專利名稱：制備亞磷酸酯化(phosphitylated)化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過含羥基化合物在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的方法。
背景通過含羥基化合物與膦試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物是一種轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)在多種有用化合物的合成中是實用的。例如，申請人認識到上述轉(zhuǎn)化在由5′-O-保護的核苷合成3′-O-亞磷酰胺中是有用的，通常如方案1所示方案1 其中，例如，X是氫、烷氧基、-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(OTBDMS)、-O-甲氧基甲基(OMOM)、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)等；R’是DMT、二甲氧基三苯甲基、寡核苷酸及其類似物等；R”是烷基，如甲基等，或烷氧基，如2-氰基乙基等；R是二異丙胺等；和B是由腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶衍生的部分。
由方案1形成的亞磷酰胺可方便地偶聯(lián)制備寡核苷酸，參見例如美國專利號4,725,677和Mellor，Thomas，“Synthesis of analogues ofoligonucloetides”，J.Chem Soc.，Perkin Trans.1，1998，747-757(兩者在此處引入作為參考)，在治療和診斷應(yīng)用包括，例如，抗致敏藥物(如Crooke，S.T.Handbook of Experimental PharmacologyAntisenseResearch and Application；Springer-Verlag，Berlin，(1998)所述，在此處引入作為參考)領(lǐng)域中具有日益增強的重要性。為了滿足對上述寡核苷酸日益增長的需要，希望大規(guī)模改進核苷亞磷酰胺的合成(Noe，Kaufhold，New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry，Wiley-VChWeinheim，2000，261，在此處引入作為參考)。
然而，申請人逐漸意識到，由于某些原因由含羥基化合物制備亞磷酸酯化化合物，如3′-O-亞磷酰胺的常規(guī)方法是不利的。多數(shù)常規(guī)方法的一個缺點是需要使用昂貴的和/或危險的活化試劑/化合物。例如，在Beaucage和Carruthers，Tetrahedron Lett.1981，22，1859(此處引入作為參考)中，1H-四唑被推薦作最通用的亞磷酸酯化活化劑。但是，這種活化劑/試劑是昂貴的和危險的。(參見，例如，Stull，F(xiàn)undamentals of Fire and Explosion，AlChE Monograph Series，No.10，New York，1977，Vol.73，22，在此處引入作為參考)。鑒于富氮雜環(huán)的爆炸天性，處理上述組合物時需要特別安全防范。危險較小的化合物，4，5-二氰基咪唑，在某些核苷亞磷酰胺的制備中是有用的。不幸的是該化合物非常昂貴，其昂貴程度實際上阻礙了其在工業(yè)方法中的應(yīng)用。由未取代吡啶衍生的亞磷酸酯化活化劑在下列文獻中公開，例如，Gryaznov，Letsinger，J.Am.Chem.Soc.1991，113，5876；Gryaznov，Letsinger，Nucleic Acids Res.1992，20，1879；Beier，Pfleiderer，Helvetica Chimica Acta，1999，82，879；Sanghvi等人，Organic ProcessResearch and Development 2000，4，175；和美國專利號6,274,725，已授權(quán)給Sanghvi等人，所有文獻在此處引入作為參考。但是上述鹽是有毒的和高水溶性的。因此，應(yīng)用上述活化劑必須在系統(tǒng)中安裝價值昂貴的廢水處理裝置。
制備亞磷酸酯化化合物的多數(shù)常規(guī)方法的另一缺點是使用二氯甲烷作為優(yōu)選溶劑。因為二氯甲烷對環(huán)境不安全，所以在二氯甲烷作為溶劑的該方法中需要同時使用相對昂貴的廢物處理裝置。
避免至少某些上述缺點的一種潛在方法是就地制備核苷亞磷酰胺，不用另外的活化步驟，例如，Zhang等人在美國專利號6,340,749B1中所描述，所得溶液在固相支持體合成儀上直接使用。不幸的是上述方法的效果相對較差，并且由上述方法獲得的亞磷酰胺溶液是不穩(wěn)定的，不適于儲藏。
因此，申請人認識到需要避免常規(guī)方法缺點的制備亞磷酸酯化化合物的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
和優(yōu)選的實施方案本發(fā)明通過提供制備多種亞磷酸酯化化合物的高效方法克服了上述缺陷，該方法相對于常規(guī)方法危險較小，成本較低。具體而言，申請人發(fā)現(xiàn)某些由相對位阻胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物和兩性離子絡(luò)合物，可在由含羥基起始物質(zhì)制備亞磷酸酯化化合物的方法中較有利地用作亞磷酸酯化活化劑。此處使用的術(shù)語“亞磷酸酯化化合物”一般指含有由含羥基化合物與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)形成的氧-磷鍵的化合物。申請人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酸-堿和兩性離子絡(luò)合物與常規(guī)活化劑相比毒性較低，水溶性較低。
另外，申請人在許多實施方案中出乎意料地發(fā)現(xiàn)，盡管本發(fā)明的酸-堿和兩性離子活化劑絡(luò)合物比常規(guī)使用的活化劑有更多的位阻，親核性更低，但本發(fā)明方法制備亞磷酸酯化化合物的產(chǎn)率與現(xiàn)有技術(shù)的方法獲得的產(chǎn)率至少一樣高，在某些情況下更高。雖然申請人不想限制于任何特殊的作用理論，但是可以相信亞磷酸酯化試劑用于制備亞磷酸酯化化合物的活化機理包括活化劑在亞磷酸酯化試劑的離去基團的親核取代。例如，Berner等人，Nucleic Acids Res.1989，17，853和Dahl，B.等人，Nucleic Acids Res.1987，15，1729描述了所提議的雙試劑2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰胺與位阻較小的胺活化劑(如四唑)的活化機理，包括親核性胺對二異丙基胺離去基團的取代，早于活化的雙試劑與含羥基化合物的反應(yīng)。
考慮到這一點，可以期望，包括與現(xiàn)有技術(shù)的胺活化劑如四唑和吡啶活化劑相比相對多，許多情況下顯著多位阻的胺的本發(fā)明活化劑，在取代亞磷酸酯化試劑上的離去基團的效率會較低，所以活化上述試劑制備亞磷酸酯化化合物的效率也會較低。然而，如上所述，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明有顯著多位阻的活化劑在制備亞磷酸酯化產(chǎn)物中的產(chǎn)率與常規(guī)活化劑如未取代吡啶鹽的產(chǎn)率一樣高，或更高。不想限制于任何特殊的作用理論，隨后對所發(fā)現(xiàn)的預(yù)想不到的結(jié)果的調(diào)查使申請人相信，本發(fā)明活化劑的令人驚奇的高產(chǎn)率可能是由于，至少部分是因為活化劑與某些含羥基起始物質(zhì)的反應(yīng)部分的副反應(yīng)減少(例如，在Nielsen等人，Nucleic Acids Res.1986，14，7391中所討論的鳥苷化合物中的內(nèi)酰胺單元。)因此，本發(fā)明方法使得制備亞磷酸酯化化合物的產(chǎn)率與常規(guī)方法一樣高，通常更高，同時也避免了上述常規(guī)方法的許多缺點。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明包括含羥基化合物在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的步驟，亞磷酸酯化活化劑選自由如下所述的通式I或通式II的胺衍生而來的酸-堿絡(luò)合物，由二氮雜二環(huán)胺化合物衍生的酸-堿絡(luò)合物，兩性離子胺絡(luò)合物，及其兩種或多種的組合。
