專利名稱：改善腸胃的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制改善腸胃的組合物，更具體地，本發(fā)明涉及衍生自猴菇菌的、可用作幽門螺桿菌抑制劑地分離物，以及含有該分離物的組合物。
背景技術(shù)：
自1982年Marshall和Warren從胃炎患者中分離出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)之后，世界各國的科學(xué)家對幽門螺桿菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、診斷和治療進(jìn)行了廣泛的研究，現(xiàn)已確認(rèn)幽門螺桿菌是慢性胃炎的主要致病因子，與消化性潰瘍的發(fā)病密切相關(guān)，WHO和國際癌研究組織已將其列為第一類致癌因子。
臨床上，應(yīng)用單一抗生素很難根除幽門螺桿菌的感染，因此采用了不同的藥物組合，比如以鉍劑為基礎(chǔ)的二聯(lián)和三聯(lián)療法。雖然這種組合療法的效果明顯，但其應(yīng)用仍然遇到了一些困難，主要不表現(xiàn)為副作用大；耐藥性增加；腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量和種類減少，菌群失衡。因此，尋找治療簡單、安全無副作用、治愈率高的藥物是醫(yī)藥研究者孜孜以求的目標(biāo)，幽門螺桿菌感染的治療也趨于多元化。
猴菇菌(Hericium erinaceum，He)也稱為猴菇菌，可用來治療慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌等疾病已得到廣泛的認(rèn)可，上海市中藥制藥三廠的猴菇菌片已在臨床應(yīng)用多年。雖然眾多的報(bào)道認(rèn)為猴菇菌中含有多糖、生物堿、萜類等生物活性成分，但這些成分對幽門螺桿菌是否有抑制作用尚未見報(bào)道。
已有大量研究表明分子量低于1萬的甲殼低聚糖，具有更為廣泛和獨(dú)特的生理活性物質(zhì)。甲殼低聚糖的制備方法通常有化學(xué)法(包括酸降解法和氧化降解法)和酶降解法。
氧化降解法普遍采用了多種試劑進(jìn)行降解反應(yīng)或降解產(chǎn)物的處理，這給產(chǎn)品的分離、純化和安全性增添了困難，增加了產(chǎn)品的成本。
酸水解法由于是非特異的，分解步驟難以控制，特別是不能得到高級的寡聚糖(＞6)，大大影響了其生物功能的發(fā)揮。
酶解法，由于具有特異性，可選擇性地酶解切斷特定鏈，從而得到高級的寡聚糖，而且反應(yīng)條件溫和，沒有強(qiáng)酸強(qiáng)堿，減少了環(huán)境污染。其酶解產(chǎn)物特別適合于醫(yī)藥、食品、化妝品領(lǐng)域中的運(yùn)用。然而，目前沒有大規(guī)模的生產(chǎn)工藝且生產(chǎn)成本高。
目前工業(yè)上主要采用化學(xué)法制取甲殼低聚糖，然而成本高、質(zhì)量差，用這種方法得到的產(chǎn)品中化學(xué)物質(zhì)的殘留影響了其在食品、醫(yī)藥中的應(yīng)用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)衍生自猴菇菌的、對幽門螺桿菌有抑制作用的可改善腸胃功能的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過多年深入研究，對猴菇菌中抗幽門螺桿菌的成分進(jìn)行了提取分離，獲得了有效抑制幽門螺桿菌生長的分離物，并研制成幽門螺桿菌抑制劑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種組合物，它含有猴菇菌堿醇提取物經(jīng)薄層層析分離到的Rf值在0.15-0.6之間的分離物。
在一優(yōu)選例中，所述的分離物選自下組物質(zhì)
(1)猴菇菌菌絲體堿醇提取物中經(jīng)硅膠柱層析分離得到的四環(huán)三萜酸
FrIII-3，Rf值為0.50±0.05；
(2)FrIII-4和5，Rf值為0.4±0.05和0.45±0.05
(3)FrIII-6和7，Rf值分別為0.30±0.05，0.20±0.05；
或它們的混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的分離物是猴菇菌菌絲體堿醇提取物中經(jīng)硅膠柱層析分離得到的四環(huán)三萜酸FrIII-3，其分子式為C34H52O7。
