專利名稱：P6a的代謝產(chǎn)物的分離、合成及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維蛋白降解產(chǎn)物P6A在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)代謝生成的超短肽的分離、鑒定、合成，以及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，例如作為溶血栓劑的應(yīng)用。
為了考察P6A及類似物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，本發(fā)明將P6A經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，斷頭處死，取全血，0℃離心，得到的血漿經(jīng)處理后進(jìn)行LC/MS研究。在質(zhì)譜中將P6A可能的各種代謝方式產(chǎn)生的離子編入多離子檢測(cè)的采集表中。測(cè)得的結(jié)果表明，P6A在小鼠體內(nèi)經(jīng)代謝生成Ala-Arg-Pro-Ala、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro、Pro-Ala-Lys四種序列。為了闡明P6A與它的代謝產(chǎn)物之間在溶栓作用方面的聯(lián)系，本發(fā)明采用液相法合成了所述的4種寡肽，在大鼠動(dòng)靜脈旁路插管模型上評(píng)價(jià)了它們的溶血栓作用。結(jié)果表明，Pro-Ala-Lys是比P6A更加優(yōu)秀的溶栓化合物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供結(jié)構(gòu)式Ala-Arg-Pro-OH，Ala-Arg-Pro-Ala-OH，Arg-Pro-Ala-Lys-OH和Pro-Ala-Lys-OH的合成小分子肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述小分子肽作為治療血栓性疾病，如腦血栓、腦栓塞、冠心病、靜脈血栓形成等疾病的藥物的應(yīng)用。
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例在下文中，術(shù)語“Boc”為叔丁氧羰基，“Bzl”為芐基，“Tos”為對(duì)甲苯磺?；?，“Ala”為丙氨酸，“Arg”為精氨酸，“Pro”為脯氨酸，“Lys”為賴氨酸。
實(shí)施例1
P6A代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)測(cè)定4mg P6A溶于0.3ml生理鹽水中，得到的澄明的溶液經(jīng)尾靜脈緩慢地注射到體重為40g的小鼠體內(nèi)，小鼠斷頭處死，取全血，0℃離心5分鐘，分離血漿。取100μl血漿并與100μl高氯酸(1mol/l)充分混合，然后于3500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，取30μl上清液在LC/MS上進(jìn)樣。另取100μl高氯酸(1mol/l)充分混合，然后于3500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，取30μl上清液在LC/MS上進(jìn)樣作為空白對(duì)照。在質(zhì)譜中將P6A所有可能的代謝途徑產(chǎn)生的離子編入多離子檢測(cè)的采集表中。檢測(cè)到的離子、質(zhì)量數(shù)、對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)，以及峰面積列入表1。
表1 LC/MS檢測(cè)到的P6A的代謝產(chǎn)物量數(shù)414 343 471 315(m/z)序列 Ala-Arg-Ala-Arg-Arg-Pro-Pro-Ala-Pro-Ala Pro Ala-Lys Lys峰面積4.02×1079.54×1066.92×1062.88×106表中列出的代謝物之間的關(guān)系，以及它們與P6A之間的關(guān)系可表示為

圖1。
實(shí)施例2Ala-Arg-Pro-Ala-OH的合成2.1 Boc-Pro-Ala-OCH3的合成22.0mg(0.25mmol)Boc-Pro-OH溶于適量無水THF，冰浴下加入31mg(0.27mmol)N-羥基琥珀酰亞胺和56mg(0.27mmol)DCC，反應(yīng)混合物置于冰箱中放置24小時(shí)，濾除DCU，濾液在室溫下減壓濃縮，殘留物用石油醚析晶，得到對(duì)應(yīng)的活潑酯。
35.0mg(0.25mmol)HCl·AlaOCH3，27mg(0.27mmol)N-甲基嗎啉與適量無水THF混合，然后加入上面得到的活潑酯，室溫反應(yīng)26小時(shí)，TLC(CHCl3∶CH3OH，19∶1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物濃縮至干，殘留物用10ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、飽和檸檬酸水溶液，以及飽和NaCl水溶液洗滌。分出有機(jī)層，用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液于37℃減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物71.3mg(95％)。FAB-MS(m/z)301〔M+H〕+。
2.2 HCl·Pro-Ala-OCH3的合成75mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-OCH3與適量6N無水HCl/乙酸乙酯溶液混合，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(CHCl3∶CH3OH，9∶1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物室溫減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解后再在室溫下減壓濃縮，該操作反復(fù)數(shù)次，直至除盡游離的氯化氫。殘留物用無水乙醚析晶，得到的標(biāo)題化合物直接用于下步反應(yīng)。