亞磷酸酯化活化劑本發(fā)明此處所使用的術(shù)語“亞磷酸酯化活化劑”一般指促進含羥基化合物與亞磷酸酯化試劑的反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的化合物。申請人發(fā)現(xiàn)多種酸-堿絡(luò)合物和兩性離子絡(luò)合物可有利地用作亞磷酸酯化活化劑。
A.酸-堿絡(luò)合物本發(fā)明的酸堿絡(luò)合物通過至少一種下文所述通式I或通式II的胺堿、或二氮雜二環(huán)胺堿和至少一種酸反應(yīng)形成酸-堿絡(luò)合物。
其中R、R1、和R2獨立的是烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、或雜芳基，每個具有約1至約10個碳原子(C1-C10)。
其中R3、R4、R5、R6、和R7獨立的是氫、C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、C1-C10芳基、C1-C10芳烷基、C1-C10雜烷基、或C1-C10雜芳基，其中R3、R4、R5、R6、和R7中的至少一個不是氫。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、和R7中的C1-C10烷基可以是直鏈或支鏈部分，例如，取代或未取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、壬基、癸基等。任一上述基團可被鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、烷基、氟烷基、芳烷基等所取代。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、和R7中的C1-C10環(huán)烷基可以是，例如，取代的或未取代的環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基、甲基環(huán)己基、二甲基環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。任一上述基團可被，例如，鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、烷基、氟烷基、芳烷基等所取代。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、和R7中的C1-C10芳基可以是，例如，取代的或未取代的苯基、鄰甲苯基、間甲苯基、對甲苯基、鄰二甲苯基、間二甲苯基、對二甲苯基、α-萘基、β-萘基等。任一上述基團可被，例如，鹵素、羥基、芳氧基、烷基、氟烷基、芳烷基等所取代。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、和R7中的C1-C10芳烷基可以是，例如，取代的或未取代的芐基、4-甲基芐基、鄰甲基芐基、對甲基芐基、二苯基甲基、2-苯基乙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基等。任一上述基團可被，例如，鹵素、羥基、芳氧基、烷基、氟烷基、芳烷基等所取代。
通式I和II中的任兩個鄰近的R、R1、和R2，或R3、R4、R5、R6、和R7基團可分別連結(jié)形成芳環(huán)、非芳族環(huán)或雜環(huán)。
適用于本發(fā)明方法的通式I胺堿的實例包括三烷基胺，如，二異丙基乙胺(即Hünig堿)、三丙胺、三乙胺、三甲胺、二乙基甲胺、N-甲基嗎啉(NMM)等；叔二胺，如，四甲基乙二胺(TMEDA)；聚胺和聚合物鍵連烷基胺；三芳胺，如，三苯胺等；三芳烷基胺，如，三芐基胺等；其它三取代胺，如二甲基苯胺；等等。通式I的某些優(yōu)選的胺堿包括Hünig堿等。
適用于本發(fā)明方法的通式II胺堿的實例包括二甲基氨基吡啶(DMAP)、4-二甲基氨基吡啶、和其它取代的吡啶，如，單烷基吡啶，包括甲基吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶，二烷基吡啶，包括二甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶，三烷基吡啶，包括三甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、連三甲基吡啶，四烷基吡啶，包括四甲基吡啶，和五烷基吡啶，包括五甲基吡啶等。通式II的某些優(yōu)選的堿包括2-甲基吡啶、連三甲基吡啶等。
適用于本發(fā)明方法的二氮雜二環(huán)胺堿的實例包括1，5-二氮雜二環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)；1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(DBU)；1，1，3，3-四甲基胍；等等。
多種酸中的任一種可與本發(fā)明的一種或多種堿結(jié)合形成本發(fā)明的酸-堿絡(luò)合物。適合的酸包括乙酸衍生物，如，三氟乙酸(TFA)、二氯乙酸等；磺酸，如，甲磺酸、三氟甲磺酸、4-吡啶鎓亞甲基磺酸等；非水性氫鹵酸，如非水性氯化氫、非水性溴化氫、非水性碘化氫等；和HBF4。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用的酸是三氟乙酸。
本發(fā)明某些優(yōu)選的酸-堿絡(luò)合物包括三氟乙酸和Hünig堿；三氟乙酸和2-甲基吡啶；以及三氟乙酸和連三甲基吡啶的絡(luò)合物。特別優(yōu)選的酸-堿絡(luò)合物是三氟乙酸和Hünig堿的絡(luò)合物。
多種公知的形成酸-堿絡(luò)合物的方法的任一種可適合用于制備本發(fā)明的酸-堿絡(luò)合物。例如，在某些實施方案中，通過將至少一種酸加入到至少一種堿中形成絡(luò)合物來制備本發(fā)明的酸-堿絡(luò)合物。
本發(fā)明的酸和堿可在有或沒有溶劑的存在下加入形成本發(fā)明絡(luò)合物。在包括溶劑存在的實施方案中，在酸和堿接觸形成絡(luò)合物之前，酸和/或堿中的一個或兩者可首先溶解在溶劑中形成酸溶液和/或堿溶液。本發(fā)明形成酸-堿絡(luò)合物所使用的溶劑可與本發(fā)明亞磷酸酯化反應(yīng)中所使用的任一任選的溶劑相同或不同。適用于制備本發(fā)明酸-堿絡(luò)合物的溶劑包括非極性和極性，非質(zhì)子溶劑。適合的非極性和極性，非質(zhì)子溶劑的實例包括乙酸酯，如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯等；醚類，如，四氫呋喃(THF)、甲基叔丁基醚(MTBE)等；芳族溶劑，如，甲苯、氯苯等；二氯甲烷；乙腈；N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及上述兩種或多種溶劑的組合。在某些實施方案中，酸-堿絡(luò)合物中的堿，或絡(luò)合物本身可用作溶劑。
