專利名稱：膠原蛋白及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法。本發(fā)明特別涉及到一種以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法，其中包括將有機酸緩沖液施用于所述動物皮以提取膠原蛋白。
背景技術：
膠原蛋白是一種占哺乳動物蛋白質(zhì)總量約30％的物質(zhì)(參見L.C.Junqueira and J.Carneiro，Basic History，4th ed.，Lange MedicalPublications，Los Altos，Calif. ，pp.89-119).膠原蛋白是結締組織，如皮膚、腱束和骨的主要結構蛋白，具有獨特的氨基酸組成和結構。重要地是，膠原蛋白螺旋結構的主要部分在各類哺乳動物中變化極小。
來自哺乳動物的膠原蛋白實際是同一類蛋白質(zhì)，由幾種不同類型的細胞生成。在該蛋白質(zhì)家族中，不同類型的膠原蛋白通過它們的化學組成、不同的形態(tài)以及病理特征、在組織中的分布和它們的功能區(qū)分開來。
至少存在十二種在遺傳學上類型明顯不同的膠原蛋白。最常見的I型膠原蛋白由三條多肽鏈組成。兩條鏈完全相同，稱為α1，第三條稱為α2。I型膠原蛋白構成了軟結締組織(皮、腱)和硬結締組織(骨和牙齒)膠原蛋白的主要部分。II型膠原蛋白是軟骨中的主要膠原蛋白，由三條α1鏈組成。III型膠原蛋白由三條α1鏈組成，在血管、傷口和某些腫瘤里都有發(fā)現(xiàn)。
膠原蛋白的諸多性質(zhì)使之成為極具吸引力的可用于多種醫(yī)療用途的材料，例如植入、移植、器官置換、組織修復、玻璃體置換、整形和美容外科、外科縫合、外科創(chuàng)傷、燒傷敷料，等(參見U.S.Pat.Nos.5,106,949，5,104,660，5,081,106，5,383,930，4,485,095，4,485,097，4,539,716，4,546,500，4,409,332，4,604,346，4,835,102，4,837,379，3,800,792，3,491,760，3,113,568，3,471,598，2,202,566和3,157,524，這些提及的文獻均作為參考；J.F.Prudden，Arch.Surg.891046-1059 ；和E.E.Peacock等.Ann.Surg.，161238-247 )。例如，就其本身而言，膠原蛋白之所以是相對弱的免疫原，至少部分是因為膠原蛋白的結構掩蓋了潛在的抗原決定簇。并且具有螺旋結構的膠原蛋白可以抵抗蛋白水解作用。此外，它還是天然的細胞粘著材料和肌肉骨骼系統(tǒng)的主要的抗拉承重部分。因此，膠原蛋白產(chǎn)品已產(chǎn)生了廣泛的影響，適用于醫(yī)療和獸醫(yī)領域。
膠原蛋白可以多種方式制備，可按不同的方法從各種組織中制得。一種最易得的膠原蛋白是“天然”膠原蛋白，它具有多種特性，包括低抗原性和抗酶消化性。高度分散的天然膠原蛋白分散體在化妝品、食品和制藥工業(yè)中具有廣泛的現(xiàn)行或潛在的用途。
然而盡管優(yōu)勢明顯，膠原蛋白來源的材料在商業(yè)上獲得的成功僅限于利用了膠原蛋白特性的幾種專門產(chǎn)品。商用膠原蛋白來源材料和生物技術產(chǎn)品的短缺原因主要包括制備純膠原蛋白的高成本、分離出的膠原蛋白的易變性以及處理和儲存膠原蛋白的難度。
