專利名稱：相分離法純化質(zhì)粒dna方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用新型的兩相法使DNA與其他生物大分子分離開(kāi)來(lái)。而且能同時(shí)分離到不同的細(xì)菌組分，為這些細(xì)菌組分的分離純化提供了便利的條件。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA純化方法是用SDS(十二烷基磺酸鈉)、TX-100等試劑裂解細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA釋放到上清中，再經(jīng)酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，上清中的質(zhì)粒DNA經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀回收。但是這樣純化的質(zhì)粒DNA中仍存留大量的蛋白質(zhì)、脂多糖、多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)嚴(yán)重干擾了許多重要的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尤其細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因治療、DNA疫苗免疫等生物學(xué)研究對(duì)質(zhì)粒DNA的純度要求更高，這種純化方法已不能滿足對(duì)質(zhì)粒DNA純度上的要求，需采用其它形式的純化方法來(lái)分離純化質(zhì)粒DNA。
另有文獻(xiàn)報(bào)道采用了DEAD-silica樹(shù)脂(resin)來(lái)純化質(zhì)粒DNA。DNA分子上帶有磷酸根基因，使DNA分子帶負(fù)電荷。在silica上DEAE基團(tuán)密度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)多糖類樹(shù)脂上的DEAE密度，使DNA更為牢固地結(jié)合到這種含高密度DEAE的樹(shù)脂上的，而且需用很高的鹽濃度才能將DNA洗脫下來(lái)，但蛋白質(zhì)等其它雜質(zhì)在較低的鹽濃度時(shí)就被洗脫下來(lái)，DNA與其它雜質(zhì)達(dá)到完全分離。但這種情況只有在生物大分子表面未結(jié)合SDS等陰離子時(shí)才出現(xiàn)。但是，在含質(zhì)粒DNA的上清中，實(shí)際上存留了大量與SDS結(jié)合的變性蛋白質(zhì)、LPS、多糖。SDS分子帶有硫酸根基因，帶負(fù)電荷，能與蛋白質(zhì)等分子牢固結(jié)合，造成這些分子表面帶有大量負(fù)電荷，大大改變了原來(lái)的層析行為，使蛋白質(zhì)、LPS和多糖的洗脫條件發(fā)生了根本變化，無(wú)法完全將DNA與蛋白質(zhì)、LPS等雜質(zhì)徹底地分離開(kāi)來(lái)。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1378592A公開(kāi)了“在無(wú)RNA酶和有機(jī)溶劑的條件下應(yīng)用切向流過(guò)濾來(lái)純化質(zhì)粒DNA的方法”，該方法包括如下步驟(a)消化所述細(xì)胞；(b)將細(xì)胞培養(yǎng)約4到24小時(shí)以進(jìn)行裂解并溶解，但不對(duì)RNA進(jìn)行酶促消化；(c)除去來(lái)自細(xì)胞的裂解物雜質(zhì)以提供一種質(zhì)粒DNA溶液；(d)使該溶液流經(jīng)切向流過(guò)濾裝置而過(guò)濾，以獲得含有該質(zhì)粒DNA的回流液；(e)回收該回流液。該法分離速度和效果不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服背景技術(shù)的不足，提供了一種使DNA與其他生物大分子分離開(kāi)來(lái)，分離速度和效果都較好的DNA純化方法。
本發(fā)明的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于按如下操作步驟1)加液懸浮含質(zhì)粒的細(xì)菌液離心棄上清后，加細(xì)菌懸浮液使徹底懸?。?)加堿裂解加細(xì)菌裂解液溫和混勻，使菌體充分裂解，形成透亮溶液；3)中和凝集加中和緩沖液溫和混勻，至形成凝集塊；4)成相分離加分相溶液溫和混勻，形成乳濁液，離心，棄上相，將下相轉(zhuǎn)入微量濾器濾去殘留的相間沉淀；5)過(guò)濾回收在濾液中加DNA結(jié)合溶液轉(zhuǎn)入DNA制備管，用負(fù)壓或離心法使溶液濾過(guò)硅膠膜，使DNA結(jié)合到硅膠膜上而得到濃縮和回收。
