專利名稱：能夠結(jié)合il－18bp和抑制第二細(xì)胞因子活性的細(xì)胞因子的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠與IL-18結(jié)合蛋白結(jié)合和抑制第二細(xì)胞因子活性的細(xì)胞因子的用途，所述第二細(xì)胞因子是IL-1家族的成員。
背景技術(shù)：
1989年有人描述了從小鼠脾細(xì)胞獲得的能誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)的一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血清活性(Nakamura等，1989)。此種血清活性不是作為IFN-γ的直接誘導(dǎo)劑，而是與IL-2、IFNα/β、TNF或有絲分裂原一起作為協(xié)同刺激劑起作用。嘗試從內(nèi)毒素(誘導(dǎo))后的小鼠血清純化此種活性，顯示一種看起來均一的50-55KDa的蛋白質(zhì)(Nakamura等，1993)。因?yàn)槠渌?xì)胞因子對IFN-γ的產(chǎn)生可能起協(xié)同刺激作用，抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的中和抗體不能中和此種血清活性，提示它是一種獨(dú)特的因子。1995年，還是這些科學(xué)家證實(shí)，產(chǎn)生IFN-γ所需的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的協(xié)同刺激物存在于用P.acnas預(yù)處理的小鼠肝臟提取液中(Okamura等，1995)。在此模型中，肝臟巨噬細(xì)胞群(Kupffer細(xì)胞)擴(kuò)增，低劑量的細(xì)菌脂多糖(LPS)在未預(yù)處理的小鼠中不致死，但卻引起了這些小鼠死亡。該因子稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子(IGIF)，后命名為白介素18(IL-18)，并從1200克重的P.acnas處理小鼠肝臟中提純至均漿。采用純化IL-18的氨基酸序列衍生的簡并寡核苷酸克隆了小鼠的IL-18cDNA(Okamura等，1995)。已在活化巨噬細(xì)胞中檢測到IL-18和白介素-12(IL-12)的信使RNA。IL-18本身不誘導(dǎo)IFN-γ，其主要功能是作為有絲分裂原或IL-12的協(xié)同刺激劑。IL-18的人cDNA序列在1996年已有報(bào)導(dǎo)。
白細(xì)胞介素IL-18具有IL-1蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)特征(Tsutsui等人，1996；Nakamura等人，1993；Okamura等人，1995；Ushio等人，1996)。與其他大多數(shù)具有四螺旋束結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子不同，IL-18和IL-1β全部為β-折疊結(jié)構(gòu)(Tsutsui等，1996)。IL-18與IL-1β相似，被合成為一種沒有生物活性的前體(proIL-18)，缺少信號肽(Ushio等人，1996)。IL-1β和IL-18前體由caspase-1(IL-1β轉(zhuǎn)化酶或ICE)切割，caspase-1在P1位置上天冬氨酸殘基之后割開前體。所得到的成熟細(xì)胞因子易從細(xì)胞釋放出來(Ghayur等人，1997和Gu等人，1997)。
IL-18是一種通過T輔助I型(Th1)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的協(xié)同刺激劑(Kohnoet等人，1997)，也是小鼠自然殺傷細(xì)胞克隆中由FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的協(xié)同刺激劑(Tsutsui等人，1996)。
Th1淋巴細(xì)胞參與抗腫瘤的免疫反應(yīng)(Seki等人，2000)。Th1反應(yīng)包括分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-18和IFN-γ，以及產(chǎn)生識別特異性腫瘤抗原的具有細(xì)胞毒性的特異性T淋巴細(xì)胞。Th1反應(yīng)也是宿主防御許多微生物的一條生命臂(vital arm)。然而，Th1反應(yīng)也與不希望的副作用相關(guān)，如產(chǎn)生一些自身免疫疾病、炎癥和器官移植排斥。
細(xì)胞因子結(jié)合蛋白(可溶性細(xì)胞因子受體)通常是其各自細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它們或通過可變換的剪接或通過細(xì)胞表面受體蛋白裂解而產(chǎn)生。過去已對這些可溶性受體進(jìn)行了敘述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受體(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)和IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一種稱為骨保護(hù)素(OPG，也稱破骨抑制因子-OCIF)的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白是TNFR/Fas家族的一個成員，似乎是僅作為分泌性蛋白存在的可溶性受體的第一個例子(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。
在IL-18柱上進(jìn)行親和純化從尿中得到了白介素-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在體外消除了IL-18對IFN-γ的誘導(dǎo)和IL-18對NF-κB的活化，以及在體內(nèi)消除了IL-18對IFN-γ的誘導(dǎo)。IL-18是一種可溶性循環(huán)蛋白質(zhì)，在脾中固有地表達(dá)，屬于免疫球蛋白超家族。最豐富的IL-18BP同種型，即剪接變體同種型a，對IL-18具有高親和力，結(jié)合速率快，解離速率慢，解離常數(shù)(Kd)約為400pM(Kim等人，2000)。
有人利用計(jì)算機(jī)模型(Kim等人，2000)和基于IL-1β與IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)對參與IL-18和IL-18BP相互作用的殘基進(jìn)行了描述。在IL-18與IL-18BP結(jié)合的模型中，已經(jīng)提出IL-18的42位上Glu(E)殘基和89位上Lys(K)殘基分別與IL-18BP的Lys-130和Glu-114結(jié)合(Kim等人，2000)。
IL-18BP固有地存在于許多細(xì)胞中(Puren等人，1999)，并在健康人體內(nèi)循環(huán)(Urushihara等人，2000)。IL-18BP對IL-18具有高親和力以及在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)IL-18BP的濃度較高(相對IL-18過量20倍摩爾)，表示細(xì)胞因子生物學(xué)一種獨(dú)有現(xiàn)象。因此，可以推測，在循環(huán)中即使不是全部但大部分IL-18分子與IL-18BP結(jié)合。與IL-18的細(xì)胞表面受體競爭的循環(huán)IL-18BP可用作天然消炎和免疫抑制分子。
一些病毒試劑編碼IL-18BP類蛋白質(zhì)，例如傳染性軟疣病毒性蛋白MC53和MC54與哺乳動物IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。傳染性軟疣病毒性蛋白MC53和MC54具有結(jié)合與中和人IL-18的能力，方式與IL-18BP相似(Xiang和Moss，1999)。缺肢痘病毒p13蛋白質(zhì)與IL-18BP同源，在體外與IL-18結(jié)合，并抑制其活性。感染p13缺失突變病毒的小鼠顯示感染水平下降(Born等人，2000)。故感染程度似乎與是否有IL-18BP相關(guān)。
循環(huán)IL-18BP的水平高可能表示一種自然防御，這種防御針對自身免疫疾病感染和發(fā)病的過度Th1反應(yīng)。
包括IL-18在內(nèi)的IL-1家族細(xì)胞因子在第一線和第二應(yīng)答感染過程中具有各種各樣炎性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)(Dinarello 1996和Nakanishi 2001)。從表達(dá)序列標(biāo)簽(ETS)數(shù)據(jù)庫搜索中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了白介素-1(IL-1)基因家族的六個新成員(Barton 2000，Busfield 2000，Debets 2001，Kumar 2000，Lin 2001，Mulero 1999，Pan 2001和Smith 2000)。這些蛋白質(zhì)都有共同的β-桶模式，它由12個β-鏈和與IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)、IL-1β和IL-18高度同源的氨基酸組成。IL-1家族的這些新成員來源于共同的祖先，例如IL-1和IL-18(Nicklin 2002，Taylor2002)。除了IL-18外，各自對應(yīng)于人染色體2上同一個區(qū)域(Nicklin 2002，Mulero 2000，Taylor 2002和Busfield 2000)?，F(xiàn)時尚未知道這些IL-1同源物的生物功能。IL-1的新同源物IL-IH4的五個不同剪切變體(IL-IF7a-e)已有描述(Busfield 2000，Kumar 2000，Pan 2001，Smith 2000，Taylor 2002)。所述的第一個同種型IL-1F7a具有由IL-1F7基因的外顯子3組成的獨(dú)特的N-末端，該基因的其他它剪切變體不存在這樣的N-末端。短的同種型IL-IF7c、IL-IF7d和IL-IF7e分別缺少外顯子4、2或二者。只有含外顯子1和2的IL-1F7b與c表達(dá)具有潛在caspase-1(ICE)切割位點(diǎn)的N-末端前結(jié)構(gòu)域(Kumar 2002)。除了這些剪切變體外，根據(jù)外顯子2內(nèi)的兩個堿基對突變，IL-1F7b還存在氨基酸多態(tài)性(V31G和A42T)(Kumar 2000，Pan 2001)。盡管對很多數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以及對IL-1-基因座排序，但仍未發(fā)現(xiàn)IL-1H4的小鼠同源物。IL-1F7b的序列與IL-18高度同源。IL-18活性的特點(diǎn)是它在IL-2、IL-12或IL-15作為協(xié)同刺激劑存在下能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。IL-18這一活性通過由配體結(jié)合鏈(命名為IL-18Rα)(Torgoe，1999)和信號傳導(dǎo)鏈(命名為IL-18Rβ)(Born 1998，Kim 2001)組成的IL-18R復(fù)合物介導(dǎo)(Torigoe 1997)。與IL-18Rα鏈結(jié)合再與IL-18Rβ鏈形成復(fù)合物后，IL-18誘導(dǎo)IL-1受體相關(guān)激酶和TNF受體相關(guān)因子6(TRAF-6)的活化。這些被激活的激酶最后導(dǎo)致核因子κ-B(NF-κB)易位(Matsumoto，Robinson)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，利用受體pulldown試驗(yàn)(Pan 2001)或者基于計(jì)算機(jī)芯片的結(jié)合研究(BiaCore)(Mulero 2000)將IL-1F7b與IL-18Rα結(jié)合。對于沒有前肽的IL-1F7b成熟形式，只觀察到有效但低的親和力結(jié)合，其解離常數(shù)為Kd＝130Mm，提示與ICE加工IL-1F7b的生物相關(guān)性(Kumar 2002)。雖然可與IL-18Rα結(jié)合，但已經(jīng)驗(yàn)證IL-1F7b前體或成熟IL-1F7b沒有IL-18樣或拮抗活性(Pan 2001，Kumar 2002)。
最近有人提出，白介素IL-18參與了慢性炎癥性疾病的病理過程，包括內(nèi)毒素性休克、肝炎和自身免疫性糖尿病(Kahiwamura和Okamura，1998)。Tsuij等(1999)發(fā)表關(guān)于IL-18在肝損傷產(chǎn)生中可能的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型中IL-18水平升高。然而，迄今尚未闡明該多功能因子IL-18在肝損傷產(chǎn)生中的作用機(jī)理。
肝損害或損傷可能有不同原因，例如，可能由于病毒或細(xì)菌感染、濫飲酒、免疫性疾病或癌癥。
病毒性肝炎，例如由乙肝病毒和丙肝病毒引起的肝炎是很難對付的疾病，影響到世界上許多人。已知肝炎病毒的數(shù)量持續(xù)增加，除乙肝和丙肝病毒外，迄今已發(fā)現(xiàn)至少4個引起病毒相關(guān)肝炎的其他病毒，稱為甲、丁、戊、庚肝炎病毒。
酒精性肝病是另一種廣泛分布的與長期飲用酒精相關(guān)的疾病。免疫性肝炎是一種罕見的自身免疫病，很難對付。肝損傷還包括膽管損傷。原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種自身免疫性肝病，其特征是肝內(nèi)膽管的破壞。