在另一優(yōu)選例中，所述的分離物的結(jié)構(gòu)式為
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有選自下組的組份
(a)分子量小于10000道爾頓的甲殼低聚糖；(b)橘粉；或其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的甲殼低聚糖是從猴菇菌培養(yǎng)物中分離出的。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物，它還含有藥學(xué)上可接受的載體，并且是膠囊形式。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法，它包括步驟
(a)將猴菇菌菌絲體和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小時(shí)；
(b)過濾得到濾渣；
(c)向?yàn)V渣加入堿性乙醇，回流提取5-50小時(shí)；
(d)過濾得到濾液；
(e)濃縮濾液；
(f)用酸酸化濾液至pH為2-4；
(g)放置5-100小時(shí)，過濾獲得沉淀。
在一優(yōu)選例中，堿性乙醇的pH為8-10，體積為濾渣的5-20倍或更多，較佳地為濾渣的10-15倍。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中回流條件是回流提取3-8次，每次2-6小時(shí)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(f)中，用2-8N鹽酸酸化至pH 2.5-3.5。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟
(h)對沉淀進(jìn)行硅膠柱層析，從而獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)甲殼低聚糖的方法，包括步驟
(a)提供一原料液，所述的原料液是從猴菇菌發(fā)酵液中分離出菌絲體后得到的上清液；
(b)向原料液中加入乙醇至終濃度為55-70％；
(c)放置混合物6-24小時(shí)(較佳地8-12小時(shí))，產(chǎn)生多糖沉淀；
(d)過濾混合物得到濾液；
(e)濃縮濾液，得到濃縮液。
在一優(yōu)選例中，還包括步驟(f)向濃縮液中加入乙醇至85％-90％，室溫(如4℃)放置一段時(shí)間，如6-24小時(shí)，較佳地8-12小時(shí)，產(chǎn)生的沉淀即為甲殼低聚糖。


圖1是本發(fā)明獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物以及生產(chǎn)甲殼低聚糖的流程圖。
圖2顯示了本發(fā)明的分離物FrII(即甲殼低聚糖)對幽門螺桿菌的抑制作用。
圖3顯示了本發(fā)明的分離物FrIII對幽門螺桿菌的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
如本文所用，Rf值指各成分在薄層層析板上斑點(diǎn)的位置，稱作比移值。其計(jì)算公式如下
Rf＝展開后，起始線至斑點(diǎn)中心的距離/展開后，起始線至溶劑前沿的距離
可用于本發(fā)明原料沒有特別限制，只要是猴菇菌或其發(fā)酵產(chǎn)物即可。較佳地為猴菇菌菌絲體(對于組份FrII和FrIII而言)，或發(fā)酵液的上清液(對于組份FrII而言)。
在本發(fā)明的分離方法(參見圖1)中，首先將猴菇菌菌絲體(宜為粉碎形式)與一定量的水混合。水的體積沒有特別限制，通常為猴菇菌菌絲體體積的5-20倍或更多，較佳地為10-15倍。
然后，將水的混合物在90-100℃(較佳地95-100℃)回流提取。回流時(shí)間特別特別限制，通常為5小時(shí)以上，較佳地為5-100小時(shí)。可以分段進(jìn)行，例如回流提取3-8次，每次2-6小時(shí)(更佳地3-5小時(shí))。
回流處理過的混合物，經(jīng)過濾后得到濾渣。
接著，向?yàn)V渣加入堿性乙醇，進(jìn)行回流提取。堿性乙醇的pH為8-10，濃度越高越好，例如99.9％，體積為濾渣的5-20倍或更多，較佳地為10-15倍?；亓鲿r(shí)間特別特別限制，通常為5小時(shí)以上，較佳地為5-100小時(shí)?？梢苑侄芜M(jìn)行，例如回流提取3-8次，每次2-6小時(shí)(更佳地3-5小時(shí))。