上述步驟1)、2)和5)為常規(guī)步驟。3)到4)為新型的相分離體系。在這個(gè)體系中，首先必需含有在乙醇/異丙醇高度不溶解的鹽，而且蛋白質(zhì)，LPS(細(xì)菌脂多糖)，RNA以及脂質(zhì)在該鹽中將變性析出或不溶解，相反DNA必須完全溶解。硫酸銨、氯化銫具備這樣的特性。由于硫酸銨價(jià)格低廉，而且又是蛋白質(zhì)LPS，RNA的有效變性劑。在這個(gè)體系中細(xì)菌經(jīng)SDS/NaOH溶解并釋放出質(zhì)粒DNA后，用含硫酸銨的溶液中和，使蛋白質(zhì)變形并與基因組DNA形成緊密的不溶性復(fù)合物。但是這時(shí)溶液體系中硫酸銨濃度不足以使其他雜質(zhì)都有效沉淀下來(lái)。在加入有機(jī)溶液乙醇∶異丙醇(v/v＝2～10∶1)后，水份被抽提到了有機(jī)相(上相)中，使無(wú)機(jī)相中的硫酸銨濃度幾乎達(dá)到了飽和狀態(tài)，呈高度的脫水狀態(tài)。除了質(zhì)粒DNA仍呈溶解狀態(tài)位于下相外，細(xì)菌脂溶性成分被抽提到上相，所有其他的細(xì)菌成份由于與飽和硫酸銨和乙醇∶異丙醇都不相容而被變性沉淀出來(lái)，RNA由于密度大，被離心沉淀在管底，其他變性成份沉淀在相間。
純化的關(guān)鍵性原理就是在飽和狀態(tài)的硫酸銨中質(zhì)粒DNA仍保持完全的溶解狀態(tài)，而其他雜質(zhì)被完全變性并沉淀出來(lái)。加入乙醇∶異丙醇混合溶劑使含硫酸銨溶液中的水份被抽提走，使下相達(dá)到近飽和狀態(tài)的硫酸銨溶液。形成這兩相體系的關(guān)鍵是(1)含一定濃度硫酸銨的溶液；(2)一定體積和一定比例的乙醇∶異丙醇溶劑。如果硫酸銨濃度過(guò)低，不易形成兩相，而且硫酸銨會(huì)析出。濃度太高，硫酸銨也會(huì)析出。僅當(dāng)加入適當(dāng)比例體積的乙醇∶異丙醇混合溶劑時(shí)才能形成兩相系統(tǒng)，并使下相中的硫酸銨的濃度達(dá)到近飽和的狀態(tài)。當(dāng)加入的乙醇∶異丙醇混合溶劑體積過(guò)小，不能成相，反而導(dǎo)致硫酸銨沉淀。體積過(guò)大，也形成沉淀，盡管DNA并不析出，但不利于后續(xù)的操作。乙醇也可以與硫酸銨的溶液形成兩相體系，但所需的乙醇體積過(guò)大，而且比例稍有偏差，會(huì)導(dǎo)致或者不能成相，或者造成硫酸銨沉淀析出。加一定量的異丙醇，硫酸銨溶液與乙醇∶異丙醇有機(jī)溶劑的兩者的比例范圍大大加寬。
所述的中和緩沖液為硫酸銨(或氯化銫)380～480克，鹽酸胍28～98克，NaH2PO4·2H2O 16～18克，加水至1升；所述的分相溶液為乙醇∶異丙醇(v/v)＝2～10∶1。其中，鹽酸胍能促使質(zhì)粒DNA的游離性，使DNA有效進(jìn)入下相，而不至于與蛋白質(zhì)形成共聚凝集。
所述的中和緩沖液中加有促使鹽析的乙酸銨36～45克，則效果更好。
常規(guī)的DNA結(jié)合溶液5～7M鹽酸胍，還有20～100mM NaH2PO4，40～200mM NaAc，pH5.0～6.0。
在實(shí)際操作中，以加液懸浮步驟結(jié)束時(shí)體積為1個(gè)體積時(shí)，在3)、4)步驟中加中和緩沖液分相溶液(v/v)＝1.6～2.4∶2.6～3.2，就能達(dá)到所需效果。
對(duì)所加分相溶液進(jìn)行預(yù)冷，可以使分相效果更好，預(yù)冷通常不高于10℃。
本發(fā)明獨(dú)特的相分離只需要一步即將不同的細(xì)菌組分同時(shí)分離開(kāi)來(lái)，是本發(fā)明技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn)。在該相分離體系中，RNA在離心過(guò)程中沉淀于管底4，基因組DNA與變性蛋白質(zhì)形成不溶性復(fù)合物位于相間2，多糖、脂多糖、脂質(zhì)、細(xì)菌代謝產(chǎn)物和色素被抽提到上相1中，而質(zhì)粒DNA仍呈溶解狀態(tài)位于下相3，見(jiàn)圖1。下相中已高度純化的質(zhì)粒DNA在特定的高鹽條件下結(jié)合到silica膜/上，達(dá)到快速回收和進(jìn)一步純化的目的。經(jīng)洗滌液、脫鹽液(100mM NH4Ac，55～70％乙醇，10mM Tris-HCl，pH7.0)洗滌去除殘留在silica膜上的雜質(zhì)和高濃度鹽離子后，吸附到silica膜上的質(zhì)粒DNA經(jīng)微量水或三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗脫下來(lái)，并可立即用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
用本發(fā)明相分離技術(shù)將質(zhì)粒DNA分離純化，具有分離純度高，速度快(約10-20分鐘完成)的優(yōu)點(diǎn)，而且能同時(shí)分離到不同的細(xì)菌組分，為這些細(xì)菌組分的分離純化提供了便利的條件。


