專利名稱：抗“sars”病毒高免血清及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗“SARS”病毒高免血清及其制備方法，更具體地講，本發(fā)明涉及一種以滅活的“SARS”病毒為抗原制得的抗“SARS”病毒高免血清及其制備方法。
背景技術(shù)：
SARS病毒是在去年我國乃至世界范圍內(nèi)肆虐的SARS病的元兇。它的傳播嚴(yán)重影響了人們的正常生活秩序?！癝ARS”病毒是一種嶄新的冠狀病毒，非某種已知冠狀病毒的近期變種。冠狀病毒是一種RNA病毒。2003年3月以來，國內(nèi)外相繼報(bào)道了引起SARS冠狀病毒的基因序列，該病毒含有完整的5’末端序列、編碼序列和3’末端序列，全RNA基因組長度為29727核苷酸，基因編碼區(qū)的組成結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒類似，包括多個開放閱讀框架(ORFS)，分別編碼病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和結(jié)構(gòu)蛋白。
球蛋白制劑是最常見的免疫血清，球蛋白制劑有破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽毒素、肉毒抗毒素、抗炭疽血清等。目前，市場上常見的球蛋白制劑有抗狂犬病血清、抗蛇毒血清?？箍袢⊙逵煽袢《久庖唏R，經(jīng)胃蛋白酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑。用于配合抗狂犬病疫苗對被瘋動物嚴(yán)重咬傷如頭、臉、頸部或多部位咬傷者進(jìn)行預(yù)防注射，被瘋動物咬傷后注射愈早愈好，咬后48小時(shí)之內(nèi)注射，可減少發(fā)病率?？股叨狙逵蒙叨久庖唏R后的馬血漿精制而成，供治療蛇咬傷者之用。
我國的專利申請03128064.1公開了一種用于治療和預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的馬抗嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥血清，它是由組織培養(yǎng)SARS滅活病毒免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑，具有特異性中和SARS病毒的作用，用于受SARS病毒感染病人的治療，還可用于高危人群的預(yù)防。通常采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。
我國的專利申請03128116.8公開了一種用于預(yù)防和治療SARS的免疫制劑，它是由SARS病人恢復(fù)期血漿或者含高效價(jià)SARS病毒抗體的健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取并經(jīng)病毒滅活處理制備的人SARS免疫球蛋白，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，還可用于高危人群的預(yù)防。
至今，人們?nèi)晕从幸环N能有效地治療SARS的藥物。明年SARS病毒有可能會卷土重來，威脅人類的健康。因此，研究有效治療和預(yù)防SARS的藥物的任務(wù)迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供了一種制備治療SARS病毒(SARSV)的高免血清的方法。
本發(fā)明制備抗“SARS”病毒高免血清的方法包括以下步驟(1)用甲醛滅活的方法或溫度滅活的方法對“SARS”病毒進(jìn)行滅活，制得滅活的“SARS”病毒；(2)用滅活的“SARS”病毒與免疫佐劑混合后注射到動物體內(nèi)；
(3)采集免疫后動物的血液；(4)從步驟(3)所采集的血液中分離出血清。
該方法還可以進(jìn)一步包括如下步驟(5)從步驟(4)所得到的血清中進(jìn)一步分離出有效成分；(6)對步驟(5)所得到的有效成分進(jìn)行精制和純化。
上述制備方法是基于下面的原理滅活的“SARS”病毒中的抗原成分可以誘導(dǎo)和刺激動物產(chǎn)生高滴度中和抗體，而這種中和抗體又可以在人體內(nèi)與“SARS”病毒特異性結(jié)合，清除進(jìn)入體內(nèi)的“SARS”病毒而達(dá)到治療“SARS”的目的。