2.3 Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，只是用107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH代替Boc-Pro-OH，用59.4mg(0.25mmol)HCl·Pro-Ala-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到標(biāo)題化合物137.5mg(90％)。FAB-MS(m/z)611〔M+H〕+。
2.4 HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3的合成按照2.2項(xiàng)下的操作，由133mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3制得標(biāo)題化合物，直接用于下步反應(yīng)。
2.5 Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，只是用47mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH代替Boc-Pro-OH，用137mg(0.25mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到標(biāo)題化合物153mg(90％)。FAB-MS(m/z)682〔M+H〕+。
2.6 Ala-Arg-Pro-Ala-OH的合成170.3mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OCH3與適量1N NaOH/CH3OH溶液混合，冰浴下攪拌2小時(shí)，TLC(CHCl3∶CH3OH，9∶1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物用鹽酸(2mol/l)中和至pH7，室溫下減壓濃縮除去甲醇，殘留物再用鹽酸(2mol/l)酸化至pH2，減壓濃縮至干。上述產(chǎn)物加入1ml二甲硫醚，1ml苯甲醚，以及5ml CF3SO3H/CF3COOH(1∶4)，0℃反應(yīng)2小時(shí)，減壓除去溶劑，殘留物用無水乙醚固化，固體物用Sephadex G 10純化，得到91mg(88％)標(biāo)題化合物。FAB-MS(m/z)414〔M+H〕+。
實(shí)施例3Ala-Arg-Pro-OH的合成3.1 Boc-Arg-(Tos)-Pro-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，用107mg Boc-Arg-(Tos)-OH代替Boc-Pro-OH，用41.4mg(0.25mmol)HCl·Pro-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到119.9mg(89％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)540〔M+H〕+。
3.2 HCl·Arg-(Tos)-Pro-OCH3的合成按照2.2項(xiàng)下的操作，由135mg(0.25mmol)Boc-Arg-(Tos)-Pro-OCH3得到的標(biāo)題化合物，直接用于下步反應(yīng)。
3.3 Boc-Ala-Arg-(Tos)-Pro-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，用47mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH代替Boc-Pro-OH，用119mg(0.25mmol)HCl·Arg-(Tos)-Pro-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到140mg(92％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)611〔M+H〕+。
3.4 Ala-Arg-Pro-OH的合成按照2.6項(xiàng)下的操作，由152mg(0.25mmol)Boc-Ala-Arg-(Tos)-Pro-OCH3，制得77mg(90％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)343〔M+H〕+。
實(shí)施例4Arg-Pro-Ala-Lys的合成4.1 Boc-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，用47mg(0.25mmol)Boc-Ala-OH代替Boc-Pro-OH，用91mg(0.25mmol)HCl·Lys(Cl2Bzl)-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到120mg(96％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)501〔M+H〕+。
4.2 HCl·Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3的合成按照2.2項(xiàng)下的操作，由125mg(0.25mmol)Boc-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3制得標(biāo)題化合物。
4.3 Boc-Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，用22mg(0.25mmol)Boc-Pro-OH與109mg(0.25mmol)HCl·Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3反應(yīng)，得到135mg(90％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)598〔M+H〕+。