任一適量的酸和堿可用于制備本發(fā)明的酸-堿絡(luò)合物。通常，應(yīng)使用足夠的酸和堿使酸和堿成分在絡(luò)合物中以大約1∶1的摩爾比存在。在某些實施方案中，使用約0.9至約1.5當(dāng)量的堿和約0.9至約1.5當(dāng)量的酸。優(yōu)選地，使用約0.9至約1.3當(dāng)量的堿和約0.9至約1.1當(dāng)量的酸，還更優(yōu)選使用約1.0至約1.3當(dāng)量的堿和約1.0至約1.05當(dāng)量的酸。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，使用約1.3當(dāng)量的堿和約1.05當(dāng)量的酸。除非另外說明，所有的當(dāng)量是摩爾當(dāng)量。
本發(fā)明的酸-堿絡(luò)合物可在本發(fā)明亞磷酸酯化反應(yīng)中就地形成，或與其分開形成。在絡(luò)合物就地形成的實施方案中，絡(luò)合物可在膦和/或含羥基化合物加入前在反應(yīng)混合物中形成。有選擇性地，絡(luò)合物可在膦和/或含羥基化合物加入到反應(yīng)混合物中后隨后加入絡(luò)合物的酸和/或堿來制備。
任一適合的反應(yīng)條件可用于形成本發(fā)明的絡(luò)合物。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的酸和堿在約0℃至約100℃的溫度下混合。優(yōu)選地，酸和堿在約10℃至約60℃的溫度下混合，更優(yōu)選約15℃至約40℃。
B.兩性離子絡(luò)合物此處所使用的術(shù)語“兩性離子絡(luò)合物”通常指在同一分子中(如內(nèi)鹽)中含有陽離子和陰離子的絡(luò)合物離子，這在本領(lǐng)域是公知的。申請人出乎意料地發(fā)現(xiàn)上述兩性離子絡(luò)合物適于用作本發(fā)明的亞磷酸酯化活化劑。
多種兩性離子化合物/內(nèi)鹽的任一種適用于本發(fā)明。適合的兩性離子化合物的實例包括磺酸化合物，如，吡啶乙基磺酸等。
亞磷酸酯化試劑此處所使用的術(shù)語“亞磷酸酯化試劑”通常指能夠在亞磷酸酯化活化劑的存在下與含羥基化合物反應(yīng)，在含羥基化合物的羥基的氧原子和亞磷酸酯化試劑的磷原子之間成鍵形成亞磷酸酯化化合物的任一試劑化合物。多種化合物的任一種適于用作本發(fā)明的亞磷酸酯化試劑。適合的化合物包括，例如，膦，如二取代膦，包括，烷氧基二(二烷基氨基)膦，如雙二異丙基氨基-2-氰基乙氧基膦；二烷氧基(二烷基氨基)膦；烷氧基烷基(二烷基氨基)膦，二(N，N-二異丙基氨基)-2-甲基三氟乙酰基氨基乙氧基膦；二(N，N-二異丙基氨基)-2-聯(lián)苯基甲基甲硅烷基乙氧基膦；(烯丙氧基)二(N，N-二甲基氨基)膦；等等；還有亞磷酰胺，如羥基保護的N，N，N’，N’-亞磷酰胺，包括，2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺(phosphorodiamidite)；甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；甲基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺等，和3′-O-亞磷酰胺，如，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧腺苷(N6-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-(N4-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧鳥苷(N2-異丁酰基(isobutyroyl))-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺等；以及它們中的兩種或多種的混合物。優(yōu)選的亞磷酸酯化活化劑包括羥基保護的N，N，N’，N’-亞磷酰胺，如，2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺、甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧腺苷(N6-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-(N4-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧鳥苷(N2-異丁酰基)-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺。在特別優(yōu)選的實施方案中，亞磷酸酯化試劑是2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
含羥基化合物此處所使用的術(shù)語“含羥基化合物”通常指含有至少一個羥基的化合物，能夠在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)，在含羥基化合物的至少一個羥基的氧原子和亞磷酸酯化試劑的磷原子之間成鍵形成亞磷酸酯化化合物。通常，能夠在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)，在含羥基化合物的至少一個羥基的氧原子和亞磷酸酯化試劑的磷原子之間成鍵形成亞磷酸酯化化合物的包括至少一個羥基的化合物，適于用作本發(fā)明的含羥基化合物。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的含羥基化合物包括任一天然的和/或非天然的核苷，包括DNA和/或RNA核苷，包括Linked Nucleic Acid(LNA)衍生物和被另外的基團如鹵素取代基取代的核苷，含有探測物質(zhì)(Detector)的核苷，包括生物素或熒光素連結(jié)的化合物；具有抗致敏作用配體的含效應(yīng)物的化合物；和由上述兩種或多種化合物衍生的寡聚結(jié)構(gòu)。適合的DNA和RNA核苷的實例包括保護性核苷，如5′-O-保護的核苷(有或沒有另外的N-保護，如通過苯甲?；惗□；⑹宥』窖趸阴；癟AC”等進行保護)，包括腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、脫氧腺苷、脫氧胞苷和脫氧鳥苷的5′-O-保護的核苷；5′-O-保護-2′-保護的核苷，(有或沒有另外的N-保護)，包括腺苷、胞苷、鳥苷、和尿苷(其中優(yōu)選的2′-保護基包括叔丁基二甲基甲硅烷基、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)和烷氧基，如甲氧基)的5′-O-保護-2′-保護的核苷，和腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胞苷和脫氧鳥苷的3′-O-保護的核苷，(有或沒有另外的N-保護)，以及由它們衍生的寡聚結(jié)構(gòu)。
反應(yīng)溶劑和條件本方法可適于用作批量或連續(xù)加工。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明亞磷酸酯化方法的反應(yīng)步驟中還包含溶劑。本發(fā)明亞磷酸酯化反應(yīng)中使用的溶劑可與本發(fā)明形成酸-堿絡(luò)合物中所使用的任一任選的溶劑相同或不同。適用于本發(fā)明亞磷酸酯化反應(yīng)的溶劑包括非極性和極性，非質(zhì)子溶劑。適合的非極性和極性，非質(zhì)子溶劑的實例包括乙酸酯，如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯等；醚類，如，THF、MTBE等；芳族溶劑，如，甲苯、氯苯等；二氯甲烷；乙腈；NMP；DMF以及上述兩種或多種溶劑的組合。在某些實施方案中，酸-堿絡(luò)合物中的堿，或絡(luò)合物本身可用作溶劑。
