專利名稱：納米金屬硫蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，具體指一種采用納米技術(shù)制備的、具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性的納米金屬硫蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)，是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的生物基團(tuán)，結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，富含功能巰基，具有生物活性的蛋白質(zhì)，能參與微量元素的代謝和調(diào)控，對有害的重金屬元素，如鉛、鎘、汞等具有解毒功能，是目前人們發(fā)現(xiàn)的清除自由基、抗衰老、抗輻射能力最強(qiáng)的生物制品，已被聯(lián)合國教科文組織列為21世紀(jì)生物制品的推薦項目。
金屬硫蛋白的制備方法一般為先對動物子皮下注射金屬誘導(dǎo)劑，如CdCl2誘導(dǎo)其在體內(nèi)產(chǎn)生金屬硫蛋白，取其臟器或腎臟或腦組織切碎勻漿，用Tris-HCl—乙醇—氯仿混合液萃取后分離，冷凍干燥制得。其流程可概括為金屬誘導(dǎo)→切碎勻漿→離心分離→上柱分離→超濾脫鹽→冷凍干燥→金屬硫蛋白制劑。
但由于目前采用的生產(chǎn)技術(shù)只能制得粒徑在微米級的制品，從而限制了其性能的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種采用納米誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)和采用納米技術(shù)處理的工藝方法制備金屬硫蛋白，使金屬硫蛋白產(chǎn)品的粒徑達(dá)到納米級(粒徑為0.1-100nm)的水平，即成為納米金屬硫蛋白(Nano-Metallothionein，簡稱N-MT)，以提高和擴(kuò)展其性能。
本發(fā)明的一種納米金屬硫蛋白，由金屬硫蛋白經(jīng)納米技術(shù)處理獲得，所述金屬硫蛋白是在對動物體進(jìn)行誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后在其臟器中提取出的一種低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可誘導(dǎo)性的金屬與硫蛋白結(jié)合物，在每摩爾金屬硫蛋白中含有60-61個氨基酸結(jié)合，7-12個金屬離子，相對分子量為6000-7000u，含有18-20個巰基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金屬硫蛋白在誘導(dǎo)時采用由納米溶質(zhì)與納米溶劑構(gòu)成的納米誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，并對提取的金屬硫蛋白以超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化技術(shù)處理所獲得的納米級微粒。
本發(fā)明的一種納米金屬硫蛋白的制備方法，其流程為納米誘導(dǎo)、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態(tài)下進(jìn)行?，F(xiàn)分述如下●納米誘導(dǎo)—通過將納米金屬誘導(dǎo)劑注射入動物體，使動物體產(chǎn)生金屬與硫蛋白的結(jié)合物。如對動物進(jìn)行5-8天分2-4次皮下注射，誘導(dǎo)動物的臟器產(chǎn)生金屬硫蛋白，在誘導(dǎo)結(jié)束后一天，摘取動物的臟器；納米金屬誘導(dǎo)劑是以經(jīng)納技術(shù)制備的納米金屬鹽類作溶質(zhì)，純水經(jīng)電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。納米金屬誘導(dǎo)劑是以經(jīng)納技術(shù)制備的納米金屬鹽類作溶質(zhì)，純水經(jīng)電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。
●搗碎勻漿—將動物臟器清洗、搗碎后、進(jìn)行勻漿處理；●分離—勻漿后進(jìn)行第一次離心分離，除去沉淀和雜蛋白，取上清液；再次分離，清除雜質(zhì)，棄上清液；上色譜柱層析分離，收集洗脫液；●超濾脫鹽；●納米制備a)取上道工序的收集液，進(jìn)行低溫超聲霧化納米化，收集產(chǎn)物即為納米金屬硫蛋白；b)或取上道工序的收集液，進(jìn)行甚低溫超聲粉碎納米化，收集產(chǎn)物即為納米金屬硫蛋白；c)或取上道工序的收集液，進(jìn)行低溫超聲霧化納米化和甚低溫超聲粉碎納米化，收集產(chǎn)物即為納米金屬硫蛋白。
綜上所述，其中搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽基本上與現(xiàn)行生化工藝相似，而納米誘導(dǎo)和納米制備工藝則為本發(fā)明所特有。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，采用本發(fā)明的工藝所獲得的納米金屬硫蛋白，由于其微粒粒徑已達(dá)到納米級，從而其穿透性、擴(kuò)張性、表面能、趨向性、附集性均產(chǎn)生質(zhì)的飛躍，成為一種具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性的新型生物制品，它具有零維、高表面能、高運動速度和生物靶向效應(yīng)，能快速透過細(xì)胞，其活性和功能得以大大的提高和擴(kuò)展。因此在臨床使用中用量顯著降低，注射次數(shù)可以減少。本發(fā)明采用超聲霧化納米化、甚低溫超聲粉碎納米化等技術(shù)手段，不僅效率高，產(chǎn)品得率高，而且可保證納米生物材料的活性和品質(zhì)。
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合一按本發(fā)明的技術(shù)制備納米金屬硫蛋白的實施例作進(jìn)一步說明。
1.納米誘導(dǎo)—在活體兔子皮下注射納米金屬誘導(dǎo)劑，第1天30mg/只，第2天和第4天50mg/只，第7天60mg/只，誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生金屬硫蛋白，第8天屠宰后取其肝臟。