對回流處理過的混合物進(jìn)行過濾，得到濾液。再用常規(guī)方法，例如真空濃縮濾液。通常至少濃縮為原體積的1/2以上。
接著，用酸酸化濾液。其中，采用的酸沒有特別限制，可以是鹽酸，硫酸等無機(jī)酸或乙酸等有機(jī)酸，較佳地是鹽酸，其濃度通常2-8N。通常將pH調(diào)節(jié)為2-4，較佳地pH 2.5-3.5即可。
最后，放置一段時(shí)間(通常為5小時(shí)以上，例如5-100小時(shí))，對產(chǎn)生的沉淀進(jìn)行過濾即可獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
在另一優(yōu)選例中，還可獲得的分離物進(jìn)一步地進(jìn)行硅膠柱層析，獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的級分FrIII3-7。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)甲殼低聚糖的方法，它包括步驟
(a)提供一原料液，所述的原料液是從猴菇菌發(fā)酵液中分離出菌絲體后得到的上清液；
(b)向原料液中加入乙醇至終濃度為55-70％(較佳地58-65％，更佳地約60％)；
(c)放置混合物6-24小時(shí)(較佳地8-12小時(shí))，產(chǎn)生多糖沉淀；
(d)過濾混合物得到濾液；
(e)濃縮濾液，得到濃縮液。
濃縮液可以直接使用。此外，還可將甲殼低聚糖制成固體形式，例如，向濃縮液中加入乙醇至85％-90％，室溫(如4℃)放置一段時(shí)間，如6-24小時(shí)，較佳地8-12小時(shí)，產(chǎn)生的沉淀即為甲殼低聚糖。
在本發(fā)明中，就發(fā)酵工藝而言，與常規(guī)的發(fā)酵工藝基本相同。不同點(diǎn)僅在于在培養(yǎng)基中加入甲殼素或殼聚糖作為產(chǎn)生分子量小于10000道爾頓的甲殼低聚糖的原料，其加入量通常為1-100克/升培養(yǎng)基，較佳地為10-80克/升培養(yǎng)基。此外，還可在培養(yǎng)基中加入橘粉，其加入量通常為0.1-20克/升培養(yǎng)基，較佳地為1-10克/升培養(yǎng)基。
一種優(yōu)選的培養(yǎng)基組成如下
成分含量(克/升培養(yǎng)基)
玉米粉(或淀粉，馬玲薯浸提液等) 20～60
葡萄糖(或蔗糖、乳糖、麥芽糖等) 10～40
甲殼素或殼聚糖 10～80
麩皮(或豆餅粉、大豆蛋白、花生蛋白、橘粉等) 1～10
KH2PO4 0.5～2.5
水 余量
一種優(yōu)選的發(fā)酵過程是斜面菌種→液體種子→25L發(fā)酵罐發(fā)酵(裝液系數(shù)50％-80％，溫度25～30℃，接種量5-15％)→70～192小時(shí)放罐。
本發(fā)明的分離物可用作幽門螺桿菌抑制劑，抑制幽門螺桿菌的生長。因此，可作為藥物活性成分用于藥物組合物，例如治療胃病的藥物組合物。此外，還可作為添加劑用于食品或保健品。在本發(fā)明的抑制劑中，可以添加各種常規(guī)的載體、賦形劑、稀釋劑、添加劑、香料、防腐劑等物質(zhì)，只要它們不干擾本發(fā)明分離物的抑制幽門螺桿菌的活性。此外，還可與治療胃病等消化性潰瘍或改善腸胃的物質(zhì)聯(lián)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)本發(fā)明以甲殼素或殼聚糖為主要發(fā)酵基質(zhì)，利用藥用真菌-猴菇菌深層發(fā)酵過程中產(chǎn)生的殼聚糖降解酶，將甲殼素或殼聚糖轉(zhuǎn)化為低聚糖；并對猴菇菌絲體中的多糖和三萜酸類進(jìn)行生化提?。蛔詈筮M(jìn)行合理配伍精制而成。從而通過強(qiáng)化免疫和抑制幽門螺桿菌生長，達(dá)到改善胃腸道功能的作用。
(2)本發(fā)明的組合物(如腸胃康膠囊等)所含猴菇菌多糖和甲殼低聚糖具有免疫增強(qiáng)作用，能夠提高巨噬細(xì)胞的吞嗜殺菌能力，因免疫功能低下或放化療造成的白細(xì)胞數(shù)目下降可通過服用本品得到遏制，使其恢復(fù)到正常水平。
(3)本發(fā)明的組合物所含猴菇菌乙醇提取物(三萜類)和甲殼低聚糖能與胃上皮細(xì)胞存在粘附因子的特異受體結(jié)合，從而抑制幽門螺桿菌的生長，促進(jìn)有益菌群生長，因而具有改善腸胃功能。