幾項(xiàng)研究顯示酒精性肝炎、肝硬化、病毒性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化這些疾病中，肝損傷與T輔助細(xì)胞-1(Th1)應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。一項(xiàng)研究中，通過將含卵白蛋白的脂質(zhì)體導(dǎo)向肝臟，隨后過繼性轉(zhuǎn)移卵白蛋白特異性Th1細(xì)胞，建立了一種小鼠新型肝損傷模型。用含卵白蛋白的脂質(zhì)體和Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)移聯(lián)合處理小鼠，導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶活性增高，與血清IFN-γ水平升高相平行。恰恰相反，卵白蛋白特異性Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)移導(dǎo)致血清IL-4水平增高，但不誘導(dǎo)肝損傷?？笽FN-γ抗體和抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體可阻止肝損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明Th1細(xì)胞是急性肝損傷中的主要效應(yīng)細(xì)胞(Nishimura和Ohta，1999)。另一系列研究表明，過度表達(dá)IFN-γ的小鼠在無任何病原體或其他刺激物時表現(xiàn)出自發(fā)性肝炎(Okamoto等，1998)。
另一項(xiàng)研究表明原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)中有Th1應(yīng)答反應(yīng)。PBC是一種自身免疫性肝病，其特征是肝內(nèi)膽道破壞。一般認(rèn)為細(xì)胞免疫機(jī)制，尤其涉及T細(xì)胞時，導(dǎo)致了這種膽管損傷。最近提出，Th1和Th2應(yīng)答反應(yīng)的相對強(qiáng)度是各種自身免疫病病理生理過程的重要因素。在此項(xiàng)研究中通過檢測這兩種T細(xì)胞亞組的特異性細(xì)胞因子，即Th1細(xì)胞的IFN-γ和Th2細(xì)胞的IL-4，評價了PBC中細(xì)胞亞組的平衡。用非同位素原位雜交和免疫組織化學(xué)方法，計(jì)數(shù)了18個PBC病人和35個疾病對照(包括慢性活動性丙肝、肝外膽道阻塞)和正常肝臟的肝切片中IFN-γ和IL-4信使RNA(mRNA)陽性細(xì)胞數(shù)。表達(dá)IFN-γ和IL4mRNA的單核細(xì)胞聚集在PBC肝臟發(fā)炎的肝門管道中，但罕見于肝外膽道阻塞、酒精性纖維化或正常肝切片中。PBC肝臟中檢測到的IFN-γ和IL-4mRNA陽性細(xì)胞數(shù)比對照肝臟明顯高(P＜0.01)。而PBC肝中IFN-γmRNA的表達(dá)比IL-4表達(dá)更常檢測到，IFN-γmRNA表達(dá)水平與肝門炎癥活動程度高度相關(guān)。檢測到IFN-γmRNA陽性細(xì)胞主要在損傷的膽管周圍，圍繞以淋巴樣聚集體。該資料表明Th1細(xì)胞是PBC淋巴樣浸潤中較重要的T細(xì)胞亞組(Harada等，1997)。
還認(rèn)為，病毒抗原識別的細(xì)胞因子模式對分辨病毒感染和病毒清除起著深刻影響。一項(xiàng)研究調(diào)查了細(xì)胞因子向Th2型應(yīng)答轉(zhuǎn)移而失平衡是否在慢性乙肝中起作用，用RT-PCR分析了與慢性乙肝相關(guān)的外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞因子譜。乙肝表面抗原(HbsAg)刺激后，在41％、8％、41％和50％的病人中分別檢測到IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)。這些細(xì)胞因子中，Th1細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)與血清AST/ALT(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)高水平(肝損傷的典型標(biāo)志)相關(guān)。Th2型細(xì)胞因子沒有顯示出對肝細(xì)胞有保護(hù)性作用。結(jié)論是HBsAg反應(yīng)性細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子IFN-γ與慢性乙肝的肝細(xì)胞損傷相關(guān)(Lee等，1999)。據(jù)報(bào)告乙肝病人的肝臟中有高水平的FAS配體及其受體(CD95)(Luo等，1997)，認(rèn)為FAS配體是導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞毒因子之一。
另一項(xiàng)研究鑒定了三十位未治療的慢性肝炎丙肝病毒/RNA(HCV/RNA)陽性病人中，與肝損傷進(jìn)展相關(guān)的因子。用Ishak’s評分法評價了壞死性炎癥性和結(jié)構(gòu)性損傷。通過α平滑肌肌動蛋白(αSMA)免疫組織化學(xué)測定，顯示出激活的肝星形細(xì)胞(HSC)，并用形態(tài)測定法定量，用競爭性RT-PCR法評價血漿HCV/RNA。為研究涉及肝損傷進(jìn)展的免疫應(yīng)答反應(yīng)類型，用免疫組織化學(xué)評價IFN-γ陽性細(xì)胞(Th1樣應(yīng)答的表達(dá))，并用形態(tài)測定法定量。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)在靠近小葉壞死性炎癥或襯墊的纖維中隔區(qū)域可檢測到HSC。αSHA和Sirius紅陽性的實(shí)質(zhì)，與壞死性炎癥和結(jié)構(gòu)性評分顯著相關(guān)。肝門外周區(qū)域測到的IFN-γ陽性細(xì)胞與炎癥浸潤相關(guān)，也與結(jié)構(gòu)破壞顯著相關(guān)。因此結(jié)論是，HSC的激活和肝損傷進(jìn)展與Th1樣應(yīng)答相關(guān)(Baroui等，1999)。與乙肝情況相似，在丙肝病人的肝臟和血清中發(fā)現(xiàn)了Fas配體及其受體(Hiramatsu等，1994；Okazaki等，1996；Lio等，1998)。
已發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞因子和其他Th1標(biāo)記物與酒精性肝炎和肝硬化相關(guān)。炎性刺激和脂質(zhì)過氧化激活了核因子κB(NF-κB)并上調(diào)促炎性細(xì)胞因子和趨化因子。一項(xiàng)研究中，評價了病理性肝損傷、內(nèi)毒素血癥、脂質(zhì)過氧化和NF-κB激活之間的關(guān)系及促炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子之間的失平衡。通過胃內(nèi)灌注給大鼠(每組5只)喂食乙醇和含飽和脂肪、棕櫚油、玉米油或魚油的飲食。對照大鼠用等卡路里的葡萄糖代替乙醇，進(jìn)行了病理分析和內(nèi)毒素測定，包括脂質(zhì)過氧化，NF-κB和促炎癥細(xì)胞因子(TNFα、IL-1β、IFN-γ和IL-12)，C-C趨化因子(調(diào)節(jié)活化，由正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌[RANTES]，單核細(xì)胞趨化蛋白[MCP]-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白[MIP]-1-α)，C-X-C趨化因子(誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化附著的細(xì)胞因子[CINC]、MIP-2、IP-10和上皮中性粒細(xì)胞活化蛋白[ENA]-78)及抗炎癥細(xì)胞因子(IL-10、IL-4和IL-13)的信使RNA(Mrna)水平。在顯示壞死性炎癥損傷(魚油-乙醇和玉米油-乙醇)的大鼠中觀察到NF-κB激活和促炎細(xì)胞因子C-C及C-X-C趨化因子的表達(dá)增加。這幾組大鼠還有最高水平的內(nèi)毒素和脂質(zhì)過氧化。在顯示炎性肝損傷的組中IL-10和IL-4mRNA水平較低。因此在存在促炎癥刺激時，發(fā)生NF-κB激活并導(dǎo)致Th1促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)增加(Naji等，1999)。酒精性肝病中FAS配體及其受體也升高，再次提示Th1細(xì)胞因子參與了酒精性肝炎誘導(dǎo)的自身免疫過程(GaIle等，1995；Taieb等，1998；Fiore等，1999)。
在酒精相關(guān)的肝壞死炎癥病理過程中，TNF-αγ也出現(xiàn)于共同途徑中，文獻(xiàn)報(bào)道酒精性肝病的動物模型中和人酒精性肝病中，肝和血清TNF水平升高，推測這種TNF代謝異常在酒精性肝病的許多代謝性并發(fā)癥和肝損傷中起了作用(Grove等，1997；McClain和Cohen，1999)。例如，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝炎患者TNF-α水平(均值26.3ng/L；95％置信區(qū)間(CI)，21.7-30.9)比正常人(6.4ng/L；CI 5.4-7.4)高。后來死亡的患者的TNF-α水平(34.7ng/L；CI27.8-41.6)比存活者(16.6ng/L；CI 14.0-19.2)高。酒精性肝炎患者TNF-α水平與血清膽紅素(r＝0.74；p＝0.0009)和血清肌酸酐(r＝0.81；p＝0.0003)正相關(guān)。酒精性肝炎患者的TNF-α水平比非活動性酒精肝硬化患者(11.1ng/L；CI 8.9-13.3)和無肝病嚴(yán)重飲酒(6.4ng/L；CI 5.0-7.8)高。腎功能異?；颊逿NF-α水平(14.1ng/L；C15.4-22.8)比酒精性肝病患者低。因此結(jié)論是酒精性肝炎TNF-α升高在疾病嚴(yán)重時最顯著，提示TNF-α在致病過程中起了作用(Bird等，1990)。
TNF介導(dǎo)了內(nèi)毒素的許多生物作用。最近的研究顯示給予TNF可引起肝損傷，TNF可能介導(dǎo)肝細(xì)胞毒素半乳糖胺的致死性。內(nèi)毒素是最強(qiáng)的TNF誘導(dǎo)劑之一。由于酒精性肝病患者常有內(nèi)毒素血癥，由于酒精性肝炎的許多臨床表現(xiàn)是已知的TNF的生物作用，故在酒精性肝炎病人中評價其作用。測定了16位酒精性肝炎病人和16位健康志愿者外周血單核細(xì)胞(TNF產(chǎn)生的主要來源)的基礎(chǔ)TNF和脂多糖刺激后的TNF釋放，16位酒精性肝炎病人有8人，16位健康志愿者只有2人具有可檢測的自發(fā)性TNF活性(P＜0.05)。脂多糖刺激后，酒精性肝炎病人的平均單核細(xì)胞TNF釋放顯著增加，超過健康對照的二倍(25.3±3.7對10.9±2.4單位/ml，p＜0.05)。因此結(jié)論是與健康志愿者的單核細(xì)胞相比，酒精性肝炎病人的單核細(xì)胞具有顯著增加的自發(fā)性TNF和脂多糖刺激的TNF釋放(McClain和Cohen，1989)。
脂多糖(LPS)結(jié)合蛋白(LBP)和CD14在內(nèi)毒素激活細(xì)胞中起著關(guān)鍵的中介作用。推測腸LPS參與了酒精性肝病中促進(jìn)肝損傷的病理過程。已證明胃內(nèi)喂食油和酒精4周的大鼠，其Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞中CD14和LBP水平升高，非骨髓性細(xì)胞中的CD14mRNA表達(dá)也升高。LBP和CD14表達(dá)升高迅速增加了LPS誘導(dǎo)的各種促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，并與酒精性肝病的病理性肝損傷相關(guān)(Su等1998；Lukkari等1999)。
關(guān)節(jié)炎是一種涉及關(guān)節(jié)炎癥的疾病。這些關(guān)節(jié)呈現(xiàn)腫脹、僵硬、觸痛、發(fā)紅或發(fā)熱，可能伴有體重減輕、發(fā)燒或虛弱癥狀。當(dāng)這些癥狀持續(xù)2周以上時，原因可能是炎癥性關(guān)節(jié)炎，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎癥也可由感染引起，導(dǎo)致膿毒性關(guān)節(jié)炎。一種很常見的關(guān)節(jié)炎是退行性關(guān)節(jié)病(骨關(guān)節(jié)炎)。
關(guān)節(jié)炎和相關(guān)疾病的常用處方藥是非類固醇抗炎藥(NSAID)，其包括阿斯匹林和阿斯匹林類藥物，它們可減輕引起關(guān)節(jié)疼痛的炎癥，關(guān)節(jié)僵硬和腫脹。然而NSAID是非特異性藥物，有許多副作用，包括胃出血(華盛頓大學(xué)關(guān)節(jié)炎矯形外科，F(xiàn)rederick Matsen(Chairman)，www.orthop.washington.edu)。除NSAID外，采用CelebrexTM，一種環(huán)氧合酶(COX-2)抑制劑來緩解成人骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的體癥和癥狀，它還可治療家族性腺瘤息肉病病人。