任一適量的含羥基化合物和亞磷酸酯化試劑可用于本發(fā)明方法。在某些實施方案中，使用約0.9至約1.5當(dāng)量的含羥基化合物和約0.9至約1.5當(dāng)量的亞磷酸酯化試劑。優(yōu)選地，使用約0.9至約1.1當(dāng)量的含羥基化合物和約0.9至約1.3當(dāng)量的亞磷酸酯化試劑，還更優(yōu)選使用約0.9至約1.1當(dāng)量的含羥基化合物和約1.0至約1.3當(dāng)量的亞磷酸酯化試劑。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，使用約1.0當(dāng)量的含羥基化合物和約1.1當(dāng)量的亞磷酸酯化試劑。除非另外說明，所有的當(dāng)量是摩爾當(dāng)量。
任一適合的反應(yīng)條件，包括加入此處作為參考的任一文獻中所公開的條件，可用于本發(fā)明的亞磷酸酯化反應(yīng)。在某些實施方案中，亞磷酸酯化反應(yīng)在約0℃至約100℃的溫度下進行。優(yōu)選地，亞磷酸酯化反應(yīng)在約0℃至約40℃的溫度下進行，更優(yōu)選約20℃。
通過本方法制備的亞磷酸酯化化合物可通過本領(lǐng)域公知的任一適合的方法純化。例如，可使用水溶液洗滌、干燥、減壓濃縮、色譜法、蒸餾、結(jié)晶、沉淀等方法。
根據(jù)某些優(yōu)選的實施方案，申請人發(fā)現(xiàn)相對高純度的亞磷酸酯化化合物，如3′-O-亞磷酰胺，可通過亞磷酸酯化化合物在溶液中沉淀獲得。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的沉淀方法包括提供含有將要沉淀的亞磷酸酯化化合物和溶劑的化合物溶液，和將所述化合物溶液與沉淀溶劑接觸沉淀出亞磷酸酯化化合物。
多種適合溶劑的任一種可用于本發(fā)明的化合物溶液。適合的化合物溶液溶劑的實例包括甲苯、二甲苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、兩種或多種上述溶劑的組合等。優(yōu)選的化合物溶液溶劑包括甲苯等。
化合物溶液可通過本發(fā)明多種方法中的任一種來提供。在某些優(yōu)選的實施方案中，化合物溶液可作為本發(fā)明亞磷酸酯化反應(yīng)的產(chǎn)物來提供。上述溶液可直接由亞磷酸酯化反應(yīng)獲得，或者通過純化反應(yīng)產(chǎn)物并將上述純化的產(chǎn)物溶劑化來提供。有選擇性地，通過不同于本發(fā)明反應(yīng)的來源獲得的亞磷酸酯化化合物，可溶解在化合物溶液溶劑中得到本發(fā)明的化合物溶液。
任一適合的沉淀溶劑可用于沉淀本發(fā)明的亞磷酸酯化化合物，包括烷烴，如石油醚、戊烷、己烷、異己烷、庚烷、異辛烷等，以及上述兩種或多種烷烴的混合物。優(yōu)選的沉淀溶劑包括石油醚、己烷、其兩種或多種的混合物等。
在某些優(yōu)選的實施方案中，可向沉淀溶劑中加入一種或多種助劑來影響本發(fā)明方法中沉淀物的結(jié)構(gòu)。適合的助劑的實例包括，例如，三乙胺等。任一適量的助劑可加入到本發(fā)明的沉淀溶劑中。在某些優(yōu)選的實施方案中，基于沉淀溶劑和助劑總重量使用約0至約10％重量的助劑，優(yōu)選使用約0至約5％。
本方法可使用化合物溶液和沉淀溶劑/助劑的任一適合的比率。在某些優(yōu)選的實施方案中，化合物溶液加入到約5至約25當(dāng)量的重量，優(yōu)選約20至約25當(dāng)量的沉淀溶劑或沉淀溶劑和助劑(如果存在)中。
沉淀可在任一適合的條件下利用任一適合的實驗設(shè)備來進行。優(yōu)選地，沉淀在惰性氣體，如氮氣、氬氣等下進行?？墒褂萌我贿m合的溫度，例如，約-20℃至約40℃。優(yōu)選地，沉淀在約0℃至約30℃下進行，更優(yōu)選地，約5℃至約25℃。任一適合的容器可用于沉淀。在某些優(yōu)選的實施方案中，使用不銹鋼容器。
自動寡核苷酸合成本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，根據(jù)本方法，寡核苷酸可由包括核苷和/或其衍生的低聚物的含羥基化合物來合成，不僅可通過上文所描述的批量和/或連續(xù)加工，還可應(yīng)用自動核苷酸合成技術(shù)，如下所述，例如，Applied BioSystems User’s Manual for Models 392和394DNA/RNA Synthesizer；Section 6 Chemistry for AutomatedDNA/RNA Synthesis(March 1994)和M.J.Gait，“OligonucleotideSynthesis，A.Practical Approach”，IRL Press at Oxford UniversityPress(1984，ISBN 0-904147-74-6)，加入此處作為參考。在上述實施方案中，核苷和/或寡核苷酸的含羥基化合物固定在固相支持體上，在自動DNA合成儀中在亞磷酸酯化活化劑的存在下與核苷亞磷酸酯化試劑反應(yīng)形成寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，可確定亞磷酸酯化反應(yīng)的具體數(shù)目和順序，來制備包含不同長度和核苷序列的寡核苷酸。
任一適合的固相支持體物質(zhì)可適用于本發(fā)明。適合的固相支持體物質(zhì)的實例包括可控孔度玻璃(“CPG”)、聚苯乙烯、二氧化硅、纖維素紙、及其兩種或多種的組合。優(yōu)選的一類固相支持體物質(zhì)包括可控孔度玻璃、聚苯乙烯及其組合。
用于本方法的固相支持體可具有任一合適大小的孔。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，孔大小的選擇至少部分依賴于要制備的低聚物的大小和所使用的核苷酸合成方法?；诖私虒?dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會合理地選擇適合孔大小的固相支持體物質(zhì)用于多種應(yīng)用。
多種固定有核苷的固相支持體是市售的。例如可由AppliedBiosystems(ABI)獲得的多種固定在CPG上的多種n-保護的脫氧核苷(包括在1000埃CPG上的0.2微摩爾苯甲?；Ｗo的脫氧胞嘧啶)。
多種自動DNA/RNA合成儀的任一種可適用于本發(fā)明。適合的DNA合成儀的實例包括由Applied Biosystems提供的ModelNos.3900、380、380B、392和394，Expedite 8800、8905、8909，GeneAssembler，OligoPilot，OligoPilotII，AKTAoligopilot 10和AKTAoligopilot 100，以及Beckmann Oligo 1000和1000M，MWGBiotech Oligo 2000，PolyPlex GeneMachine，Illumina Oligator，MerMade I和II，Imntelligent BioInstruments Primer Station 960，Proligo Polygen，Syntower等。優(yōu)選的一類合成儀包括Model 394等。
根據(jù)本發(fā)明的自動化方法可使用任一適量的固相支持的含羥基化合物和亞磷酸酯化試劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，每一反應(yīng)使用過量，優(yōu)選50倍過量的亞磷酸酯化試劑。
實施例根據(jù)下面的實施例對本發(fā)明進一步描述，該實施例只是說明性的，不是以任一方式加以限制。
實施例1-11這些實施例闡述了幾種保護性核苷試劑與2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺在本發(fā)明幾種活化劑存在下的亞磷酸酯化。
進行11種亞磷酸酯化反應(yīng)(1-11)，包括保護性核苷試劑在本發(fā)明的酸-堿活化劑的存在下與2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺反應(yīng)，計算每種產(chǎn)物的收率，如下文的一般方法所述。保護性核苷、活化劑堿、活化劑酸、溶劑的多種組合以及11種反應(yīng)中每一種的收率列在表1中。