(4)本發(fā)明利用猴菇菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的殼聚糖酶系，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和葡聚糖酶等，對甲殼素或殼聚糖進(jìn)行酶法降解，從而得到均分子量較低的且安全可靠的甲殼低聚糖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的提取和純化
以固體培養(yǎng)的猴菇菌菌絲體為原料，按圖1所示的流程進(jìn)行提取。其中，粉碎后的菌絲體和10倍水的混合物在是100℃下回流3小時(shí)，共5次；濾渣與12倍堿性乙醇溶液(pH10)的混合物回流3小時(shí)，共5次；濾渣與10倍酸性乙醇(pH3-5)溶液的混合物回流3小時(shí)，共5次。
制得組分FrI、FrII、FrIII和FrIV。各組分的提取率見表1。
表1 100g 猴菇菌菌絲體或菌絲體中各組分的提取率
實(shí)施例2
對組分FrIII的進(jìn)一步分離
A.薄層層析(TLC)及結(jié)果
分別以下述系統(tǒng)為展開劑，以硫酸∶甲醇(1∶1)為顯色劑，進(jìn)行薄層層析。
系統(tǒng)1—正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)
系統(tǒng)2—正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚(1∶1∶1)
系統(tǒng)3—氯仿∶乙醚∶乙酸乙酯(9∶1∶1)
系統(tǒng)4—甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)
結(jié)果表明，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑時(shí)效果最好。在猴菇菌菌絲體乙醇提取物中有10個(gè)左右的斑點(diǎn)。
B.硅膠柱層析條件及結(jié)果
硅膠200-300目
洗脫劑氯仿∶甲醇＝9∶1，8∶2，1∶1
展開劑甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5
流速快速分離，400ml/15分鐘
每管體積15ml
上樣量22g(FrIII)。
經(jīng)一次硅膠柱層析后得到FrIII-1～2混合物(氯仿∶甲醇＝9∶1)1.15g，F(xiàn)rIII-3～5混合物(氯仿∶甲醇＝8∶2)2.24g，F(xiàn)rIII-6～7混合物(氯仿∶甲醇＝1∶1)12.5g。將FrIII-3～5混合物再次硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯體系，洗脫程序正己烷100％20ml→90％20ml→80％20ml→70％20ml→60％20ml→50％20ml；減壓層析法，保持流速約1.2ml/min；每5ml分管收集，顯色劑同上)，得到FrIII-3(80％正己烷部分，1.09g)和FrIII-4～5的混合物0.86g。
實(shí)施例3
對各組分或級分的定性鑒定
(1)FrI和FrII
利用蒽酮硫酸顯色的方法。上述沉淀取少量，溶于去離子水中，取1ml溶液，加入4ml蒽酮硫酸試劑(1g蒽酮溶于500ml的濃硫酸中)，煮沸10分鐘，呈藍(lán)綠色，證明FrI含有多糖(猴菇菌多糖)，而FrII含低聚糖。
對FrII進(jìn)一步分析表明，其主要成分是甲殼低聚糖，分子量小于10000道爾頓，1500-3000道爾頓的甲殼低聚糖占85％以上。
(2)FrIII
A.利用醋酐-硫酸反應(yīng)(Liebermann-Burchard反應(yīng))
取實(shí)施例1中的濃縮液各1ml蒸干，加醋酐1ml溶解，后滴加濃硫酸2滴，呈黃色→紫紅色→墨綠色轉(zhuǎn)變，說明含有皂甙和三萜類。
B.利用TLC
按實(shí)施例2中所述的方法進(jìn)行TLC，
結(jié)果表明，菌絲體中FrIII組份中有5個(gè)斑點(diǎn)的Rf值在0.15～0.60之間，另外有2個(gè)斑點(diǎn)的Rf值在0.60～0.70之間。在實(shí)驗(yàn)中觀察到FrIII-3～5(Rf＝0.56～0.40)先顯亮紅色，然后變?yōu)樽仙籉rIII-6～7(Rf＝0.40～0.17)則由橙色變?yōu)樽仙?，這表明這些級份中都可能含有萜酸，且具不飽和特性，否則呈黃色并逐漸褪色。
