專利名稱：抗菌肽畢赤酵母的制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域。尤其是抗菌肽基因克隆于酵母制備飼料添加劑技術。
柞蠶抗菌肽(Cecropin)是注射大腸桿菌于柞蠶(Antheraea pernyi)蛹誘導產生的天然多肽，已發(fā)現有A、B及D等多種，具有廣譜殺菌作用。從柞蠶免疫蛹中提取抗菌肽得率低(0.02％以下)，消耗原料較多，工藝復雜，成本高昂，投產有較大困難。提取抗菌肽后的蛹渣及繭殼仍需進行深加工。如1000噸柞蠶繭(1000-1200萬元)僅能提取200-250Kg抗菌肽，每Kg成本10萬元以上。
柞蠶抗菌肽在醫(yī)藥上應用已有初步成效，如用熱激法處理柞蠶蛹，制成“育成蛹粉“作為腎肝寧”藥物的原料，是治療腎炎及肝炎的新藥，已投入生產；柞蠶蛹免疫血淋巴制成柞蠶素凍干粉，作為柞蠶素膠囊的原料，作為西藥二類治療乙型肝炎新藥進入一期臨床試驗?？咕淖鳛轱暳咸砑觿┯蓄A防及治療畜禽疾病的功效，但必須降低成本才能實現。
根據柞蠶抗菌肽的氨基酸序列，設計并合成其基因，克隆于大腸桿菌中表達，由于表達后的抗菌肽對宿主有殺滅作用，且表達率較低，未有應用價值；抗菌肽基因與昆蟲桿狀病毒多角體蛋白基因重組，在昆蟲細胞或昆蟲體內表達。由于昆蟲細胞培養(yǎng)成本高，用蟲體表達不易大規(guī)模培養(yǎng)。
近年來在畜禽飼料中濫用抗生素導致畜禽的奶、肉、蛋中殘留而嚴重影響人的健康，又因大量使用抗生素而引起耐藥性菌株的出現，給治療帶來困難。歐共體已禁止人畜共用的抗生素摻入飼料。用天然殺菌劑代替現有禽畜飼料中所使用的抗生素是禽畜飼料業(yè)的需求，也是人們的希望。
本發(fā)明的目的是設計合成新型抗菌肽基因，導入畢赤酵母中表達，制備用作為禽畜飼料添加劑，代替目前禽畜飼料中使用的抗生素，以達到預防和治療禽畜疾病，克服由于濫用抗生素帶來的不良后果以及降低生產成本的目的。本發(fā)明是這樣實現1．根據柞蠶天然抗菌肽設計抗菌肽AD氨基酸序列，BamHⅠ M K W K L F K K I E K V G5′GGATCCGT ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT GAA AAG GTT GGT3′CCTAGGCA TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA CTT TTC CAA CCAF1Q R V R D A V T S A G P A V A--------------------------------------------→CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATC TCT GCT GGT CCT GCT GTT GCCGTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG TAG AGA CGA CCA GGA CGA CAA CGG←------------------------------------F2T V A Q A T A L A KACT GTT GCT CAA GCT ACT GCC TTG GCT AAG TAATAAGAATTCGTCGAC 3′TGA CAA CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC ATTATTCTTAAGCAGCTG 5′EcoRⅠ SalⅠ將第1-11位氨基酸設計為柞蠶抗菌肽A序列，將第12-37位氨基酸設計為蠶抗菌肽D序列；2．用DNA合成儀合成含82個堿基的F1多聚脫氧核糖核苷酸片段和含78個堿基F2多聚脫氧核糖核苷酸片段，它們之間有20個堿基互補；3．設計合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′4．通過F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶鏈反應)方法合成具有134個堿基對的抗菌肽AD基因；5．將抗菌肽AD基因與pCRTM2.1質粒(T載體)用T4DNA連接酶連接構建成pCRCAD重組質粒；6．用pCRCAD重組質粒轉化大腸桿菌JM109，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)篩選獲得含重組質粒pCRCAD的轉化子；7．采用點突變方法，使第37位的賴氨酸(AAG)改造成天門冬酰胺(AAC)；8．