專利名稱：新型抗腫瘤植物提取物、其提取方法及其類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從植物中提取得到的化合物、其提取方法、用途及其類似物。
核磁共振碳譜(100MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as intemalstandard)123.8(d，C-1)，115.2(d，C-2)，157.8(s，C-3)，105.3(d，C-4)，130.2(s，C-4a)，123.8(s，C-4b)，104.6(d，C-5)，149.0(s，C-6)，149.8(s，C-7)，104.2(d，C-8)，124.5(s，C-8a)，122.6(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，53.5(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.6(t，C-14)，57.8(d，C-14a)，3 1.2(t，C-15)，120.1(s，C-15a)，122.5(s，C-15b)，55.6(q，C-3-OMe)，55.8(q，C-6-OMe)and 55.5(q，C-7-OMe).
特別地，當(dāng)R1＝R3＝OMe，R2＝OH時(shí)，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物2)，其特征在于顏色和形狀白色粉末熔點(diǎn)248-250℃比旋光[α]D20-63.7°(c0.2，CH3OH)紅外光譜主要的特征譜帶位于3410，2934，1613，1514，1467，1419，1357，1310，1265，1240，1195，1137，1037 and 819cm-1紫外光譜(λmaxMeOHlogε)282nm(4.96)質(zhì)譜(ESI(+))364(M+H)+(ESI(-))362(M-H)-(HREIMS(+))363.1830([M]+，calcd.363.1834)核磁共振氫譜(400MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as internalstandard)8.12(1H，s，H-5)，7.92(1H，d，J＝2.4Hz，H-4)，7.80(1H，d，J＝9.2Hz，H-1)，7.33(1H，s，H-8)，7.26(1H，dd，J＝9.2，2.4Hz，H-2)，4.97 and 4.51(each 1H，d，J＝16Hz，H-9)，4.00(3H，s，H-3-OMe)，3.98(3H，s，H-7-OMe)，3.74 and 3.16(each 1H，d，J＝10.4Hz，H-11)，3.55 and 3.10(each 1H，d，J＝15.2Hz，H-15)，3.51(1H，m，H-14a)，2.25 and 1.89(each 1H，d，J＝14.4Hz，H-14)，1.93(2H，m，H-12)，1.60 and 1.77(each 1H，m，H-13).
核磁共振碳譜(100MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as internalstandard)124.8(d，C-1)，116.2(d，C-2)，157.8(s，C-3)，108.3(d，C-4)，131.5(s，C-4a)，123.2(s，C-4b)，104.8(d，C-5)，147.1(s，C-6)，150.6(s，C-7)，104.3(d，C-8)，124.0(s，C-8a)，122.1(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，54.1(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.4(t，C-14)，57.6(d，C-14a)，31.2(t，C-15)，120.0(s，C-15a)，122.1(s，C-15b)，55.9(q，C-3-OMe)and 55.5(q，C-7-OMe)。
要得到化合物1和化合物2，可以借助合適的溶劑浸提蓼科植物束序苧麻粗粉得到總浸膏，總浸膏用水分散后用適宜的有機(jī)溶劑萃取而得到萃取物，萃取物經(jīng)分離得到。本發(fā)明以整個(gè)植物形式存在的束序苧麻通常被干燥粉碎后用合適的溶劑進(jìn)行浸提得到總浸膏，總浸膏分散在適量水中，用適宜的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，濃縮萃取液得到萃取物。從萃取物中經(jīng)分離得到上述的化合物，此類化合物是具有抗腫瘤活性并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的菲并喹喏里西啶型生物堿。
本發(fā)明中化合物的提取可以通過(guò)以下方式得以實(shí)現(xiàn)束序苧麻全植株粉碎后用70％-98％的乙醇、甲醇等浸提，浸提液經(jīng)減壓濃縮得總浸膏，總浸膏溶解在水中后可以分別用合適的有機(jī)溶劑萃取，比如乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯等，萃取液經(jīng)減壓濃縮得萃取物，萃取物經(jīng)分離提純得到化合物1和化合物2。
特別地，當(dāng)R1＝R2＝R3＝OMe時(shí)，該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物1)白色細(xì)針晶，在薄層板上與Dragendorff試劑反應(yīng)顯橘紅色。該化合物的質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰(APIMS(+)378(M+H)+，ESI(+)755(2M+H)+，378(M+H)+)提示該化合物可能為含氮化合物。此化合物位于δ8.15(1H，d，J＝2.4Hz，H-4)，7.83(1H，d，J＝9.2Hz，H-1)，7.30(1H，dd，J＝9.2，2.4Hz，H-2)和8.13(1H，s，H-5)，7.34(1H，s，H-8)的1H NMR信號(hào)及紅外光譜中的1609和1466cm-1說(shuō)明兩個(gè)取代苯環(huán)的存在。1H NMR信號(hào)δ4.05(3H，s，H-6-OMe)，4.01(3H，s，H-3-OMe)，3.97(3H，s，H-7-OMe)確認(rèn)為3個(gè)甲氧基的1H NMR信號(hào)。13C NMR(DEPT)中除上述基團(tuán)的信號(hào)外，還有位于δ122.6(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，53.5(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.6(t，C-14)，57.8(d，C-14a)，31.2(t，C-15)和120.1(s，C-15a)處的9個(gè)信號(hào)。