4.4 HCl·Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3的合成按照2.2項(xiàng)下的操作，由150mg(0.25mmol)Boc·Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3制得標(biāo)題化合物。
4.5 Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3的合成按照2.1項(xiàng)下的操作，用107mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-OH代替Boc-Pro-OH，用134mg(0.25mmol)HCl·Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3代替HCl·Ala-OCH3，得到198mg(87％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)908〔M+H〕+。
4.6 Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制備按照2.6項(xiàng)下的操作，由227mg(0.25mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3制得99.9mg(85％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)471〔M+H〕+。
實(shí)施例5 Pro-Ala-Lys-OH的制備按照2.6項(xiàng)下的操作，由149.6mg(0.25mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Cl2Bzl)-OCH3制得71mg(90％)標(biāo)題化合物，F(xiàn)AB-MS(m/z)315〔M+H〕+。
實(shí)施例6Pro-Ala-Lys-OH和Ala-Arg-Pro-OH的溶栓活性6.1血栓的制備往垂直固定的玻璃管(長(zhǎng)15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封)中注入0.1ml枸櫞酸化的大鼠動(dòng)脈血液，該血液復(fù)鈣未凝。往管內(nèi)迅速插入一根不銹鋼質(zhì)料的血栓固定螺栓。該血栓固定螺栓用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長(zhǎng)12mm，含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長(zhǎng)7.0mm，呈問號(hào)型。血液凝固15分鐘后，打開玻璃管底部的膠塞，用鑷子固定血栓固定螺旋的托柄，從玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱重(質(zhì)量范圍為74-84mg)。
6.1.2旁路管道的制備旁絡(luò)管道由3段構(gòu)成，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60.0mm，內(nèi)徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長(zhǎng)100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm，該管的一端拉緊成尖管(用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為110mm，另一端的外部套一段長(zhǎng)7.0mm，外徑3.5mm的聚乙烯管，用于插入中段的聚乙烯管內(nèi)。3段管的內(nèi)壁均硅烷化。將精確稱重的血栓包裹的血栓固定螺栓放入中段聚乙烯管內(nèi)，膠管的兩端分別與剛描述過的兩根聚乙烯管的套管端相連。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg體重)，備用。
6.1.3大鼠頸動(dòng)靜脈旁路插管模型Wistar大鼠(雄性，250～300g)按80mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定后進(jìn)行手術(shù)，分離氣管，分離右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈。在暴露的左頸外靜脈上小心地剪一斜口，將上面制備好的旁路管道的尖管由斜口插入左頸外靜脈開口的近心端，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段血栓固定螺栓的托柄。用注射器通過另一端的尖管推入準(zhǔn)確量的肝素生理鹽水(50Iu/kg)，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，在距動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈小心地剪一斜口。從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端都用4號(hào)手術(shù)縫線與動(dòng)靜脈固定。打開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈。于是，構(gòu)成了大鼠動(dòng)靜脈旁路溶栓模型。