具體而言，以硫酸∶甲醇(1∶1)為顯色劑，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑，在猴菇菌發(fā)酵菌絲體乙醇提取物中有5個(gè)斑點(diǎn)的Rf值介于0.2～0.6之間，其中，F(xiàn)rIII-3，F(xiàn)rIII-4，F(xiàn)rIII-5，F(xiàn)rIII-6，F(xiàn)rIII-7的Rf值分別為0.50±0.05；0.4±0.05，0.45±0.05，0.30±0.05，0.20±0.05。
c.光譜分析
(i)紫外光譜
FrIII-3的最大吸收(λmax)在254nm；FrIII-4～5的最大吸收(λmax)在246nm、FrIII-6～7在223nm左右。
(ii)紅外光譜
FrIII-3～7在3000～3500cm-1的有強(qiáng)吸收峰表明含有羥基；2400cm-1處的弱吸收峰表明是三萜酸；在1740cm-1～1760cm-1沒有出現(xiàn)五元環(huán)酮的特征吸收，表明C15位無羰基。1200～1400cm-1的兩個(gè)吸收峰(1305cm-1，1400cm-1)是多氫菲環(huán)的特征吸收，是四環(huán)三萜最為有力的證明。
(iii)核磁共振對FrIII-3和FrIII-4～5進(jìn)行了13CNMR分析，數(shù)據(jù)如表2和3所示
表2 FrIII-3的13CNMR數(shù)據(jù)
表3 FrIII-4和FrIII-5的13CNMR采集到的主要數(shù)據(jù)
D.質(zhì)譜分析
經(jīng)ESI-MS檢測到FrIII-3的分子離子峰(m/z)比較明顯在572(M+)，570(M+-2H)，535(M+-2H2O)。因此推測FrIII-3的分子式為C34H52O7，其可能的分子結(jié)構(gòu)如下
(3) FrIV
利用1％三氯化鋁顯色反應(yīng)。取組分FrIV溶液1ml，滴加1％三氯化鋁溶液，呈黃色反應(yīng)，證明含有黃酮類物質(zhì)。
實(shí)施例4
各組分和級分的抑菌效果檢測
(一)材料
實(shí)驗(yàn)材料
1、培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂，改良布氏瓊脂，巧克力瓊脂，蛋黃瓊脂
2、新鮮脫纖維馬血、羊血、RPMI1640
3、混合抗生素萬古霉素(Vancumycin)，多粘菌素B(Polymyxin B)，黃胺增效劑(TMP)
4、實(shí)驗(yàn)菌株幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)三株，編號為12908(常用的標(biāo)準(zhǔn)株)，滬東97，F(xiàn)44(臨床分離菌株)
(二)、結(jié)果與討論
1、幽門螺桿菌培養(yǎng)
采用不同培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)方式和不同厭氣條件進(jìn)行培養(yǎng)。
表4 不同培養(yǎng)基對幽門螺桿菌生長的影響-不生長。+，++，+++生長能力依次遞增。下同
表5 不同培養(yǎng)方式對幽門螺桿菌生長的影響
由表4、表5可以看出在布氏瓊脂、巧克力瓊脂上，以及在三氣(5％O2，10％CO2，85％N2)條件下幽門螺桿菌生長良好；這說明幽門螺桿菌是一種專性微需氧菌，在大氣中和絕對厭氧環(huán)境中均不能生長。
2、幽門螺桿菌鑒定
按常規(guī)方法進(jìn)行包括形態(tài)特征、生化反應(yīng)和PCR分型的鑒定。結(jié)果如下
表6 幽門螺桿菌的鑒定
+陽性；-陰性
雖然幽門螺桿菌對臨床微生物實(shí)驗(yàn)中常用于鑒定腸道細(xì)菌的大多數(shù)經(jīng)典生化實(shí)驗(yàn)不起反應(yīng)，但幽門螺桿菌均能產(chǎn)生尿素酶(Urease)、觸酶(Catalase)和氧化酶(Oxidase)。因此以它們作為幽門螺桿菌生化鑒定依據(jù)，但這些酶的測定對幽門螺桿菌的分型毫無幫助。而研究認(rèn)為在幽門螺桿菌菌株中，含有毒素相關(guān)蛋白基因(Cytotoxin associated gene A，CagA)的菌株(I型菌)具有較強(qiáng)的毒性，與十二指腸潰瘍及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此對三株幽門螺桿菌的CagA基因進(jìn)行了PCR檢測，有一株(滬東97)具有CagA基因。然后，主要以滬東97為實(shí)驗(yàn)菌，對猴菇菌提取物進(jìn)行了抑菌作用實(shí)驗(yàn)。