一般方法活化劑堿(1.1-1.2當(dāng)量)加入到溶劑中，隨后在室溫下加入0.95-1.1當(dāng)量的活化劑酸形成活化劑溶液。在單獨的容器中約1當(dāng)量的保護性核苷溶解于約10當(dāng)量的溶劑中，然后減壓蒸餾出約3當(dāng)量的溶劑。約1-1.2當(dāng)量的2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺室溫下加入到核苷混合物中，然后室溫下隨著劇烈的攪拌將先前制備的活化劑溶液加入到核苷混合物中。12小時后，反應(yīng)混合物用甲苯稀釋并用水洗滌。分出有機層，如果需要經(jīng)硫酸鈉干燥，減壓濃縮。然后利用HPLC技術(shù)計算所要的酰胺(amidite)的收率，也就是，所得的產(chǎn)物混合物利用適合的洗脫劑通過HPLC柱，使用HPLC峰下的面積確定混合物中產(chǎn)物％收率。
表1

DMT＝二甲氧基三苯甲基；Bz＝苯甲?；籭Bu＝異丁?；鶎嵤├?2-18這些實施例闡述了幾種保護性核苷試劑與2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺在本發(fā)明的Hünig堿-TFA活化劑存在下的亞磷酸酯化。
7種通式III(下文)的核苷試劑在Hünig堿-TFA活化劑存在下與2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺根據(jù)實施例1-11的一般方法進行反應(yīng)，通過兩種方法中的一種計算產(chǎn)物收率(1)所得的產(chǎn)物混合物利用適合的洗脫劑通過HPLC柱，使用HPLC峰下的面積確定混合物中產(chǎn)物％收率；或(2)所得的產(chǎn)物混合物利用乙酸甲酯/甲苯混合物通過短的硅膠柱純化(根據(jù)要純化的特殊產(chǎn)物進行濃縮)。減壓和溶劑中濃縮合適的產(chǎn)物部分直到獲得所要酰胺的大約50％的溶液。該溶液加入到約5-25當(dāng)量的石油醚中沉淀產(chǎn)物，過濾并用石油醚洗滌。然后干燥產(chǎn)物，稱重并計算百分收率。

其中，B是由N6-苯甲?；汆堰?A(Bz))、N4-苯甲?；奏?C(Bz))、N2-異丁?；B嘌呤(G(iBu))、胸腺嘧啶(T)、或尿嘧啶(U)衍生的部分，和X是氫、OTBDMS、或甲氧基(OMe)。每種核苷的X和B的詳細的變化和每種反應(yīng)的％收率如表2所示。
表2

實施例19該實施例闡述了本發(fā)明N6-苯甲?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷(Bz-DMT-dA)與三氟乙酸二異丙基乙基銨和2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺的亞磷酸酯化。
二異丙基乙基胺6.4g(49.4mmol)在反應(yīng)容器中溶解于20ml的無水THF中。三氟乙酸4.9g(43.6mmol)室溫下加入到THF混合物中形成以下反應(yīng)步驟中使用的活化劑溶液。
Bz-DMT-dA30g(45mmol)在反應(yīng)容器中溶解于185ml的無水THF中。然后減壓蒸餾出50ml的THF形成反應(yīng)混合物。室溫下向反應(yīng)混合物中加入14.7g(47.2mmol)2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。上文制備的活化劑溶液然后在室溫下伴隨著劇烈攪拌加入到反應(yīng)混合物中。12小時后，反應(yīng)混合物用80ml甲苯稀釋并用50ml水洗滌。分出有機層并減壓濃縮。所得的產(chǎn)物利用乙酸甲酯/甲苯(80/20)通過短的硅膠柱純化。減壓下和溶劑中濃縮適合的產(chǎn)物部分直到獲得所要5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧腺苷-(N6-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺(PAm-Bz-DMT-dA)的大約50％的溶液。大約50％的溶液伴隨著劇烈攪拌(約500-600rpm)在室溫下加入到1L的配有機械攪拌器和含有500ml己烷的不銹鋼反應(yīng)器中。3小時后過濾所得的沉淀，用50ml己烷洗滌，干燥得到32g(83％)的Pam-Bz-DMT-dA。
實施例20該實施例闡述了本發(fā)明N4-苯甲?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧胞苷(Bz-DMT-dC)與三氟乙酸二異丙基乙基銨和2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺的亞磷酸酯化。
二異丙基乙胺22.4g(173mmol)在反應(yīng)容器中溶解于30ml的無水THF中。三氟乙酸18.4g(164mmol)室溫下加入到THF混合物中形成以下反應(yīng)步驟中使用的活化劑溶液。
Bz-DMT-dC103g(158.3mmol)在反應(yīng)容器中溶解于450ml的無水甲苯中。然后減壓蒸餾出100ml的甲苯形成反應(yīng)混合物。室溫下向反應(yīng)混合物中加入51.4g(170.5mmol)2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。上文制備的活化劑溶液然后在室溫下伴隨著劇烈攪拌加入到反應(yīng)混合物中。12小時后，反應(yīng)混合物用100ml的醋酸銨水溶液洗滌兩次。分出有機層并減壓濃縮。所得的產(chǎn)物利用乙酸甲酯/甲苯/三乙胺(100/30/2)通過短的硅膠柱純化。減壓下和溶劑中濃縮適合的產(chǎn)物部分直到獲得所要5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧胞苷-(N4-苯甲酰基)-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺(PAm-Bz-DMT-dC)的大約50％的甲苯溶液。利用3L的配有機械攪拌器的不銹鋼反應(yīng)器，該溶液5℃下隨著劇烈攪拌(約500-600rpm)加入到19g三乙胺的1880ml的己烷溶液中。3小時后過濾所得的沉淀，用100ml己烷洗滌，干燥得到112g(85％)的PAm-Bz-DMT-dC。
對比實施例1-3根據(jù)上文對實施例12-18所描述的一般方法進行三個對比亞磷酸酯化反應(yīng)(C1-C3)，包括將保護性核苷試劑在吡啶-TFA活化劑的存在下與2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺反應(yīng)，計算每一種的產(chǎn)物收率。保護性核苷、溶劑的多種組合以及3個反應(yīng)的每一個的收率如表3所示。如表3中的收率所述(與表1和2中的收率相比)，本發(fā)明方法的收率與利用包含未取代吡啶的顯著少位阻鹽的常規(guī)活化劑的對比反應(yīng)相比，令人驚奇地至少同樣良好，在許多實施方案中更好。
表3

實施例21該實施例闡述了本發(fā)明利用自動合成技術(shù)制備兩個寡核苷酸序列(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和(5′-TTTTTTTTTTC-3′)。
