專利名稱：含有抗－fc受體結合劑的治療化合物的制作方法
有關的申請以下是與本申請有關的專利申請(1)順序號為08/484,172，題為“含有抗/Fc受體抗體的治療化合物”，1995年6月7日提出；(2)美國順序號為08/661,052，1996年6月7日提出，現已頌發(fā)證書的美國專利NO.5,837,243，該專利是(1)的部分繼續(xù)；(3)美國順序號為09/188,082，1998年11月6月日提出的美國專利申請，它是(2)的部分繼續(xù)；(4)美國順序號為09/364,088，1999年7月30日提出的美國專利申請，它是(3)的部分繼續(xù)，本申請是(4)的部分繼續(xù)。前述每項申請的全部內容，及此處列舉的所有參考文獻、頌布的專利，以及公布的申請專利均在此引入，作為參考。
背景技術：
免疫球蛋白(Igs)由二條重鏈和二條輕鏈組成，每條鏈包含對抗體效應物功能起作用的NH2末端抗原結合的可變區(qū)，和COOH末端恒定區(qū)。Ig重鏈COOH末端區(qū)形成Fc區(qū)，并通過與特定的受體，皆知為Fc受體(FcRs)的相互作用，參與觸發(fā)細胞的活性。所有類別的Ig，或同種型，的Fc受體(例如，IgG(FcγR)、IgE(FcεR)、IgA(FcαR)、IgM(FcμR)、IgD(FcδR))，都已鑒定。不同的同種型抗體的生物活性不同，它部分取決于其與不同FcR的結合能力，這些不同的FcR在不同的免疫(效應)細胞上表達。(Fridman，W.H.(1991年9月)FASEB雜志Vol.5.2684-2690)。直接抗FcRs的鼠抗體已有制備(參見例如，美國專利No.4,954,617，題為人單核吞噬細胞免疫球蛋白G上的Fc受體的單克隆抗體，和國際專利申請公布號WO91/0587，題為對IgA受體特異的單克隆抗體)。
鼠單克隆抗體可用于人的治療，而且已能生產出無人的病原體，例如肝炎或人免疫缺陷病毒，污染的鼠單克隆抗體。但是，鼠單克隆抗體用于某些人的治療時，會誘發(fā)出對“外源”鼠蛋白的免疫應答。該應答稱為人抗鼠抗體，或HAMA應答(Schroff，R.等(1985)，CancerRes.，45，879-885)，而且這種情況會引起血清疾病，并造成鼠抗體從個體的循環(huán)中迅速排出。已表明，人體的這種免疫應答可以抗鼠免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)。
重組DNA技術已用于抗體的改變中，例如，一個種的特定免疫球蛋白區(qū)可被另一個種的免疫球蛋白區(qū)所取代。Neuberger等(PCT專利申請?zhí)朠CT/GB85/00392)描述了某種方法，按此方法，一個種的Ig分子的互補重鏈和輕鏈的可變區(qū)，可以與另一個種的互補重鏈和輕鏈的Ig恒定區(qū)相結合。該方法可用來取代鼠的恒定區(qū)，產生“嵌合”抗體，該抗體可用于人的治療。用Neuberger等所述方法生產的嵌合抗體中，含有人的Fc區(qū)，它可有效地刺激抗體介導的效應因子功能，例如補體結合功能，但仍然可能在人體內引起抗鼠(外源)可變區(qū)的免疫應答。
Winter(英國專利申請?zhí)朑B2188538A)描述了一種改變抗體的方法，該方法是用來源于另一個種的互補決定區(qū)取代該抗體的互補決定區(qū)(CDR)。該方法可以用來將鼠單克隆抗體可變區(qū)的CDR代入人的重鏈和輕鏈的Ig可變區(qū)域中，該CDR具有所需的結合性能(例如與人的病源體結合)。然后，這些改變后的Ig可變區(qū)與人的Ig恒定區(qū)結合而產生抗體，該抗體的組成中，除了代入的鼠CDR以外，其余全部是人的。由于鼠的組分相當少，Winter所述的“重構的”或“人源化的”抗體與“嵌合”抗體相比，大大降低了在人體內引起的免疫應答。而且，改變的抗體在循環(huán)中的半衰期應可達到天然的人抗體的水平。但是，如Winter所稱，僅用對某種抗原，例如病毒或細菌蛋白特異的另一種抗體的互補CDR，來取代某種抗體的CDR，所產生的改變抗體并不總能保持其所需的結合能力。實際上，在抗體可變區(qū)框架中的某些氨基酸與構成CDR的氨基酸殘基相互作用，以致于要恢復其與抗原結合的能力，有可能需要取代人的Ig可變區(qū)中的氨基酸。