WO 01/00229描述了用腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑和COX-2抑制劑聯(lián)合治療炎癥。
TNF拮抗劑也用于治療關(guān)節(jié)炎。例如WO 9103553描述了TNF拮抗劑。
最近研究表明，IL-18在關(guān)節(jié)代謝中起著促炎癥作用。Olee等(1999)證明，IL-18由關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生并誘導(dǎo)促炎癥和分解代謝反應(yīng)。軟骨細(xì)胞中IL-1β誘導(dǎo)了IL-18mRNA。軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-18前體并在對IL-1刺激反應(yīng)中分泌成熟形式的IL-18。研究IL-18對軟骨細(xì)胞的作用進(jìn)一步證明它抑制TGF-β誘導(dǎo)的增殖和增加氧化氮產(chǎn)生。IL-18激發(fā)正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的幾種基因的表達(dá)，包括可誘導(dǎo)性氧化氮合成酶、可誘導(dǎo)性環(huán)氧合酶、IL-6和基質(zhì)裂解素(stromelysin)?；虮磉_(dá)與相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成相關(guān)。用IL-18處理正常人關(guān)節(jié)軟骨增加了葡糖胺聚糖的釋放。這些發(fā)現(xiàn)鑒定IL-18是一種調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞反應(yīng)和對軟骨退化有作用的細(xì)胞因子。
Saha等(1999)已證明IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)/Caspase-1位于人骨關(guān)節(jié)炎組織中，在IL-1β和IL-18成熟中起作用，他研究了人正常軟骨和骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨及滑液中Caspase-1的表達(dá)和產(chǎn)生，定量測定了骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的ICE水平，檢測了ICE、IL-1β和IL-18局部分布之間的關(guān)系以及軟骨細(xì)胞的凋亡。該研究所做的實(shí)驗(yàn)表明，人滑膜和軟骨均表達(dá)和合成ICE，OA組織中陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組織。關(guān)節(jié)軟骨的淺表層和上中層優(yōu)先產(chǎn)生ICE。OA軟骨外植體和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生成熟的IL-1β，用特異性ICE抑制劑處理完全阻抑了軟骨細(xì)胞，ICE抑制劑還明顯減少IL-18陽性細(xì)胞的數(shù)量。活性IL-1β和ICE之間的這種關(guān)系提示，ICE可能通過激活此促炎癥細(xì)胞因子而促進(jìn)OA的發(fā)展，IL-18可能在軟骨病理學(xué)中起作用。
Gracie等(1999)提出，IL-18在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中有促炎癥作用。他們檢測到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的IL-18mRNA和蛋白水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎對照。還證明體外IL-12或IL-15與IL-18聯(lián)合誘導(dǎo)了滑膜組織產(chǎn)生IFN-γ。給予用膠原/弗氏不完全佐劑免疫的小鼠IL-18，加速了其侵蝕性炎癥關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，提示IL-18在體內(nèi)可能是促炎癥的。
然而迄今除了化學(xué)藥物外，采用可溶性受體或單克隆抗體只阻斷TNFα和IL-1β，已顯示能降低小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一種小鼠模型)(Williams等，1994)，從而提示可用作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療藥物。
術(shù)語“慢性或特發(fā)性炎癥性腸病”包括至少兩種狀況節(jié)段性回腸炎(也稱克隆氏病，Crohn′s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎，二者都是腸胃道疾病。節(jié)段性回腸炎最常影響小腸，當(dāng)其還涉及結(jié)腸時對潰瘍性結(jié)腸炎的鑒別診斷可能是一個問題。
節(jié)段性回腸炎的慢性炎癥和潰瘍通常以小腸梗阻或腹痛開始，這可能類似于急性闌尾炎，其他表現(xiàn)可能是關(guān)于其并發(fā)癥的。該病進(jìn)程緩慢，盡管治療也可能惡化和緩解，通常發(fā)生于青壯年，約一半病例年齡在20-30歲之間，90％在10-40歲之間，男性略多于女性。
顯微鏡檢查反映了該病的總體外觀，炎癥涉及部位是不連續(xù)的，呈局灶性或斑塊狀。主要在粘膜和粘膜下層見到淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞集聚，但常影響全層(穿透性炎癥)。節(jié)段性回腸炎的典型顯微鏡特征是存在顆粒細(xì)胞，圍繞著淋巴細(xì)胞套。特發(fā)性炎癥性腸病的發(fā)生率顯示因地理而有相當(dāng)差異。北歐和美國這些病的發(fā)病率比南歐、非洲、南美和亞洲國家高得多，雖然南歐部分地區(qū)和日本都市化和財(cái)富的增加導(dǎo)致較高的發(fā)病率(General and SystematicPathology，Churchill Livingstone第三版，2000，JCE Underwood編)。
節(jié)段性回腸炎臨床上有二種主要類型，第一種病人在發(fā)作后三年內(nèi)病情持續(xù)緩解，第二種病人病情持續(xù)三年以上。
不論病因?qū)W如何，有證據(jù)表明節(jié)段性回腸炎具有持續(xù)和不恰當(dāng)?shù)腡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，伴有促炎癥細(xì)胞因子，特別是白介素1，2，6和8，IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生的增高。節(jié)段性回腸炎的特征是伴有纖維化的持續(xù)性(慢性)炎癥。成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積過程可能由轉(zhuǎn)化生長因子β所介導(dǎo)，該因子具有明確的抗炎癥作用，即成纖維細(xì)胞募集、基質(zhì)合成和炎性細(xì)胞下調(diào)，但可能牽涉到許多其他介質(zhì)。
潰瘍性結(jié)腸炎是大腸的一種非特異性炎癥，通常起始于直腸，以不同程度向鄰近結(jié)腸延伸。不象節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎局限于大腸。
越來越多的證據(jù)表明，潰瘍性結(jié)腸炎是改變的自身免疫性反應(yīng)的一種結(jié)果，但粘膜損傷也可能是T細(xì)胞不恰當(dāng)激活以及由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子、蛋白酶和反應(yīng)性氧代謝物造成的間接損傷所致。對結(jié)腸上皮造成損傷的后一種機(jī)制稱為“無辜傍觀者(innocent bystander)”損傷。有利于自身免疫的證據(jù)是存在自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和針對結(jié)腸上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的自身抗體及抗中性粒細(xì)胞胞漿性自身抗體(ANCA)。然而，不應(yīng)考慮潰瘍性結(jié)腸炎是自身免疫病，其粘膜損傷是對自身抗原的免疫反應(yīng)的直接結(jié)果(Generaland Systematic Pathology，同上)。
關(guān)于節(jié)段性回腸炎的治療，大多數(shù)人首先用含美沙拉敏(mesalamine，一種有助于控制炎癥的物質(zhì))的藥物治療。不能從其獲益或不能耐受此藥的病人可用其他含mesalamine的藥，通常稱為5-ASA。Mesalamine制劑的可能副作用包括惡心、嘔吐、心灼熱、腹瀉和頭痛。
某些病人服用皮質(zhì)類固醇以控制炎癥，這些藥對急性節(jié)段性回腸炎最有效，但可引起嚴(yán)重副作用，包括對感染的易感性增大。
也可采用抑制免疫系統(tǒng)的藥物來治療節(jié)段性回腸炎，最常用處方藥是6-巰基嘌呤及相關(guān)藥物硫唑嘌呤。免疫抑制劑通過阻斷產(chǎn)生炎癥的免疫反應(yīng)而起作用。這些藥物可能引起副作用，如惡心、嘔吐和腹瀉，并可降低病人對感染的抵抗力。當(dāng)合用皮質(zhì)類固醇和免疫抑制藥治療病人時，可減少皮質(zhì)類固醇的劑量。某些研究提示免疫抑制藥可增強(qiáng)皮質(zhì)類固醇的效果。
美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)了藥物infliximab用于治療對標(biāo)準(zhǔn)療法(mesalamine物質(zhì)，皮質(zhì)類固醇，免疫抑制劑)無反應(yīng)的中度至重度節(jié)段性回腸炎和治療開放性引流瘺。首次批準(zhǔn)專用于節(jié)段性回腸炎治療的infliximab是一種抗腫瘤壞死因子(TNF)單克隆抗體?？筎NF在TNF到達(dá)小腸前從血流中去除TNF從而預(yù)防了炎癥。
狹窄、瘺管或外科手術(shù)引起的小腸中細(xì)菌過度生長可用抗生素治療。對此常見問題，醫(yī)生可處方以下抗菌素之一種或多種氨芐青霉素、磺胺、頭孢菌素、四環(huán)素或滅滴靈。
炎癥消退時腹瀉和痙攣性腹痛常緩解，但還可能需要其他藥物，可采用幾種抗腹瀉藥，包括地芬諾酯、氯哌丁胺和可待因。因腹瀉而脫水的病人常輸液和電解質(zhì)治療。
故仍然需要有效的療法來治療和/或預(yù)防炎癥性腸病，特別是節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎，該療法應(yīng)減少副作用或甚至無副作用為理想。
組織學(xué)和免疫學(xué)觀察表明，細(xì)胞介導(dǎo)免疫力和T細(xì)胞激活是節(jié)段性回腸炎(CD)的關(guān)鍵特征。對人和實(shí)驗(yàn)動物模型的研究提示，在此病中，局部免疫應(yīng)答反應(yīng)傾向于以Th1型為主(Desreumaux等，1997)，局部釋放的細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-1β和TNF-α導(dǎo)致促進(jìn)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)(Reimund等，1996)。
細(xì)胞因子IL-18在Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中，與細(xì)胞因子IL-12合作，通過刺激IFN-γ分泌、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性和刺激Th1細(xì)胞分化，而起著重要作用(Uschito等，1996)。
IL-18與IL-12、IL-2、抗原、有絲分裂原，可能還有其他因子一起作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ。IL-18還增強(qiáng)GM-CSF和IL-2的產(chǎn)生，促進(jìn)抗CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和加強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的Fas介導(dǎo)的殺傷。成熟的IL-18由其前體經(jīng)IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE caspase-1)而產(chǎn)生。IL-18受體由至少二個組分組成，在配體結(jié)合中起協(xié)同作用。在小鼠受IL-12激活的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有IL-18的高親和力和低親和力結(jié)合位點(diǎn)(Okamoto等，1998)提示其為多條鏈的受體復(fù)合物。迄今已鑒定到二個受體亞基，二者均屬于IL-1受體家族(Okamoto等，1999)。IL-18的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及NF-κB的激活(Matsumoto等，1997)。
最近有人提出IL-18涉及炎癥性腸病(Pizarro等，1999；Monteleone等，1999)。
