專利名稱：乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳鐵旦白和乳過氧化物酶的制備方法，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶或乳漿中提取乳鐵旦白和乳過氧化物酶的方法。
發(fā)明技術(shù)背景乳鐵旦白和乳過氧化物酶是哺乳動物乳汁中重要的生物活性成份，乳鐵旦白是人乳中的重要活性成份，其含量高達(dá)7～8克/升，它不但可以將機(jī)體正?；顒铀璧蔫F離子運(yùn)輸?shù)窖?xì)胞，以供應(yīng)造血時所必需的鐵離子，還能通過粘附鐵離子，使致病的細(xì)菌和病毒無法得到其生長所需的鐵離子而抑制細(xì)菌或病毒繁殖。動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，乳鐵旦白能有效抑制包括大腸桿菌、厭氧桿菌、鏈球菌在內(nèi)的數(shù)十種致病菌，以及包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒在內(nèi)的數(shù)十種病毒的繁殖，是新生兒早期重要的過繼性免疫組成部份。此外還能通過刺激CD4+、CD8+等淋巴細(xì)胞繁殖，激活自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，刺激白介素和細(xì)胞因子釋放而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，提高人體免疫功能，抑制多種腫瘤細(xì)胞生長。
乳鐵旦白是一種含鐵的糖旦白，分子量約7,700D，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫功能、抗感染、補(bǔ)充鐵劑、抗腫瘤等作用的營養(yǎng)制劑中，但目前從人乳中提取的乳鐵旦白價格昂貴，每克價格約3800美元，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。
乳過氧化物酶是一種具有生物活性的酶，通過非特異性氧化作用，破壞致病原的外膜旦白、運(yùn)送系統(tǒng)、糖降解酶及核酸等，已被證實(shí)對大腸桿菌和沙門氏菌有良好的殺滅效果。
牛奶中含有乳鐵旦白和乳過氧化物酶，其生物活性與人乳中成份相似，每升牛奶中含有約200mg乳鐵旦白和約30mg乳過氧化物酶，牛初乳中含量更高，每升牛初乳中含有約1克乳鐵旦白和約150mg乳過氧化物酶，在制備奶酪的付產(chǎn)品乳漿中，乳鐵旦白約殘存25％，沒有經(jīng)過高溫滅菌的乳漿中乳過氧化物酶仍具有活性。
因此從牛初乳、牛奶或乳漿中制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶應(yīng)該是一種經(jīng)濟(jì)可行的選擇，尤其工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，其原料來源豐富，產(chǎn)品屬純天然成份，安全可靠。
歐洲專利(EP-AO 253395)介紹了一種用羧甲基纖維素層析柱分離乳鐵旦白的方法，僅適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，應(yīng)用工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的方式從牛初乳、牛奶或乳漿中制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶，以滿足應(yīng)用的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案，其特征是，采用離心方式去除脂肪，應(yīng)用交錯切面流體過濾分離裝置濾除乳糖及小分子物質(zhì)，應(yīng)用陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白和乳過氧化物酶，用高滲離子滲透液洗脫吸附的乳鐵旦白和乳過氧化物酶，通過離子交換或超濾去除離子并濃縮，經(jīng)冷凍干燥或真空干燥制備成粉。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，以牛初乳或牛奶作為原料，采用離心方式脫脂，離心速度為3000～6000轉(zhuǎn)/分，最好是在5000轉(zhuǎn)/分，離心時間15～45分鐘，最好是30分鐘，離心后，去除離心液上層漂浮的脂肪。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，在牛初乳或牛奶脫脂后，或者直接以乳漿作為原料，采用交錯切面流體過濾分離裝置，應(yīng)用分子量為4萬～7萬D的超濾膜，最好是應(yīng)用分子量為5萬～6萬D的超濾膜濾除殘余的脂肪、乳糖和小分子物質(zhì)，過濾的分離液可以用作制備酪旦白、乳清旦白或者制備旦白水解物，而殘留的濃縮物用于制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，已經(jīng)脫脂和濾除小分子物質(zhì)的牛初乳、牛奶或乳漿通過陽離子交換樹脂灌裝的層析柱，當(dāng)液體以較高的表面速度和以較高的液體過柱率通過層析柱時，陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白和乳過氧化物酶，在過柱過程結(jié)束后，用鹽溶液洗脫吸附在陽離子交換樹脂上的旦白質(zhì)，濃縮洗脫物后干燥，即可制備乳鐵旦白和/或乳過氧化物酶的粉狀物質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，可采用多種類型的陽離子交換樹脂，但最好是采用在高壓高流速狀況下仍然能保持物理機(jī)械穩(wěn)定性能的產(chǎn)品，例如瓊脂糖凝膠(制藥等級)，就符合上述條件，選擇的陽離子交換樹脂顆粒大小范圍是100.mu.m～300.mu.m，最好范圍是125.mu.m～150.mu.m，在吸收時能提供較高表面速率。