本申請的申請人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)了一種非常簡單的技術，使用它能以動物皮為原料制得高收率的天然可溶性膠原蛋白和分散的不溶膠原蛋白，成本低廉且克服或至少緩解了以前遇到的問題。特別地，申請人發(fā)現(xiàn)用適當?shù)挠袡C酸緩沖液處理動物皮，酶溶性天然膠原蛋白的收率獲得了提高。
發(fā)明概述泛言之，本發(fā)明提供了一種以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法，其中包括將有機酸緩沖液施用于所述動物皮充分長的時間以提取膠原蛋白。
更深一層，本發(fā)明提供了膠原蛋白用以制備醫(yī)療和生物技術產(chǎn)品，用于普通外科、皮膚病科、口腔外科、整形和重建外科、神經(jīng)外科、整形外科外科、眼科、血管外科、獸醫(yī)以及其它相關領域。
優(yōu)選天然可溶性膠原蛋白和高度分散的天然膠原蛋白。
本領域普通技術人員很容易理解本發(fā)明公開的方法可適用于從任何一種動物皮中提取膠原蛋白。然而本發(fā)明特別適用于從取自偶蹄目、兔形目、嚙齒目、奇蹄目、食肉目和有袋目的哺乳動物皮中提取膠原蛋白。優(yōu)選的動物皮取自一種動物，該動物選自綿羊、牛、山羊、馬、豬和有袋動物組成的類群。更優(yōu)選的動物皮是綿羊的皮。
有機酸緩沖液可包括本領域已知的任何適用的有機酸。作為優(yōu)選，有機酸是選自醋酸、檸檬酸、丙酮酸、乳酸和甲酸中的一種或多種酸的水溶液或混懸液。更優(yōu)選的有機酸緩沖液由冰醋酸水溶液組成，pH值在3到5之間。更加優(yōu)選的有機酸緩沖液pH值在3.2到4.5之間。最優(yōu)選的有機酸緩沖液的pH值在4.0到4.2之間。
一旦將有機酸緩沖液施用于動物皮后，應允許有充分長的時間進行溫育(incubate)以使羊毛或毛發(fā)松動脫落或除去。溫育優(yōu)選在溫度20到40℃之間、時間8到27個小時之間的條件下進行。接著動物皮被切成或絞成碎片。
作為優(yōu)選，切好或絞碎的皮在非變性條件下同有機酸緩沖液混合成混懸液，在溫度0到30℃之間不停地攪拌，進行溫育。作為優(yōu)選，也可以在一種或多種蛋白酶存在的條件下進行溫育。更為優(yōu)選的蛋白酶選自ESPERASE、ALCALASE、DURAZYM和SAVINASE、MAXATASE、MAXACAL、PROPERASE、MAXAPEM和胃蛋白酶。最優(yōu)選胃蛋白酶。
皮的碎片在有機酸緩沖液和蛋白酶混懸液中溫育，之后混懸液經(jīng)離心和/或過濾，可溶性和/或分散的膠原蛋白被移去。
膠原蛋白可干燥粉碎成粉。膠原蛋白交替經(jīng)過干燥和粉碎后成粉，用有機酸再分散，所得分散體通過冷凍干燥法形成膠原蛋白底物或海綿，冷凍干燥法在Silyer等.U.S.Pat.No.4,703,108中有公開。
更可以想到純化膠原蛋白還可包含一些添加的化合物，包括但不限于抗菌劑、抗病毒劑、生長因子、防脫水化合物、防腐劑或其它化合物，適合在生物醫(yī)學和/或獸醫(yī)上使用。
發(fā)明詳述在描述本方法前要說明，顯然本發(fā)明不限于所述的具體材料和方法，因為這些都可以改變。很顯然這里所用的術語也僅僅為了描述具體的實施方式，并非用于限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只通過所附的權利要求來限定。需要指出的是，在這里以及在所附的權利要求中，所用的單數(shù)形式的指示代詞，如“一種”和“這個”(“a，”“an，”and“the”)都包括了其復數(shù)關系，除非上下文清楚地有了不同的表述。