Pizarro等(1999)特征分析了節(jié)段性回腸炎(CD)病人結(jié)腸標(biāo)本中IL-18的表達(dá)和定位并分離了粘膜細(xì)胞群。采用半定量RT-PCR法，與潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和非炎癥對照病人相比，發(fā)現(xiàn)CD病人新鮮分離的小腸上皮細(xì)胞和固有層單核細(xì)胞中IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄增加。與固有層單核細(xì)胞相比，小腸上皮細(xì)胞中的IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄更加豐富。免疫組織化學(xué)分析手術(shù)切除的結(jié)腸組織將IL-18定位于固有層單核細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)以及小腸上皮細(xì)胞。Western blot分析揭示，與重組和成熟的人IL-18蛋白相符的18.3KDa條帶，主要見于CD而非UC的腸粘膜活檢標(biāo)本中。在CD和UC二者活檢標(biāo)本的非炎癥區(qū)域中檢測到與無活性IL-18前體相符的第二條24KDa條帶。此條帶在非炎癥對照中是唯一的形式。
Monteleone等(1999)證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，采用半定量RT-PCR和Western blot分析檢測了12個CD、9個UC病人和15個非炎癥性腸病對照者的整個腸粘膜組織和固有層單核細(xì)胞中的IL-18。發(fā)現(xiàn)所有測試標(biāo)本中均有IL-18轉(zhuǎn)錄，然而與UC和對照相比，在CD的粘膜和固有層單核細(xì)胞樣本中均檢測到IL-18mRNA積累增高。CD中取自炎癥區(qū)域的粘膜標(biāo)本中IL-18轉(zhuǎn)錄更豐富。與成熟IL-18相符的18KDa條帶主要見于CD粘膜標(biāo)本中。非炎癥性腸病(non-IBD)對照粘膜標(biāo)本中IL-18以24KDa多肽存在。與此相一致，CD或UC標(biāo)本中表達(dá)了活性IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的亞基(p20)，而non-IBD對照的結(jié)腸粘膜中，只合成ICE作用前體(p45)。
Ohta等(2001)表明，牛皮癬病變皮膚中IL-18表達(dá)相對于正常皮膚高。他們的發(fā)現(xiàn)提示從角化細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18參與了牛皮癬病變中Th1應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生，并且它的生物活性似乎受皮膚炎癥嚴(yán)格控制。
在一些動物模型中，中和內(nèi)源性IL-18的抗體減輕了疾病的嚴(yán)重程度?？笽L-18可防止內(nèi)毒素致死性。即使在不依賴于干擾素-γ的模型中，中和IL-18也可延長存活期?？笽L-18也可保護(hù)肝臟免受于毒素或激活T細(xì)胞所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。在肝黑素瘤轉(zhuǎn)移的模型中，IL-18阻塞可防止血管內(nèi)皮粘附-1分子表達(dá)的IL-18上調(diào)，從而減少惡性細(xì)胞粘著。IL-18和IL-12協(xié)同地作用刺激I細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞以產(chǎn)生IFN-γ，但中和IL-18可防止IL-12誘導(dǎo)IFN-γ。IL-18類似某些細(xì)胞，能用來增強(qiáng)小鼠抗腫瘤的宿主防御，這是一種最常見的依賴于IFN-γ的機(jī)制。但它是IL-18的促炎功能，可能有助于增強(qiáng)宿主防御。在關(guān)節(jié)炎、肺損傷或炎癥性腸病模型中，中和IL-18揭示該種細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥中有重要作用(Dinarello 2000)。
發(fā)表的數(shù)據(jù)提示，IL-18可能在炎癥性CNS疾病中起著病理作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在動物模型中中和IL-18可預(yù)防腦損傷(Yatsiv等，2002)、缺血性損傷(Mallat等，2002)、心功能不全(Raeburn 2002)和神經(jīng)炎(Yu等，2002)。
但有證據(jù)顯示，IL-18促進(jìn)了小鼠體內(nèi)抗腫瘤的宿主防御。例如，同系小鼠中表達(dá)鼠IL-12或鼠IL-18的鼠乳腺癌細(xì)胞較少生成腫瘤，而且形成腫瘤的速度也比對照的不表達(dá)細(xì)胞慢(Coughlin等，1998)?？贵w中和研究揭示抗腫瘤作用需要IFN-γ。Tasaki進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)白介素-18在鼠結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)保護(hù)性免疫性。而用編碼IL-18基因的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞當(dāng)引入免疫活性小鼠時無法形成皮下腫瘤，而且對非轉(zhuǎn)導(dǎo)的接種結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生抗性。免疫組織化學(xué)分析揭示，帶有IL-18載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的結(jié)腸癌中血管數(shù)目明顯減少。而在缺乏免疫力的小鼠中觀察不到結(jié)腸IL-18轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞喪失致腫瘤性。因此，從腫瘤細(xì)胞分泌出來的IL-18用作輔助劑，因?yàn)樗碳輔助1型細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答(Tasaki等，2000)。
已經(jīng)有人提出，IFN-α通過誘導(dǎo)IL-18BP在慢性丙肝病人體內(nèi)發(fā)揮其抗炎作用(Kaser等2002)。
先前的研究工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與健康個體相比，很多疾病的病人，例如膿毒癥(Novick 2001)、急性移植物抗宿主病(Zecchina 2001)、節(jié)段性回腸炎(Corbaz 2002)，他們的IL-18BP水平大幅提高。不過也發(fā)現(xiàn)這些病人的循環(huán)IL-18水平非常高，因此在循環(huán)中存在的IL-18BP水平不足以中和全部IL-18。
所以，有必要提供關(guān)于病理涉及IL-1家族的細(xì)胞因子如IL-18的疾病的治療和/預(yù)防方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1優(yōu)選來自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選IL-18。
更具體地說，細(xì)胞因子-1通過結(jié)合細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈來抑制細(xì)胞因子-2的活性。所以，可采用細(xì)胞因子-1治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎，或者治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移(metastasis)形成。有需要的話，本發(fā)明的藥物還可含有IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
編碼這種細(xì)胞因子-1的載體可代替該細(xì)胞因子-1，用來制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)所述細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病的藥物。
本發(fā)明的上述蛋白質(zhì)和/或載體可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
此外，本發(fā)明還提供一種內(nèi)源基因激活細(xì)胞因子-1的載體，其可治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病，其中所述細(xì)胞因子-1優(yōu)選來自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選為IL-18。更具體地說，細(xì)胞因子-1通過結(jié)合細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈來抑制細(xì)胞因子-2的活性。更具體地說，本發(fā)明涉及細(xì)胞因子-1在治療或預(yù)防炎癥性疾病，例如內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎，或者在治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成中的應(yīng)用。有需要的話，本發(fā)明的藥物還可含有IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
本發(fā)明用于內(nèi)源基因激活的載體可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容提供一種細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的抑制劑在治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體可預(yù)防或減緩的疾病中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1優(yōu)選來自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選為IL-18。更具體地說，本發(fā)明涉及本發(fā)明的細(xì)胞因子-1抑制劑在治療或預(yù)防病毒性疾病或者在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。
例如，細(xì)胞因子-1抑制劑包括抗體、反義核酸、RNAi、或者能夠結(jié)合細(xì)胞因子-1的可溶性細(xì)胞因子-2受體或其片段。
本發(fā)明還提供一種抑制有需要病人的細(xì)胞因子-2受體的方法，所述細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選為IL-18，所述方法包括給予治療有效量的細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，其中所述細(xì)胞因子-1優(yōu)選是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段。更具體地說，細(xì)胞因子-1通過結(jié)合細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈來抑制細(xì)胞因子-2的活性。更具體而言，本發(fā)明涉及細(xì)胞因子-1在治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎，或者在治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成中的應(yīng)用。有需要的話，IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段可與細(xì)胞因子-1共結(jié)予。本發(fā)明的細(xì)胞因子-1可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
另一個選擇是，本發(fā)明的方法包括給予編碼所述細(xì)胞因子-1的載體。
另外，本發(fā)明也提供一種抑制有需要病人的細(xì)胞因子-2受體的方法，所述細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選為IL-18，所述方法包括給予治療有效量的可基因激活細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段的載體，其中所述的細(xì)胞因子-1優(yōu)選是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段。更具體地說，細(xì)胞因子-1通過結(jié)合細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈來抑制細(xì)胞因子-2的活性?？刹捎眉?xì)胞因子-1治療或預(yù)防炎癥性疾病，例如內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎，或者治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成。有需要的話，IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段可與細(xì)胞因子-1共結(jié)予。本發(fā)明的用于基因激活的載體可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