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用機(jī)械性能穩(wěn)定的陽離子交換樹脂能提高灌注壓，并提高吸收時的表面速率和液體過柱速率，加快處理原材料的速度，提高單位時間內(nèi)產(chǎn)量，理想的表面速率為2000cm～3000cm/每小時，理想的過柱率為100～300柱容量/每小時，當(dāng)采用工作壓力為3bar/10cm床高度時，可以達(dá)到上述理想表面速率和過柱率。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，離子交換樹脂最好首先用PH6.5的磷酸緩沖液(0.025molNa.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大約采用4倍床容量的緩沖液沖洗層析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳漿通過層析柱后，乳鐵旦白和乳過氧化物酶被吸附在陽離子交換樹脂上，這時再用緩沖鹽溶液沖洗層析柱可洗脫已吸附的物質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，洗脫吸附在層析柱上的乳鐵旦白和乳過氧化物酶可以是用一種緩沖液一次性洗脫，洗脫液內(nèi)含有上述兩種生物活性成份；也可以分次采用不同濃度緩沖液，分別洗脫乳過氧化物酶和乳鐵旦白，低濃度的緩沖液(大約0.2～0.5mol NaCL)僅能洗脫乳過氧化物酶，高濃度的緩沖液(大約2.5mol NaCL)可以單獨(dú)洗脫乳鐵旦白，而中等濃度的緩沖液(大約＞0.7mol NaCL)能同時洗脫乳鐵旦白和乳過氧化物酶，過高濃度的緩沖液不應(yīng)作為最佳選擇，洗脫液需進(jìn)行除鹽程序，除鹽的方法可以是離子交換、電透析或超濾，其中超濾是最好的方法。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，洗脫的乳鐵旦白和/或乳過氧化物酶可以經(jīng)過除鹽程序后干燥，也可以直接干燥，干燥的方法包括噴霧干燥、真空干燥和冷凍干燥，考慮到生物活性物質(zhì)的熱敏感性，最理想的方法是冷凍干燥。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，根據(jù)最后用途，可以采用不同濃度的緩沖液進(jìn)行洗脫程序，從而得到乳鐵旦白洗脫液，或乳過氧化物酶洗脫液，或同時含有乳鐵旦白和乳過氧化物酶的洗脫液，經(jīng)過干燥程序后分別得到上述三種不同成份的干粉。
本發(fā)明的有益效果是，通過采用合理的工藝，使工業(yè)化制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶成本降低，收獲率提高，能以合理的價格滿足市場的需要，廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫功能，對抗感染，抗腫瘤，治療缺鐵性貧血等多種用途。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1從牛初乳中制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶收集母牛分娩后三天內(nèi)的牛初乳15升，采用離心方式脫脂，離心速度5000轉(zhuǎn)/分，離心時間20分鐘，脫脂牛初乳通過交錯切面流體分離過濾裝置(Pall公司生產(chǎn)TFF裝置)，選擇超微濾膜分子量為6萬D，收集殘余濃縮物準(zhǔn)備過層析柱。
采用10cm自動控制生產(chǎn)的層析儀(Bioprocess system pharmacia)，裝置瓊脂糖凝膠陽離子交換樹脂(SP Sepharose Big Beadsion exchanger)，層析柱直徑為10cm，床高度為11cm，床容量為0.864升。
在室溫下，用3.2升0.025M，PH6.5磷酸緩沖液對層析柱進(jìn)行平衡，超濾濃縮物用泵抽方式，以180升/小時的流速通過層析柱，表面速度約2300cm/小時，過柱速率約208床容量/小時。
用0.3M NaCL緩沖液沖洗，沖洗液量為2.8升，獲得乳過氧化物酶洗脫液，然后用1.0MNaCL緩沖液沖洗，沖洗液量為2.2升，獲得乳鐵旦白洗脫液，兩種洗脫液分別用10,000D的超微濾膜超濾除鹽濃縮后冷凍干燥，得到乳過氧化物酶干粉和乳鐵旦白干粉。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種乳鐵旦白和乳過氧化物酶的制備方法，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶或乳漿中提取乳鐵旦白和乳過氧化物酶的方法，其特征是，采用離心方式去除脂肪，應(yīng)用交錯切面流體過濾分離裝置濾除乳糖及小分子物質(zhì)，應(yīng)用陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白和乳過氧化物酶，用高滲離子滲透液洗脫吸附的乳鐵旦白和乳過氧化物酶，通過離子交換或超濾去除離子并濃縮，經(jīng)冷凍干燥或真空干燥制備成粉。