設計合成引物AB引物A:5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG 3′引物B:3′CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD質粒為模板加入引物A及B,PCR擴增得到改造后的抗菌肽基因命名為抗菌肽CAD，其DNA序列是M K W K L F K K I E K5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT CAA AAG3′CTC GAG CTC TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA GTT TTCK V G Q R V R D A V IAAG GTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATCTTC CAA CCA GTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG GTTS A G P A V A T V A QTCT GCT GGT GCT GCT GTT GCC ACT GTT GCT CAAAGA CGA CCA CGA CGA CAA CGG TGA CAA CGA GTTA T A L A NGCT ACT GCC TTG GCT AAC TAA GAA TTC GGC GGC 3′CGA TGA CGG AAC CGA TTG ATT CTT AAG CCG CCG 5′9．以抗菌肽CAD基因與pHIL-S1質粒重組轉化于大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素抗性基因篩選到轉化子pHIL-CAD5，測序結果為141堿基對(bp)；10．將抗菌肽CAD基因與載體質粒pPICZα-A重組，克隆于大腸桿菌TOP10，以Zerocin抗性基因篩選得含重組質粒pACAD5的轉化子；11．用鋰鹽法將重組質粒pACAD5轉入畢赤酵母中表達，獲得抗菌肽CAD畢赤酵母工程菌GSCAD5；12．將含抗菌肽CAD的畢赤酵母GSCAD5菌株在培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)作為菌種培養(yǎng)基配方蛋白胨 10-20g酵母提取物 5-10gNaCl 5-10g葡萄糖 20g加水到1000mL將菌種接入裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，培養(yǎng)基的配方蛋白胨15g酵母粉10gNaCl5-10g蔗糖15-20g定容1000mL發(fā)酵條件發(fā)酵溫度30±1℃培養(yǎng)基pH7～7.3接種量為以10OD濁度的菌種接種30％(體積)發(fā)酵過程發(fā)酵罐入加入培養(yǎng)基后，通入汽壓蒸汽滅菌30分鐘，放冷到37℃，在無菌條件下接種，在304±1℃，pH5.5～6.0，通氣量20-40升/分鐘，攪拌速度500轉/分鐘，培養(yǎng)24小時后，取樣檢測菌體密度達6OD以上時加入95％甲醇，甲醇加入量1％(占發(fā)酵液總量)誘導產生抗菌肽，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，抽樣檢測菌體密度達10OD以上，效價5000單位/mL。通入100℃蒸汽，20-30分鐘，放料。發(fā)酵液離心除去菌體，用升膜式真空濃縮器濃縮原體積的1/10，將濃縮液冷凍干粉，得到凍干物即為抗菌肽畢赤酵母制品。效價50000-58000單位/g。
抗菌肽CAD畢赤酵母的應用抗菌肽CAD畢赤酵母可作為抗生素預防畜禽腹瀉病。
仔豬按5000-5500單位/kg拌入飼料中，連續(xù)一個月可預防及治療仔豬腹瀉。
小雞可加入60-100單位/頭日于飲水中，連續(xù)14天可預防及治療雛雞腹瀉。本發(fā)明優(yōu)點1．抗菌肽CAD是一個新的基因，包括抗菌肽A,D的優(yōu)點，C端為天門冬酰胺與天然的結構一致，提高其殺菌效價及穩(wěn)定性。2．克隆于畢赤酵母中表達，達到高密度培養(yǎng)(120-130g濕菌體/L)，效價5000～5500單位/mL。3．抗菌肽在酵母中表達可以工業(yè)化生產，降低成本，比天然提取物降低(100倍以下)，可取代大腸桿菌表達及昆蟲桿狀病毒系統表達。4．優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，降低成本，縮短生產周期，通過中試后可以工業(yè)化生產。5．應用于畜禽飼料添加劑，代替某些抗生素，預防仔豬及雛雞的腹瀉病。
本發(fā)明的實施過程一、抗菌肽畢赤酵母制備1．抗菌肽AD基因的合成根據抗菌肽AD及其基因的設計，用DNA合成儀合成F1(82堿基)及F2(78堿基)，用引物1及引物2作PCR擴增。F1及F2片酸(25mmol/uL)1uL,d NTP(pmol/L)2.5uL,10×PCR緩沖液5uL，雙蒸水35.5uL,92℃變性1min，加入Taq DNA聚合酶1uL(3u)，按52℃ 60Sec,70℃ 60Sec,90℃ 30Sec共35次循環(huán)，終止后回收PCR產物。以第一次PCR產物為模板，用引物1及引物2作第二次PCR擴增，最后一步延伸72℃延伸10min。PCR產物回收后，在低融點瓊脂糖凝膠電泳，得到抗菌肽AD基因，回收后-20℃保存。2．抗菌肽AD基因克隆于大腸桿菌將抗菌肽AD基因與pCRtm2.1(T載體)質粒，用BamHⅠ及SalⅠ酶切后用T4DNA連接酶連接成重組子pCRTMAD，克隆于大腸桿菌JM103，在含異丙基硫代β-半乳糖苷(ITPG)、X-gal及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上挑選白色菌落，大量培養(yǎng)后制備pCRAD質粒。用BamHⅠ及SalⅠ酶切后電泳得到134bp的抗菌肽AD基因，純化后在ABI377DNA自動制序列儀，測定基序列與設計完全一致。3．點突變C-端為酰胺基抗菌肽AD基因C-端為賴氨酸，密碼為AAG，用點突度方法改造為天門各酰胺，密碼為AAC，設計合成引物A及引物B，以pCRTMAD質粒為模板經PCR擴增為得到C-端為天門冬酰胺的抗菌肽基因ADCAD。
