專利名稱：對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物,及其生產(chǎn)和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物及其生產(chǎn)和使用方法。
遺憾的是制備肽和其它硫酯(Hojo等，Pept.Chem.(1992)，VolumDate 1991，29th pp，115-20；Canne等，Tetrahed.Letters(1995)361217-20；Hackeng等，Proc Natl Acad Sci USA.(1999)9610068-73)和某些情況下使用的傳統(tǒng)條件限于非親核合成策略。例如，當(dāng)試圖使用Nα-9-芴基甲氧羰基(“Fmoc”)-基肽合成法制備有硫酯活性的肽時，問題產(chǎn)生了，就是肽合成過程中，強親核試劑如哌啶或哌啶生成的氫氧根離子導(dǎo)致硫酯部分的破壞，這是不希望有的。這是一個重要問題，因為用于在每個Fmoc-基有機合成循環(huán)中除去Nα-Fmoc基團的優(yōu)選試劑含有哌啶。哌啶如同其它強堿性或親核化合物(以下稱為“親核試劑”)一樣，破壞肽的硫酯成分，使它在以后的硫酯介導(dǎo)反應(yīng)中失去作用。
已有多種嘗試用于解決這一問題。Clippingdale等(J.PeptideSci.(2000)6225-234)用非親核性堿來除去由Fmoc-基固相肽合成法(“SPPS”)制備的肽的Nα-Fmoc基團。此方法有幾個問題，包括產(chǎn)生不希望的缺失、副產(chǎn)物并需要主鏈保護策略。其它研究小組，包括，Bertozzi等(J.Amer.Chem.Soc.(1999)12111684-11689)和Pessi等(Journal of the American Chemical Society；1999；12111369-11374.)已經(jīng)報導(dǎo)在Fmoc SPPS中結(jié)合‘Kenner’保險栓連接子，在溶液中生成完全保護的肽-硫酯，‘Kenner’保險栓連接子對親核試劑是穩(wěn)定的直至連接子烷基化。此方法的一個缺點是受保護的肽在溶液中的溶解性能太差。此方法的其它缺點，包括此方法固有的副反應(yīng)，如當(dāng)連接子烷基化而不穩(wěn)定時生成多余的烷基化副產(chǎn)物，因此在許多應(yīng)用情況下此方法是不實際的。相似的失敗已發(fā)生在除了肽之外的分子的親核性合成方案中，如有機小分子。
因此，所需要的就是通用并可靠的系統(tǒng)，它適用于產(chǎn)生對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物和組合物，它與用于多種有機合成策略、采用硫酯介導(dǎo)反應(yīng)的結(jié)合和化學(xué)選擇性連接反應(yīng)的有機或水性反應(yīng)條件相容。本發(fā)明陳述了這點以及其它需要。
在會聚或相容的選擇性連接方案中，且更通常在存在或生成氫氧根離子或其它強親核試劑的條件下，本發(fā)明化合物對于親核試劑介導(dǎo)的有機合成方案，如Fmoc-基SPPS中使用的親核試劑是穩(wěn)定的，并因而得到大范圍使用。例如，對親核試劑穩(wěn)定的含原硫代酸酯或硫醇羧基酯的成分可在氫氧根離子或其它強親核試劑存在時制備，且在適宜時即轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚粤蝓バ问?。為活化對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，使用非親核性試劑如強酸，將氧保護基從原硫代酸酯上簡單地除去。得到的硫酯活化成分用于眾多硫酯介導(dǎo)連接反應(yīng)中的任一反應(yīng)。通過混合硫醇催化劑活化本發(fā)明中對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯。添加硫醇催化劑促進了分子內(nèi)的硫酯形成，如此有利于與帶有親核基團的有關(guān)成分的硫酯介導(dǎo)連接反應(yīng)。
因而，本發(fā)明的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物及方法極大地擴大了親核性合成方案，尤其是固相或溶液相Fmoc-基小分子和肽合成方案的應(yīng)用。使這些方案的產(chǎn)物能夠用于大范圍的硫酯介導(dǎo)連接反應(yīng)，用來生產(chǎn)有機小分子、肽和多肽、其它聚合物等。
例如，如(A)和(B)所示，在存在親核試劑或堿(例如哌啶)時，合成材料可保持在足以切除Fmoc基團的條件下，然后保持在足以使原硫代酸酯-C(OR’)2S-轉(zhuǎn)化為硫酯-C(O)S-的酸性條件下。如(A)所示，任選擇用于將多肽綁縛在樹脂上的連接子使之在足夠形成硫酯的條件下，抗酸(HF，TFA等)的切除。因此，在此實施方案中，F(xiàn)moc保護的氨基基團將去保護，形成硫酯，但多肽將保留在固態(tài)支持物上。如(B)所示，任選擇用于將多肽綁縛在樹脂上的連接子使之在形成硫酯的條件下被切除。因此，在此實施方案中，F(xiàn)moc保護的氨基基團將去保護，形成硫酯，且多肽將從固態(tài)支持物上釋放。
如(C)和(D)所示，另一個可能的選擇是，存在親核試劑或堿(例如哌啶)時，合成材料保持在足以切除Fmoc基團的條件下，而不將反應(yīng)物保持在足以使原硫代酸酯-C(OR’)2S-轉(zhuǎn)化為硫酯-C(O)S-的酸性條件下。這些實施方案允許人們不制備硫酯而除去Fmoc基團。因此，如(C)所示，人們可除去Fmoc基團，并在從固態(tài)支持物上切除多肽或蛋白質(zhì)，或生成硫酯之前，將比連接子更易受酸切除影響的殘基去保護。此外，如(D)所示，人們可除去Fmoc基團，并從固態(tài)支持物上切除多肽或蛋白質(zhì)，并在生成硫酯之前將其它受保護的殘基去保護。
本發(fā)明的方法允許人們使用各種這些方案的組合(例如在相同的合成中使用，去除某些比連接子對酸更不穩(wěn)定的殘基的保護基，以及去除另一些酸不穩(wěn)定性比連接子小一些的殘基的保護基等)。
圖2顯示了對親核試劑穩(wěn)定的Fmoc-烷基硫醇羧基酯硫酯生成樹脂和，通過使用硫醇催化劑活化它們來產(chǎn)生多種對親核試劑穩(wěn)定的中間體和活化硫酯靶X-C(O)SR的方案。本圖揭示了通過使用這些試劑而獲得的化學(xué)合成的充分靈活性。例如，如(E)所示，選擇連接子和殘基保護基使得合成材料可在足夠除去Fmoc保護基的條件下保持，然后在足夠?qū)⒈Ｗo基比連接子對酸更不穩(wěn)定的殘基去保護的條件下保持。在此實施方案中，F(xiàn)moc保護的殘基和酸不穩(wěn)定殘基被去保護，而既不生成硫酯也不從樹脂上釋放合成材料。其后連接子在適當(dāng)條件下的切除可用于將化合物烷基硫醇羧基酯釋放到溶液中，在溶液中，通過加入催化性硫醇，可將它轉(zhuǎn)化為硫醇酯。另一選擇，如(F)所示，選擇連接子和殘基保護基使得合成材料可在足夠除去Fmoc的一種或多種組合條件下保持，并從樹脂中釋放合成產(chǎn)物，而并不生成硫酯。在此實施方案中，合成材料從樹脂中釋放，且那些比連接子更不穩(wěn)定的所選殘基保護基被除去，而那些酸不穩(wěn)定性比連接子小的所選殘基保護基保留下來。在另一實施方案(G)中，添加硫醇催化劑使羧基硫醇硫酯轉(zhuǎn)化為硫酯。這樣的添加可在添加堿或酸之前或之后進行。因而，當(dāng)合成產(chǎn)物已Fmoc-去保護之后，可以任意順序從樹脂上切除，或?qū)⑺氖鼙Ｗo殘基去保護。此外，本發(fā)明的方法允許人們使用這些策略的各種組合(例如在相同的合成中使用，去除某些比連接子對酸更不穩(wěn)定的殘基的保護基，以及去除另一些酸不穩(wěn)定性比連接子小一些的殘基的保護基等)。