ABI 394 DNA合成儀配備4個基于CPG(1000埃)含有0.2微摩爾苯甲?；Ｗo的脫氧胞嘧啶的合成柱(來自ABI)。該合成儀再配備4個瓶子，每個含有四種3′-O-亞磷酰胺(分別基于dC、dA、dG、和T)中的一種作為反應(yīng)中亞磷酸酯化試劑的核苷源。合成儀再配備下列的溶液源活化劑溶液1.0M的Hünig堿/TFA絡(luò)合物(通過在43.0克的乙腈(Honeywell Burdick and Jackson)中合并8.9克二異丙基乙胺(Aldrich Biotech)和8.9克的TFA來制備)Deblock-T3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液；A Cap10％乙酸酐/10％吡啶/80％THF；B Cap10％N-甲基咪唑/80％THF；和Oxidation T0.02M碘/2％水/20％吡啶/78％THF核苷亞磷酸酯化試劑順次反應(yīng)，每個耦合用50倍的過量，得到所要的寡核苷酸“fos-21”(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和“CT10”(5′-TTTTTTTTTTC-3′)。利用配有PDA檢測器的Agilent1100 Series HPLC進行HPLC分析。Agilent ChemStation的LC 3D軟件用于收集和分析數(shù)據(jù)。所使用的HPLC柱是Dionex DNAPak 100(4×250mm)柱。使用1.0ml/min流速的線性梯度。流動相是B，10mM NaClO4，10mM Tris-Cl pH，8.3；D，300mM NaClO4，10mM TrispH，8.3。梯度程序如下寡核苷酸HPLC分析梯度程序-45分鐘

在水中50mg/ml的濃度下，制備寡核苷酸進行分析。OD260峰的粗DNA收率值用來計算濃度。制備30ml加樣樣品。每種寡核苷酸測試4個樣品。測量平均收率，fos-21大約42.7％，CT-10大約85.2％。
對比實施例4該實施例闡述了利用四唑和吡啶-TFA活化劑通過自動合成方法合成兩個寡核苷酸序列(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和(5′-TTTTTTTTTTC-3′)。
寡核苷酸序列(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和(5′-TTTTTTTTTTC-3′)中的每一個根據(jù)實施例22所描述進行合成和測試，只是使用常規(guī)的活化劑溶液。在一個實驗中，(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和(5′-TTTTTTTTTTC-3′)都利用來自Honeywell Burdick and Jackson，Inc.的四唑作活化劑進行制備。在另一個實驗中，(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)和(5′-TTTTTTTTTTC-3′)都利用U.S.專利號6,274,725所描述的吡啶-TFA活化劑進行制備。
(5′-ACGATGATGTTCTCGGGCTTC-3′)的平均收率，利用四唑作活化劑為65％，利用吡啶-TFA為58.1％。(5′-TTTTTTTTTTC-3′)的平均收率，利用四唑作活化劑為87.3％，利用吡啶-TFA為86.0％。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將含羥基化合物在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的步驟，亞磷酸酯化活化劑選自(1)由通式I的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物 其中R、R1、和R2獨立的是C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、C1-C10芳基、C1-C10芳烷基、C1-C10雜烷基、或C1-C10雜芳基；(2)由通式II的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物 其中R3、R4、R5、R6、和R7獨立的是氫、C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、C1-C10芳基、C1-C10芳烷基、C1-C10雜烷基、或C1-C10雜芳基，所述R3、R4、R5、R6、和R7中的至少一個不是氫；(3)由二氮雜二環(huán)胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物；(4)兩性離子胺絡(luò)合物；和(5)上述兩種或多種的組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是由通式I的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的通式I的胺堿選自二異丙基乙胺、三丙胺、三乙胺、三甲胺、二乙基甲胺、NMM、TMEDA、三芐基胺以及它們中的兩種或多種的組合。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的通式I的胺堿是二異丙基乙胺。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由酸進一步衍生而來，該酸選自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、4-吡啶鎓亞甲基磺酸、非水性氯化氫、非水性溴化氫、非水性碘化氫、和HBF4。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的酸-堿絡(luò)合物由三氟乙酸進一步衍生而來。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是由通式II的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的通式II的胺堿選自二甲基苯胺、DMAP、4-二甲基氨基吡啶鎓、甲基吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶、2，6-一甲基吡啶、三甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、連三甲基吡啶、四甲基吡啶、五甲基吡啶以及它們中的兩種或多種的組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的通式II的胺堿是2-甲基吡啶或連三甲基吡啶。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由酸進一步衍生而來，該酸選自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、4-吡啶鎓亞甲基磺酸、非水性氯化氫、非水性溴化氫、非水性碘化氫、和HBF4。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述的酸-堿絡(luò)合物由三氟乙酸進一步衍生而來。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由選自DBU、DBN、1，1，3，3-四甲基胍以及它們的組合的二氮雜二環(huán)胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是兩性離子胺絡(luò)合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的兩性離子胺絡(luò)合物包括吡啶乙基磺酸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的含羥基化合物是核苷或其衍生的低聚物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的核苷是5′-O-保護的核苷。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑選自雙二異丙基氨基-2-氰基乙氧基膦；二烷氧基(二烷基氨基)膦；烷氧基烷基(二烷基氨基)膦，二(N，N-二異丙基氨基)-2-甲基三氟乙?；被已趸?；二(N，N-二異丙基氨基)-2-聯(lián)苯基甲基甲硅烷基乙氧基膦；(烯丙氧基)二(N，N-二甲基氨基)膦；2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；甲基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；和它們中的兩種或多種的混合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑選自2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺和甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑是2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