含有抗Fc受體部分和抗靶部分的雙特異性分子，(例如異源抗體)，已制成制劑并用于治療上，例如治療癌癥(例如乳癌或卵巢癌)或病原體感染(如HIV)(參見，例如，國際專利申請公布號W091/00360，題為具有雙效應因子功能的雙特異性異源抗體；以及國際專利申請公布號WO91/05793，題為治療愛滋病的雙特異性試劑)。此外，識別抗原和抗原呈遞細胞的雙特異性分子可施予治療對象，以刺激其免疫應答(參見，例如國際專利申請公布號WO92/05793，題為用雙特異試劑導向的免疫刺激)。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供導向免疫細胞的重組和化學合成的多特異性分子。該分子是“多特異性的”，因為這些分子與多個(2個或2個以上)不同的靶結合，其中一個靶是免疫細胞表面上的分子，例如效應細胞和/或抗原遞呈細胞(APC)。優(yōu)選的免疫細胞靶包括Fc受體，特別是FcδRI和FcαR。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性分子包括至少一個與效應細胞上的分子，例如Fc受體，結合的部分，以及至少一個(例如，2、3、4個或4個以上)與不同的靶，例如在腫瘤細胞或病原體上的抗原，結合的部分。因此，這些分子可以用于誘導效應細胞介導的靶清除。在一個優(yōu)選的實施方案中，上述多特異性分子包含作為結合特異性的人或人源化的抗體(或抗體片段)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性分子包括抗原“多聚體復合物”，該復合物由多個部份(即2個或2個以上)組成，這些部分與抗原遞呈細胞(APC)上的分子，例如Fc受體結合、并與一種或一種以上抗原連接。這些多聚體復合物將抗原，例如自身抗原，導向APC，以通過APC誘導和/或增強對抗原的內在化(胞吞作用)、加工和/或遞呈。因此，這些分子可以用于在體內或體外誘導或增強對正常非免疫原性的蛋白，例如自身抗原，的免疫應答。
另一方面，多特異性分子是本發(fā)明的特征，該分子最低限度包括抗Fc受體部分、抗靶部分、以及可包括或不包括的直接抗第三種靶的第三部分。該第三部分，此處亦稱為“抗增強因子”(抗EF)部分，例如，可以是抗體或抗體片段，或是細胞受體的配體。在優(yōu)選的實施方案中，該多特異性分子包含作為結合特異性的人或人源化的抗體(或抗體片段)。
另一方面，產生多特異性分子的方法也是本發(fā)明的特征。在一個實施方案中，兩種特異性都在同一載體中編碼，并在宿主細胞中表達和裝配成雙特異性分子或融合蛋白。在另一實施方案中，先分別產生每種特異性(例如用重組方法)，然后，在抗體的場合，用化學法通過重鏈C末端的鉸鏈區(qū)的巰基結合相互聯結在一起。
還有另一方面，本發(fā)明的特征是，多特異性分子，此處亦稱為“抗原多聚體復合物”，該復合物含有2種或2種以上與至少一種抗原連接的結合特異性。該結合特異性物結合到抗原遞呈細胞表面的組分上，例如Fc受體，該受體在與結合特異性結合時，可以介導分子復合物的內在化。在優(yōu)選的實施方案中，該分子復合物包括3種或3種以上的結合特異性，而且其中至少一種特異性是對Fc受體(例如FcγRI或FcαR)特異的。在特別優(yōu)選的實施方案中，該抗原在非復合物形式施用時是非免疫原性的。