圖3顯示了通過天然化學(xué)連接反應(yīng)來合成靶分子的會聚方案，在本例中，假定的肽片斷A、B、C和D，與對親核試劑穩(wěn)定的Fmoc生成原硫代酸酯片斷來生成多肽連接產(chǎn)物A-cys-B-cys-C-cys-D，通過半胱氨酸連接部位的天然酰胺鍵連接。此圖顯示了本發(fā)明方法用于介導(dǎo)蛋白質(zhì)、多肽和聚合物雙向有機合成的能力。如圖所示，本方法能連接多個片斷(片斷可以為衍生蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、樹脂、核酸、碳水化合物、聚合物等)?？梢赃B接任意數(shù)目的這樣的片斷。依照本方法，“片斷A”硫酯的硫酯部分與“片斷B”硫酯的半胱氨酸殘基反應(yīng)?！捌瑪郆”硫酯還包含原硫代酸酯部分。氨基的氮和半胱氨酸殘基上的硫原子攻擊“片斷A”硫酯的碳，導(dǎo)致了五元環(huán)的暫時形成。此環(huán)自發(fā)分解形成連接的“片斷AB”產(chǎn)物，其中酰胺鍵連接前面硫酯的碳和氨基上的氮原子，且其中重新生成半胱氨酸殘基?！捌瑪郃”和“片斷B”間的反應(yīng)不涉及或影響“片斷B”的原硫代酸酯部分。使用本發(fā)明的方法，“片斷B”的原硫代酸酯部分轉(zhuǎn)化為硫酯，因而生成了像“片斷A”那樣能進一步延伸的化合物?！捌瑪郃”和“片斷B”的反應(yīng)展示了氨基-至-羧基方向的肽合成。在圖3所示的第二個實施方案中，提供了羧基-至-氨基方向的肽合成?！捌瑪郈”(衍生蛋白質(zhì)、多肽、聚合物、碳水化合物、核酸或含有受保護的(“PG”)半胱氨酸殘基的氨基酸及硫酯)與“片斷D”(半胱氨酸、或N-末端含半胱氨酸的蛋白質(zhì)、多肽、聚合物)反應(yīng)。如同片斷A和B的情況，反應(yīng)分解形成連接的“片斷CD”產(chǎn)物，其中酰胺鍵連接前面硫酯的碳和前面片斷D的N-末端半胱氨酸氨基上的氮原子，且其中重新生成半胱氨酸殘基側(cè)鏈硫醇。在除去PG保護基后，連接分子如“片斷D”可進一步延伸。值得注意的是，在形成硫酯部分后，片斷AB連接產(chǎn)物可與片斷CD連接產(chǎn)物連接，因而包括生成片斷ABCD連接產(chǎn)物的會聚合成方案。
圖4顯示了圖3描述的靶分子天然化學(xué)連接的另一會聚方案，在本例中，假定的肽片斷A、B、C和D，與對親核試劑穩(wěn)定的Fmoc生成原硫代酸酯片斷來生成多肽連接產(chǎn)物A-cys-B-cys-C-cys-D，通過半胱氨酸連接部位的天然酰胺鍵連接。
本發(fā)明具體實施方案的描述本發(fā)明涉及含有原硫代酸酯或硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物，及其生產(chǎn)方法和用途。此類化合物和方法在有機合成中有廣泛應(yīng)用，包括肽-、多肽-和其它聚合物-硫酯的生成。本發(fā)明特別適用于由在使用強親核試劑的條件下制備的前體來生成活性硫酯，前體如用Fmoc SPPS制備的肽或多肽，以及通過多步連接或結(jié)合方法制備的肽或多肽，這需要相容的選擇性保護方法來進行相關(guān)的特異性連接或結(jié)合反應(yīng)。
本發(fā)明中對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯具有分子式X-C(OR’)2-S-R，其中X是相關(guān)的靶分子，任選地包含一個或多個可被親核試劑切除的保護基，R’是對親核試劑穩(wěn)定的保護基，在非親核性切除條件下可除去，R是與原硫代酸酯-C(OR’)2-S-相容的任何基團。還提供了對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯硫酯生成樹脂，具有分子式X-C(OR’)2-S-R-連接子-樹脂或X-C((OR1’-連接子-樹脂)(OR2’))-S-R，其中X、R’和R如上所述，并且其中連接子和樹脂是任意對親核試劑穩(wěn)定的連接子和適用于固相有機合成的樹脂，包括隨后可轉(zhuǎn)化為親核試劑不穩(wěn)定的連接子以進行切除的保險栓連接子。
靶分子X的實例包括，但并不局限于，任何含有一個或幾個反應(yīng)官能團的部分，如受親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺(即在親核條件下可切除的保護基)，如受親核試劑不穩(wěn)定的Fmoc基團保護的氨基酸的Nα氨基。因而，X可包括含有反應(yīng)官能團的化合物，該化合物自發(fā)或人為地包含氨基酸或氨基酸衍生物、肽、多肽、核酸、脂、碳水化合物、水溶性聚合物如聚氧化烯、聚酰胺、及其共聚物等，假如在其上至少一個反應(yīng)官能團含有親核試劑不穩(wěn)定的保護基。已知許多這樣的保護基適用于此目的(見，例如，
“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“Synthetic Peptides，A Uset’s Guide，”G.A.Grant，編輯.，W.H.Freeman & Company，New York.NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，編輯.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1994；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，編輯.，Georg Thierne Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R的實例包括，但并不局限于，芳基、苯甲基和烷基。優(yōu)選的實施方案包括3-羧基-4-硝基苯基硫酯、苯甲基硫酯、巰基乙酸硫酯和巰基丙酸亮氨酸酯(見，例如，Dawson等.，Science(1994)266776-779；Canne等Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，等.，WO 96/34878；Kent，等.，WO 98/28434；Ingenito等.，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073).