因此，比如，提到“一種有機酸”就是提到了一種和多種有機酸及其為本領域普通技術人員所知的等同物，等等。除非有不同規(guī)定，這里用到的所有技術和科學術語都具有相同的含義，一如本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員通常所理解的那樣。盡管任何與這里所描述的那些相似或等同的材料和方法都可用于實踐或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在只對優(yōu)選的材料和方法進行描述。
所有這里提到的出版物均被引用，以說明并公開這些出版物中報道的方法、記錄和試藥，而這些方法、記錄和試藥可以和本發(fā)明聯(lián)系在一起使用。在這里，沒有任何東西可被解釋為承認了本發(fā)明不具有早于由在先發(fā)明所公開的內(nèi)容的資格。
本發(fā)明涉及到以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法。本發(fā)明特別提供了適合在生物醫(yī)學、獸醫(yī)和其它領域使用的膠原蛋白的制備方法。
這里使用的術語“動物”指的是任何可以按所公開的方法從中提取出膠原蛋白的動物。例如，動物可選自偶蹄目、兔形目、嚙齒目、奇蹄目、食肉目和有袋目的哺乳動物。
偶蹄目包括大約150個現(xiàn)存的物種，分布于9個科豬(豬科)、野豬(Tayassuidae)、河馬(河馬科)、駱駝(駝科(Camelidae))、鼷鹿(鼷鹿科)、長頸鹿和霍加狼(長頸鹿科)、鹿(鹿科)、麋鹿(Antilocapridae)，和牛、綿羊、山羊、羚羊(?？?。許多動物如山羊、綿羊、牛和豬具有非常相似的生物學特性和高度的基因同源性。更重要的是，眾所周知某類動物如山羊、綿羊、馬和驢可以異種交配。
奇蹄目是“奇數(shù)趾”或“奇數(shù)蹄”的哺乳動物，包括犀牛、貘和馬。兔形目包括大鼠、小鼠、家兔、野兔和其它嚙齒類動物，而有袋目包括大袋鼠和小袋鼠。
上述動物類群所有成員的皮都有兩層，即真皮和表皮。表皮分為好幾層，表示發(fā)育連續(xù)的幾級。皮最老的部分是可消耗的外層，堅韌、起保護作用，由死細胞構成，在表面不斷被磨損掉、不斷地被里層的皮所替代。伴隨細胞的生長和成熟，細胞的核逐漸消失，大部分細胞內(nèi)容物轉化成角蛋白，即一種不僅生成皮外保護層，還生成了甲、蹄、毛發(fā)和角等構造的蛋白。
真皮層在表皮之下，是一層厚結締組織，與肌肉、神經(jīng)和血管相連。結締組織含豐富的膠原蛋白。
這里所使用的術語“膠原蛋白”指的是細胞外家族的纖維蛋白，其特征是牢固的三股螺旋結構。三條膠原蛋白多肽鏈(“α-鏈”)相互纏繞形成螺旋結構。該術語也包含各種不同類型的膠原蛋白，盡管優(yōu)選的形態(tài)為I型和III型膠原蛋白。術語“天然膠原蛋白”指的是保留完整的膠原蛋白三螺旋區(qū)域。
如上所述，膠原蛋白螺旋結構的主要部分在不同種類的哺乳動物之間變化極小。實際上，各種類型的膠原蛋白在核苷酸和氨基酸序列上具有高度的同源性。比如，將人類、馬科動物和鼠科動物進行比較，II型αI膠原蛋白核苷酸序列的同源性至少88％。人類和馬科動物在核苷酸水平上序列的同源性達93％，而小鼠和馬科動物的序列同源性達89％。人類和小鼠的核苷酸序列同源性為88％(參見，NCBI accession numbersU62528(Equine)，NM033150(Human)and NM031163(mouse)http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。其它類型的膠原蛋白有程度相似的氨基酸同源性。比如，豬和綿羊的I型αI膠原蛋白之間的核苷酸序列同源性為90％(參見，NCBI accession numbers AF29287(Ovine)andAF201723(Porcine)http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