本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)這一原理，利用在廣州分離獲得的“SARS”病毒，經(jīng)滅活后制成滅活疫苗，然后與可以加強(qiáng)免疫刺激效應(yīng)的佐劑一起注射到馬、豬等動物體內(nèi)。證實(shí)產(chǎn)生高免抗體后，從血液中提取血清成分。本項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)在于用新發(fā)現(xiàn)的“SARS”病毒制備治療型高免抗體。
在上述制備方法的步驟(1)之前，還可以包括對“SARS”病毒進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
在步驟(1)中，采用的滅活方法可以是甲醛滅活方法，或者是溫度滅活方法。滅活之后要進(jìn)行檢測，以確保滅活的“SARS”病毒無致病能力。滅活條件的控制關(guān)鍵在于控制滅活溫度、時(shí)間以及甲醛濃度。
如果選用甲醛進(jìn)行滅活，則甲醛的濃度可以控制在0.10％-1.00％的范圍內(nèi)，優(yōu)選為0.15％-0.60％的甲醛，滅活的時(shí)間為數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)。例如，采用0.2％的甲醛滅活SARS病毒24小時(shí)以上，或者0.4％的甲醛滅活SARS病毒2小時(shí)以上，都可以使SARS病毒喪失感染性，滅活率為100％，而病毒滅活前后抗原性不受影響。盡管0.2％的甲醛作用24小時(shí)以上可以滅活病毒，但能檢測出高拷貝的核酸，因此更優(yōu)選采用0.4％的甲醛滅活24小時(shí)作為滅活SARS疫苗的條件。這種滅活方法能有效地滅活病毒，并且滅活前后抗原性不受影響。
如果選用溫度滅活，則滅活溫度一般控制在46-66℃范圍內(nèi)，滅活時(shí)間一般控制在10-100分鐘范圍內(nèi)。溫度滅活可以在水浴中進(jìn)行。
在步驟(2)中用滅活的“SARS”病毒免疫動物時(shí)，為加強(qiáng)免疫效果和獲得高含量抗體，優(yōu)選將免疫佐劑和滅活的“SARS”病毒混合后肌肉注射到動物體內(nèi)。其中，免疫的動物可以是小鼠、大鼠、兔、豬、牛、猴或馬，優(yōu)選為馬或豬。
免疫的方法既可以是單獨(dú)用滅活的“SARS”病毒(“SARS”滅活疫苗)免疫動物，也可以采用“SARS”滅活疫苗與流感疫苗聯(lián)合對動物進(jìn)行免疫。為了特異性地提高人體對“SARS”病毒和流感病毒的免疫功能，優(yōu)選采用“SARS”滅活疫苗與流感疫苗聯(lián)合對動物進(jìn)行免疫，更優(yōu)選將免疫佐劑和“SARS”滅活疫苗與流感疫苗混合后肌注到動物體內(nèi)。
本發(fā)明所使用的免疫佐劑可以是如下物質(zhì)中的一種或幾種佛氏佐劑(Freund’s adjuvant，包括佛氏完全佐劑(FCA)和佛氏不完全佐劑(FIA))、氫氧化鋁和CpG，優(yōu)選為佛氏完全佐劑或佛氏不完全佐劑，更優(yōu)選為佛氏完全佐劑和佛氏不完全佐劑。
免疫程序分基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫?；A(chǔ)免疫一般注射兩次抗原，第一次用FCA+SARSV，第二次及其以后用FCA+SARSV。加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫的數(shù)天后進(jìn)行接種方法可以是背部多點(diǎn)皮下注射、背部多點(diǎn)肌肉注射、臀部肌肉注射。選擇合適的免疫的時(shí)間間隔和長度可以達(dá)到較好的免疫效果。
在步驟(4)中，所采用的分離血清的方法為常溫自然凝聚法或鉛塊壓出法。
可以考慮進(jìn)行步驟(5)和(6)的原因是動物的血清直接注射給人可能會引起副反應(yīng)。因此可以對血清進(jìn)行純化和提取有效成份分離出血清中的免疫球蛋白G(IgG)。IgG的分離、精制和純化的方法是用層析柱IgG。用酶切的辦法將有效成份IgG消化成片段，再用凝膠層析法提取有效片段，去掉無效成份。酶優(yōu)選為木瓜蛋白酶。然后進(jìn)行柱親和純化。
在步驟完成(4)或完成(5)和(6)之后可以進(jìn)行鑒定、活性檢測，例如用蛋白測定法檢測濃度，用中和抗體試驗(yàn)檢測血清、IgG以及Fab片段，得到中和“SARS”病毒的效價(jià)。還可以對產(chǎn)品在無菌條件下分裝。