本發(fā)明又一方面內(nèi)容涉及一種抑制細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的方法，用于治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體可預(yù)防或減緩的疾病，其中所述細(xì)胞因子-1優(yōu)選來自IL-1家族，更好是IL-1F7b，能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員，優(yōu)選為IL-18。更具體地說，本發(fā)明的方法包括用細(xì)胞因子-1抑制劑治療或預(yù)防病毒性疾病或者治療或預(yù)防癌癥。


圖1所示為人IL-18和IL-IF7b的序列相似性。
圖中給出人IL-18(accession no.D4995)和人IL-IF7b(accession no.AF200496)。運(yùn)用專家蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)(ExPasy)再加上人工調(diào)整產(chǎn)生序列對比。IL-18和IL-IF7b的氨基酸相同性為28％，相似性為55％。下劃線氨基酸代表IL-18的ICE切割位點(diǎn)和IL-IF7b的預(yù)計(jì)切割位點(diǎn)。
圖2所示為IL-IF7b既不刺激也不抑制IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ。
圖2A所示為人NKO細(xì)胞、全人血培養(yǎng)基、PBMC(用IL-12(1ng/ml)協(xié)同刺激)和KG-1細(xì)胞(用TNFα(10ng/ml)協(xié)同刺激)用100ng/ml重組IL-IF7b(前體或成熟形式)或者IL-18處理。18小時(KG-1是48小時)后測量上清液的IFNγ。結(jié)果以三個不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM表示。
圖2B所示為在IL-12(1ng/ml)和增加濃度的IL-IF7b前體或成熟IL-IF7b存在下，以IL-18(20ng/ml)誘導(dǎo)NK細(xì)胞。數(shù)據(jù)以三個不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM表示。
圖3A和圖3B所示為IL-IF7b和IL-18Ra-胞外結(jié)構(gòu)域3的交聯(lián)。
圖3A所示為與IL-18RaD3交聯(lián)的IL-IF7b的還原SDS-PAGE。在硝基纖維素上印跡后，通過針對IL-18Rα的單抗mAb可目測到交聯(lián)蛋白質(zhì)。
圖3B所示為化學(xué)交聯(lián)后在IL-18而非IL-IF7b存在下形成IL-18Rα-和β-ECD三元復(fù)合物。在Western blot后，通過針對his6-tagged IL-18Rβ的抗his6tag單抗可目測到該復(fù)合物。
圖4A和圖4B所示為IL-IF7b和IL-18BP的交聯(lián)。
圖4A所示為采用兔抗IL-18BP血清以Western blot檢測交聯(lián)蛋白質(zhì)(每次1.5μg)。
圖4B所示為用針對IL-18BP的mAb免疫沉淀交聯(lián)蛋白質(zhì)(每次10μg)。交聯(lián)IL-1F7b/IL-18BP和對照泳道(IL-18BP+/-BS3，交聯(lián)劑)用兔抗IL-1F7b血清染色。采用兔抗IL-18血清檢測IL-18/IL-18BP復(fù)合物。
圖5A和圖5B所示為IL-IF7b增強(qiáng)IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)NKO細(xì)胞釋放IFNγ的能力。
加入NKO細(xì)胞(0.5×106/ml)和IL-12(1ng/ml)前1小時，使成熟IL-IF7b250ng/ml(A，0＝9)(圖5A)或者IL-IF7b前體250ng/ml(B，0＝8)(圖5B)、IL-18(25ng/ml)和以RPMI/FCS 10％稀釋IL-18BP的稀釋液在96孔微滴定板上培育1小時。與細(xì)胞培育16小時后，收集上清液并測量IFNγ。數(shù)值表示為在不存在IL-IF7b或IL-18BP情況下用IL-18 25ng/ml加上IL-121ng/ml刺激NKO細(xì)胞所產(chǎn)生的IFNγ百分比。運(yùn)用Student′s配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(***p值＜0.001)。
圖6所示為轉(zhuǎn)染RAW264.7中IL-IF7b的表達(dá)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，通過SDS-PAGE分離各個克隆的溶胞產(chǎn)物(5×106細(xì)胞)，用Western blot分析檢測IL-1F7b表達(dá)。兔抗IL-1F7b血清(稀釋1∶500)特異性染色I(xiàn)L1F7b陽性克隆。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段以及能夠抑制細(xì)胞因子-2受體(細(xì)胞因子-2是IL-1受體家族成，例如IL-18R)的細(xì)胞因子-1(例如IL-1F7b)在制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)所述細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病的藥物中的應(yīng)用。本說明書所用的術(shù)語“抑制細(xì)胞因子-2受體”和“抑制細(xì)胞因子-2的活性”是可互換的。所以，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段以及能夠抑制細(xì)胞因子-2(細(xì)胞因子-2是IL-1家族細(xì)胞因子的成員)的活性的細(xì)胞因子-1的應(yīng)用。本發(fā)明基于IL-1F7b能增強(qiáng)IL-18BP抑制IL-18活性的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-1F7b與IL-18BP結(jié)合，其復(fù)合物可通過IL-18，可能的話，通過募集IL-18R的信號傳導(dǎo)鏈(即IL-18Rβ)來抑制IL-18R的活化。
本發(fā)明的細(xì)胞因子-1可優(yōu)選是IL-1家族成員，如IL-1F7b、IL-18、IL-1和IL-1Ra。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞因子-1和細(xì)胞因子-2是兩個不同的細(xì)胞因子。例如可選擇細(xì)胞因子-1和2的下列組合IL-1F7b(細(xì)胞因子-1)和IL-18(細(xì)胞因子-2)、IL-1F7b(細(xì)胞因子-1)和IL-1(細(xì)胞因子-2)、IL-18(細(xì)胞因子-1)和IL-1(細(xì)胞因子-2)、IL-1(細(xì)胞因子-1)和IL-18(細(xì)胞因子-2)、IL-1F7b(細(xì)胞因子-1)和IL-1Ra(細(xì)胞因子-2)、IL-1Ra(細(xì)胞因子-1)和IL-18(細(xì)胞因子-2)以及IL-18(細(xì)胞因子-1)和IL-1Ra(細(xì)胞因子-2)。
最近發(fā)現(xiàn)，IL-1F7b(也稱IL-1H4)是與IL-1α/β、IL-1Ra和IL-18(IL-1家族)具有序列同源性的遞增蛋白質(zhì)家族的新成員。雖然IL-1F7b與IL-18受體亞基之一IL-18Rα亞基結(jié)合，但該結(jié)合不會產(chǎn)生IL-18激動或拮抗功能。根據(jù)本發(fā)明，用化學(xué)交聯(lián)使IL-1F7b與IL-18Rα結(jié)合，但與IL-18不同，IL-1F7b不能募集IL-18Rβ鏈形成具有功能活性的三元復(fù)合物。
對IL-1F7b和IL-18的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)都有兩個保守性氨基酸，即IL-1F7b有氨基酸E35和K124，而IL-18有氨基酸E42和K89。IL-18的殘基E42和K89對IL-18的活性和抑制都很重要，這是因?yàn)樗鼈儏⑴c結(jié)合IL-18Rα(活化)和結(jié)合IL-18BP(抑制)。
此外，我們在交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，IL-1F7b與IL-18BP結(jié)合，而且IL-1F7b與IL-18類似，可通過兩個對結(jié)合于IL18Rα有重要作用的相同保守性氨基酸殘基(即氨基酸E35和K124)與IL-18BP結(jié)合。因此，在IL-1F7b與IL-18BP形成復(fù)合物后，IL-1F7b可能無法再與IL-18Rα結(jié)合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-1F7b不僅與IL-18BP結(jié)合，而且能夠增值它的活性，即增強(qiáng)IL-18活性的抑制。IL-F7b蛋白質(zhì)的前體和成熟形式都發(fā)現(xiàn)有該活性。因?yàn)镮L-1F7b與IL-18BP形成復(fù)合物后不能結(jié)合于IL-18Rα，所以IL-18活性的抑制可能是由這個復(fù)合物與信號傳導(dǎo)鏈IL-18Rβ結(jié)合所致。故β-鏈可被募集到該復(fù)合物，從而消除β-鏈以形成IL-18Rα和IL-18的功能性受體復(fù)合物。
因此，本發(fā)明包括通過一個能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、等位基因變體或片段的不同細(xì)胞因子(細(xì)胞因子-1)或其同種型、突變蛋白、等位基因變體或片段抑制信號傳導(dǎo)通過細(xì)胞因子-2受體，所述細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員。
免疫組織化學(xué)定位研究表明單核細(xì)胞群存在IL-1F7b，這證明了IL-1F7b具有作為IL-18生物活性的天然表達(dá)調(diào)節(jié)劑的作用。
本文所用術(shù)語“突變型蛋白”指細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的同類物，此同類物中細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所置換，或缺失，或IL-1F7b中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產(chǎn)生的產(chǎn)物的活性與IL-1F7b相比無顯著改變。更具體地說，IL-1F7b的一個或多個氨基酸，但不超過30個，較佳不超過20個，更好不超過10個，最好不超過1或2個，可被其他氨基酸所置換、或缺失，或者可加入。采用已知的合成和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)，或任何適合的其他已知技術(shù)制備這些突變蛋白。
本發(fā)明的突變蛋白包括由在嚴(yán)格條件下雜交于編碼細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的DNA或RNA的核酸(如DNA或RNA)所編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指本領(lǐng)域一般技術(shù)人員常規(guī)地稱為“嚴(yán)格的”雜交條件以及隨后的洗滌條件。參照Ausubel等人，Current Protocol的Molecular Biology(分子生物學(xué)的目前方案)，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(同上)。不起限制作用，嚴(yán)格條件的例子包括洗滌條件，在低于所研究的雜交體的Tm計(jì)算值12-20攝氏度下，如在2×SSC和0.5％SDS中洗滌5分鐘，在2×SSC和0.1％SDS中洗滌15分鐘；在0.1×SSC和0.5％SDS，于37攝氏度洗滌30-60分鐘并且在0.1×SSC和0.5％SDS，于68攝氏度洗滌30-60分鐘。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知道，嚴(yán)格條件還依賴于DNA序列、寡核苷酸探針(如10-40堿基)或混合的寡核苷酸探針的長度。如果使用混合探針，優(yōu)選使用四甲基氯化銨(TMAC)來代替SSC。參考Ausubel(同上)。
任何這樣的突變蛋白優(yōu)選具有與細(xì)胞因子-1如IL-1F7b高度相同的氨基酸序列，從而具有與IL-1F7b相當(dāng)?shù)幕钚浴L-1F7b的一種活性是其結(jié)合IL-18BP的能力。因此，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定任一給定的突變蛋白是否具有與IL-1F7b相同的活性，該實(shí)驗(yàn)包括對該突變蛋白進(jìn)行簡單的夾心競爭測試，以測定它是否結(jié)合于適當(dāng)標(biāo)記的IL-18BP(如放射免疫測試或ELISA測試)。
在一個較佳實(shí)施例中，與IL-1F7b的氨基酸序列相比，任何這類突變蛋白具有至少40％的相同性或同源性。更佳地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或最佳地至少90％的相同性或同源性。