誘導或增強對目的抗原免疫反應的方法也是本發(fā)明的特征，該方法是對治療對象施予本發(fā)明的抗原多聚體復合物。本發(fā)明進一步還包括對治療對象免疫接種的方法，該方法是將本發(fā)明的抗原多聚體復合物施予治療對象。
基于其可引起效應細胞介導的對靶細胞的殺傷，本發(fā)明的多特異性分子還可以用于多種免疫治療中。在特定的實施方案中，該多特異性分子可用來殺死或抑制各種瘤細胞的生長。
附圖簡述

圖1表明人源化的FcγRI抗體，H22鉸鏈區(qū)部分的核苷酸和氨基酸序列。將[A]改變，產生截短的單巰基形式的[B]，然后進一步改變，人工改造出2個獨特的克隆位點[C]。加下線的核苷酸表明由原先的序列變化而來。加上線的核苷酸為所示限制性位點的識別序列。
圖2是重鏈-EGF融合表達結構pJG055的圖示。
圖3是產生抗Fc受體配體雙特異性分子的圖示。
圖4是用于測定人源化的Fcγ受體-表皮生長因子融合蛋白活性的流式細胞分析圖示。
圖5是標繪平均螢光強度(MFI)的圖，MFI表明各種濃度的表皮生長因子(EGF)融合蛋白(H22-EGF融合蛋白)和完全人源化的雙特異(BsAb)H477與EGF受體(EGFR)表達1483細胞的結合。
圖6表明各種濃度的EGF融合蛋白或BsAbH477，在結合EGFR的鼠抗體M425存在和不存在的情況下，與A431細胞結合的結果。
圖7是標繪抗體依賴的細胞毒性(ADCC)的圖，該ADCC由各種濃度的EGF融合蛋白、BsAbH477或H425抗體與A431細胞結合所產生。
圖8是標繪EGF融合蛋白、BsAb或H425抗體在只有培養(yǎng)基存在下的結合而產生的ADCC的柱狀圖，培養(yǎng)基含有25％的人血清，或含有受體抗體m22的Fab片段。
圖9表明在不同量的EGF、H22-EGF、H22的Fab片段(H22Fab)或H425的F(ab′)2片段(H425F(ab′)2)存在下培養(yǎng)的A431活細胞數。
圖10表示H22Fd-HRG融合蛋白的氨基酸序列。
圖11是表明PC-3或SKBr-3腫瘤細胞特異殺傷百分率的柱狀圖，該細胞的殺傷是將這些細胞與干擾素γ處理的單核細胞和表達H22融合蛋白的骨髓瘤細胞上清的1∶3或1∶30的稀釋液培養(yǎng)一起而引起的。
圖12表明PC-3瘤細胞在單核細胞和不同濃度的H22-鈴蟾肽融合蛋白存在下的裂解百分率。
圖13是流式細胞分析的圖式表示，該分析法用于測定由o-PDM或DTNB法產生的BsAb447活性。
圖14標繪了不同濃度來源于o-PDM和DTNB法的BsAb447與EGFR和FcγRIA431細胞結合的MFI。
圖15標繪了來源于o-PDM和DTNB法的BsAb447與A431細胞結合所產生的抗體依賴的細胞毒性。
圖16是描述三特異抗體構建的流程圖。
圖17二價的雙特異抗體轉化為三價的三特異抗體的描述。
圖18是HER2/neu(A圖)和EGFR(B圖)雙功能熒光激活細胞分選分析的描述。
圖19標繪了不同濃度的抗體BsAb或TsAb與靶細胞結合的結果。平均熒光強度(MFI)隨Ab的結合增加而增加。它表明TsAb以劑量依賴的方式，同時與SKBr-3細胞上的HER2/neu和可溶的FcγRI結合。
圖表20表明TsAb以劑量依賴的方式，同時與A431細胞上的EGFR和可溶的FcγRI結合。該分析方法類似于圖19中所用的方法。
圖21表明TsAb、M22×H425×520C9，以及BsAb、M22×520C9能夠誘導SKBR-33細胞的ADCC，但是BsAb，M22×H425，不能誘導。不同濃度的抗體與SKBR-33細胞和預激活的PMN一起溫育。
圖22表明TsAb、M22×H425×520C9，以及BsAb、M22×H425能夠誘導A431細胞的ADCC，但是BsAb，M22×520C9，不能誘導。分析按類似于圖21的分析方式進行。
