).采用平衡緩沖液在300GM/H流速下充分?jǐn)U張，記錄擴(kuò)張床高度。
(2).降低柱塞到離擴(kuò)張床膠面0.5-1CM(3).啟動(dòng)記錄儀和紫外檢測(cè)儀。當(dāng)基線穩(wěn)定時(shí)，上樣緩沖液-丙酮的混合物(0.25％V/V)并等待丙酮紫外吸收信號(hào)出現(xiàn)。
(4).當(dāng)紫外信號(hào)穩(wěn)定在最大吸收值(100％)時(shí)，換成緩沖液。在記錄紙上作下標(biāo)記。
(5).等待紫外信號(hào)下降并穩(wěn)定在基線水平。
(6).根據(jù)圖5所示，計(jì)算理論塔板數(shù)N。
N＝t2/σ2t＝平均保留時(shí)間，是從步驟4中的標(biāo)記處到50％最大紫外信號(hào)的距離σ＝標(biāo)準(zhǔn)偏差是從最大紫外信號(hào)的15.85％到84.15％之間距離的一半在STREAMLINE200柱采用14.5CM的STREAMLINE DEAE凝膠，擴(kuò)張到43.6CM，最后檢測(cè)到t＝120.6，σ＝25.9，N＝t2/σ2＝120.62/25.92＝22為合理的理論塔板數(shù)實(shí)施例7擴(kuò)張床吸附洗脫液上親和層析操作程序?qū)嶒?yàn)材料1.設(shè)備層析柱90×70，蠕動(dòng)泵，紫外檢測(cè)儀和記錄儀2.材料單抗膠MCAb-Sepharose F.F.，緩沖液PBS，0.1M Gly-HCl，0.1MTris-HCl，0.1MNaAc，0.5MNaOH實(shí)驗(yàn)程序1.平衡使用PBS平衡柱床2.上樣根據(jù)擴(kuò)張床吸附洗脫液的檢測(cè)結(jié)果確定上樣量，將洗脫液上樣至柱內(nèi)3.清洗使用PBS清洗柱內(nèi)未吸附的雜質(zhì)4.洗脫使用洗脫緩沖液將柱上吸附的干擾素清洗下來，收集洗脫峰，即圖6中第2個(gè)峰5.再生使用Tris-HCl和NaAc緩沖液清洗殘留的柱內(nèi)雜質(zhì)親和層析圖譜見圖6，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間，每一格是30分鐘，圖中縱坐標(biāo)為280nm紫外線吸收相對(duì)值(百分?jǐn)?shù))。
實(shí)施例8凝膠過濾處理親和層析洗脫液實(shí)驗(yàn)材料1.設(shè)備層析柱130×70，蠕動(dòng)泵，紫外檢測(cè)儀和記錄儀2.材料Sephacryl S-100，緩沖液PBS，0.5MNaOH實(shí)驗(yàn)程序1.平衡使用PBS緩沖液平衡三個(gè)柱床體積
2.上樣將親和層析洗脫液按柱床體積4％的上樣量上到柱內(nèi)3.洗脫使用PBS緩沖液洗脫樣品，收集干擾素主峰4.再生使用0.5MNaOH再生柱床凝膠過濾圖譜見圖7，圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間，每一格是60分鐘，圖中縱坐標(biāo)為280nm紫外線吸收相對(duì)值(百分?jǐn)?shù))。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，采用本發(fā)明重組人干擾素α1b的純化工藝，生產(chǎn)效率可以大大提高，生產(chǎn)成本則大大降低。具體體現(xiàn)在工藝周期縮短40％，純化得率提高70％，生產(chǎn)成本降低40-50％等多方面。
(1).工藝周期比較 上表為干擾素新舊純化工藝流程圖和工期比較。從中可以看出，在舊工藝中，從菌體到原液的整個(gè)純化工藝周期為5天時(shí)間，而新工藝僅為3天時(shí)間，工期縮短2天。純化周期縮短40％，相應(yīng)的純化產(chǎn)能可以提高40％。而且由于通常純化是整個(gè)生產(chǎn)的瓶頸所在，純化產(chǎn)能提高40％，就意味著干擾素原料和制劑的生產(chǎn)能力提高40％。
(2).純化得率比較從菌體開始，經(jīng)過全部純化路線，獲得干擾素純品。在不同規(guī)模情況下比較了新舊工藝的得率。
在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，用與舊工藝相同批的菌體勻漿液沿新工藝路線生產(chǎn)至干擾素純品。其中，由于沒有實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)張柱，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的擴(kuò)張床吸附采用裝填床的形式進(jìn)行層析。而舊工藝的數(shù)據(jù)取自實(shí)際生產(chǎn)。從下表結(jié)果來看，新舊工藝活性得率之比為2.08，即新工藝得率提高1倍。

工藝放大后，在生產(chǎn)規(guī)模，采用STREAMLINE200柱進(jìn)行擴(kuò)張床吸附，與舊工藝采用相同的菌體勻漿液純化至純品。結(jié)果如下表，可以看出，同在生產(chǎn)規(guī)模，采用EBA的新工藝得率提高82％。

生產(chǎn)規(guī)模得率提高的幅度低于實(shí)驗(yàn)規(guī)模，主要原因有兩點(diǎn)1.由于EBA得率遠(yuǎn)高于舊工藝中相應(yīng)的初純和離子交換步驟，因此EBA收集物上單抗時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)過量上樣問題，導(dǎo)致干擾素流穿過多。而舊工藝不存在這個(gè)問題，在單抗步驟損失很少。2.EBA收集物由于只經(jīng)過一步純化，在樣品保存過程中可能存在酶解問題。
(3).產(chǎn)品質(zhì)量比較新舊工藝在質(zhì)量指標(biāo)上無明顯差異，都完全滿足生物制品規(guī)程的要求。所有指標(biāo)包括比活、HPLC及電泳純度、內(nèi)毒素、外源DNA、宿主蛋白、IgG含量都全部合格，成品的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等要求全部合格。