當上述很多動物都具有水平相同的家系和生物學特性，當許多種動物，如牛、綿羊、小鼠、和豬的膠原蛋白都具有相似的形態(tài)學即皮的構造、高度的氨基酸和核苷酸序列同源性，本領域普通技術人員很容易預見到這里所公開的方法適用于所有動物。
當動物被選來用于提取膠原蛋白時，先除去皮?？梢允褂萌魏伪绢I域已知方法取下動物皮。此外，皮可以取自任何年歲的動物，在優(yōu)選的實施方式中動物是小于14周的小羊。
取下的皮可立即在本發(fā)明的方法中使用，或選擇在低于20℃條件下存放，優(yōu)選在4℃到20℃之間。然而，可以預見在該溫度范圍外過長時間存放對提取出的膠原蛋白的數(shù)量和質(zhì)量有不利影響。
在一個優(yōu)選的實施方式中，將一種或多種有機酸基的緩沖液施用于新鮮動物皮的肉面。這里所用的術語“新鮮”指的是在使用前取下不超過一天的動物皮。優(yōu)選使用前不超過12個小時。更為優(yōu)選取下后8小時內(nèi)使用的動物皮。
有機酸緩沖液優(yōu)選乳酸緩沖液、醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、丙酮酸緩沖液、甲酸緩沖液或其組合；然而，其它本領域已知的有機酸緩沖液也可以使用。
使用醋酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉，鉀鹽及類似鹽也可以，來調(diào)整有機酸緩沖液pH值，優(yōu)選的pH值在3到5之間、更優(yōu)選在3.2到4.6之間。
在另一個更為優(yōu)選的實施方式中，緩沖液由醋酸、乳酸或甲酸中的一種或多種與一種堿金屬(包括銨)或一種堿金屬鹽混合的水溶液或混懸液所組成。也可以使用無機酸和有機酸的混合物。
最優(yōu)選的緩沖液由40％(w/w)的冰醋酸水溶液組成，通過加入大約20％的無水醋酸鈉和需要量的氫氧化鈉將pH調(diào)整至優(yōu)選值(4.0-4.2)。
施用有機酸緩沖液可以通過本領域已知的任何方法。比如，可以通過噴霧、涂抹、浸漬或類似的方法。作為優(yōu)選，施用方法是以每張皮大約50到100ml的比例涂抹。如果有機酸緩沖液作浸漬用或?qū)⑵そ胗袡C酸緩沖液中，有機酸緩沖液需加水稀釋10倍。
施用有機酸緩沖液后，將動物皮在20℃到40℃溫度下溫育8到27個小時。優(yōu)選在溫育過程中有足夠高的相對濕度，以免動物皮干枯。比如，相對濕度高于60％的，優(yōu)選高于80％，更優(yōu)選高于90％的相對濕度。
不受什么特別的理論或假說限制，本申請確信在提取過程階段使用有機酸緩沖液不僅會使羊毛和毛發(fā)的松動脫落，也會使皮上的糖胺聚糖(GAGs)被大量消化。GAGs的去除使得膠原蛋白結構打開，在后續(xù)階段依次促進了酶對膠原蛋白的增溶作用。
這里使用術語“大量”和“大量地”，當其用來描述GAG的去除時，是相對于動物皮中正常GAG量而言，在有機酸緩沖液的初期溫育結束時，被消化掉的GAG量優(yōu)選占所有GAG總量超過70％，更優(yōu)選超過80％，更加優(yōu)選超過90％。