綜合上述信息，該化合物可能是菲并喹喏里西定型生物堿。根據(jù)此化合物的1H-1H COSY，HMQC和HMBC(見下圖)推斷該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定，其分子式C24H27NO3(計(jì)算值377.1991)與高分辨質(zhì)譜所提供實(shí)測(cè)值(377.1994)吻合。此化合物的IR光譜中位于2850cm-1處的吸收說(shuō)明D環(huán)與E環(huán)是反式稠和的。由此該化合物的結(jié)構(gòu)如下所示。 特別地，當(dāng)R1＝R3＝OMe，R2＝OH時(shí)，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物2)白色粉末，在薄層板上與Dragendorff試劑反應(yīng)顯橘紅色。此化合物的質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰(ESI(+)364(M+H)+，ESI(-)362(M-H)-)提示該化合物可能為含氮化合物?；衔?與化合物1的1H NMR和13C NMR譜圖非常相似，差別在于化合物l中的一個(gè)甲氧基被一個(gè)羥基取代。根據(jù)NOSY實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見右圖)確定化合物2中的6-位應(yīng)為羥基取代。因此化合物2即為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定，其分子式C23H25NO3(計(jì)算值363.1834)與高分辨質(zhì)譜所提供實(shí)測(cè)值(363.1830)吻合。
本發(fā)明中，化合物2可在一定條件下轉(zhuǎn)化為化合物1化合物2溶解于無(wú)水丙酮中，向此溶液中加入硫酸二甲酯，再加入無(wú)水碳酸鉀，攪拌并回流，反應(yīng)液冷卻后過(guò)濾，濾液與化合物1作薄層對(duì)照，證明化合物2的甲基化產(chǎn)物就是化合物1。
本發(fā)明中從蓼科植物束序苧麻中提取分離得到的化合物1和2是新發(fā)現(xiàn)的具有顯著抗腫瘤活性并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的菲并喹喏里西定型生物堿，抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明化合物1和2對(duì)7種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)理是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。
另外，本發(fā)明以抗腫瘤化合物1和2的結(jié)構(gòu)為模型，設(shè)計(jì)并合成了系列類似物，其結(jié)構(gòu)式如右所示，其中R1 R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9可以為下述之一種氫原子(H)、羥基(hydroxyl)、烴基(alkyl)、芳基(aryl)、?；?acyl)、烷氧基(alkoxy)、醛基(aldellyde)、鹵素(halogen)、氨基(amjno)、烴氨基(alkylamino)、芳氨基(arylamino)和酰氨基(acylamino)，且R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9不全為氫原子(H)。上述的類似物可以作為抗腫瘤藥物應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明分離得到的菲并喹喏里西定型生物堿具有顯著抗腫瘤活性并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化；2、本發(fā)明的提取、萃取分離的工藝簡(jiǎn)單；3、本發(fā)明為新型抗癌藥物的研制奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1束序苧麻全植株30Kg(干重)，粉碎后用95％乙醇浸提(50L×3)，減壓濃縮得總浸膏1176g?？偨嗳芙庠?.0L溫?zé)崴?約50℃)中，冷卻后用乙酸乙酯萃取(1.0L×10)，減壓濃縮得乙酸乙酯部分455g。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析梯度洗脫(CHCl3，CHCl3∶CH3OH＝50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，CH3OH)分成9個(gè)部分(TLC作檢測(cè)，相同部分合并在一起)；Fr.4經(jīng)硅膠柱層析(CH2Cl2∶CH3OH＝20∶1)分離得到1(132mg)和2(26mg)。
實(shí)施例2化合物2轉(zhuǎn)化為化合物1化合物2(3mg)溶解于5ml的無(wú)水丙酮中，向此溶液中加入1.4mg硫酸二甲酯，再加入無(wú)水碳酸鉀1.3mg。攪拌并回流30分鐘。反應(yīng)液冷卻后過(guò)濾，濾液與化合物1作薄層對(duì)照，證明化合物2的甲基化產(chǎn)物就是化合物1。
實(shí)施例3本發(fā)明抑制人體惡性腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含適量青、鏈霉素和谷氨酰胺，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)。試驗(yàn)前將細(xì)胞按一定密度接種于96孔培養(yǎng)板中，24小時(shí)后換用含不同濃度本發(fā)明(用PBS配置成1mg/ml工作液，使用時(shí)按所需濃度用培養(yǎng)基稀釋并加入細(xì)胞)的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。終止培養(yǎng)，每孔加入50ul預(yù)冷50％三氯乙酸(TCA，終濃度為10％)，靜置5分鐘后移放4℃1小時(shí)。蒸餾水洗滌5次，空氣干燥，加入100ul SRB染液(用1％醋酸配制成0.4％溶液)，染色處理細(xì)胞10分鐘，用1％醋酸溶液洗滌細(xì)胞4次，除去未結(jié)合染料，空氣干燥。最后加入150ul 10mmol/L非緩沖Tris溶液溶解結(jié)合染料，充分混勻后，經(jīng)酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定并計(jì)算GI50(50％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制所需要的濃度)。
表1本發(fā)明對(duì)七種腫瘤中38個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制(GI50，μg/ml)作用