20.權(quán)利要求1的方法，還包括亞磷酸酯化化合物在沉淀溶劑中的沉淀步驟。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的沉淀步驟包括提供含有亞磷酸酯化化合物和溶劑的化合物溶液，并將所述化合物溶液與沉淀溶劑接觸沉淀出亞磷酸酯化化合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的沉淀溶劑包括石油醚。
23.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將5′-O-保護的核苷在三氟乙酸-二異丙基乙胺絡(luò)合物的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)形成3′-O-亞磷酰胺的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑是2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的5′-O-保護的核苷選自N6-苯甲?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷、N4-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧胞苷、N2-異丁?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧鳥苷、和5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸苷。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述的3′-O-亞磷酰胺選自5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧腺苷(N6-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-(N4-苯甲酰基)-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧鳥苷(N2-異丁?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺、和5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述的3′-O-亞磷酰胺通過3′-O-亞磷酰胺在沉淀溶劑中沉淀進行純化。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法制備的亞磷酸酯化化合物。
29.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將5′-O-保護的核苷衍生的低聚物在三氟乙酸-二異丙基乙胺絡(luò)合物的存在下與3′-O-亞磷酰胺反應(yīng)形成亞磷酸酯化低聚物化合物的步驟。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的反應(yīng)在自動DNA合成儀中進行。
31根據(jù)權(quán)利要求29的方法制備的亞磷酸酯化低聚物化合物。
32.一種純化亞磷酸酯化化合物的方法，包括提供含有亞磷酸酯化化合物和溶劑的化合物溶液，并將所述化合物溶液與沉淀溶劑接觸沉淀出純化的亞磷酸酯化化合物的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的沉淀溶劑包括石油醚。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的接觸步驟在約5℃至約25℃的溫度下進行。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的接觸步驟在不銹鋼容器中進行。
36.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟在選自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯、四氫呋喃及其兩種或多種組合的溶劑存在下進行。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的溶劑選自乙酸甲酯、乙酸異丙酯、四氫呋喃及其兩種或多種結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將含羥基化合物在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的步驟，亞磷酸酯化活化劑選自(1)由通式I的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物 其中R、R1、和R2獨立的是C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、C1-C10芳基、C1-C10芳烷基、C1-C10雜烷基、或C1-C10雜芳基；(2)由通式II的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物 其中R3、R4、R5、R6、和R7獨立的是氫、C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、C1-C10芳基、C1-C10芳烷基、C1-C10雜烷基、或C1-C10雜芳基，所述R3、R4、R5、R6、和R7中的至少一個不是氫；(3)由二氮雜二環(huán)胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物；(4)兩性離子胺絡(luò)合物；和(5)上述兩種或多種的組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是由通式I的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的通式I的胺堿選自二異丙基乙胺、三丙胺、三乙胺、三甲胺、二乙基甲胺、NMM、TMEDA、三芐基胺以及它們中的兩種或多種的組合。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的通式I的胺堿是二異丙基乙胺。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由酸進一步衍生而來，該酸選自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、4-吡啶鎓亞甲基磺酸、非水性氯化氫、非水性溴化氫、非水性碘化氫、和HBF4。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的酸-堿絡(luò)合物由三氟乙酸進一步衍生而來。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是由通式II的胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的通式II的胺堿選自二甲基苯胺、DMAP、4-二甲基氨基吡啶鎓、甲基吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、二甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、三甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、連三甲基吡啶、四甲基吡啶、五甲基吡啶以及它們中的兩種或多種的組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的通式II的胺堿是2-甲基吡啶或連三甲基吡啶。