在溫育后用機械或手工方法除去羊毛或毛發(fā)，制得脫毛的皮，這里稱之以術語“生皮(pelt)”。如果羊毛或毛發(fā)具有經(jīng)濟價值可以干燥并包裝，否則棄去。
生皮用機械或手工方法去肉。除去或棄去任何含有殘留羊毛或毛發(fā)的生皮。然后將生皮切成或絞成碎片?？梢允褂萌魏文軌蚴股て扑榈脑O備，包括工業(yè)絞碎器、研磨機或食品處理器。
生皮碎片加入非變性溶液制成一種混懸液。非變性溶液包括一種有機酸緩沖液，混懸液在非變性條件下溫育。這里所使用的術語“非變性條件”指的是膠原蛋白的三螺旋結構得以保存的條件。相應地，在一種優(yōu)選的實施方式中，所用有機酸緩沖液優(yōu)選pH值約為2、在溫度低于25℃條件下使用。
在一種優(yōu)選的實施方式中，有機酸緩沖液包括醋酸、乳酸、甲酸或其組合。有機酸緩沖液的濃度可在0.01M到0.5M之間，更優(yōu)選在0.1M到0.05M之間。優(yōu)選濃度在0.1M和0.05M之間的醋酸。
生皮碎片和非變性溶液相對的比例在10∶1到1000∶1之間?；鞈乙涸谥苽鋾r最好緩緩搖動。搖動的次數(shù)有賴于混懸液中生皮碎片的尺寸，然而，優(yōu)選搖動的力度足以輕輕地移動生皮碎片?；鞈乙簝?yōu)選的溫育溫度在0到30℃之間、溫育時間至少1小時。在一種有優(yōu)選的實施方式中，最多可以溫育7天，然而，溫育時間是由pH值、溫度和生皮的種類一起決定的。
在一個優(yōu)選的實施方式中，在混懸液中引入一種蛋白酶。現(xiàn)有很多合適的蛋白酶在市面上有售或為本領域所公知。比如，合適的蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶類，從特定菌株枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(枯草桿菌蛋白酶BPN和BPN’)中得到。一種合適的蛋白酶是從芽孢桿菌菌株中得到的，在pH值范圍8-12之間活性最強，丹麥的Novo Industries A/S，此后簡稱“Novo”對其進行了研發(fā)并以商品名ESPERASE銷售。對該酶和類似酶的制備在Novo的GB 1,243,784中有述。其它合適的蛋白酶包括來自Novo的ALCALASE、DURAZYM和SAVINASE和來自Gist-Brocades的MAXATASE、MAXACAL、PROPERASE、MAXAPEM(MAXACAL經(jīng)蛋白質(zhì)加工)。蛋白酶中也包括改性細菌絲氨酸蛋白酶，在下述文獻中有述，European PatentApplication Serial Number 87303761.8，申請日April 28，1987(具體頁數(shù)17、24和98)，以及European Patent Application Serial Number199，404，Venegas，出版日期October29，1986，其中提到一種改性細菌絲氨酸蛋白酶。
其它合適的蛋白酶還包括堿性絲氨酸蛋白酶，在EP 909159584中有述，對應WO 91/06637，出版日期May 16，1991。專利申請EP 251 446和WO 91/06637中所述的蛋白酶也適用于本發(fā)明，WO 91/02792中所述的蛋白酶BLAPS和WO 95/23221所述的它們的變種也適用于本發(fā)明。