圖1是相分離結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。在實(shí)施例中，細(xì)菌懸浮液含有RNase Al的25mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0；細(xì)菌裂解液1％SDS/0.18～0.2M NaOH(SDS十二烷基磺酸鈉)；中和緩沖液380～480克，鹽酸胍28～98克，NaH2PO4·2H2O 16～18克，加水至1升；分相溶液乙醇∶異丙醇(v/v)＝2～10∶1；DNA結(jié)合溶液5～7M鹽酸胍，還有20～100mM NaH2PO4，40～200mM NaAc，PH5.0～6.0。
一般采用，細(xì)菌懸浮液細(xì)菌裂解液中和緩沖液分相溶液DNA結(jié)合溶液(v/v)＝1∶1∶1.6～2.4∶2.6～3.2∶2。
脫鹽液100mM NH4Ac，55～70％乙醇，10mM Tris-HCl，pH7.0；洗滌液2.5-5M鹽酸胍，20mM Tris-HCl，pH6.5-7.0；RNase Al是100μg/ml的RNA酶組分Al；Tris是三羥甲基氨基甲烷；實(shí)施例1——超純質(zhì)粒DNA小量純化一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.第一次使用時(shí)，將隨試劑盒攜帶的RNase Al(100μg/ml的RNA酶組分)全部加入細(xì)菌懸浮液(含有RNase Al的25mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0)中，混合均勻，4℃密閉貯存。
2.第一次使用時(shí)，按脫鹽液(100mM NH4Ac終濃度，56％乙醇，pH值7.0)試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇，混合均勻。室溫密閉貯存。
3.使用前注意觀察細(xì)菌裂解液中是否有白色沉淀出現(xiàn)，如有沉淀，請(qǐng)于37℃溫育溶解，并冷卻至室溫再使用。
4. 4℃預(yù)冷中和緩沖液和分相溶液。
二、操作步驟1、加液懸浮收集1～4ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的質(zhì)粒菌液，12000×g離心30秒，棄盡上清。用250μl已加了RNase Al的細(xì)菌懸浮液充分懸浮細(xì)菌沉淀。
注意細(xì)菌過(guò)量會(huì)影響裂解、中和效率。若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少。
注意確認(rèn)細(xì)菌懸浮液中已加入RNase Al；懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊，否則會(huì)影響菌體的裂解。
2、加堿裂解加入250μl細(xì)菌裂解液(1％SDS/0.2M NaOH，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4～6次，此步驟不宜超過(guò)5分鐘。
注意避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染；細(xì)菌裂解液使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和細(xì)菌裂解液中的NaOH，降低溶菌效率。
3、中和凝集加入450μl 4℃預(yù)冷的中和緩沖液(硫酸銨420克，鹽酸胍47克，NaH2PO4·2H2O 16克，乙酸銨36克，加水至1升)，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)8～10次，充分混合均勻。
注意避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染。
4、成相分離加入650μl 4℃預(yù)冷的相分離液(乙醇∶異丙醇(v/v)＝3∶1)，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，再稍用力混合數(shù)次使溶液形成混濁的乳濁液，12000×g離心1分鐘。吸棄藍(lán)色上相，將無(wú)色下相轉(zhuǎn)移至微量濾器(置于1.5ml離心管中)中，12000×g離心30秒。
注意上相無(wú)需完全棄盡，在轉(zhuǎn)移無(wú)色下相時(shí)偶有混入的上相，可在Tip頭內(nèi)迅速分相，易于丟棄(見(jiàn)圖1)。如在轉(zhuǎn)移過(guò)程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可在過(guò)濾時(shí)除去。
5、過(guò)濾回收棄微量濾器，加450μl DNA結(jié)合溶液到濾液中，混合均勻。
步驟6.1可以選擇負(fù)壓法或離心法操作。