R’的實例包括，但并不局限于，對親核試劑穩(wěn)定的(即，對親核試劑穩(wěn)定的保護基)但是在酸性條件下不穩(wěn)定(即，對非親核試劑不穩(wěn)定的保護基)的保護基，如有催化劑的產(chǎn)氫物質(zhì)(“H2/Cat.”或其它還原劑)，或強酸如三氟乙酸(“TFA”)或氫氟酸(“HF”)。這包括任意可與Fmoc SPPS相容的保護基，假如保護基R’是對親核試劑穩(wěn)定的和對非親核試劑不穩(wěn)定的。已知許多這樣的保護基適用于此目的(見，例如，
“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；”Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，編輯.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“AdvancedChemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，編輯.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of PeptideSynthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1994；and“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，編輯.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R’基團可為與原硫代酸酯-C[(OR1’)(OR2’)]中的獨立氧基團連接的獨立保護基，當(dāng)特別提到時稱之為“非環(huán)狀原硫代酸酯保護基”。以外，R’基團可形成連接并保護兩個氧基團-C(O-R’-O)的雙氧環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)特別提到時稱之為“環(huán)狀原硫代酸酯保護基”。這些化合物顯示如下，其中左邊的化合物含有環(huán)狀原硫代酸酯，右邊的化合物含有非環(huán)狀原硫代酸酯。
環(huán)狀原硫代酸酯非環(huán)狀原硫代酸酯 在環(huán)狀原硫代酸酯中(n)＝1-7個碳；R3可存在或不存在且可單獨存在，或作為雙氧環(huán)主鏈上的兩個或更多相同或混合的取代基，且它是調(diào)節(jié)R’對非親核試劑不穩(wěn)定性的部分。R3優(yōu)選地包含吸電子或給電子基團，以增加對除去非親核保護基R’的穩(wěn)定性。環(huán)狀原硫代酸酯中(n)＝1到5，更優(yōu)選(n)＝1到3，最優(yōu)選(n)＝1-2，且R3優(yōu)選為烷基、苯甲基或芳基。R3烷基、苯甲基或芳基可以是或包含線性、支鏈、取代或非取代的環(huán)狀芳香性或非芳香性、雜芳環(huán)或非雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)所給環(huán)狀原硫代酸酯的預(yù)計最終用途來選擇它們。通常，R3烷基、苯甲基和芳基是用于SPPS的基團，并與酸性或還原性切除相容。合適的吸電子基團包括但不局限于不同氧化狀態(tài)的雜原子(不包括O-)、羰基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和鹵素基團。合適的給電子基團包括但不局限于脂肪族烷基、支鏈脂肪族烷基、苯甲基、取代苯甲基。優(yōu)選的吸電子基團包括酮、酯、酰胺、I、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一個或多個吸電子基團取代的苯甲基。優(yōu)選的給電子基團包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2和被一個或幾個給電子基團取代的苯甲基。在優(yōu)選的實施方案中，R3包含對親核切除條件穩(wěn)定的吸電子基團(即對親核試劑穩(wěn)定)。在此適用如上所述的各種給電子和吸電子基團，公開在“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanism，and Structure，”第四版，J.March編輯，JohnWiley & Sons，New York，NY，1992。將意識到R3可包括間隔基團，典型的是-CH2-基團，它可被選擇以調(diào)節(jié)R’保護基對非親核切除的穩(wěn)定性或使特殊靶分子的合成容易或提高，且可以還原或非還原形式提供。
至于非環(huán)狀原硫代酸酯，其中R’是獨立的氧保護基R1’和R2’，R1’和R2’基團可相同或不同，且從烷基、苯甲基或芳基中選出。優(yōu)選的R1’和R2’烷基、苯甲基或芳基包含吸電子或給電子基團，且優(yōu)選它們相同。R1’和R2’基團可含有線性、支鏈、取代或非取代環(huán)狀芳香性或非芳香性、雜芳環(huán)或非雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)，根據(jù)所給非環(huán)狀原硫代酸酯的預(yù)計最終用途來選擇它們。通常，R1’和R2’基團是用于SPPS的基團，并與酸性或還原性切除相容。在優(yōu)選的實施方案中，R1’和R2’包含對親核切除條件穩(wěn)定的吸電子基團(即對親核試劑穩(wěn)定)。合適的吸電子基團包括但不局限于不同氧化狀態(tài)的雜原子(不包括O-)、羰基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和鹵素基團。合適的給電子基團包括但不局限于脂肪族烷基、支鏈脂肪族烷基、苯甲基、取代苯甲基。優(yōu)選的吸電子基團包括酮、酯、酰胺、I、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一個或多個吸電子基團取代的苯甲基。優(yōu)選的給電子基團包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2和被一個或幾個給電子基團取代的苯甲基。在此適用如上所述的各種給電子和吸電子基團，公開在“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanism，andStructure，”第四版，J.March編輯，John Wiley & Sons，New York，NY，1992。將意識到R3可包括間隔基團，典型的是-CH2-基團，它可被選擇以調(diào)節(jié)R’保護基對非親核切除的穩(wěn)定性或使特殊靶分子的合成容易或提高，且可以還原或非還原形式提供。
本發(fā)明中對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯可在溶液中，通過聚合物載體合成法，或如在此描述的和依照已知工藝中的標(biāo)準(zhǔn)有機化學(xué)技術(shù)的組合來合成。見，例如，“Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，”4th Edition，J.March(編輯)，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1992；“Comprehensive Organic Transformations，A Guide to FunctionalGroup Preparations，”R.Larock(編輯)，VCH Publishers，New York，NY，1989；“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；Feugeas等.，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)1506-1507；和Honma和.，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)818-820).本發(fā)明中溶液和固相方法合成原硫代酸酯硫酯生成樹脂在下面方案I-III中有Fmoc-氨基酸范例。在方案I-III中，Rs是相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈，它可以是遺傳編碼或非編碼氨基酸側(cè)鏈或它們的衍生物且可以是保護的或非保護的，Z是可有可無的保護基團可以是取決于所給合成方案的各種基團，如Fmoc、芐氧基羰基(Z-或Cbz-)或叔丁氧基羰基(“Boc”)。用于合成的試劑可以從許多商品來源獲得，或重新合成。還有，將了解到起始成分和各種中間體，如具有第一氨基酸的原硫代酸酯硫酯生成化合物或用于相關(guān)的有機合成方案中下一步加工的其它化合物X可儲存起來供以后使用，或者可成套供給等。