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由酸進一步衍生而來，該酸選自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、4-吡啶鎓亞甲基磺酸、非水性氯化氫、非水性溴化氫、非水性碘化氫、和HBF4。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述的酸-堿絡(luò)合物由三氟乙酸進一步衍生而來。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑由選自DBU、DBN、1，1，3，3-四甲基胍以及它們的組合的二氮雜二環(huán)胺堿衍生的酸-堿絡(luò)合物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化活化劑是兩性離子胺絡(luò)合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的兩性離子胺絡(luò)合物包括吡啶乙基磺酸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的含羥基化合物是核苷或其衍生的低聚物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的核苷是5′-O-保護的核苷。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑選自雙二異丙基氨基-2-氰基乙氧基膦；二烷氧基(二烷基氨基)膦；烷氧基烷基(二烷基氨基)膦，二(N，N-二異丙基氨基)-2-甲基三氟乙?；被已趸?；二(N，N-二異丙基氨基)-2-聯(lián)苯基甲基甲硅烷基乙氧基膦；(烯丙氧基)二(N，N-二甲基氨基)膦；2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；甲基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺；和它們中的兩種或多種的混合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑選自2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺和甲氧基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑是2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
20.權(quán)利要求1的方法，還包括亞磷酸酯化化合物在沉淀溶劑中的沉淀步驟。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的沉淀步驟包括提供含有亞磷酸酯化化合物和溶劑的化合物溶液，并將所述化合物溶液與沉淀溶劑接觸沉淀出亞磷酸酯化化合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的沉淀溶劑包括石油醚。
23.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將5′-O-保護的核苷在三氟乙酸-二異丙基乙胺絡(luò)合物的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)形成3′-O-亞磷酰胺的步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的亞磷酸酯化試劑是2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷二酰胺。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的5′-O-保護的核苷選自N6-苯甲?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷、N4-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧胞苷、N2-異丁?；?5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧鳥苷、和5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胸苷。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述的3′-O-亞磷酰胺選自5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧腺苷(N6-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-(N4-苯甲?；?-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧鳥苷(N2-異丁酰基)-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺、和5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-N，N-二異丙基氨基-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述的3′-O-亞磷酰胺通過3′-O-亞磷酰胺在沉淀溶劑中沉淀進行純化。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法制備的亞磷酸酯化化合物。
29.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，包括將5′-O-保護的核苷衍生的低聚物在三氟乙酸-二異丙基乙胺絡(luò)合物的存在下與3′-O-亞磷酰胺反應(yīng)形成亞磷酸酯化低聚物化合物的步驟。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的反應(yīng)在自動DNA合成儀中進行。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法制備的亞磷酸酯化低聚物化合物。
32.一種純化亞磷酸酯化化合物的方法，包括提供含有亞磷酸酯化化合物和溶劑的化合物溶液，并將所述化合物溶液與沉淀溶劑接觸沉淀出純化的亞磷酸酯化化合物的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述的沉淀溶劑包括石油醚。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的接觸步驟在約5℃至約25℃的溫度下進行。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述的接觸步驟在不銹鋼容器中進行。
全文摘要
提供了制備亞磷酸酯化化合物包括3′－O－亞磷酰胺的方法，包括將含羥基化合物在亞磷酸酯化活化劑的存在下與亞磷酸酯化試劑反應(yīng)制備亞磷酸酯化化合物的步驟，亞磷酸酯化活化劑選自(1)由通式(I)的胺堿衍生的酸－堿絡(luò)合物，其中R、R
文檔編號C07H19/10GK1646452SQ03808763
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者C·維爾納, F·內(nèi)倫茨, A·坎施克-康拉德森 申請人:霍尼韋爾國際公司