6.1.4 Pro-Ala-Lys-OH和Ala-Arg-Pro-OH的溶栓作用用頭皮針將生理鹽水(3ml/kg)、尿激酶的生理鹽水溶液(2000IU/kg)、P6A的生理鹽水溶液(5.4mg/kg)、Ala-Arg-Pro-OH的生理鹽水溶液(3.4mg/kg)，以及Pro-Ala-Lys-OH的生理鹽水溶液(3.1mg/kg)通過旁路管的中段刺人遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈處，緩慢注入到血液中(大約6分鐘)。使生理鹽水(空白對(duì)照)、尿激酶(陽(yáng)性對(duì)照)、P6A(母體化合物對(duì)照)、Ala-Arg-Pro-OH(代謝產(chǎn)物)、以及Pro-Ala-Lys-OH(代謝產(chǎn)物)通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用到血栓上。從開始注射對(duì)照液或藥物溶液開始計(jì)時(shí)，1小時(shí)后從旁路管中取出血栓固定螺栓，精確稱重，求出每只大鼠旁路管道中血栓固定螺栓進(jìn)入旁路管道前后的質(zhì)量差，統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的血栓質(zhì)量差值(x±S)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)列入表2。
表2 Ala-Arg-Pro-OH和Pro-Ala-Lys-OH的溶栓作用組別劑量(劑量/kg) 血栓減重(x±S)NS 3ml15.31±3.57UK 2000Iu 24.10±3.541)，2)，3)P6A 5.4mg 18.84±3.181)Ala-Arg-Pro-3.4mg 18.08±2.601)OHPro-Ala-Lys-3.1mg 24.63±2.441)，2)，3)OHN＝12，1)與NS相比，P＜0.05；2)與NS相比，P＜0.001；3)與P6A及Ala-Arg-Pro-OH相比，P＜0.001結(jié)果表明，Pro-Ala-Lys-OH的溶栓作用與UK相當(dāng)，與母體化合物P6A比較，顯示明顯的優(yōu)勢(shì)(P＜0.001)。
6.1.5 Ala-Arg-Pro-OH的急性毒性按10mg/kg、100mg/kg、1000mg/kg三個(gè)劑量組，每組3只小鼠，按照動(dòng)物死亡情況，再選擇四個(gè)劑量，每個(gè)劑量1只小鼠。根據(jù)動(dòng)物死亡情況取兩個(gè)或三個(gè)相鄰劑量的幾何平均值，求出LD50值。
Pro-Ala-Lys-OH按10mg/kg、100mg/kg以及1000mg/kg劑量，配成0.2ml生理鹽水溶液，經(jīng)尾靜脈緩緩?fù)谱?。結(jié)果為，10mg/kg和100mg/kg劑量下，全部小鼠存活，1000mg/kg劑量下小鼠全部死亡。于是，選擇第二次給藥劑量，140mg/kg、225mg/kg、370mg/kg以及600mg/kg，小鼠死亡率為0/1、0/1、1/1和1/1。取140mg/kg、225mg/kg和370mg/kg三個(gè)相鄰劑量的平均值，LD50為226mg/kg。大劑量給藥5分鐘后，小鼠全身墉懶，隨后四肢抽搐，呼吸急促，心跳加快，30分鐘后死亡。尸解發(fā)現(xiàn)心臟部位出血，腦、肺、腸、胰、脾、胃、肝、腎等器官未見異常。
中劑量給藥15分鐘后，小鼠全身慵懶，隨后四肢抽搐，呼吸急促，心跳加快，40分鐘后死亡。尸解發(fā)現(xiàn)心臟部位出血，腦、肺、腸、胰、脾、胃、肝、腎等器官未見異常。
低劑量給藥30分鐘后，小鼠全身慵懶，1小時(shí)后恢復(fù)正常，尸解未見任何異常。
小劑量給藥后小鼠未見明顯毒性體征，飼養(yǎng)一周后尸解，各器官未見異常。
在所有的給藥劑量下，均未發(fā)現(xiàn)已有溶栓藥物常見的顱內(nèi)出血現(xiàn)象。結(jié)果顯示由中毒劑量求得的LD50值相當(dāng)于治療劑量的73倍，有比較理想的安全性。
權(quán)利要求
1.一種P6A的代謝產(chǎn)物的分離方法，包括將P6A經(jīng)靜脈注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，處死，取全血，離心，分離血漿，與高氯酸混合，離心，然后做LC/MS，分離出Ala-Arg-Pro、Arg-Pro-Ala-Lys、Ala-Arg-Pro、Pro-Ala-Lys四種序列。
2.一種為P6A代謝產(chǎn)物的合成小分子肽，其序列為Ala-Arg-Pro-OH。
3.一種為P6A代謝產(chǎn)物的合成小分子肽，其序列為Ala-Arg-Pro-Ala-OH。
4.一種為P6A代謝產(chǎn)物的合成小分子肽，其序列為Arg-Pro-Ala-Lys-OH。
5.一種為P6A代謝產(chǎn)物的合成小分子肽，其序列為Pro-Ala-Lys-OH。
6.一種治療血栓性疾病，如腦血栓、腦栓塞、冠心病、靜脈血栓形成等疾病的藥物，其特征在于含有權(quán)利要求2的小分子肽。
7.一種治療血栓性疾病，如腦血栓、腦栓塞、冠心病、靜脈血栓形成等疾病的藥物，其特征在于含有權(quán)利要求3的小分子肽。
8.一種治療血栓性疾病，如腦血栓、腦栓塞、冠心病、靜脈血栓形成等疾病的藥物，其特征在于含有權(quán)利要求4的小分子肽。
9.一種治療血栓性疾病，如腦血栓、腦栓塞、冠心病、靜脈血栓形成等疾病的藥物，其特征在于包括權(quán)利要求5的小分子肽。
10.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的小分子肽在制藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及P6A代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)代謝生成的超短肽的分離,這些超短肽的合成以及這些超短肽作為溶血栓劑的應(yīng)用。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明的小分子肽表現(xiàn)了比P6A更優(yōu)秀的溶血栓作用。
文檔編號(hào)C07K5/10GK1356338SQ01136780
公開日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 王超, 徐友宜, 吳艷芬 申請(qǐng)人:北京明心源科技有限公司