本發(fā)明采用的是動物血清成份。雖然動物血清成份用于人體不如人緣血清，但目前的國內(nèi)外技術(shù)均還不能把動物血清人源化，而且靠收集“SARS”患者的血清無法大量地制備抗“SARS”病毒高免血清。因此本發(fā)明是適合工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。用這種方法制得的高免血清對提升人體抗“SARS”病毒感染的能力具有明顯效果，對其他病毒或微生物無交叉反應(yīng)，對人體無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，填補(bǔ)了“SARS”治療無有效和特異藥物的國內(nèi)外空白。
以下結(jié)合實(shí)施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，任何依照本發(fā)明的基本精神的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中使用的動物1.動物選擇選擇3-5歲膘情好、未經(jīng)免疫的深色馬(紅棕色或黑色，白色、青色馬不用)，免疫前飼養(yǎng)90天以上，進(jìn)行馬傳貧、鼻疽、布病檢查，選出健康馬用于動物免疫。所用馬匹包括長春馬和廣東馬。
2.動物飼養(yǎng)場所選擇與管理選擇遠(yuǎn)離其它動物飼養(yǎng)場所的圈舍作為飼養(yǎng)場所，動物進(jìn)入一周前進(jìn)行消毒。專人飼養(yǎng)，器械及用具專用，在飼養(yǎng)場所及周圍置警示牌避免閑人進(jìn)入。動物排泄物消毒后深埋。
實(shí)施例1.抗原制備以250ml log 10-6.7TCID50/ml的SARS病毒細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原，以0.4％甲醛進(jìn)行滅活，5000g×30分鐘離心取上清，20000-25000g超速離心1.5h取沉淀，滅菌蒸餾水16×稀釋。制備佛氏完全佐劑(FCA)(為Sigma的產(chǎn)品)與不完全佐劑(FIA)(為Sigma的產(chǎn)品)用于免疫。
實(shí)施例2.免疫程序用實(shí)施例1制備的抗原免疫3匹廣東馬。免疫可分為基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫。
基礎(chǔ)免疫一般注射兩次抗原，第一次用FCA+SARSV，第二次及其以后用FIA+SARSV?；A(chǔ)免疫(見表1)第二次10-14天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫的第24天后進(jìn)行(見表2)。
表1基礎(chǔ)免疫

表2加強(qiáng)免疫

實(shí)施例3.血清分離與保存按實(shí)施例2免疫的步驟免疫后3匹廣東接種的馬，于末免7天后采血，并隔一天第二次采血，采血前12小時(shí)不喂飼料，但不限飲水，采血量按17-19ml/Kg體重計(jì)算，每次免疫之前采10-20ml血液分離血清備檢。
采馬全血至1000或2000ml量筒中，以鉛塊壓出法分離血清，-20℃保存。
實(shí)施例4.IgG的分離稱量實(shí)施例3分離出的馬血清100ml，置磁力攪拌器上攪拌。加入200ml的60Mm的醋酸鈉緩沖液(pH4.0)，調(diào)整pH至4.8。緩慢滴加辛酸，室溫下繼續(xù)攪拌30分鐘，每10ml加辛酸1.5ml。5000g離心30分鐘，保留上清液。用1M NaOH調(diào)節(jié)pH至5.7。含有IgG的上清液對PBS透析，然后分裝，置-20℃保存。
實(shí)施例5.馬免疫接種SARS滅活疫苗ELISA檢測抗體采用間接ELISA法(1)用Ph9.6的碳酸緩沖液將SARS滅活疫苗1∶100稀釋后包被96孔板，4℃過夜；(2)以15％小牛血清PBST(1‰吐溫)進(jìn)行封閉；(3)樣本血清用含5％馬血清PBST稀釋100倍后加樣；(4)加HRP標(biāo)記的單抗鼠IgG抗體；(5)加鄰苯二胺底物液及H2O2，避光顯色；(6)用2M的H2SO4終止反應(yīng)；(7)用Bio-Rad505酶標(biāo)儀測各孔490nm的吸光值。
間接ELISA法檢測抗體結(jié)果在廣東接種的3匹馬，免疫接種第兩個月后，ELISA檢測的抗體滴度高達(dá)1∶40960。
實(shí)施例6.免疫后中和抗體檢測1.病毒稀釋 將滴定后的病毒稀釋成100TCID50/25ul。