本發(fā)明可用的細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的突變蛋白，或相應(yīng)的編碼核酸，包括由基本一致的、作為置換肽或多核苷酸序列所構(gòu)成的有限集合，這些物質(zhì)可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員基于本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)，在無過分試驗(yàn)的情況下，通過常規(guī)方法制得。
根據(jù)本發(fā)明，突變蛋白的優(yōu)選改變是已知的“保守性”置換。細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的保守性氨基酸置換，可包括一組內(nèi)的同義氨基酸，這些同義氨基酸有足夠相似的物理化學(xué)特性以致于在組成員之間的置換將保持分子的生物功能(Grantham，1974)。很清楚，還可在上述氨基酸序列中插入和缺失氨基酸，而不改變它們功能，尤其是如果這些插入或缺失只涉及到少數(shù)氨基酸，比如少于30個，較佳地少于10個，并且不取消或置換那些對功能構(gòu)象至關(guān)重要的氨基酸，比如半胱氨酸殘基。由這些插入和/或缺失所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
較佳地，同義氨基酸(synonymous amino acid)組為表1所定義的那些；更佳地，同義氨基酸組為表2所定義的那些；最佳地，同義氨基酸組為表3所定義的那些。
表1優(yōu)選的同義氨基酸組氨基酸 同義組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，His
LeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Mer，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2更優(yōu)選的同義氨基酸組氨基酸 同義組SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，Ile
GlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表3最優(yōu)選的同義氨基酸組氨基酸 同義組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，Ser
HisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet可通過在蛋白質(zhì)內(nèi)的產(chǎn)生氨基酸置換，得到用于本發(fā)明的細(xì)胞因子-1如IL-1F7b多肽或蛋白的突變蛋白，其例子包括任何已知的方法步驟，如在Mark等的美國專利4959314，4588585，4737462；Koths等的美國專利5116943，Namen等的美國專利4965195；Chong等的美國專利4879111，和Lee等的美國專利5017691中所述的方法；以及美國專利4904584(Shaw等)中所述的賴氨酸置換蛋白質(zhì)。
術(shù)語“融合蛋白”是指一種多肽，其中包含細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b，或其突變蛋白或片段，并和另一種蛋白質(zhì)(如在體液中有更長保留時間的蛋白)融合在一起。因而IL-1F7b可與其他蛋白質(zhì)、多肽等融合，如免疫球蛋白或其片段。
如本文所用，“功能衍生物”涵蓋細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b的衍生物，以及它們的突變蛋白和融合蛋白，這些物質(zhì)可用本領(lǐng)域已知的手段，從作為殘基側(cè)鏈或作為N末端或C末端基團(tuán)存在的官能團(tuán)制備而得，并且只要它們?nèi)匀皇撬帉W(xué)上可接受的(即它們沒有破壞蛋白的與IL-1F7b的活性基本相似的活性，并且不會使含該物質(zhì)的組合物具有毒性)，那幺它們就被包括在本發(fā)明中。
這些衍生物可以例如包括聚乙二醇支鏈，它可掩蓋抗原位點(diǎn)并且延長細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b在體液中的停留時間。其他的衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)而形成的酰胺，氨基酸殘基的自由氨基與?；糠?如烷酰基或碳環(huán)芳?；鶊F(tuán))形成的N-酰基衍生物，或自由羥基(如絲氨酰基或蘇氨?；鶜埢牧u基)與?；糠中纬傻腛-酰基衍生物。
作為細(xì)胞因子-1和/優(yōu)選IL-1F7b或其突變蛋白和融合蛋白的“片段”，本發(fā)明包括了單獨(dú)的蛋白質(zhì)分子多肽鏈或其與相關(guān)分子或殘基相連(如糖或磷酸殘基)的多肽鏈的任何片段或前體，或蛋白質(zhì)分子或糖殘基自身的聚集體，只要所述片段具有與IL-1F7b基本上相似的活性，例如結(jié)合IL-18BP和抑制細(xì)胞因子-2受體。
本發(fā)明還涉及細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。這些同種型、突變蛋白、融合蛋白或功能衍生物保留了細(xì)胞因子-1的生物活性(尤其是結(jié)合于IL-18BP)，并且較佳地增強(qiáng)細(xì)胞因子-2的抑制。例如，IL-1F7b突變蛋白保留了結(jié)合IL-18BP的能力，較佳地增強(qiáng)IL-18的抑制。該突變蛋白保留了參與細(xì)胞因子-1與IL-18BP結(jié)合的氨基酸。例如，對于IL-1F7b，其突變蛋白保留了氨基酸酸E35和K124。理想地，與未經(jīng)修飾的細(xì)胞因子-1相比，這些突變蛋白有增強(qiáng)的生物活性。較佳的活性片段具有比細(xì)胞因子-1活性更好的活性，或具有其他優(yōu)勢，例如更好的穩(wěn)定性或更低的毒性或免疫原性，或者它們更容易大批量生產(chǎn)，或更容易純化。
細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b可用于治療或預(yù)防由細(xì)胞因子-2最好由IL-18引起或加重的炎癥性疾病或轉(zhuǎn)移形成的藥物組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些炎癥性疾病病人的循環(huán)IL-18BP水平很高，然而，IL-18BP的濃度不足以完全中和這些病人體內(nèi)的高濃度IL-18。所以，把細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b給予這些IL-18BP水平高的病人，可能有助于完全抑制IL-18的作用。另一個選擇是，把IL-1F7b和IL-18BP共給予病人，用于治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎，或者用于治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成。
因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-1F7b不僅結(jié)合IL-18BP，而且可增強(qiáng)它的活性(抑制IL-18的活性)，所以如果需要給予低劑量IL-18BP，那么共給予IL-1F7b和IL-18BP是有利的。
給予細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b的適合途徑取決于疾病本身。所以它可以通過例如局部、全身、皮下和肌內(nèi)途徑給予。
在動物模型中，中和IL-18表明該細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥中的重要作用(Interleukin-18，a proinflammatory cytokine.Dinarello CA.Eur Cytokine Netw2000Sep；11(3)483-6)。所以，本發(fā)明還涉及細(xì)胞因子-1或包含細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b的編碼序列的表達(dá)載體在制備治療或預(yù)防炎癥的藥物中的應(yīng)用。因此，給予細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b可治療或預(yù)防病理涉及IL-18的炎癥性疾病，例如內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎。
因?yàn)镮L-18阻塞可防止血管內(nèi)皮粘附-1分子表達(dá)的IL-18上調(diào)，從而減少惡性細(xì)胞粘著，所以本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體在制備預(yù)防轉(zhuǎn)移形成的藥物中的應(yīng)用。為了將細(xì)胞因子-1輸送至所需部位，可考慮基因療法。為了治療失調(diào)或疾病，包含細(xì)胞因子-1(例如IL-1F7b)序列的基因治療載體可被直接注射入患病組織，從而避免基因治療載體的全身給藥所涉及的問題，比如載體的稀釋，到達(dá)和定位于靶細(xì)胞或組織，以及副作用?；蛘?，包含本發(fā)明細(xì)胞因子-1的編碼序列的表達(dá)載體可通過肌內(nèi)注射給予。
如上所述的細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b以及它的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段是藥物組合物中較佳的活性成份。藥物組合物也可包括如上所述的IL-18BP以及它的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段作為活性成份。
“藥學(xué)上可接受”的定義包括任何載體，其并不干擾活性成份的生物活性的有效性，并且給予后對宿主沒有毒性。例如，對腸胃外給藥而言，活性蛋白質(zhì)可在諸如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer氏溶液等載體中，配制成用于注射的單位劑型。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的活性成份可以通過幾種方法施用于人。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(例如在緩釋劑型中)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)(全身)、皮下、口服、顱內(nèi)、硬膜外、局部、和鼻內(nèi)的途徑。可以采用任何其他在治療上有效的給藥途徑，例如通過上皮或內(nèi)皮組織的吸收或通過基因療法(其中編碼活性成分的DNA分子被給予病人(如通過載體)，這導(dǎo)致了該活性成分在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其他一些生物活性物質(zhì)成分(例如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運(yùn)載體)一起給予。
對于腸胃外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))來說，活性蛋白質(zhì)可以與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體(例如水、鹽水、葡萄糖溶液)以及維持滲透壓(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖劑)的添加劑一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。制劑可用常用的技術(shù)進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)的生物利用度也可通過延長分子在人體中半衰期的偶聯(lián)法加以改善，例如如PCT專利申請WO92/13095中所述的那樣，把分子連于聚乙二醇。
如上所述的細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段可用來抑制炎癥性疾病病人的細(xì)胞因子-2的活性，所述的炎癥性疾病例如是膿毒癥、毒素或激活T細(xì)胞引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬或炎癥性腸病。如上所述的本發(fā)明細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段還可用來預(yù)防轉(zhuǎn)移形成，這是因?yàn)镮L-18阻塞可防止血管內(nèi)皮粘附-1分子表達(dá)的IL-18上調(diào)，從而減少惡性細(xì)胞粘著。上述方法包括把治療有效量的細(xì)胞因子-1如IL-1F7b給予有需要的病人。細(xì)胞因子-1可與上述的IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段共給予。
活性蛋白質(zhì)的治療有效量是一個有很多變量的函數(shù)，包括突變蛋白的類型、突變蛋白對IL-18BP的親和性、突變蛋白所體現(xiàn)的任何殘余細(xì)胞毒活性、給藥途徑、病人的臨床狀況。