通常，原硫代酸酯通過將前體原酯在硫醇交換反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為原硫代酸酯來制備。更特別地，按照標(biāo)準(zhǔn)方法原酯X-C(OR’)3作為含有所需相關(guān)的對親核試劑穩(wěn)定的保護基的前體來制備(見，例如，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，pp.437 ff，1999；McElvin等.，J.Amer.Chem.Soc.(1942)641825；R.H.Dewolf，Synthesis(1974)153；Feugeas等.，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)1506-1507；和Honma等.，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)818-820).在優(yōu)選的實施方案中，原酯前體通過最終的路易斯酸催化原酯轉(zhuǎn)化反應(yīng)由腈構(gòu)建，這展示在下面方案I中。在此方案中，靶分子X的腈形式與強酸如HCl或HBr及過量的引發(fā)醇如甲醇或乙醇或保護基R’的醇形式即R’OH混合。然后伯醇修飾的腈在合適的路易斯酸，如AlCl3，BF3·Et2O或SnCl4存在下，通過與相關(guān)保護基的醇形式R’OH反應(yīng)轉(zhuǎn)化為所需原酯前體X-C(OR’)3。另一選擇，腈和一種醇R’OH可轉(zhuǎn)化為亞氨酯，接著在路易斯酸催化劑存在下加入另一種醇R’OH轉(zhuǎn)化為所需前體原酯X-C(OR’)3；在大多數(shù)情況下第一和第二種醇R’OH是相同的，但如果需要混合的原酯，也可以是不同的；例如，如果需要混合結(jié)構(gòu)，第一醇可以是引發(fā)醇。為生成環(huán)狀原硫代酸酯前體，相關(guān)保護基的二醇形式，即OH-R’-OH與伯醇修飾的原酯或衍生自亞氨酯的原酯混合，并用路易斯酸作為催化劑。為生成非環(huán)狀模式則使用單醇。原酯前體也可以從酸制備，但此路線不優(yōu)選。在某些情況下非路易斯酸1，1，1-三鹵化物可作為催化劑，但也是不優(yōu)選的。
方案1 一旦生成原酯前體X-C(OR’)3，它可儲存?zhèn)溆没蛄⒓丛诼芬姿顾?，如AlCl3存在下按標(biāo)準(zhǔn)方法通過與相關(guān)的烷基、苯甲基或芳基硫醇的交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化為所需原硫代酸酯X-C(OR’)2-S-(Feugeas等，C.R.Acad.Sci.，Paris，Ser.C(1968)266(20)1506-1507；及Honma等，Chem.Pharm.Bul1.(1976)24(4)818-820)。在下面的方案II和III中展示了Fmoc-氨基酸原硫代酸酯。
圖解II 圖解III 如

圖1和2所示，在靶分子X的Fmoc-相容合成中原硫代酸酯可結(jié)合在樹脂上。連接子和樹脂系統(tǒng)根據(jù)所給最終需要選擇；熟知許多這樣的系統(tǒng)并適用于此目的(見，例如，
The Combinatorial Index，B.A.Bunin，Acedemic Press，1998；NovaBiochem Catalog 2000；“Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，編輯.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid PhaseOrganic Chemistry，”W.D..Bennet，J.W.Christensen.L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，編輯.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1993；和“The Practice of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1994).
結(jié)合連接子和樹脂系統(tǒng)選擇保護基R’提供了額外的靈活性。例如，根據(jù)保護基R’，和將原硫代酸酯連接于樹脂的連接子，可開發(fā)許多相容的選擇性或非選擇性樹脂上合成、切除和硫酯活化方案。相容的選擇性保護方案涉及被不同化學(xué)機理除去的兩種或多種基團，因而可以任何順序并在任何其它基團存在時除去。相容的選擇性保護方案提供了實質(zhì)上更溫和的全部反應(yīng)條件，因為選擇性可在不同化學(xué)反應(yīng)而不是反應(yīng)速率的基礎(chǔ)上獲得。例如，當(dāng)使用Fmoc化學(xué)反應(yīng)進行肽合成時，即，其中X是Fmoc保護的氨基酸或肽，雖然在每輪氨基酸添加中都使用了哌啶，原硫代酸酯還是穩(wěn)定的。一旦完成最后相關(guān)的偶聯(lián)循環(huán)，F(xiàn)moc基可通過使用哌啶混合試劑除去，通常之后用強酸如TFA處理肽樹脂以除去所存在的任何其它對TFA不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護基。當(dāng)在原硫代酸酯中使用對TFA不穩(wěn)定的鄰氧保護基R’時，TFA處理生成了親核不穩(wěn)定的肽-硫酯。因而，當(dāng)使用含有對TFA不穩(wěn)定的連接子，如Rink連接子的合成樹脂時，生成肽-硫酯并同時從樹脂上切除，活性肽-硫酯釋放到溶液中。此切除產(chǎn)物此時適用于接下來相關(guān)的硫酯介導(dǎo)反應(yīng)。另一選擇，當(dāng)使用對HF不穩(wěn)定的鄰氧保護基系統(tǒng)，且使用含有對TFA不穩(wěn)定的連接子的合成樹脂時，TFA處理在溶液中生成了對親核試劑穩(wěn)定的肽原硫代酸酯。這尤其適用于生產(chǎn)帶有N-端反應(yīng)基如半胱氨酸的肽，同時結(jié)合C-端對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯(見，例如，圖3)。如果使用對酸穩(wěn)定的連接子，那么硫酯肽仍與樹脂鍵合；這可以是使用酶或保險栓切除性連接子的情況。相容的選擇性保護也可用于加工過的靶分子X，它可用于某些構(gòu)造的合成也可用于在會聚結(jié)合或連接方案中使用的中間體的制備(見，例如，圖3和4)。非選擇性方法對某些靶有利并可減少一些化學(xué)步驟，此方法中原硫代酸酯或硫醇羧基酯、連接子和加工后的靶分子X上對非親核性試劑不穩(wěn)定的保護基在同樣的條件組合下不穩(wěn)定并被同時切除。顯而易見，用于肽的與上述同樣的基本設(shè)計方法可用于其它相關(guān)的靶分子，如其它聚合物和小分子，且可用于在樹脂上或溶液中生成部分保護或全部無保護的靶分子X。
本發(fā)明中對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯具有分子式X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-R，其中X是相關(guān)的靶分子，含有一個或幾個親核試劑不穩(wěn)定的保護基，R”是對非親核試劑穩(wěn)定的基團，n是1或2，優(yōu)選n＝1，R是氫、保護基或連接于樹脂上對酸或還原劑不穩(wěn)定的連接子或保險栓連接子或在非親核性條件下可除去的保護基。還提供了對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯硫酯生成樹脂，它具有分子式X-C(O)-O-CH-(R”)-CH2n-S-連接子-樹脂或X-C(O)-O-CH(R”-連接子-樹脂)-CH2n-S-R，其中X、R”、n和R如上所述，且連接子和樹脂是任何對親核試劑穩(wěn)定的連接子和適用于固相有機合成的樹脂。