6.1A.負(fù)壓法6.1A.1.將DNA制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。將步驟5中的混合液加入DNA制備管中，開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓，以大約每秒1滴的流速緩慢吸盡管中溶液。
6.1A.2.將負(fù)壓調(diào)至最大，加500μl洗滌液，負(fù)壓吸盡管中溶液。
6.1A.3.保持負(fù)壓，沿管壁四周加700μl已加入無(wú)水乙醇的脫鹽液，負(fù)壓吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700μl脫鹽液洗滌一次。
注意確認(rèn)在脫鹽液中已按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇；沿管壁四周加入脫鹽液有助于徹底沖洗掉沾在管壁上的鹽份。
6.1B.離心法6.1B.1.將DNA制備管置于2-ml微量離心管中，將步驟5中的混合液加入DNA制備管中，12000×g離心30秒。
6.1B.2.棄濾液，將DNA制備管置回到2-ml微量離心管中，加500μl洗滌液，12000×g離心30秒。
6.1B.3.棄濾液，將DNA制備管置回到2-ml微量離心管中，加700μl已加入無(wú)水乙醇的脫鹽液，12000×g離心30秒，以同樣的方法再用700μl脫鹽液洗滌一次。
注意確認(rèn)在脫鹽液中已按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇。
6.2.將DNA制備管置于1.5ml離心管中，12000×g離心1分鐘。
6.3.將DNA制備管置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加60μl Eluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。12000×g離心1分鐘洗脫DNA。
實(shí)施例2——超純質(zhì)粒DNA中量純化操作步驟1、加液懸浮收集40ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的高拷貝質(zhì)粒菌液，或100ml LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的低拷貝質(zhì)粒?！?000×g離心8min，棄上清。將離心管倒置于紙巾上數(shù)分鐘，除盡上清。用4.5ml已加入RNase Al的細(xì)菌懸浮液充分懸浮細(xì)菌。
注意細(xì)菌過(guò)量會(huì)影響裂解、中和效率及質(zhì)粒DNA的得率。若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少。
注意確認(rèn)細(xì)菌懸浮液中已加入RNase Al。懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。否則會(huì)影響菌體的裂解。
2、加堿裂解加入4.5ml細(xì)菌裂解液，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4～6次，此步驟不宜超過(guò)5分鐘。
注意細(xì)菌裂解液使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的C02中和細(xì)菌裂解液中的NaOH，降低溶菌效率；避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染。
3、中和凝集加入8ml 4℃預(yù)冷的中和緩沖液，立即溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，直至沉淀形成緊實(shí)的凝集塊。
注意加入中和緩沖液后，應(yīng)立即混合，以避免形成局部的凝結(jié)塊；避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染。
4、成相分離加入12ml 4℃預(yù)冷的相分離液1，溫和地上下翻轉(zhuǎn)10次，再稍用力上下混合數(shù)次使溶液形成混濁的乳濁液，4℃，≥10000×g離心8分鐘。吸棄藍(lán)色上相，將下相轉(zhuǎn)入中量濾器中，用推注法將溶液過(guò)濾到50ml離心管或其他容器中。
注意上相無(wú)需完全棄盡，在轉(zhuǎn)移無(wú)色下相時(shí)偶有混入的上相，可在移液滴頭內(nèi)迅速分相，易于丟棄。如在轉(zhuǎn)移過(guò)程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可在過(guò)濾時(shí)除去。
5.過(guò)濾回收用力上下?lián)u晃裝有DNA結(jié)合溶液-R的試劑瓶，充分懸浮其中的硅膠顆粒，加8ml DNA結(jié)合溶液-R到濾液中，混合均勻。
注意硅膠顆粒是DNA吸附介質(zhì)，需充分懸浮均勻。
步驟6.1可以選擇負(fù)壓法或推注法操作。
6.1A.負(fù)壓法