3、猴菇菌提取物對幽門螺桿菌的抑制作用
用不同濃度或稀釋度的各組份，通過常規(guī)的濾紙擴(kuò)散法測抑菌圈大小和倍比稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表7A-7B所示。
表7A 猴菇菌提取物對幽門螺桿菌的抑制作用
●+，有活性；-，無活性。
●提取物濃度FrI，F(xiàn)rII，F(xiàn)rIII，F(xiàn)rIV各為10mg/ml。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)rII和FrIII對幽門螺桿菌具有抑制作用。測其最低抑菌濃度(MIC)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7B和圖2-3。
表7B FrII和FrIII組份的MIC
*1∶1的濃度為10mg/ml。
由上表可以看出，F(xiàn)rIII、FrII和FrII+FrIII的最低抑菌濃度分別為1.25mg/ml、2.5mg/ml、和0.625mg/ml。圖2為FrII對幽門螺桿菌的抑菌圈，直徑為9mm。圖3為FrIII對幽門螺桿菌(滬東97)的抑菌圈，直徑為11mm。
此外，還通過體外CFU法。利用候選物質(zhì)(包括FrII)與幽門螺桿菌共培養(yǎng)，并感染Hep2，計(jì)算粘附抑制率。結(jié)果如表7C所示。
表7C FrII對幽門螺桿菌的粘附抑制率
通過常規(guī)的濾紙擴(kuò)散法測抑菌圈大小和倍比稀釋培養(yǎng)法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。猴菇菌提取物FrIII-1至7對幽門螺桿菌的抑制作用如表8A和8B所示。
表8A猴菇菌提取物FrIII-1至7對幽門螺桿菌的抑制作用
+，有活性；-，無活性。
提取物濃度FrI，F(xiàn)rII，F(xiàn)rIII，F(xiàn)rIV各為10mg/ml。
表8B FrIII各組分的MIC
*1∶1的濃度為10mg/ml。
由表8中可以看出，F(xiàn)rIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7的最低抑菌濃度分別為1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml和1.25mg/ml，而FrIII-1～2則無活性。
此外，實(shí)驗(yàn)還表明，F(xiàn)rII、FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7對不同的幽門螺桿菌，包括12908和P44，有同樣的抑制作用。
實(shí)施例5
含分離物FrIII的抑制幽門螺桿菌的組合物
1、提取
猴菇菌菌絲體6kg，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，濃縮成浸膏0.25kg(FrI)，備用。濾渣加入240L堿性無水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，經(jīng)真空濃縮到1.5L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到63g沉淀(FrIII)，備用。
2、配制
產(chǎn)品配方
淀粉 64％
FrI(多糖) 10％
FrIII 5％
大豆蛋白 12％
橘粉9％
將上述原料按比例進(jìn)行干粉混合，混勻后，在60℃進(jìn)行干燥3小時(shí)，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時(shí)，即為成品。
實(shí)施例6
含分離物FrIII的抑制幽門螺桿菌的組合物
1、提取
猴菇菌菌絲體1kg，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，濃縮成浸膏45g(FrI)，備用。濾渣加入25L堿性無水乙醇(pH10)回流提取，共5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，經(jīng)真空濃縮到0.25L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到12g沉淀(FrIII)，備用。