靶分子X的實例包括，但并不局限于，任何含有一個或幾個反應(yīng)官能團的部分，如受親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺(即在親核條件下可切除的保護基)，如受親核試劑不穩(wěn)定的Fmoc基團保護的氨基酸的Nα氨基。因而，X可包括含有反應(yīng)官能團的化合物，該化合物自發(fā)或人為地包含氨基酸或氨基酸衍生物、肽、多肽、核酸、脂、碳水化合物、水溶性聚合物如聚氧化烯、聚酰胺、及其共聚物等，假如在其上至少一個反應(yīng)官能團含有親核試劑不穩(wěn)定的保護基。已知許多這樣的保護基適用于此目的(見，例如，“Protecting Groups in Organic Synthesis”.3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“Synthetic Peptides，A User’s Guide，”G.A.Grant，編輯.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，”W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，和H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，”M.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1993；“The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，”M.Bodanszky和A.Bodanszky，編輯.，Springer-Verlag，1994；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，編輯.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).
R”基團可以是各種具有如下性質(zhì)的不同吸電子基團或給電子基團中的一個i)使酯對酸性或還原切除條件穩(wěn)定(即，對非親核試劑穩(wěn)定)；及ii)允許催化劑硫醇存在下進行硫酯化交換反應(yīng)。合適的R”基團任選自脂肪烴基、支鏈脂肪烴基、雜原子、羰基、苯甲基、腈、硫氧基、砜、硫酸根和鹵素基團。優(yōu)選的實施方案包括-CH3、-CH2-CH3、-CH2(CH3)2、-CH2-CH2(CH3)2、甲氧基、酮、酯、酰胺、Br、Cl、F、腈、硫氧基、砜和被一個或幾個吸電子基團或給電子基團取代的苯甲基。硫醇催化劑可以是非結(jié)合硫醇或結(jié)合硫醇。優(yōu)選的催化劑硫醇包括苯甲基硫醇、苯硫酚、1-硫代-2-硝基苯酚，2-硫代-苯甲酸，2-硫代-吡啶、4-硫代-2-吡啶羧酸，和4-硫代-2-硝基苯酚，苯硫酚是最優(yōu)選的。
許多方法可用于制造本發(fā)明的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，例如在此描述的方案VII-IX中，并依照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)有機化學(xué)技術(shù)。見例如，“Advanced OrganicChemistry，Reactions，Mechanisms，and Structure，”4th Edition，J.March(編輯)，John Wiley & Sons，New York，NY.1992；“Comprehensive OrganicTransformations，A Guide to Functional Group Preparations，”R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989；和“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，3rd Edition，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，Inc.，1999).優(yōu)選的方法使用具有分子式PG-S-CH2n-CH(R”)OH的硫醇前體或具有分子式PG-S-CH2n-CO(R”)的硫酮，其中PG是對親核試劑穩(wěn)定的保護基。使用硫醇和堿-催化羧基酯化(例如，堿催化劑如二甲基氨基吡啶“DMAP”)的固相合成在下面方案IV-VI中有舉例，展示了Fmoc-氨基酸硫醇羧基酯的生成。在方案IV中，顯示了通過硫醇與連接子的偶聯(lián)，其中R是游離的。方案V展示了通過R”的偶聯(lián)。相同的基本合成方案可用于非氨基酸。還有，對于硫酮前體，酮轉(zhuǎn)化為硫醇形式然后羧基酯化。所用連接子優(yōu)選對酸不穩(wěn)定的，如可被TFA切除的連接子-樹脂系統(tǒng)，如Wang樹脂。
圖解IV 圖解V 圖解VI 本發(fā)明中對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成原硫代酸酯和硫醇羧基酯在用于結(jié)合和連接反應(yīng)的硫酯合成中得到了特別應(yīng)用。例如，它們可用于肽和多肽的硫酯介導(dǎo)的化學(xué)選擇性連接，如天然化學(xué)連接(Dawson等，Science(1994)266776-779；Kent等，WO 96/34878；Kent等，WO 98/28434)。含有C-端或側(cè)鏈硫酯的肽可在連接反應(yīng)中用本發(fā)明的原硫代酸酯和硫醇羧基酯組合物通過Fmoc合成制備。含有N-端Cys殘基的肽或多肽可用Fmoc或Boc化學(xué)合成，或通過生物學(xué)方法如重組DNA表達(dá)，或它們的組合，這取決于預(yù)期的最終用途。
因而本發(fā)明的方法和組合物的優(yōu)點是，除了對親核試劑不敏感(如Boc保護)的策略以外，允許使用對親核試劑敏感(例如，F(xiàn)moc等)的保護策略。這些化學(xué)方法允許對酸不穩(wěn)定的基團如甾類、熒光素和葉酸與合成蛋白質(zhì)或多肽連接。此外，本發(fā)明允許在化學(xué)連接反應(yīng)中使用傳統(tǒng)Fmoc試劑以及改性Fmoc試劑。特別地，本發(fā)明允許形成任意期望的合成肽或多肽的Fmoc MAP(多抗原性肽)衍生物。Fmoc MAP試劑典型地具有多個(例如，4或8)從賴氨酸核心基質(zhì)伸出的肽臂。它們的作用被認(rèn)為是提高肽的抗原性。用于實驗性疫苗設(shè)計的MAP-肽已誘發(fā)高滴度的識別天然蛋白的抗肽抗體
Tam，J.P.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，5409-5413；Posnett，D.N.等(1988)J.Biol.Chem.263，1719-1725；Auriault，C.等(1991)Peptide Res.4，6-11.據(jù)報道，與其它疫苗相比，抗V3環(huán)的AIDs疫苗刺激更高水平的抗體，并誘導(dǎo)更持久的免疫應(yīng)答responses(Wang，C.Y.等(1991)Science，254，285-288).此外，固相免疫測定中抗體-抗原的相互作用的可靠性和靈敏度增加已經(jīng)由MAP-肽觀察到，這是因為蓋覆容量和親和力強度的增強(Tam，J.P及Zavala，F(xiàn).(1989)J Immunol.Meth.124，53-61)。MAP法免去了將肽與可改變抗原決定簇的載體蛋白質(zhì)連接的需要。
本發(fā)明的方法有利于反應(yīng)基團的相容性選擇性保護，因而允許進行構(gòu)建多個(肽)片斷連接的會聚合成方案，從而提高產(chǎn)物的理論最大產(chǎn)率。
本發(fā)明可以使相容選擇性保護的能力增強，因而允許在單個容器中進行多重反應(yīng)，或使用比其它方式需要的容器少一些的反應(yīng)容器。