如表1所示，本發(fā)明對(duì)七種腫瘤、38個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用，表明了本發(fā)明的廣譜抗腫瘤作用。
實(shí)施例4本發(fā)明誘導(dǎo)乳腺癌脂肪細(xì)胞分化應(yīng)用本發(fā)明處理乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)除可引起顯著的細(xì)胞增殖抑制外，而且伴有顯著的胞漿脂質(zhì)堆積。因此應(yīng)用油紅染色法檢測(cè)本發(fā)明作用乳腺癌細(xì)胞后的脂肪細(xì)胞分化。將常規(guī)培養(yǎng)的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，貼瓶后加入不同濃度的本發(fā)明，繼續(xù)培養(yǎng)3-7天。棄培養(yǎng)上清，加入10％甲醛固定細(xì)胞1h，蒸餾水洗細(xì)胞，用油紅O染色5-10分鐘，直至脂滴著紅色時(shí)終止染色。在劑量為0.038ug/ml作用3天后，MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，主要特征為胞漿脂質(zhì)堆積，并隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)(藥物作用7d)，脂質(zhì)堆積量增加，而未經(jīng)本發(fā)明處理的細(xì)胞，沒有觀察到這種脂滴堆積的形態(tài)學(xué)改變。正常人靜止期乳腺組織內(nèi)含有豐富的脂肪細(xì)胞，癌組織的發(fā)生通常與細(xì)胞凋亡受阻、細(xì)胞分化障礙有關(guān)。誘導(dǎo)分化已成為腫瘤治療的一種新途徑，至今，已發(fā)現(xiàn)許多具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用的藥物，最典型的藥物是維甲酸類化合物。通過(guò)誘導(dǎo)分化探索乳腺癌的治療不僅能為腫瘤治療提供新的途徑，而且這種誘導(dǎo)分化作用也許可能解釋乳腺癌發(fā)生的某些機(jī)制。
權(quán)利要求
1.從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征在于具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9可以為下述之一種氫原子(H)、羥基(hydroxyl)、烴基(alkyl)、芳基(aryl)、?；?acyl)、烷氧基(alkoxy)、醛基(aldehyde)、鹵素(halogen)、氨基(amino)、烴氨基(alkylamino)、芳氨基(arylamino)和酰氨基(acylamino)，且R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9不全為氫原子(H)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是當(dāng)R1＝R2＝R3＝OMe，R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝R9＝H時(shí)，該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是當(dāng)R1＝R3＝OMe，R2＝OH，R1＝R5＝R6＝R7＝R8＝R9＝H時(shí)，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是該化合物可以借助合適的溶劑浸提蓼科植物束序苧麻粗粉得到總浸膏，總浸膏用水分散后用適宜的有機(jī)溶劑萃取而得到萃取物，萃取物經(jīng)分離得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是浸提可采用70％-98％的乙醇、甲醇，萃取的有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或5所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定通過(guò)甲基化可轉(zhuǎn)化為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物，其特征是以3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定和3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定結(jié)構(gòu)為模型，可以設(shè)計(jì)并合成系列類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成的類似物的用途，其特征是具有顯著抗腫瘤活性并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一類新型抗腫瘤植物提取物、其提取方法及其類似物。以蓼科植物束序苧麻(Boehmeria siamensis Craib，Urticaceae)為原料，經(jīng)溶劑提取和多種層析方法分離并鑒定了兩個(gè)新的菲并喹喏里西定型生物堿3，6，7－三甲氧基－11，12，13，14，14a，15－六氫－9H－菲[9，10－b]并喹喏里西定和3，7－二甲氧基－6－羥基－11，12，13，14，14a，15－六氫－9H－菲[9，10－b]并喹喏里西定，體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，其具有對(duì)多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用并可使部分腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為正常脂肪細(xì)胞。本發(fā)明還設(shè)計(jì)并合成了上述化合物的系列類似物，可應(yīng)用于臨床作為預(yù)防和治療癌癥的新藥物。本發(fā)明對(duì)研究與開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利用天然植物資源提供了科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C07D471/00GK1463973SQ0213330
公開日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
發(fā)明者羅應(yīng)剛, 高小平, 劉燕, 田雅娟, 顧健, 周敏, 李伯剛, 張國(guó)林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所