圖23是全血調節(jié)分析流程圖(A圖)及其分析結果(B圖)。這些三價抗體迅速地調節(jié)單核細胞表面的FcγRI。
圖24的A圖表明編碼野生型(TT830)和突變型(TT833)破傷風毒性肽的核苷酸的氨基酸序列，B圖是H22Fd-TT融合蛋白。
圖25的A、B和C圖分別代表MDXH210、Fab22-TT830和H22-TT833S與FcγRI陽性U937細胞結合的流式細胞計量分析結果。虛線代表陰性對照，實線表示用融合蛋白染色，以及點線代表用鼠mAb22F(ab′)2封閉的融合蛋白的結合。
圖26表明不同量的融合蛋白MDXH210、FAb22-TT830和H22-TT833與FcγRI陽性U937細胞溫育所得平均熒光強度。
圖27是T細胞與照射的單核細胞以及不同濃度的TT830、Fab22-TT830、TT或TT947溫育后增殖的圖示，表明了與TT830相比，融合蛋白Fab22-TT830將Th表位的遞呈提高了約1000倍。
圖28是表示T細胞增殖的直方圖，T細胞與1000nM的TT830或10nM的Fab-22TT830，以及單核細胞溫育，在加入T細胞和抗原之前用飽和量的mAb22F(ab′)2預溫育或不預溫育。
圖29是表示T細胞增殖的直方圖，T細胞與單核細胞和5nM的Fab-22TT830或1000nM的TT830在Ig不存在(對照)或存在下溫育。
圖30的A圖和B圖表明T細胞與單核細胞和不同濃度的TT830或Fab22-TT830溫育2天后，其上清中IFNγ(A圖)和IL4(B圖)的濃度。
圖31描繪了T細胞與單核細胞以及不同濃度的TT833S、Fab22TT830或TT830溫育后的增殖。
圖32是T細胞與TT830和單核細胞溫育2天后的增殖的圖示，單核細胞與不同濃度的TT833S預保溫過夜。
圖33是T細胞與TT830和單核細胞溫育2天的增殖的抑制百分率的圖示，單核細胞與不同濃度的TT833 S或Fab22-TT830預溫育過夜。
圖34是表示T細胞與單核細胞溫育2天后的增殖直方圖，單核細胞先與TT830溫育4小時(預脈沖)，隨后與10μM TT833S或0.1μMFab22-TT833S溫育過夜(追加)，然后加入T細胞。
圖35是表示T細胞與單核細胞以及TT830、Fab22-TT830、TT833S和Fab22-TT833S培養(yǎng)后，上清中干擾素γ(IFNγ)和IL4的濃度的直方圖。
圖36表示T細胞在只有培養(yǎng)基的條件下用單核細胞、用TT833S、或用Fab22-TT833S刺激一天，然后用單核細胞和不同濃度的TT833S刺激兩天的增殖，它表明TT833S和Fab22-TT833S不會導致T細胞無反應性。
圖37是兩種編碼單鏈雙特異分子的表達結構和一種編碼單鏈抗體的表達結構的圖示，前者含有一個對FcγRI(H22)的結合特異性，和一個對癌胚性抗原(CEA)的結合特異性(結構321和323)，后者含有一個對FcγRI的結合特異性。上述編碼區(qū)在CMV啟動子(CMVpr)的調控下。除了來自抗體的重鏈(VH)和輕鏈的可變區(qū)以外，這些結構編碼的蛋白與c-myc(c-myc)的肽鏈，以及六個組氨酸的肽鏈(H-6)融合。
圖38是表明由表達結構321(321-A5和321-B4)和323(323-B2和323-C4)編碼的單鏈雙特異分子H22-抗-CEA，和由結構225(225-C2)編碼的單鏈H22抗體的結合水平的直方圖，該結合水平用特異的ELISA測定。
圖39表示單鏈人源化的抗FcγRI抗體的核酸序列和該核酸編碼的氨基酸序列。
圖40表示含有一個對FcγRI的結合特異性，和一個對CEA的結合特異性的單鏈雙特異分子的核酸序列，以及該核酸編碼的氨基酸序列。
圖41是由多個Fab′片段連接到抗原上而構成的多聚體復合物的圖示。