納米誘導(dǎo)劑的溶質(zhì)可采用納米級的鹽類如鎘鹽、鋅鹽等，本采用ZnCl2或ZnSO4，現(xiàn)已有商品化的納米氯化鋅和納米硫酸鋅出售。納米溶劑采用納米水，納米水是純水經(jīng)過電子整水器拆開水分子團(tuán)的締合鍵，因此水分子團(tuán)的締合度甚低，完全在納米級的尺寸范圍內(nèi)，納米水具有更高的通透性、溶解力和乳化性等活性。
2.搗碎勻漿—將兔子肝臟清洗后，加等體積的Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液在搗碎機(jī)上搗碎勻漿。
Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液的配制方法是，取0.01mol的Tris(緩血酸銨)重量，用納米純水稀釋成1L溶液，再用HCl調(diào)節(jié)溶液的PH值至PH＝8.6，定容為1L，即成Tris-HCl緩沖液，再按Tris-HClP/無水乙醇/氯仿＝1.00/1.30/0.08的比例配制成Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液。
3.一次分離—在勻漿料中加入2-4倍體積的上述Tris-HCl+無水乙醇+氯仿混合溶液，充分?jǐn)嚢韬?，在離心機(jī)上高速分離后取上清液，加入2-4倍料液的-20℃無水乙醇，靜置12小時以上，以除去沉淀物和雜蛋白。
4.二次分離—取上道工序的上清液，高速離心分離后，棄上清液，取沉淀部分加入0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液后，再次高速分離后，取上清液，進(jìn)一步除去雜質(zhì)。
5.層析分離—取上道工序的上清液，上Sephadex G-50色譜柱，再上DEAE-Sepharase Fast Flow層析柱進(jìn)行離子交換層析分離，并以Tris緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。
6.超濾脫鹽—取上道工序收集液，上經(jīng)碳酸銨平衡的Sephadex G-25色譜柱，同樣以Tris緩沖液洗脫，脫鹽過程中嚴(yán)格控制流速，經(jīng)超濾脫鹽后收集洗脫液。
7.納米制備—取上道工序收集液進(jìn)低溫超聲霧化納米化裝置進(jìn)行超聲霧化獲得納米金屬硫蛋白產(chǎn)品，或?qū)⑸系拦ば蚴占哼M(jìn)行甚低溫超聲粉碎納米化裝置進(jìn)行超聲粉碎，即得納米金屬硫蛋白產(chǎn)品。
所述超聲霧化納米化裝置是利用超聲諧振，使MT微粒間相互撞擊，分散成更細(xì)的微粒，MT微粒中的微量水份，又進(jìn)一步促進(jìn)超聲“空化”效果，激化MT微粒，使成更細(xì)的納米化微粒，所述甚低溫超聲粉碎納米化裝置是利用物質(zhì)材料在甚低溫狀態(tài)下，變?yōu)闃O易破碎的“玻璃體”的原理，對MT材料進(jìn)行超聲粉碎，使成納米級微粒。
權(quán)利要求
1.一種納米金屬硫蛋白，由金屬硫蛋白經(jīng)納米技術(shù)處理獲得，所述金屬硫蛋白是在對動物體進(jìn)行誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后在其臟器中提取出的一種低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可誘導(dǎo)性的金屬與硫蛋白結(jié)合物，在每摩爾金屬硫蛋白中含有60-61個氨基酸結(jié)合，7-12個金屬離子，相對分子量為6000-7000u，含有18-20個巰基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金屬硫蛋白在誘導(dǎo)時采用由納米溶質(zhì)與納米溶劑構(gòu)成的納米誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，并對提取的金屬硫蛋白以超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化技術(shù)處理所獲得的納米級微粒。
2.一種納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于其制備流程為納米誘導(dǎo)、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態(tài)下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米誘導(dǎo)是通過將納米金屬誘導(dǎo)劑注射入動物體，使動物體產(chǎn)生金屬與硫蛋白的結(jié)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米誘導(dǎo)是通過將納米金屬誘導(dǎo)劑注射入動物子體內(nèi)，對動物子進(jìn)行5-8天分2-4次皮下注射，誘導(dǎo)動物臟器產(chǎn)生金屬硫蛋白，在誘導(dǎo)結(jié)束后一天，摘取動物的臟器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米金屬誘導(dǎo)劑是以經(jīng)納技術(shù)制備的納米金屬鹽類作溶質(zhì)，純水經(jīng)電子或超聲納米化處理所獲得的納米溶劑配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于所述納米金屬誘導(dǎo)劑的溶質(zhì)采用納米級的鋅鹽，如ZnCl2或ZnSO4。
全文摘要
一種納米金屬硫蛋白，系經(jīng)納米誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)、納米技術(shù)處理獲得的納米級的金屬硫蛋白。其制備方法為納米誘導(dǎo)、搗碎勻漿、分離、超濾脫鹽、超聲霧化納米化或/和甚低溫超聲粉碎納米化，所述工藝過程均在低溫狀態(tài)下進(jìn)行。納米誘導(dǎo)是通過將納米金屬誘導(dǎo)劑注射入動物體，使動物體產(chǎn)生金屬與硫蛋白的結(jié)合物。所述超聲霧化納米化是利用超聲霧化納米化裝置使金屬硫蛋白的微粒納米化，所述甚低溫超聲粉碎納米化是利用甚低溫超聲粉碎納米化裝置使金屬硫蛋白的微粒納米化。采用本發(fā)明的工藝所獲得的納米金屬硫蛋白，其活性和功能得以大大的提高和擴(kuò)展，具有高生物敏感性、高生物親和性和高生物活性。
文檔編號C07K14/825GK1524881SQ03115579
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月28日
發(fā)明者陶芒, 崔濟(jì)忠, 陶 芒 申請人:上海清沁生物科技有限公司