2.動物血清SARS病毒免疫接種馬不同時(shí)期的血清，將血清在無菌的96孔板上從1∶10開始，連續(xù)倍稀釋至1∶10240，每一稀釋度2孔，同時(shí)采集免疫接種前的各種動物作為對照用。
3.中和試驗(yàn) 在以上血清稀釋孔內(nèi)加入25ul 100TCID50/25ul的Z2-Y3病毒應(yīng)用液，輕輕搖勻后置36℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照與病毒滴度回滴實(shí)驗(yàn)。
4.結(jié)果的觀察 從第4天起觀察結(jié)果，滴天(細(xì)胞100％出現(xiàn)病變)判定結(jié)果。
中和抗體檢測結(jié)果在廣東接種的3匹馬，免疫接種60后，中和抗體效價(jià)為1∶6400。
實(shí)施例7.6匹長春馬免疫后中和抗體檢測按實(shí)施例2-7的方法免疫在長春免疫的6匹馬，免疫接種20天時(shí)后，中和抗體效價(jià)為1∶2560-5120。
實(shí)施例6和7的結(jié)果表明，用SARS滅活疫苗免疫馬均能產(chǎn)生較高的保護(hù)性抗體(中和抗體)。
實(shí)施例8.在豬的體內(nèi)提取高免血清的方法免疫豬，步驟參照實(shí)施例2-7。
權(quán)利要求
1.一種制備抗“SARS”病毒高免血清的方法，所述的方法包括以下步驟(1)用甲醛滅活的方法或溫度滅活的方法對“SARS”病毒進(jìn)行滅活，制得滅活的“SARS”病毒；(2)用滅活的“SARS”病毒與免疫佐劑混合后注射到動物體內(nèi)；(3)采集免疫后動物的血液；(4)從步驟(3)所采集的血液中分離出血清。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法還進(jìn)一步包括如下步驟(5)從步驟(4)所得到的血清中進(jìn)一步分離出有效成分；(6)對步驟(5)所得到的有效成分進(jìn)行精制和純化。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所采用的甲醛滅活的濃度范圍為0.10％-1.00％，所采用的溫度滅活的溫度范圍為46-66℃。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所采用的免疫佐劑為佛氏完全佐劑和/或佛氏不完全佐劑。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所采用的動物為馬或者豬。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所采用的分離血清的方法為常溫自然凝聚法或鉛塊壓出法。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(5)中，所分離出的有效成分為免疫球蛋白G。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(6)中，所采用的精制和純化的方法為先用酶消化的方法將免疫球蛋白G消化成片段，然后提取其有效片段，去掉無效成份。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的酶消化的方法為木瓜蛋白酶酶切法。
10.一種按照上述權(quán)利要求之一所述方法制備的抗“SARS”病毒高免血清，其特征在于，所述的抗“SARS”病毒高免血清是以滅活的“SARS”病毒為抗原制得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗“SARS”病毒高免血清及其制備方法。本發(fā)明的方法包括如下主要步驟對“SARS”病毒進(jìn)行滅活；用滅活的“SARS”病毒與免疫佐劑混合后注射到動物體內(nèi)；采集免疫后動物的血液；將所采集的血液中分離出血清。該方法還可以進(jìn)一步包括如下步驟將所得到的血清中進(jìn)一步分離出有效成分；將所得到的有效成分進(jìn)行精制和純化。本發(fā)明所制備的抗“SARS”病毒高免血清對提升人體抗“SARS”病毒感染的能力具有明顯效果，對人體無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07K16/10GK1546172SQ20031011237
公開日2004年11月17日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者陸家海, 王一飛, 潘興華 申請人:陸家海