pCRCAD質粒(25m mol/uL)luL,d NTP(2m mol/L)5uL，引物A(30p mol/uL)luL，引物B(30p mol/uL)1uL,10×PCR緩沖液5uL，雙蒸水36uL,95℃變性1min，加TaqDNA聚合酶1uL(3u),72℃完成第一個循環(huán)后，按52℃ 60Sec,70℃ 60Sec,90℃ 30Sec共39次循環(huán)，最后一步延伸10min。PCR產物回收后，在低融點瓊脂糖凝膠電泳得到141bp的抗菌肽CAD基因。4．抗菌肽CAD基因克隆于大腸桿菌將抗菌肽CAD基因與pHIL-S1質粒經EcoRⅠ酶切后用T4DNA連接酶連接成pHIL-CAD5重組質粒，克隆于大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素抗性基因篩選轉化子，提取轉化子DNA，用EcoRⅠ酶切，電泳得到141bp的條帶，經ABI377 DNA自動測序儀測定基序列與設計完全一致。5．酵母表達載體的構建將含抗菌肽CAD基因的pHIL-CAD5質粒與穿梭質粒pPICZα-A用EcoRⅠ酶切后用T4DNA連接酶連接成pACAD5重組質粒，克隆于大腸桿菌TOP10，經Zerocin抗生素抗性基因篩選而得到酵母表達載體pACAD5。6．抗菌肽CAD基因克隆于畢赤酵母
pCAD5質粒用SacⅠ內切酶線性化后，用鋰鹽法克隆于畢赤酵母。取50μL酵母感受態(tài)細胞，離心后加入240μL 50％聚乙二醇4000,36μL 1mol/L氯化鋰，25μL(2mg/mL)變性后的線性化pCAD5，充分混合后，30℃靜置30min，42℃熱激20-25min，冷至室溫，5000r/m離心10min，沉淀物懸浮于1mLYEPD培養(yǎng)基中，取200μL涂布于YEPD平板(含Zerocin 100μg/mL)，30℃培養(yǎng)3-4天，挑選轉化子即為抗菌肽CAD基因轉化畢赤酵母。7．畢赤酵母轉化子的鑒定提取轉基因畢赤酵母的總DNA，用地高辛標記的抗菌肽基因片段作探針，作Southem blot結果呈陽性。轉基因畢赤酵母在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃+1℃,pH5.5-6.0，搖瓶200r/min,48hr后，加入培養(yǎng)液體積1％甲醇誘導抗菌肽CAD基因的表達，繼續(xù)培養(yǎng)至72hr，終止培養(yǎng)。用Hultmark方法測定抗菌活性，達到5000單位/mL水平。二、抗菌肽畢赤酵母飼料添加劑預防及治療雛雞腹瀉病的試驗效果以雜星579雞品種，體重34-39g/頭，用5000單位/kg的劑量混入飼料中飼喂，參比區(qū)為恩諾沙星(5mg/kg體重)，對照區(qū)不加抗菌素。每處理200頭，分4組重復，連續(xù)飼養(yǎng)4周，調查發(fā)病率及體重增加情況，見表1。
死亡率方差分析X2=611,X0.01=9.2，屬極顯著水平。
權利要求
1.抗菌肽畢赤酵母的制備，其特征在于根據柞蠶天然抗菌肽設計抗菌肽AD氨基酸序列BamHⅠ M K W K L F K K I E K V G5′GGATCCGT ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT GAA AAG GTT GGT3′CCTAGGCA TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA CTT TTC CAA CCAF1Q R V R D A V I S A G P A V A-------------------------------------------→CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATC TCT GCT GGT CCT GCT GTT GCCGTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG TAG AGA CGA CCA GGA CGA CAA CGG←-------------------------------------F2T V A Q A T A L A KACT GTT GCT CAA GCT ACT GCC TTG GCT AAG TAATAAGAATTCGTCGAC 3′TGA CAA CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC ATTATTCTTAAGCAGCTG 5′EcoRⅠ SalⅠ將第1-11位氨基酸設計為柞蠶抗菌肽A序列，將第12-37位氨基酸設計為柞蠶抗菌肽D序列；用DNA合成儀合成含82個堿基的F1多聚脫氧核糖核苷酸片段和含78個堿基F2多聚脫氧核糖核苷酸片段，它們之間有20個堿基互補；設計合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通過F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶鏈反應)方法合成具有134個堿基對的抗菌肽AD基因；將抗菌肽AD基因與pCRTM2.1質粒(T載體)用T4DNA連接酶連接構建成pCRCAD重組質粒；用pCRCAD重組質粒轉化大腸桿菌JM109，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)篩選獲得含重組質粒pCRCAD的轉化子；采用點突變方法，使第37位的賴氨酸(AAG)改造成天門冬酰胺(AAC)；設計合成引物AB引物A:5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG 3′引物B:3′CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD質粒為模板加入引物A及B,PCR擴增得到改造后的抗菌肽基因命名為抗菌肽CAD，其DNA序列是M K W K L F K K I E K5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT CAA AAG3′CTC GAG CTC TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA GTT TTCK V G Q R V R D A V IAAG GTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATCTTC CAA CCA GTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG GTTS A G P A V A T V A QTCT GCT GGT GCT GCT GTT GCC ACT GTT GCT CAAAGA CGA CCA CGA CGA CAA CGG TGA CAA CGA GTTA T A L A NGCT ACT GCC TTG GCT AAC TAA GAA TTC GGC GGC 3′CGA TGA CGG AAC CGA TTG ATT CTT AAG CCG CCG 5′以抗菌肽CAD基因與pHIL-S1質粒重組轉化于大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素抗性基因篩選到轉化子pHIL-CAD5，測序結果為141堿基對(bp)；將抗菌肽CAD基因與載體質粒pPICZα-A重組，克隆于大腸桿菌TOP10，以Zerocin抗性基因篩選得含重組質粒pACAD5的轉化子；用鋰鹽法將重組質粒pACAD5轉入畢赤酵母中表達，獲得抗菌肽CAD畢赤酵母工程菌GSCAD5；將含抗菌肽CAD的畢赤酵母GSCAD5菌株在培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)作為菌種將菌種接入盛有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后，取樣檢測菌體密度達6OD以上時加入95％甲醇，甲醇加入量1％(占發(fā)酵液總量)誘導產生抗菌肽，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，抽樣檢測菌體密度達10OD以上后，通入100℃蒸汽，20-30分鐘，放料，發(fā)酵液離心，除去菌體，濾液濃縮到原體積的1/10，將濃縮液凍成干粉，即為抗菌肽畢赤酵母制品。
2.根據權利要求1所述的抗菌肽畢赤酵母的制備，其特征在于菌種培養(yǎng)基配方為蛋白胨 10-20g酵母提取物 5-10gNaCl 5-10g葡萄糖 20g加水到 1000mL
3.根據權利要求1所述的抗菌肽畢赤酵母的制備，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為。蛋白胨15g酵母糖10gNaCl5-10g蔗糖15-20g定容1000mL發(fā)酵溫度30±1℃，培養(yǎng)基pH7～7.3，接種量為以10OD濁度的菌種接種30％(體積)。
4.抗菌肽畢赤酵母的應用，其特征在于用5000-5500單位/Kg的畢赤酵母拌入調料中喂養(yǎng)仔豬，可預防及治療仔豬腹瀉；按60-100單位/頭、日，加入水中，供小雞飲水，可預防及治療雛雞腹瀉。
全文摘要
柞蠶抗菌肽具有廣譜殺菌作用。根據天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列,設計抗菌肽AD基因,克隆于畢赤酵母中表達。經優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件,在發(fā)酵罐中達到高密度培養(yǎng)及高效表達(5000單位/毫升)。將抗菌肽酵母制品按5000單位/kg添加于仔豬飼料中,或以60－100單位/日·頭添加于雛雞飲水中,能預防與治療禽畜腹瀉,可代替部分抗生素作為飼料添加劑。
文檔編號C07K14/435GK1322815SQ01112278
公開日2001年11月21日 申請日期2001年4月3日 優(yōu)先權日2001年4月3日
發(fā)明者黃自然, 黃亞東, 鄭青, 姚汝華 申請人:深圳市藝鵬生物工程有限公司