2、配制
產(chǎn)品配方
淀粉 64％
FrI(多糖)15％
FrIII 8％
大豆蛋白 8％
橘粉 5％
將上述原料按比例進(jìn)行干粉混合，混勻后，在60℃進(jìn)行干燥3小時(shí)，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時(shí)，即為成品。
實(shí)施例6
含組份FrIII和甲殼低聚糖的抑制幽門螺桿菌的組合物
1、發(fā)酵
A培養(yǎng)基組成
甲殼素或殼聚糖6％，玉米粉2％，葡萄糖2％，麩皮0.5％，橘粉1％，營養(yǎng)鹽0.5％，去離子水93.2％。
B原料處理
上述固體原料除營養(yǎng)鹽外，進(jìn)行干粉混合；營養(yǎng)鹽溶于10ml去離子水，然后干粉與剩余去離子水混合；分別進(jìn)行高壓蒸汽消毒，121℃，30分鐘。
C發(fā)酵
將上述消毒液混合，按接種量5％，攪拌轉(zhuǎn)速180r/m，培養(yǎng)溫度30℃，通風(fēng)量1∶1，發(fā)酵96小時(shí)。
D離心收集菌絲體
4000r/m，離心20分鐘，上清液保留，菌絲體用于下一步的提取步驟。
2、提取
猴菇菌菌絲體1kg，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，濃縮成浸膏0.26kg(FrI)，備用。濾渣加入20L堿性無水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，經(jīng)真空濃縮到0.10L。然后用6N HCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到95g沉淀(FrIII)，備用。
FrII的制備方法猴菇菌發(fā)酵液，經(jīng)離心分離得到上清液，向上清液中加入乙醇至終濃度為60％，4℃放置8-12小時(shí)，產(chǎn)生多糖沉淀(FrI)；離心后得到上清液，濃縮上清液至原體積1/10，得到濃縮液。該濃縮液可以直接使用，還可進(jìn)一步加入乙醇至85％-90％，4℃放置8-12小時(shí)，得到甲殼低聚糖沉淀。
3、配制
產(chǎn)品配方
淀粉 64％
FrI(多糖)10％
FrII(甲殼低聚糖) 15％
FrIII 5％
大豆蛋白 6％
將上述原料按比例進(jìn)行干粉混合，混勻后，在60℃進(jìn)行干燥3小時(shí)，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時(shí)，即為成品。
實(shí)施例7
含組份FrIII和甲殼低聚糖的抑制幽門螺桿菌的組合物
1、發(fā)酵
A培養(yǎng)基組成
甲殼素或殼聚糖1％，玉米粉2％，葡萄糖3％，麩皮0.5％，橘粉4％，營養(yǎng)鹽0.8％，去離子水88.7％。
B原料處理
上述固體原料除營養(yǎng)鹽外，進(jìn)行干粉混合；營養(yǎng)鹽溶于10ml去離子水，然后干粉與剩余去離子水混合；分別進(jìn)行高壓蒸汽消毒，121℃，30分鐘。
C發(fā)酵
將上述消毒液混合，按接種量10％，攪拌轉(zhuǎn)速200r/m，培養(yǎng)溫度27℃，通風(fēng)量1∶1，發(fā)酵80小時(shí)。
D離心收集菌體
4000r/m，離心20分鐘，上清液保留，菌體進(jìn)入一步抽提。
2、提取
猴菇菌菌絲體100g，粉碎后加入10倍體積的去離子水，95℃回流提取5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，濃縮成浸膏28g(FrI)，備用。濾渣加入2L堿性無水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小時(shí)，收集濾液，經(jīng)真空濃縮到0.01L。然后用6NHCl酸化到pH3，置4℃冰箱中過夜，收集到10.1g沉淀(FrIII)，備用。
FrII的制備方法猴菇菌發(fā)酵液，經(jīng)離心分離得到上清液，向上清液中加入乙醇至終濃度為60％，4℃放置8-12小時(shí)，產(chǎn)生多糖沉淀；離心后得到上清液，濃縮上清液至原體積1/10，加入乙醇至85％-90％，4℃放置8-12小時(shí)，產(chǎn)生的沉淀即為甲殼低聚糖。
3、配制
產(chǎn)品配方
淀粉 60％