同樣是得到最高收率的可溶性膠原蛋白，所需時間及所用條件會有很大變化，取決于所需要的酶消化的種類和數(shù)量，從1到10天不等。酶與生皮的重量比值變化很大，從1∶10到1∶1000(w/w)不等。胃蛋白酶是優(yōu)選的酶，該酶與生皮的重量配比約為1∶100。
溫育后可通過沉淀或過濾方法分離可溶膠原蛋白和分散的膠原蛋白。采用離心，上清含有溶解的膠原蛋白，沉淀含有分散的膠原蛋白。采用過濾，溶解的膠原蛋白在濾液中。
可通過已知方法，如沉淀、過濾或類似方法從上清液中回收溶解的膠原蛋白。優(yōu)選用鹽沉淀溶解的膠原蛋白的方法?？蓪Ⅺ}，如NaCl加入上清液(過濾液)，使最終濃度在5到20％w/v之間，優(yōu)選10％。將混懸液離心，得到沉淀，棄去上清液。沉淀在稀(0.1M)醋酸或乳酸中再溶解(沉淀與溶液的比例約為1∶100)?？扇苄阅z原蛋白通過加入鹽再沉淀。接著再將沉淀溶于稀酸并離心。然后測量混懸液中膠原蛋白的濃度，并將其調(diào)至所需濃度(從1到10mg/ml)。膠原蛋白以這種形式使用，或?qū)⑷芙獾哪z原蛋白經(jīng)對水透析轉化成脫水膠原蛋白。
這里所用的術語“脫水膠原蛋白”指的是已經(jīng)脫水的膠原蛋白，脫水可采用任何本領域公知的方法。在優(yōu)選的實施方式中，脫水膠原蛋白通過凍干法、冷凍干燥或干燥來制備。
含有分散的膠原蛋白的混懸液經(jīng)過濾除去大顆粒。將濾液中膠原蛋白的濃度調(diào)至所需，并以該形式進行使用。也可選擇將膠原蛋白水洗并干燥。
這里所用的術語“干燥”指的是任何從膠原蛋白中去除水的方法。該術語所包括的方法含有但不限于風干或凍干。
由上述內(nèi)容可知，按本發(fā)明方法制備的不同實施方式中的膠原蛋白適合于各種需要用到膠原蛋白的生物醫(yī)學用途。可預期地，本發(fā)明的膠原蛋白能在多種裝置和多種用途中應用，包括但不限于，膠原蛋白縫合線、包括創(chuàng)傷和燒傷敷料的膠原蛋白軟組織置換、動脈血管置換、止血劑、藥物遞送基質(zhì)、眼科治療中用到的玻璃體置換和牙髓治療、細胞溫育支架，等。進一步還可預見到，本發(fā)明的不同實施方式能以任何形式應用，包括但不限于纖維或膜片、袋、海綿、縫合線和水溶性混懸液，以及各種復合材料。此外，如果需要的話，本發(fā)明的方法制備的膠原蛋白還可以按預期應用的需要進一步修飾，提供改善的生物活性相應。還可預見，本發(fā)明的方法也可用于制備其它生物分子及膠原蛋白。
在說明書中，“包括(comprise)”一詞和該詞的其它形式，如“包括有(comprising)”和“包括了(comprises)”，表示“包括但不限于”，不用于排除其它附加劑、成分、各個整體或各個步驟。
僅通過參照下述不起限定作用的實施例來描述本發(fā)明。然而顯然下述實施例僅作為例證使用，無論如何不應被理解為對以上本發(fā)明概述的限定。比如，實施例主要部分涉及的是綿羊皮，很容易理解，本發(fā)明還可用于這里所述的其它動物皮，包括如牛、豬和袋鼠。
實施例1以綿羊皮為原料提取I型和III型膠原蛋白一張新取美利奴綿羊皮，羊毛長約5cm，取自當?shù)赝涝讏鰟倓傇讱⒑蟮难?。皮移至試驗室放入低溫冷凍容器中。皮通過機械方法去肉，然后噴灑接近50ml的有機酸緩沖液。緩沖液是40％的溶于水的冰醋酸，已用氫氧化鈉調(diào)整pH值至4.0。
皮在溫度35℃、相對濕度85％下溫育16個小時。手工除去羊毛，修剪除去任何皮上殘留的羊毛和毛發(fā)。所得生皮稱重約1.2kg。
然后將生皮水洗，使用工業(yè)技術等級的食品處理器將其切成碎片。