6.1A.1.正確連接VITAGENE(中文名稱)負(fù)壓裝置，將甲量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。吸取步驟5中的混合液轉(zhuǎn)移到中量制備管中，開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓，以每秒約2滴的流速緩慢吸盡管中溶液。
6.1A.2.將負(fù)壓調(diào)至最大，加9ml Buffer W1，負(fù)壓吸盡管中溶液。
6.1A.3.保持負(fù)壓，向中量制備管中加9ml已加入無(wú)水乙醇的脫鹽液，負(fù)壓吸盡管中溶液。
注意確認(rèn)在脫鹽液溶液中已按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇。
6.1B.推注法6.1B.1.吸取步驟5中的混合液轉(zhuǎn)移到中量制備管中，插入注射器芯，垂直向下緩慢推注，以每秒約2滴的流速排盡管中溶液。
6.1B.2.旋轉(zhuǎn)取下中量制備管上含硅膠顆粒的純化柱，退出注射器芯，再將純化柱重新安裝到注射器上，加9ml Buffer W1，插入注射器芯，垂直向下推注，排盡液體。
注意硅膠顆粒為白色顆粒，如未見(jiàn)白色顆粒沉積在柱中，復(fù)查步驟7是否將硅膠顆粒充分懸浮均勻。
6.1B.3.以同樣方法，用9ml已加入無(wú)水乙醇的脫鹽液洗滌中量制備管。
注意確認(rèn)在脫鹽液中已按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇。
6.2.旋轉(zhuǎn)取下含硅膠顆粒的純化柱，置于1.5ml離心管中，最高速度離心2分鐘。
6.3.將純化柱置于潔凈的1.5ml離心管中，在硅膠顆粒上加500μl水。用Tip頭輕輕攪拌硅膠顆粒使其被洗脫液完全浸透，室溫靜置1分鐘。12000×g離心1分鐘。
5.4.棄純化柱，在洗脫的質(zhì)粒DNA中加400μl異丙醇，混合均勻，12000×g離心10分鐘。
5.5.仔細(xì)倒置離心管丟棄上清。加500μl-20℃預(yù)冷的70％乙醇，12000×g離心2分鐘。
5.6.仔細(xì)倒置離心管丟棄上清，室溫干燥10分鐘。
5.7.用適量水溶解DNA沉淀。
權(quán)利要求
1.一種相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于按如下操作步驟1)加液懸浮含質(zhì)粒的細(xì)菌液離心棄上清后，加細(xì)菌懸浮液使徹底懸?。?)加堿裂解加細(xì)菌裂解液溫和混勻，使菌體充分裂解，形成透亮溶液；3)中和凝集加中和緩沖液溫和混勻，至形成凝集塊；4)成相分離加分相溶液溫和混勻，形成乳濁液，離心，棄上相，將下相轉(zhuǎn)入微量濾器濾去殘留的相間沉淀；5)過(guò)濾回收在濾液中加DNA結(jié)合溶液轉(zhuǎn)入DNA制備管，用負(fù)壓或離心法使溶液濾過(guò)硅膠膜，使DNA結(jié)合到硅膠膜上而得到濃縮和回收。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于所述的中和緩沖液為硫酸銨或氯化銫380～480克，鹽酸胍28～98克，NaH2PO4·2H2O 16～18克，加水至1升；所述的分相溶液為乙醇∶異丙醇(v/v)＝2～10∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于所述的中和緩沖液中加有乙酸銨36～45克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于以1)步驟結(jié)束時(shí)體積為1個(gè)體積，在3)、4)步驟中加中和緩沖液分相溶液(v/v)＝1.6～2.4∶2.6～3.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于所述的分相溶液預(yù)冷。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的相分離法純化質(zhì)粒DNA方法，其特征在于所述的分相溶液預(yù)冷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用新型的兩相法使DNA與其他生物大分子分離開(kāi)來(lái)。其特征在于按如下操作步驟1)加液懸??；2)加堿裂解；3)中和凝集；4)成相分離5)過(guò)濾回收。用本發(fā)明相分離技術(shù)將質(zhì)粒DNA分離純化，具有分離純度高，速度快(約10－20分鐘完成)的優(yōu)點(diǎn)，而且能同時(shí)分離到不同的細(xì)菌組分，為這些細(xì)菌組分的分離純化提供了便利的條件。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1523033SQ03141590
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者余偉明 申請(qǐng)人:余偉明