(4).生產(chǎn)成本比較A.新工藝固定資產(chǎn)投資降低。由于去除了離心分離、多步沉淀、柱層析脫鹽和離子交換等步驟，因而減少了大型連續(xù)流離心機(jī)、多個(gè)反應(yīng)罐和層析系統(tǒng)的投資。在年產(chǎn)1000萬支干擾素的生產(chǎn)規(guī)模，純化設(shè)備的投資可以減少260萬人民幣，減少幅度為41％。
B.物料成本降低。酸化沉淀、硫氨鹽析、脫鹽等步驟的減少，使得物料成本降低。在年產(chǎn)1000萬支干擾素的生產(chǎn)規(guī)模，物料成本降低18萬，降低幅度為58％。同時(shí)還伴隨著水電等成本的下降。
C.人員成本下降。由于工藝的簡化，勞動(dòng)量的降低。使得完成相同任務(wù)所需人數(shù)大大降低。在年產(chǎn)1000萬支干擾素的生產(chǎn)規(guī)模，純化人數(shù)從14人減為8人，人員成本減少43％。
綜合以上因素，可以看出，由于采用新工藝，整個(gè)純化工藝的生產(chǎn)成本下降了40-50％。
以上各實(shí)施例意在具體說明本發(fā)明之設(shè)計(jì)思路在重組人干擾素α1b的純化工藝中采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)取代傳統(tǒng)的柱層析技術(shù)，以及如何實(shí)現(xiàn)該項(xiàng)技術(shù)。本發(fā)明之實(shí)施，并不限于以上各實(shí)施例所公開的方式，凡基于本發(fā)明之設(shè)計(jì)思路，進(jìn)行簡單推演與替換，得到的具體的重組人干擾素α1b的純化工藝，都屬于本發(fā)明的實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種重組人干擾素α1b的純化工藝，用于從表達(dá)人干擾素α1b的工程菌中提取重組人干擾素α1b，包括細(xì)菌破碎，以及目標(biāo)蛋白的捕獲、中間純化和精制過程，其特征在于所述目標(biāo)蛋白的捕獲過程采用擴(kuò)張床吸附，中間純化過程采用親合層析，精制過程采用凝膠過濾。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述親合層析采用α1b干擾素的單克隆抗體偶聯(lián)的凝膠。
3.如權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述親合層析采用PBS做平衡液、0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1M Gly-HCl做洗脫液以及0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1MTris-HCl和0.05-0.2，優(yōu)選值為0.1M NaAc做再生液。
4.如權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述凝膠過濾采用Sephacryl凝膠。
5.如權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述凝膠過濾采用PBS做緩沖液。
6.如權(quán)利要求1所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述細(xì)菌破碎過程是在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1至6任一所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述擴(kuò)張床吸附采用陰離子凝膠。
8.如權(quán)利要求7所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述陰離子凝膠是STREAMLINE DEAE。
9.如權(quán)利要求1至6任一所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述擴(kuò)張床吸附采用pH值為7.0-8.0，優(yōu)選值為7.4的Tris-HCl緩沖液，并采用鹽濃度洗脫的方法。
10.如權(quán)利要求9所述的重組人干擾素α1b的純化工藝，其特征在于所述鹽濃度洗脫采用含0.2-0.5，優(yōu)選值為0.4MNaCl的pH7.4 50mM Tris-Hcl做洗脫液。
全文摘要
一種重組人干擾素α1b的純化工藝，用于從表達(dá)人干擾素α1b的工程菌中提取重組人干擾素α1b，包括細(xì)菌破碎、擴(kuò)張床吸附、親合層析和凝膠過濾步驟。細(xì)菌破碎是在Tris－HCl緩沖液中進(jìn)行；所述擴(kuò)張床吸附步驟中，選用陰離子凝膠，緩沖體系選用pH值為7.4的Tris－HCl，并選用0.4MNaCl pH7.4 50mM Tris－Hcl洗脫液一步洗脫。所述親和層析步驟中，選用α1b干擾素的單克隆抗體偶聯(lián)的凝膠；平衡液采用PBS，清洗液采用PBS，洗脫液采用0.1M Gly－HCl，再生液采用0.1M Tris－HCl及0.1M NaAc－HAc緩沖液。所述凝膠過濾步驟中，選用Sephacryl凝膠，緩沖體系選用PBS。采用本重組人干擾素α1b的純化工藝，生產(chǎn)效率可以大大提高，生產(chǎn)成本則大大降低。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1727361SQ20041005093
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者何詢, 于德強(qiáng), 張為 申請(qǐng)人:深圳科興生物工程股份有限公司