“治療有效量”是指給予時，細(xì)胞因子-1如IL-1F7b導(dǎo)致如上所述的IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段中IL-18抑制活性的增強(qiáng)。給予個體的劑量(作為單劑或多劑)可隨各種不同因素而變化，包括給藥途徑、病人癥狀和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、體格)、病癥的程度、并行的治療、治療的頻率和所需的效果。對已建立的劑量范圍進(jìn)行調(diào)整和操作，以及用體外和體內(nèi)的方法來測定個體中細(xì)胞因子-1的活性，都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之內(nèi)。
在通常不表達(dá)細(xì)胞因子-1或細(xì)胞因子-1表達(dá)數(shù)量不足的細(xì)胞中，使用載體來誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)內(nèi)源性產(chǎn)生細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b的方法，也在本發(fā)明構(gòu)思中。載體可包括在需要表達(dá)細(xì)胞因子-1的細(xì)胞中起作用的調(diào)控序列。這種調(diào)控序列包括啟動子或增強(qiáng)子。調(diào)控序列然后可以通過同源重組引入基因組的正確位置，這樣使調(diào)控序列與需要誘導(dǎo)或增強(qiáng)表達(dá)的基因可操作地連接。該技術(shù)通常被稱為“內(nèi)源基因激活”(EGA)，并且在例如WO91/09955中有描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可用同樣技術(shù)關(guān)閉細(xì)胞因子-1的表達(dá)，即將負(fù)調(diào)控元件(如沉默元件)引入細(xì)胞因子-1基因座，從而導(dǎo)致下調(diào)或防止細(xì)胞因子-1表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這種使細(xì)胞因子-1表達(dá)的下調(diào)或沉默與用細(xì)胞因子-1抑制劑來預(yù)防和/或治療疾病有相同效果。
所以，當(dāng)需要減少例如炎癥性疾病中IL-18的作用，或者抑制轉(zhuǎn)移形成時，增加細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的數(shù)量或活性是有利的。IL-18BP可與細(xì)胞因子-1如IL-1F7b共給予，用于治療有需要的受試者。
然而，當(dāng)要求增強(qiáng)IL-18作用例如治療/預(yù)防腫瘤或者治療或預(yù)防病毒性疾病的某些情況下，可能希望減少細(xì)胞因子-1如IL-1F7b的數(shù)量或降低其活性。所以，使用細(xì)胞因子-1優(yōu)選IL-1F7b作為靶也在本發(fā)明構(gòu)思中。
實(shí)施例實(shí)施例1IL-1F7b對刺激IFNγ產(chǎn)生的影響基于已報(bào)導(dǎo)的IL-1F7b能與IL-18Rα鏈結(jié)合(Pan 2001，Kumar 2002)，設(shè)計(jì)了一些實(shí)驗(yàn)用來評估IL-1F7b是否象IL-18一樣在結(jié)合IL-18α受體后刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IFNγ。以下實(shí)驗(yàn)采用全長分子(IL-1F7b前體)或成熟分子(成熟IL-1F7b)，它們都是在預(yù)計(jì)ICE-切割位點(diǎn)上使用E21為N-末端。人NKO細(xì)胞(Kim 2000)、全人血培養(yǎng)基、外周血單核細(xì)胞(PBMC)(用來自Preprotech的IL-121ng/ml協(xié)同刺激)(PBMC的制備見實(shí)施例8)或者KG-1細(xì)胞(用TNFα10ng/ml協(xié)同刺激)(該細(xì)胞系自ATCC Rockville，MD獲得)都用100ng/ml重組IL-1F7b(前體或成熟形式，實(shí)施例5)或IL-18刺激。刺激后18小時(KG-1是48小時)在細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中測量IFNγ(按照Puren(1998)的液相電化學(xué)發(fā)光(ECL)法測量)。IL-18明顯地刺激IFNγ的產(chǎn)生(圖2A)，而IL-1F7b的前體或成熟形式都不能刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。
所以，IL-1F7b與IL18不同，與IL-18Rα鏈結(jié)合后不能引發(fā)IFNγ的產(chǎn)生，即IL-1F7b與IL-18Rα鏈結(jié)合不能募集IL-18Rβ鏈，因而無法形成具有功能活性的三元復(fù)合物。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試IL-1F7b是否用作IL-18拮抗劑，防止IL-18與IL-18Rα鏈結(jié)合并最終抑制它的生物活性及1FNγ的產(chǎn)生。在IL-12(1ng/ml)和遞增濃度的IL-1F7b前體或成熟IL-1F7b存在下用IL-18(20ng/ml)刺激人NK細(xì)胞系，并監(jiān)測所產(chǎn)生的IFNγ。得到的結(jié)果顯示IL-1F7b前體或成熟IL-1F7b沒有抑制IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ，即使當(dāng)IL-1F7b的濃度過量IL-18高達(dá)40倍(圖2B)，或者在加入IL-18前先使IL-1F7b與測試細(xì)胞預(yù)培育一段長時間也是這樣。人PBMC也獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
這些結(jié)果顯示IL-1F7b既不能刺激也不能抑制IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ。
實(shí)施例2IL-1F7b與IL-18受體結(jié)合的特性分析據(jù)報(bào)導(dǎo)，IL-18通過第三個胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合于IL-18Rα(IL-18RαD3)(Azam 2002)。為了特性分析IL-1F7b與IL-18Rα的結(jié)合，在大腸桿菌中單個地表達(dá)IL-18Rα的第三個胞外結(jié)構(gòu)域(D3)作為his6標(biāo)記蛋白質(zhì)，并通過Talon-親和色譜法純化。然后，使IL-1F7b與這樣純化的IL-18RαD3培育，并進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(實(shí)施例7)。如圖3A所示，SDS-PAGE和Western blot分析揭示43kDa復(fù)合物對應(yīng)于交聯(lián)的IL-1F7b和IL-18RαD3。發(fā)現(xiàn)IL-1F7b前體或成熟IL-1F7b都與IL-18Rα交聯(lián)。這些結(jié)果提示，IL-18RαD3是與IL-1F7b結(jié)合的關(guān)鍵，這一結(jié)構(gòu)域以前已被證實(shí)對結(jié)合于IL-18是非常重要的。
在IL-18與IL-18Rα結(jié)合后，IL-18Rβ被募集并且形成一個活性三元復(fù)合物IL-18/IL18Rα/IL-18Rβ。因此，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)IL-18Rα與IL-1F7b的結(jié)合是否類似IL-18，可以引發(fā)形成三元復(fù)合物IL-1F7b/IL18Rα/IL-18Rβ。在Cos細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IL-18Rα和IL-18Rβ的胞外結(jié)構(gòu)域，以確保正確的翻譯后修飾，例如糖基化(Azam 2002)。IL-18、IL-18Rα和IL-18Rβ經(jīng)過培育和化學(xué)交聯(lián)后，在對該交聯(lián)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析中觀察到一個由IL-18Rα、IL-18Rβ和IL-18組成的高分子量復(fù)合物(圖3B)。不過，與IL-18不同，當(dāng)將IL-1F7b前體或成熟IL-1F7b與IL-18Rα和IL-18Rβ一起培育，觀察不到這樣的三元復(fù)合物(圖3B)。
這些結(jié)果顯示IL-1F7b與IL-18Rα結(jié)合后沒有形成一個活性三元復(fù)合物，即IL-18Rβ沒有被募集。
實(shí)施例3IL-1F7b與IL-18BP的結(jié)合比較IL-18和IL-1F7b的氨基酸序列。如圖1所示，IL-1F7b與IL-18都有兩個保守性氨基酸，后者的保守性氨基酸是E42和K89。E42和K89已被證明對IL-18的活性及結(jié)合于IL-18BP起著關(guān)鍵作用(Novick 1999)。因此，基于IL-1F7b和IL-18的序列相似性，研究IL-1F7b與IL-18BP結(jié)合的可能性。
在IL-18BP存在或不存在下培育IL-1F7b(前體或成熟形成，1.5μg)或者IL-18(1.5μg)，并與交聯(lián)劑BS3作用(實(shí)施例7)。制備兩個對照組，每組均只含有IL-18BP蛋白質(zhì)，將其中一個對照組在交聯(lián)劑BS3存在下培育，另一個對照組在交聯(lián)劑BS3不存在下培育。還原條件下將這些蛋白質(zhì)在10％SDS-PAGE上分離，硝基纖維素印跡。使用對IL-1F7b或?qū)L-18特異的多克隆抗體經(jīng)印跡檢測蛋白質(zhì)。簡要結(jié)果示于圖4A中，檢測到除了含有IL-18BP外還有IL-1F7b前體、成熟IL-1F7b或IL-18的組有新條帶，但對照組沒有。經(jīng)過印跡鑒定到約66kDa的新條帶是含有與IL-18BP交聯(lián)的IL-1F7b前體，約64kDa的新條帶是含有與IL-18BP交聯(lián)的成熟IL-1F7b(圖4A)。
還進(jìn)行免疫沉淀研究，所用的IL-1F7b(10μg)或IL-18(10μg)在IL-18BP(10μg)存在或不存在下培育，并進(jìn)行交聯(lián)。采用對IL-18BP特異的單克隆抗體使與IL-18BP結(jié)合和交聯(lián)的蛋白質(zhì)共免疫沉淀。免疫復(fù)合物在SDS-PAGE上分離，硝基纖維素印跡。使用對IL-1F7b或?qū)L-18特異的抗體產(chǎn)生印跡。
在IL-18BP的共沉淀研究中發(fā)現(xiàn)相同的64和66kDa條帶(圖4B)。這些交聯(lián)帶64和66kDa分別表示成熟IL-1F7b/IL-18BP和IL-1F7b前體/IL-18BP的復(fù)合物。這些結(jié)果確認(rèn)了IL-1F7b與IL-18BP結(jié)合。
實(shí)施例4IL-1F7b對抑制IL-18BP介導(dǎo)的IL-18活性的影響基于IL-1F7b與IL-18BP(見前一實(shí)施例)，可能與結(jié)合IL-18的同一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合的發(fā)現(xiàn)，研究IL-1F7b對抑制IL-18BP介導(dǎo)的IL-18活性的影響。研究的一個假設(shè)是IL-1F7b可與IL-18競爭結(jié)合于IL-18BP，因此在IL-1F7b存在下IL-18BP中和的IL-18較少。
使成熟IL-1F7b 250ng/ml或IL-1F7b前體250ng/ml與IL-18(25ng/ml)和增加濃度的IL-18BP(1.56-50ng/ml)在96孔微滴定板上培育1小時，然后與IL-12(1ng/ml)一起加入到NKO細(xì)胞(0.5×106/ml)。培育16小時后，收集上清液并監(jiān)測IFNγ(參照上文引用的Puren(1998)的液相電化學(xué)發(fā)光(ECL)法測量)。
結(jié)果顯示，低濃度IL-18BP時與假設(shè)相反，IL-IF7b的存在增加了IL-18BP抑制IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ的能力(圖5A和B)。IL-18BP為6.25ng/ml和在成熟IL-1F7b存在下，IL-18的活性從76％減至55％(活性降低21％)。IL-18BP為3.12ng/ml和在成熟IL-1F7b存在下，IL-18的活性從59％減至40％(活性降低19％)。在此試驗(yàn)中IL-1F7b前體的活性比成熟IL-1F7b的活性弱(圖5B)。IL-1F7b的這一作用重現(xiàn)性很高，并且只在IL-18BP濃度低的情況下看到。用PBMC也獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例5IL-1F7b的定位從多克隆兔抗IL-1F7b血清純化得到對IL-1F7b特異的IgG，并用來研究IL-1F7b在人PBMC中的表達(dá)。使用兩個不同方法測試兔抗IL-1F7b血清和IgG制劑的特異性，所述方法采用IL-1F7b cDNA轉(zhuǎn)染的RAW264.7巨噬細(xì)胞。首先，IL-1F7b抗血清特異性地識別IL-1F7b轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中的IL-1F7b(圖6)。其次，通過共焦數(shù)字顯微鏡方法，經(jīng)親和純化的抗IL-1F7b IgG識別轉(zhuǎn)染的RAW264.7中的IL-1F7b表達(dá)，但不模擬對照細(xì)胞(未示出)。采用1μg/ml親和純化的多克隆兔抗人IL-1F7b-IgG使新鮮分離的人PBMC(實(shí)施例8)相對于IL-1F7b染色。以共焦激光顯微鏡積層觀察表達(dá)IL-1F7b的人血單核細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)IL-1F7b在位于質(zhì)膜內(nèi)表面的細(xì)胞質(zhì)以及在細(xì)胞核中表達(dá)(未示出)。觀察不到淋巴細(xì)胞群染色。
實(shí)施例6蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化采用以下寡核苷酸引物從人脾文庫(ClontechHLOOllB，BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA)克隆IL-1F7b cDNA有義引物5′GTTGAGTAATAAACTCAACG(SEQ ID NO1)，反向引物5′GTTCAATGGGGCAGTTTC(SEQ ID NO2)(對克隆AF200496有特異性(GenBank)(Kumar 2000)。用第二對引物導(dǎo)入切割位點(diǎn)(5′端為EcoRI，3′端為XbaI)再擴(kuò)增IL-1F7b cDNA(有義引物5′-ATATGAATTCATGTCCTlTGTGGGGGAG(SEQ ID NO3)；反向引物5′-TATATCTAGAAGTTTCCTAATCGCTGACC(SEQ ID NO4)。按照制造商的說明，用TA-克隆將IL-1F7b cDNA轉(zhuǎn)染到pGEM-T Easy(Promega Corp.Medison，WI)，并驗(yàn)證正確序列。然后把IL-1F7b cDNA與pPROEXTMHTa(Gibco-BRL)連接，以便用EcoRI和XbaI位點(diǎn)作細(xì)菌表達(dá)。pPROEXTMHTa載體含有一個N-末端Hisx6 tag，用于親和純化該表達(dá)蛋白。將pPROEXTMHTa/IL-IH4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為感受態(tài)大腸桿菌株DH5a(Gibco-BRL)。在含100μg/ml氨芐青霉素的200ml LB培養(yǎng)基中加入過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)液(10ml)，一直培育至密度為0.6-1OD600。
通過加入異丙基硫代半乳糖苷(0.3mM)并在37℃搖動培育3小時，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。離心(5,000xg，15分鐘，4℃)收獲細(xì)菌，沉淀物懸于25ml Talon緩沖液(50mM NaH2PO4，20mM Tris-HCI，100mM NaCl，pH 8)中。先用冰上超聲波降解法(4×10秒裂解)再用離心法(4,000xg，30分鐘，4℃)溶解細(xì)胞。以8M尿素處理從內(nèi)含體回收IL-1F7b。通過離心、對Talon緩沖液透析和加在2ml mini-Talon柱上處理消除經(jīng)尿素處理后的上清液。所用的柱先用30床體積的Talon緩沖液洗滌再洗脫，洗脫液為5毫升100mM在Talon緩沖液中的咪唑。含親和純化的IL-1F7b的洗脫液經(jīng)制備SDS-PAGE分離。凝膠以考馬斯藍(lán)(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)染色，切除含IL-IH4的條帶。按照標(biāo)準(zhǔn)方案(Rockland Inc.Gilbertsville，AP)采用含IL-1F7b的凝膠在兔中產(chǎn)生多克隆血清。按照已有技術(shù)(Kumar 2002)，在大腸桿菌中產(chǎn)生全長(前體)和成熟IL-1F7b(N-末端E21)，用于生物分析和交聯(lián)研究。
實(shí)施例7蛋白質(zhì)的交聯(lián)將純化蛋白質(zhì)與30μl PBS混合，冰上培育2小時。
然后，在1mM終濃度中加入BS3(二(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯)(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)，混合物室溫培育1小時。加入Tris-CI，pH 7.4，(20mM終濃度)使反應(yīng)淬滅。沸騰5分鐘后，還原條件(50mM DTT)下用10％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，硝基纖維素印跡。利用針對人IL-18BP、IL-1F7b或IL-18的兔抗血清(稀釋1∶500)檢測交聯(lián)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例8PBMC的分離從除去血小板的剩余白細(xì)胞或者從健康供者的肝素化血液純化得到PBMC。除去血小板的白細(xì)胞或全血用鹽水以1∶1稀釋，按照已有技術(shù)(Kim2001)施加于Ficoll-Histopaque梯度(Sigma)。離心后從界面收獲細(xì)胞，用鹽水洗三次，重懸于RPMI。將分離出來的PBMC冰上保存直至開始進(jìn)行試驗(yàn)。
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權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1能夠結(jié)合IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1屬于IL-1家族。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1是IL-1F7b。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-2受體是IL-18R。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1的抑制涉及細(xì)胞因子-1與細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還含有IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
10.一種包含細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的編碼序列的載體在制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1能夠結(jié)合IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1屬于IL-1家族。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1是IL-1F7b。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-2受體是IL-18R。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1的抑制涉及細(xì)胞因子-1與細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈的結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還含有IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼細(xì)胞因子-1的載體可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
19.一種內(nèi)源基因激活細(xì)胞因子-1的載體在治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體而引起或加重的疾病中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1能夠結(jié)合IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1屬于IL-1家族。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1是IL-1F7b。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-2受體是IL-18R。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1的抑制涉及細(xì)胞因子-1與細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈的結(jié)合。
24.根據(jù)權(quán)利要求19至23中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防炎癥性疾病，其選自內(nèi)毒素致死性(膿毒癥)、毒素或激活T細(xì)胞或丙肝引起的肝損傷、關(guān)節(jié)炎、肺損傷、牛皮癬、炎癥性腸病、腦損傷、缺血性損傷、心功能不全和神經(jīng)炎。
25.根據(jù)權(quán)利要求19至23中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防轉(zhuǎn)移形成。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還含有IL-18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段。
27.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼細(xì)胞因子-1的載體可全身、皮下和/或肌內(nèi)給予。
28.一種細(xì)胞因子-1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段的抑制劑在治療或預(yù)防因誘導(dǎo)細(xì)胞因子-2受體可預(yù)防或減緩的疾病中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子-1能夠結(jié)合IL-18BP或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、或片段，和能夠抑制所述細(xì)胞因子-2受體，該細(xì)胞因子-2是IL-1家族成員。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述細(xì)胞因子-1的抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1屬于IL-1家族。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述細(xì)胞因子-1的抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1是IL-1F7b。
31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任何一項(xiàng)所述細(xì)胞因子-1的抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-2受體是IL-18R。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至31中任何一項(xiàng)所述細(xì)胞因子-1的抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子-1的抑制涉及細(xì)胞因子-1與細(xì)胞因子-2受體的信號傳導(dǎo)鏈的結(jié)合。
33.根據(jù)權(quán)利要求28至32中任何一項(xiàng)所述細(xì)胞因子-1的抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防病毒性疾病。
34.根據(jù)權(quán)利要求28至32中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，用于治療或預(yù)防癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞因子－1或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段在制備治療或預(yù)防因誘導(dǎo)所述細(xì)胞因子－2受體而引起或加重的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞因子－1優(yōu)選來自IL－1家族，更好是IL－1F7b，能夠結(jié)合IL－18BP或其突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物或片段，和能夠抑制細(xì)胞因子－2受體，該細(xì)胞因子－2是IL－1家族成員，優(yōu)選IL－18。
文檔編號C07K1/00GK1909926SQ200380104894
公開日2007年2月7日 申請日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
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