圖42(a)所示的是純化的M22F(ab′)2多聚體(泳道1)和化學法連接的M22 Fab′多聚體復合物(泳道2)的非還原性SDS-PAGE的凝膠。圖42(b)表明用M22F(ab′)3+溫育造成CD64在巨大吞噬細胞表面的表達以依賴于劑量的方式減少，減少量高達50％。
圖43(a)表明，與其非轉基因的同窩小鼠相比，所有免疫接種三次的CD64轉基因小鼠都產生了高滴度的M22特異抗體。圖43(b)表明用少達0.25mg量的多聚體復合物免疫接種的FcγRI(CD64)轉基因小鼠仍然產生可檢測的免疫應答。
圖44(a)和44(b)表明，用抗-520C9和抗M22滴度鑒定的FcγRI(CD64)轉基因的和非轉基因的小鼠的免疫應答。小鼠用偶聯到M22多聚體復合物上的鼠抗體Fab′片段，520C9，免疫接種。
圖45(a)是編碼基因連接的多聚體復合物的表達載體圖譜，該復合物含有兩個與一個M32.2sFv區(qū)連接的H22sFv區(qū)，該MH22sFv區(qū)又與抗原連接(H22(2x)-32.2抗原復合物)。圖(b)是所產生的多聚體復合物。
圖46表明了M22FabxM22FabxM32和H22sFv-H22sFv-32.2sFv-gp75多聚體復合物與FcγRI有效結合，以及誘導內在化的能力。
圖47(a)是編碼基因連接的多聚體復合物的表達載體圖譜，該復合物含有兩個共同與抗原連接的H22sFv區(qū)(H22(2x)抗原多聚體復合物)。圖47(b)是所產生的多聚體復合物。
圖48是用H22Fab、H22sFv2-EGF多聚體和H22-Fab2多聚體進行結合競爭試驗的結果。該結果用這些多聚體對M22-藻紅蛋白結合物的結合抑制來表示。
圖49(a)是編碼基因連接的多聚體復合物的表達載體圖譜，該復合物含有三個與抗原連接的H22sFv片段(H22(3x)-抗原多聚體復合物)。圖49(b)是所產生的蛋白。
圖50是表明與其他多聚體復合物比較，H22(3x)-CEA多聚體復合物誘導FcγRI內在化的能力的柱狀圖。
圖51是抗CD89(14A8)HuMAb融合分子生產的圖示。用電穿孔法將PJZ906(14Afd-EGF)和pJZ907(14A8L-鏈)共轉染到NSO細胞中，并在含有G418和潮霉素的培養(yǎng)基中選擇。用類似的方法轉染PJZ909(14A8sFv-EGF)并在含G418的培養(yǎng)基中選擇。用有限稀釋克隆法將表達融合蛋白的細胞系亞克隆。
圖52(a)表明了14A8fab′-EGF融合結構與A431細胞上EGFR的結合(用流式細胞計量法測定)。圖52(b)表明了14A8sFv-EGF融合結構與A431細胞上EGFR的結合。A431細胞用結合藻紅蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色。不含EGF的14A8(人單克隆抗FcαR抗體，亦稱為14.1)的fab片段用作對照。圖52(c)表明融合蛋白與市售的EGF以EGF-FITC結合物(7nM)的形式競爭與A431細胞結合。
圖53(a)表明14A8fab′EGF融合結構與U937細胞的結合(用流式細胞計量法測定)。結合U937細胞的融合蛋白用結合藻紅蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色。對EGF-R特異的人源化mAbH415的fab2片段用作對照。
圖53(b)表明14A8sFv-EGF融合結構與U937細胞的結合。除了確定不同的14A8sFv-EGF濃度，以測定其抑制14A8fab′結合的能力(23nM)以外，實驗按類似圖53(a)的方式進行。H22sFv-EGF融合蛋白作為對照。mAbH22連接到CD64(FcγRI)上，它是U937細胞上不同的Fc受體。