切碎的生皮導入含有0.1M醋酸的非變性溶液。所用生皮和非改性溶液的比例為50∶1(w/w)。按胃蛋白酶與組織的比例為1∶100往混懸液中加入胃蛋白酶(1∶2000)。然后，混懸液在5℃條件下溫育7天，其間偶爾攪拌一下。
溫育后混懸液在10,000g條件下離心60分鐘?；厥蘸芙饬说鞍踪|(zhì)的上清液和含有不溶的分散膠原蛋白的沉淀。
加入鹽(NaCl)，使?jié)舛冗_到10％(w/w)，可溶性膠原蛋白沉淀下來。所得混懸液經(jīng)離心得到沉淀，上清液棄去。沉淀再溶于稀醋酸(0.1M)，沉淀和醋酸的比例為1∶100。然后將所得的溶液離心。溶解了的膠原蛋白經(jīng)過幾次的換水透析直到鹽濃度達到預期水平，然后，冷凍干燥。
使用該工藝，得到30g胃蛋白酶可溶的膠原蛋白，純度可比市售的牛膠原蛋白。制得的可溶性膠原蛋白由95％的I型膠原蛋白和5％的III型膠原蛋白組成。以羥基脯氨酸的含量進行估算，也制得了約270g的分散膠原蛋白。
實施例2以小羊皮為原料提取I型和III型膠原蛋白按例1所示方法進行制備，使用取自一頭“乳”羊，即小于12到14周的小羊。該方法最終得到超過50％的膠原蛋白，該膠原蛋白作為酸可溶膠原蛋白被分離出來。I型膠原蛋白相對于III型比例為90％∶10％。
權利要求
1.一種從動物皮制備膠原蛋白的方法，其中包括將有機酸緩沖液施用于所述動物皮充分長的時間以提取膠原蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中的動物皮取自綿羊、牛、山羊、馬、豬或有袋類動物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中將有機酸緩沖液施用于動物皮的步驟包括將有機酸緩沖液施用于動物皮的肉面。
4.如權利要求1-3中任一所述的方法，其中有機酸緩沖液的pH值在3到5之間。
5.如權利要求1-3中任一所述的方法，其中有機酸緩沖液的pH值在3.2到4.5之間。
6.如權利要求1-5中任一所述的方法，其中有機酸緩沖液包括一種或多種酸的水溶液或混懸液，所述有機酸選自醋酸、檸檬酸、丙酮酸、乳酸和甲酸。
7.如權利要求6所述的方法，其中有機酸緩沖液由40％(w/w)的冰醋酸水溶液組成。
8.如權利要求7所述的方法，其中有機酸緩沖液的pH值在4.0到4.2之間。
9.如權利要求1-8中任一所述的方法，其中以每張皮50到100ml的比例使用有機酸緩沖液。
10.如權利要求1-9中任一所述的方法，還包括溫育動物皮的步驟，溫育溫度在20到40℃之間、溫育時間6到48小時。
11.如權利要求10所述的方法，其中動物皮是脫毛的動物皮。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中動物皮上殘留的肉通過機械或手工方法除去。
13.如權利要求12所述的方法，其中動物皮被切成或絞成碎片。
14.如權利要求13所述的方法，還包括在非變性條件下將動物皮碎片與有機酸緩沖液混合成混懸液。
15.如權利要求14所述的方法，其中有機酸選自醋酸、乳酸和甲酸。
16.如權利要求15所述的方法，其中有機酸是濃度在0.1M和0.05M之間的醋酸。
17.如權利要求14-16中任一所述的方法，其中動物皮碎片和有機酸緩沖液在溫度0到30℃之間攪拌溫育。
18.如權利要求17所述的方法，其中的混懸液還包括一種或多種蛋白酶。
19.如權利要求18所述的方法，其中蛋白酶選自ESPERASE、ALCALASE、DURAZYM和SAVINASE、MAXATASE、MAXACAL、PROPERASE、MAXAPEM和胃蛋白酶。
20.如權利要求18所述的方法，其中蛋白酶是胃蛋白酶。