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，以牛初乳或牛奶作為原料，采用離心方式脫脂，離心速度為3000～6000轉(zhuǎn)/分，最好是在5000轉(zhuǎn)/分，離心時間15～45分鐘，最好是30分鐘，離心后，去除離心液上層漂浮的脂肪。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，在牛初乳或牛奶脫脂后，或者直接以乳漿作為原料，采用交錯切面流體過濾分離裝置，應(yīng)用分子量為4萬～7萬D的超濾膜，最好是應(yīng)用分子量為5萬～6萬D的超濾膜濾除殘余的脂肪、乳糖和小分子物質(zhì)，過濾的分離液可以用作制備酪旦白、乳清旦白或者制備旦白水解物，而殘留的濃縮物用于制備乳鐵旦白和乳過氧化物酶。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，已經(jīng)脫脂和濾除小分子物質(zhì)的牛初乳、牛奶或乳漿通過陽離子交換樹脂灌裝的層析柱，當(dāng)液體以較高的表面速度和以較高的液體過柱率通過層析柱時，陽離子交換樹脂吸附乳鐵旦白和乳過氧化物酶，在過柱過程結(jié)束后，用鹽溶液洗脫吸附在陽離子交換樹脂上的旦白質(zhì)，濃縮洗脫物后干燥，即可制備乳鐵旦白和/或乳過氧化物酶的粉狀物質(zhì)。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，可采用多種類型的陽離子交換樹脂，但最好是采用在高壓高流速狀況下仍然能保持物理機(jī)械穩(wěn)定性能的產(chǎn)品，例如瓊脂糖凝膠(制藥等級)，就符合上述條件，選擇的陽離子交換樹脂顆粒大小范圍是100.mu.m～300.mu.m，最好范圍是125.mu.m～150.mu.m，在吸收時能提供較高表面速率。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用機(jī)械性能穩(wěn)定的陽離子交換樹脂能提高灌注壓，并提高吸收時的表面速率和液體過柱速率，加快處理原材料的速度，提高單位時間內(nèi)產(chǎn)量，理想的表面速率為2000cm～3000cm/每小時，理想的過柱率為100～300柱容量/每小時，當(dāng)采用工作壓力為3bar/10cm床高度時，可以達(dá)到上述理想表面速率和過柱率。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，離子交換樹脂最好首先用PH6.5的磷酸緩沖液(0.025mol Na.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大約采用4倍床容量的緩沖液沖洗層析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳漿通過層析柱后，乳鐵旦白和乳過氧化物酶被吸附在陽離子交換樹脂上，這時再用緩沖鹽溶液沖洗層析柱可洗脫已吸附的物質(zhì)。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，洗脫吸附在層析柱上的乳鐵旦白和乳過氧化物酶可以是用一種緩沖液一次性洗脫，洗脫液內(nèi)含有上述兩種生物活性成份；也可以分次采用不同濃度緩沖液，分別洗脫乳過氧化物酶和乳鐵旦白，低濃度的緩沖液(大約0.2～0.5mol NaCL)僅能洗脫乳過氧化物酶，高濃度的緩沖液(大約2.5molNaCL)可以單獨(dú)洗脫乳鐵旦白，而中等濃度的緩沖液(大約＞0.7mol NaCL)能同時洗脫乳鐵旦白和乳過氧化物酶，過高濃度的緩沖液不應(yīng)作為最佳選擇，洗脫液需進(jìn)行除鹽程序，除鹽的方法可以是離子交換、電透析或超濾，其中超濾是最好的方法。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，洗脫的乳鐵旦白和/或乳過氧化物酶可以經(jīng)過除鹽程序后干燥，也可以直接干燥，干燥的方法包括噴霧干燥、真空干燥和冷凍干燥，考慮到生物活性物質(zhì)的熱敏感性，最理想的方法是冷凍干燥。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術(shù)特征是，根據(jù)最后用途，可以采用不同濃度的緩沖液進(jìn)行洗脫程序，從而得到乳鐵旦白洗脫液，或乳過氧化物酶洗脫液，或同時含有乳鐵旦白和乳過氧化物酶的洗脫液，經(jīng)過干燥程序后分別得到上述三種不同成份的干粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的制備方法，尤其涉及一種從牛初乳、牛奶或乳漿中提取乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的方法，其特征是，采用離心方式去除脂肪，應(yīng)用交錯切面流體過濾分離裝置濾除乳糖及小分子物質(zhì)，應(yīng)用陽離子交換樹脂吸附乳鐵蛋白和乳過氧化物酶，用高滲離子滲透液洗脫吸附的乳鐵蛋白和乳過氧化物酶，通過離子交換或超濾去除離子并濃縮，經(jīng)冷凍干燥或真空干燥制備成粉。
文檔編號C07K14/47GK1557950SQ20041001611
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月4日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平