圖54表明劑量依賴的融合蛋白介導的A431細胞的細胞毒性。鉻釋放分析所用的的溫育周期為16-18小時，效應物靶比值為100∶1(對單核細胞和PMN)。效應細胞包括新鮮的單核細胞(圖54(a))、PMN(圖54(b))和全血(圖54(c))。14A8的fab片段用作對照。
圖55是比較圖54(a)-(c)中結果的柱狀圖。
圖56(a)是表明14A8fab′-EGF(1μg/ml)融合蛋白介導的A431細胞的細胞毒性受14A8的fab-2片段抑制的柱狀圖。
圖56(b)是表明14a8sfv-EGF(1μg/ml)融合蛋白介導的A431細胞的細胞毒性也受14A8的fab-2片段抑制(40μg/ml)的柱狀圖。
圖57是雙特異單鏈融合分子，931和934，及其親本HuMab的圖示。14.1和3F2的可變的輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)用于產生931和943(w/EGF)結構。
圖58是由14.1和3F2(抗HER2)的Fab′片段構成的化學結合雙特異分子的圖示，該分子用作陽性對照。
圖59(a)是對轉染上清中所表達的融合蛋白931和934的篩選(結合)分析柱狀圖，該結果用流式細胞計量法分析測得。轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清與SKBR3或A431腫瘤細胞系一起溫育。用結合藻紅蛋白的羊抗人Igfab-2染色，檢測融合蛋白的結合。圖59(b)是融合蛋白931和934的ADCC分析的柱狀圖。鉻釋放分析中所用的溫育周期為16-18小時，效應物靶比值為100∶1。用轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清介導特異的裂解，檢測腫瘤細胞的殺傷。
圖60(a)表明單鏈融合蛋白931和934與U937細胞的結合(用流式細胞計量法測定)。與U937細胞不結合的抗EGF-GmAb，即425的fab′片段用作陰性對照。圖58中所示的化學連接雙特異分子(14.1×3F2)用作陽性對照。圖60(a)表明單鏈融合蛋白931和934與SKBR3細胞的結合(用流式細胞計量法測定)，14.1fab-2用作陰性對照。圖58中所示的化學連接雙特異分子(14.1×3F2)用作陽性對照。
圖61表明單鏈融合蛋白943與A431細胞的結合。除了選用EGF-R高表達的A431腫瘤細胞以外，該實驗按圖60所示同樣的方式進行。由14.1的sFv片段與EGF融合的融合蛋白用作陽性對照，14.1fab-2用作陰性對照。
圖62表明通過單鏈融合蛋白931的PMN(效應細胞)介導的SKBR3(圖62(a))和BT474(圖62(b))腫瘤細胞的細胞毒性。鉻釋放分析中所用的溫育周期為16-18小時，效應物-靶比值為100∶1。14.1fab-2用作每個實驗的陰性對照。
圖63表明通過單鏈融合蛋白931的單核細胞(效應細胞)介導的SKBR3(圖62(a))和BT474(圖62(b))腫瘤細胞的細胞毒性。鉻釋放分析中所用的溫育周期為16-18小時，效應物-靶比值為100∶1。14.1fab-2用作每個實驗的陰性對照。
圖64通過51Cr釋放測定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89雙特異分子(14.1×3.F2)介導的多形核細胞對SKBR3和BT474腫瘤分子的抗原依賴的細胞溶解。
圖65通過51Cr釋放測定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89雙特異分子(14.1×3.F2)介導的單核細胞對SKBR3和BT474腫瘤分子的抗原依賴的細胞溶解。
圖66通過51Cr釋放測定，描述了人抗HER2/neu x抗CD89雙特異分子(14.1×3.F2)介導的全血對SKBR3和BT474腫瘤分子的抗原依賴的細胞溶解。