21.如權利要求14-20中任一所述的方法，還包括一個進行分離步驟。
22.如權利要求21所述的方法，其中分離步驟包括離心和/或過濾，其中可溶性膠原蛋白和分散的膠原蛋白被分離出來。
23.如權利要求22所述的方法，其中分離步驟包括離心和溶解了膠原蛋白的上清液。
24.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中分離步驟包括過濾和含有可溶性膠原蛋白的濾液。
25.如權利要求23或24所述的方法，其中用鹽沉淀可溶性膠原蛋白。
26.如權利要求25所述的方法，其中鹽加入至最終濃度在5到20％w/v之間。
27.如權利要求25所述的方法，其中鹽加入至最終濃度為約10％。
28.如權利要求1-27中任一所述的方法，其中膠原蛋白被冷凍干燥。
29.一種制備純化天然膠原蛋白的方法，包括下述步驟a).預備一張動物皮；b).使有機酸緩沖液與動物皮接觸充分長的時間，基本除去皮中的糖胺聚糖，制得生皮；c).將所述生皮絞碎，使暴露于一種或多種蛋白酶，制得包括可溶的和分散的膠原蛋白在內(nèi)的樣品；d).將所述樣品離心從分散的膠原蛋白中分離可溶性天然膠原蛋白；和e).用鹽沉淀所述可溶性天然膠原蛋白制得純化膠原蛋白。
30.根據(jù)權利要求1-29中任一所述的方法制成的純化膠原蛋白。
31.如權利要求30所述的膠原蛋白，其中所述的純化膠原蛋白含有干重少于0.1％不溶性非膠原的蛋白質(zhì)。
32.如權利要求30所述的純化膠原蛋白，其中所述的純化膠原蛋白含有干重少于0.0001％的磷脂。
33.如權利要求30所述的純化膠原蛋白，其中純化膠原蛋白含有干重少于0.0001％的中性脂和糖脂。
34.如權利要求30所述的純化膠原蛋白，其中所述膠原蛋白包括不超過95％的I型膠原蛋白和不少于5％的III型膠原蛋白。
35.如權利要求30所述的純化膠原蛋白，其中所述膠原蛋白包括不超過90％的I型膠原蛋白和不少于10％的III型膠原蛋白。
36.如權利要求30所述的純化膠原蛋白，其中所述的膠原蛋白包括不超過80％的I型膠原蛋白和不少于20％的III型膠原蛋白。
37.一種制備純化生物相容膠原蛋白的方法，包括下述步驟a)預備一張動物皮；b)使有機酸緩沖液與動物皮接觸充分長的時間，基本除去皮中的糖胺聚糖，制得生皮；c)將所述生皮絞碎，使暴露于一種或多種蛋白酶，制得包括可溶性膠原蛋白和分散的膠原蛋白在內(nèi)的樣品；d)將所述樣品離心從分散的膠原蛋白中分離可溶性天然膠原蛋白；和e)用鹽沉淀所述可溶性天然膠原蛋白制得生物相容的膠原蛋白。
38.根據(jù)權利要求37的方法制備的生物相容膠原蛋白。
39.一種如權利要求38所述的純化生物相容膠原蛋白，還包括一種添加的化合物，該化合物適合在生物醫(yī)學上使用。
40.一種如權利要求39所述的純化生物相容膠原蛋白，其中所添加的化合物選自抗菌劑、抗病毒劑、防腐劑、生長因子和防脫水化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法。本發(fā)明特別涉及到一種以動物皮為原料制備膠原蛋白的方法，其中包括將有機酸緩沖液施用于所述動物皮充分長的時間以提取膠原蛋白。
文檔編號C07K14/78GK1653087SQ03811115
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月20日 優(yōu)先權日2002年5月21日
發(fā)明者約翰·斯諾登 申請人:科爾泰克澳大利亞有限公司