此外，采用Fmoc化學(xué)方法合成肽和多肽的能力有利于用肽反轉(zhuǎn)技術(shù)來反轉(zhuǎn)合成肽，因而允許在肽C-端引入修飾(見，例如，M.Davies等(1998)J.Org.Chem.8696-8703；M.Davies等，(1997)Angew.Chem.1091135-1138) 本專利說明書中所有提及的出版物和專利申請都在此引作參考，就好像每個單獨的出版物或?qū)＠暾埵翘貏e地且獨立地指出引作參考。
既然已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，同樣的內(nèi)容將通過參考下面的實施例而更易于理解，實施例通過例證的方式提供，并不意味著限制本發(fā)明，除非特別說明。
為除去苯甲基保護基，使用H2/Pt的還原性切除(“Protecting Groups in Organic Synthesis，”3rdEdition，T.W.Green和P.GM.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，New Tork，NY，1992，pp 250-252；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，編輯.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994，pg.137).1mmol Bzl保護的Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)2-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl溶于10mL無水甲醇中并用100mg Pt催化劑和H2在室溫下處理3小時以產(chǎn)生產(chǎn)物Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)2-S-CH2-CH2-CH2-COOH。Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯酸可用于溶液相偶聯(lián)，或用標(biāo)準(zhǔn)HBTU/DIEA偶聯(lián)方案連接于HN2-Rink樹脂以獲得Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯樹脂。實施例11Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙酸酯的制備Fmoc-NH-CH2-CN(1mmol(278mg))與HCl氣體及1當(dāng)量的乙醇(46mg)在THF中反應(yīng)以獲得亞氨基酯中間體。亞氨基酯在同樣的混合物中與1mmol乙二醇[HO-CH2-CH2-OH](62mg)反應(yīng)以獲得環(huán)狀原乙酸酯Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OEt。另-選擇，實施例8中制備的1mmol Fmoc-NH-CH2-C(OCH3)3(356mg)與1mmol乙二醇[HO-CH2-CH2-OH](62mg)在0.1mmol對甲苯磺酸(19mg)存在時于無水THF中反應(yīng)以獲得環(huán)狀原乙酸酯Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3。實施例12Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯樹脂的樹脂上合成Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯樹脂的樹脂上合成如下述進行。實施例11中制備的10mmol Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(3.54g)與12mL DCM中的1mmol AlCl3(133mg)混合并與實施例9制備的1mmol硫醇樹脂反應(yīng)以進行硫醇交換(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，F(xiàn)ac.Sci.Marseilles，F(xiàn)r.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)1506-1507)并生成Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂。另一選擇，10mmol Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(3.54g)與12mL二氯乙烷中的1mmol SnCl4(260mg)混合并與實施例9制備的1mmol硫醇樹脂反應(yīng)以完成硫醇交換(Honma等，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)818-820)并生成Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂。實施例13Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯酸的溶液相制備Bzl-保護的Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯在溶液中如下述制備。Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(1mmol(354mg))在AlCl3(1mmol，133mg)和2mL DCM存在下與HS-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl酯(1mmol196mg)反應(yīng)以完成硫醇交換(Feugeas等，Lab.Syn.Org.B.，F(xiàn)ac.Sci.Marseilles，F(xiàn)r.C.R.Adca.Sci.，Paris Ser.C.(1968)266(20)1506-1507)，這在溶液中產(chǎn)生了Bzl保護的Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯(Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl)。同樣的化合物還通過Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-OCH3(1mmol354mg)在SnCl4(0.1mmol 26mg)和2mL二氯乙烷存在下與HS-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl酯(1mmol 196mg)反應(yīng)以完成硫醇交換(Honma等，Chem.Pharm.Bull.(1976)24(4)818-820)并生成化合物Fmoc-NH-CH2-C[O-(CH2)2-O]-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl。
為除去苯甲基保護基，使用H2/Pt的還原性切除(“Protecting Groups in Organic Synthesis，”3rdEdition，T.W.Green和P.G.M.Wuts，編輯.，John Wiley & Sons，New Tork，NY，1992，pp 250-252；和“Protecting Groups，”P.J.Kocienski，編輯.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994，pg.137).1mmol Bzl保護的Fmoc-NH-CH2-C(O-(CH2)2-O)-S-CH2-CH2-CH2-COO-Bzl化合物溶于10mL無水甲醇中并用100mg Pt催化劑和H2在室溫下處理3小時以產(chǎn)生產(chǎn)物Fmoc-NH-CH2-C(O-(CH2)2-O)-S-CH2-CH2-CH2-COOH。Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯酸可用于溶液相偶聯(lián)，或用標(biāo)準(zhǔn)HBTU/DIEA偶聯(lián)方法連接到HN2-Rink樹脂以獲得Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂。實施例14Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯硫酯生成樹脂上肽的FmocSPPS實施例9中制備的Fmoc-氨基乙酸原二甲基硫代酸酯硫酯生成樹脂用于按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc SPPS程序合成FKLAG序列的肽。Fmoc去保護使用溶于DMF的20％哌啶來完成(每個循環(huán)2次，每次3分鐘)。鏈組裝使用標(biāo)準(zhǔn)HBTU/DIEA活化來完成，此活化使用2.1mmol Fmoc氨基酸、3.8mL 0.5M HBTU的DMF溶液和1mL DIEA，且每個偶聯(lián)循環(huán)進行1分鐘預(yù)活化，反應(yīng)時間為30分鐘。肽-樹脂在去保護和偶聯(lián)反應(yīng)步驟后用DMF洗滌。實施例15FKLAG肽從原二甲基硫代酸酯硫酯生成樹脂上的酸性切除FKLAG-硫酯肽通過實施例14的樹脂連接肽的酸性切除生成。350mg樹脂用5mL TFA、0.2mL水和0.25mL硫代苯甲醚處理兩小時。真空蒸發(fā)TFA并用乙醚沉淀想要的肽-硫酯。含有FKLAG硫酯的切除產(chǎn)物用HPLC純化并用電噴霧質(zhì)譜分析，計算所得的質(zhì)量在實驗誤差范圍內(nèi)。實施例16原二甲基硫代酸酯生成的FKLAG硫酯肽與N-端半胱氨酸-肽的硫酯介導(dǎo)連接實施例15中制備的FKLAG-硫酯肽與含N-端半胱氨酸的肽CARHTVHQRHLFG連接。大約0.3mg FKLAG-硫酯肽和0.6mg N-端半胱氨酸肽CARHTVHQRHLFG，與0.25mL 6M胍鹽緩沖液pH7和0.02mL苯硫酚在室溫下混合，并讓反應(yīng)過夜進行。反應(yīng)通過HPLC分析且連接產(chǎn)物通過電噴霧質(zhì)譜表征，并發(fā)現(xiàn)在實驗誤差范圍內(nèi)具有預(yù)期的質(zhì)量。實施例17Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂上肽的Fmoc SPPS用實施例12制備的Fmoc-氨基乙酸環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc SPPS過程合成FKLAG序列的肽。Fmoc去保護使用溶于DMF的20％哌啶來完成(每個循環(huán)2次，每次3分鐘)。鏈組裝使用標(biāo)準(zhǔn)HBTU/DIEA活化來完成，此活化是用2.1mmol Fmoc氨基酸、3.8mL 0.5M HBTU的DMF溶液和1mL DIEA，且每個偶聯(lián)循環(huán)進行1分鐘預(yù)活化，反應(yīng)時間為30分鐘。肽-樹脂的中間體洗滌使用DMF完成。實施例18FKLAG肽從環(huán)狀原乙基硫代酸酯硫酯生成樹脂上的酸性切除FKLAG-硫酯肽通過實施例17的樹脂連接肽的酸性切除生成。350mg樹脂用5mL TFA、0.2mL水和0.25mL硫代苯甲醚室溫處理2小時。真空蒸發(fā)TFA并用乙醚沉淀想要的肽-硫酯。含有FKLAG硫酯的切除產(chǎn)物用HPLC純化并用電噴霧質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)在實驗誤差范圍內(nèi)具有預(yù)期的質(zhì)量。實施例19環(huán)狀原乙基硫代酸酯生成的FKLAG硫酯肽與N-端半胱氨酸肽的硫酯介導(dǎo)連接實施例18中制備的FKLAG-硫酯肽與含N-端半胱氨酸的肽CARHTVHQRHLFG如下述連接。大約0.3mg FKLAG-硫酯肽和0.6mg N-端半胱氨酸肽CARHTVHQRHLFG，與0.25mL 6M胍鹽緩沖液pH7和0.02mL苯硫酚在室溫下混合，并讓反應(yīng)過夜進行。反應(yīng)通過HPLC分析且連接產(chǎn)物通過電噴霧質(zhì)譜表征。
本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系了它的具體實施方案作了描述，可以了解它能進一步修改且此申請意指涵蓋通常遵循本發(fā)明的法則的任何變化、使用或改進，并包括一些對本公開的偏差，偏差在本發(fā)明所屬領(lǐng)域的已知或慣例范圍內(nèi)，且偏差可能應(yīng)用于上文指出的基本特征。
權(quán)利要求
1.一種對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，分子式為X-C(OR’)2-S-R，其中X是相關(guān)靶分子，任選地包含一個或多個對親核試劑不穩(wěn)定的在親核切除條件下可除去的保護基，R’是對親核試劑穩(wěn)定的保護基，在非親核切除條件下可除去，且R是與原硫代部分-C(OR’)2-S-相容的任何基團。
2.權(quán)利要求1的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中X含有受對親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺。
3.權(quán)利要求2的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中所述胺存在于選自氨基酸、肽和多肽的部分上。
4.權(quán)利要求2的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中所述對親核試劑不穩(wěn)定的保護基是Fmoc。
5.權(quán)利要求1的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中R’選自烷基、芳基和苯甲基。
6.權(quán)利要求1的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中R選自芳基、苯甲基和烷基。
7.權(quán)利要求1的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中R與對親核試劑穩(wěn)定的連接子共價連接。
8.權(quán)利要求1的對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，其中所述連接子與對親核試劑穩(wěn)定的樹脂共價連接。
9.一種含有原硫代酸酯的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成樹脂。
10.權(quán)利要求9的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成樹脂，具有分子式X-C(OR’)2-S-R-連接子-樹脂，其中X是相關(guān)靶分子，包含一個或多個對親核試劑不穩(wěn)定的在親核切除條件下可除去的保護基，R’是對親核試劑穩(wěn)定的保護基，在非親核切除條件下可除去，R是與原硫代部分-C(OR’)2-S-相容的任何基團，且所述連接子和樹脂是對親核試劑穩(wěn)定的。
11.一種對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，具有分子式X-C(O)-O-CH(R”)-(CH2)n-S-R，其中X是相關(guān)靶分子，包含一個或多個對親核試劑不穩(wěn)定的保護基，R”是氫或?qū)Ψ怯H核試劑穩(wěn)定的基團，n是1或2，R是氫、保護基或連接于樹脂上的對酸、還原劑或光不穩(wěn)定的連接子或在非親核性條件下可除去的保護基。
12.權(quán)利要求12的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中X含有受對親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺。
13.權(quán)利要求13的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中所述胺存在于選自氨基酸、肽和多肽的部分上。
14.權(quán)利要求12的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中所述可親核切除的保護基是Fmoc。