FrI(多糖) 15％
FrII(甲殼低聚糖) 15％
FrIII 7％
大豆蛋白 3％
將上述原料按比例進(jìn)行干粉混合，混勻后，在60℃進(jìn)行干燥3小時(shí)，過100-120目篩，裝膠囊或壓片，然后在65℃干熱滅菌2小時(shí)，即為成品。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于，它含有猴菇菌堿醇提取物經(jīng)薄層層析分離到的Rf值在0.15-0.6之間的分離物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的分離物選自下組物質(zhì)
(1)猴菇菌菌絲體堿醇提取物中經(jīng)硅膠柱層析分離得到的四環(huán)三萜酸
FrIII-3，Rf值為0.50±0.05；
(2)FrIII-4和5，Rf值為0.4±0.05和0.45±0.05
(3)FrIII-6和7，Rf值分別為0.30±0.05，0.20±0.05；
或它們的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述的分離物是猴菇菌菌絲體堿醇提取物中經(jīng)硅膠柱層析分離得到的四環(huán)三萜酸FrIII-3，其分子式為C34H52O7。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，還含有選自下組的組份
(a)分子量小于10000道爾頓的甲殼低聚糖；
(b)橘粉；或其混合物。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述的甲殼低聚糖是猴菇菌培養(yǎng)物中分離出的。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物，它還含有藥學(xué)上可接受的載體，并且是膠囊形式。
8.一種獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法，其特征在于，它包括步驟
(a)將猴菇菌菌絲體和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小時(shí)；
(b)過濾得到濾渣；
(c)向?yàn)V渣加入堿性乙醇，回流提取5-50小時(shí)；
(d)過濾得到濾液；
(e)濃縮濾液；
(f)用酸酸化濾液至pH為2-4；
(g)放置5-100小時(shí)，過濾獲得沉淀。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(c)中，堿性乙醇的pH為8-10，體積為濾渣的5-20倍；在步驟(c)中回流條件是回流提取3-8次，每次2-6小時(shí)；步驟(f)中，用2-8N鹽酸酸化至pH 2.5-3.5；并且在步驟(g)之后，還包括步驟(h)對沉淀進(jìn)行硅膠柱層析，從而獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物。
10.一種生產(chǎn)甲殼低聚糖的方法，其特征在于，它包括步驟
(a)提供一原料液，所述的原料液是從猴菇菌發(fā)酵液中分離出菌絲體后得到的上清液；
(b)向原料液中加入乙醇至終濃度為55-70％；
(c)放置混合物6-24小時(shí)，產(chǎn)生多糖沉淀；
(d)過濾混合物得到濾液；
(e)濃縮濾液，得到濃縮液。上清液至原體積1/10，加入乙醇至85％-90％，4℃放置8-12小時(shí)，產(chǎn)生的沉淀即為甲殼低聚糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種改善腸胃功能的組合物，它含有猴菇菌堿醇提取物經(jīng)薄層層析分離到的Rf值在0.15－0.6之間的分離物。一種優(yōu)選的組合物還含有甲殼低聚糖和/或橘粉。本發(fā)明還提供了獲得對幽門螺桿菌有抑制作用的分離物的方法以及產(chǎn)生甲殼低聚糖的方法。本發(fā)明的組合物可有效地抑制幽門螺桿菌的生長，達(dá)到改善腸胃功能的效果。
文檔編號C07J9/00GK1442199SQ0211095
公開日2003年9月17日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月6日
發(fā)明者李平作, 趙國屏, 陳常慶 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心