15.權(quán)利要求11的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中R”選自氫、甲基、脂肪烴基、支鏈脂肪烴基、雜原子、羰基、苯甲基、取代苯甲基、腈、硫氧基和砜。
16.權(quán)利要求11的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中R選自氫、芳基、苯甲基和烷基。
17.權(quán)利要求11的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中R”或R與對親核試劑穩(wěn)定的連接子共價連接。
18.權(quán)利要求17的對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，其中所述連接子與對親核試劑穩(wěn)定的樹脂共價連接。
19.一種含有硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成樹脂。
20.權(quán)利要求19的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成樹脂，具有分子式X-C(O)-O-CH-(R”)-CH2n-S-連接子-樹脂或X-C(O)-O-CH(R”-連接子-樹脂)-CH2n-S-R，其中X是相關(guān)靶分子，包含一個或多個對親核試劑不穩(wěn)定的保護基，R”是氫或?qū)Ψ怯H核試劑穩(wěn)定的基團，n是1或2，R是氫、保護基或連接于樹脂上的對酸、還原劑或光不穩(wěn)定的連接子或在非親核性條件下可除去的保護基，且所述連接子和樹脂對親核試劑穩(wěn)定。
21.一種聚合物，含有硫酯反應(yīng)性親核基團和選自非環(huán)狀原硫代酸酯、環(huán)狀原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的基團。
22.權(quán)利要求21的聚合物，其中所述聚合物選自肽和多肽。
23.權(quán)利要求22的聚合物，其中所述硫酯反應(yīng)性親核基團位于所述肽或多肽的氨基端。
24.權(quán)利要求22的聚合物，其中所述對親核試劑穩(wěn)定的基團位于所述肽或多肽的羧基端。
25.一種聚合物，含有受保護的硫酯反應(yīng)性親核基團和選自非環(huán)狀原硫代酸酯、環(huán)狀原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的基團。
26.權(quán)利要求25的聚合物，其中所述聚合物選自肽和多肽。
27.權(quán)利要求26的聚合物，其中所述受保護的硫酯反應(yīng)性親核基團位于所述肽或多肽的氨基端。
28.權(quán)利要求26的聚合物，其中所述對親核試劑穩(wěn)定的基團位于所述肽或多肽的羧基端。
29.一種聚合物的化學(xué)連接方法，所述方法包括步驟i)在連接條件下將第一和第二聚合物連接以生成連接產(chǎn)物，所述第一聚合物含有硫酯反應(yīng)性親核基團和選自非環(huán)狀原硫代酸酯、環(huán)狀原硫代酸酯、芳基硫醇羧基酯、苯甲基硫醇羧基酯和烷基硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的基團，所述第二聚合物含有活性硫酯基團。
30.權(quán)利要求29的方法，進一步包括步驟ii)將所述連接產(chǎn)物的對親核試劑穩(wěn)定的基團轉(zhuǎn)化為活性硫酯，并將它與含有硫酯反應(yīng)性親核基團的第三聚合物連接。
31.一種合成對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物的方法，此組合物含有相關(guān)的分子，所述方法包括步驟i)將相關(guān)的分子與對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物共價偶聯(lián)，所述對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物含有對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯，此原硫代酸酯在非親核條件下可轉(zhuǎn)化為活性硫酯，所述相關(guān)的分子含有受對親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺基；和ii)通過在親核切除條件下的切除，從所述相關(guān)的分子中除去所述對親核試劑不穩(wěn)定的保護基以產(chǎn)生對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物，此組合物含有與所述對親核試劑穩(wěn)定的原硫代酸酯共價連接的所述相關(guān)的分子。
32.權(quán)利要求31的方法，其中進一步包括iii)重復(fù)步驟i)和ii)一次或多次。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述原硫代酸酯通過連接子與樹脂共價連接，且其中所述連接子在親核切除條件下穩(wěn)定。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述原硫代酸酯通過連接子與樹脂共價連接，且其中所述連接子在非親核切除條件下可以切除。
34.權(quán)利要求33的方法，它進一步含有將所述連接子在非親核切除條件下切除。
35.一種合成對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物的方法，此組合物含有相關(guān)的分子，所述方法包括步驟i)將相關(guān)的分子與對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物共價偶聯(lián)，所述對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物含有對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯，此硫醇羧基酯在非親核條件下可轉(zhuǎn)化為活性硫酯，所述相關(guān)的分子含有受對親核試劑不穩(wěn)定的保護基保護的胺基；和ii)通過在親核切除條件下的切除，從所述相關(guān)的分子中除去所述對親核試劑不穩(wěn)定的保護基以產(chǎn)生對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成組合物，此組合物含有與所述對親核試劑穩(wěn)定的硫醇羧基酯共價連接的所述相關(guān)的分子。
37.權(quán)利要求36的方法，其中進一步包括iii)重復(fù)步驟i)和ii)一次或多次。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述硫醇羧基酯通過連接子與樹脂共價連接，且其中所述連接子在親核切除條件下穩(wěn)定。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述硫醇羧基酯通過連接子與樹脂共價連接，且其中所述連接子在非親核切除條件下可以切除。
40.權(quán)利要求39的方法，它進一步含有將所述連接子在非親核切除條件下切除。
全文摘要
本發(fā)明涉及含原硫代酸酯或硫醇羧基酯的對親核試劑穩(wěn)定的硫酯生成化合物以及它們的生產(chǎn)和使用方法。這些化合物和方法在有機合成中有廣泛應(yīng)用，包括肽－、多肽－和其它聚合物－硫酯的生成。本發(fā)明特別適用于由使用強親核試劑條件下制備的前體來生成活化硫酯，前體如用Fmoc SPPS制備的肽或多肽，以及通過多步連接或結(jié)合方法制備的肽或多肽，這需要(或從其使用中受益)相容的選擇性方法指導(dǎo)相關(guān)的特異性連接或結(jié)合反應(yīng)。
文檔編號C07K1/00GK1451013SQ01815056
公開日2003年10月22日 申請日期2001年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月1日
發(fā)明者P·博蒂, J·A·布拉德博尼, S·B·H·肯特 申請人:格萊風(fēng)治療公司