發(fā)明詳述多特異性分子本發(fā)明介紹導向免疫細胞的重組和化學合成的多特異性分子。該分子是“多特異性的”，因為它們與多個(2個或2個以上)不同的靶結合，其中一個靶是免疫細胞表面上的分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性分子包括至少一個與效應物細胞上的分子，例如Fe受體，結合的部分，以及至少一個(例如，2、3、4個或4個以上)與不同的靶，例如在瘤細胞或病原體上的抗原，結合的部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多特異性分子包括抗原“多聚體復合物”，該復合物由多個部份(即2個或2個以上)組成，這些部分與抗原遞呈細胞(APC)上的分子，例如Fc受體結合、并與一種或一種以上抗原連接。這些多聚體復合物將抗原，例如自身抗原，導向APC，以誘導和/或增強對抗原的內在化(胞吞作用)、加工和/或遞呈。因此，這些分子可以用于在體內或體外誘導或增強對正常非免疫原性的蛋白，例如自身抗原的免疫應答。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多特異性分子包括與Fc受體，通常是FcδR(例如，FcδRI)或FcαR，結合的人或人源化的(嵌合)抗體或抗體片段。多特異性分子另外包含1種或1種以上的結合特異性，例如配體和/或其他人抗體或抗體片段，它們與不同靶細胞(例如，腫瘤細胞)上的抗原結合。此類多特異性分子可通過化學法連接，或以融合蛋白的方式用基因工程方法表達。而且，由于它們可通過FcδRI或FcαR導向效應細胞，它們可用于誘導效應細胞(例如，PMN、巨噬細胞和單核細胞)介導的靶(例如，腫瘤)細胞的殺傷，或者，如果與抗原連接，則可通過抗原遞呈(AP)效應細胞(例如，樹枝狀細胞)用于增強抗原遞呈。
如此處用來描述本發(fā)明的多特異性分子那樣，術語“結合到…的部分”可與術語“對…的結合特異性”通用。二者都是指多特異性分子中與靶表位結合的區(qū)域。如以下所詳述的，這些部分或結合特異性包括任何能結合到靶表位上的化合物，包括但不限于抗體、抗體片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv，或單鏈的Fv)及其摸擬物(例如，肽、化學和有機的摸擬物，該摸擬物“摸擬”抗體或抗體片段的結合)。合適的抗體和抗體片段包括，但不限于鼠、人源化的(嵌合的)、單鏈的，和人的單克隆抗體及其片段。在特定的實施方案中，該結合特異性包括一個或一個以上選自H22(ATCC保藏號CRL11177)、M22(ATCC保藏號HB12147)、M32.2(ATCC保藏號HB9469)的抗體，及其抗原結合片段，每種抗體都與FcγRI(CD64)結合。人源化的抗體H22，及其鼠的等同物，M22具有以下優(yōu)點，即其與FcγRI結合的位點在天然配基(IgG)的結合位點之外，這樣，在其施入體內時，該結合不會被內源配體所阻斷或受到競爭抑制。在另一個特定的實施方案中，該結合特異性包括一種或一種以上的抗體，該抗體選自與FcαR(CD89)結合的人單克隆抗體14.1和與HER2結合的人單克隆抗體3.F2。
此處所用的術語，抗體的“抗原結合部分”(或簡單稱為“抗體部分”)是指一種或一種以上保留與抗原(例如，Fc受體)特異結合能力的抗體片段?，F已證明，抗體的抗原結合功能可由全長的抗體片段來完成。包括在術語抗體的“抗原結合部分”之內的結合片段有以下例子(i)Fab片段，包括VL、VH、CL和CH1區(qū)的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，兩條Fab片段通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接而組成的二價片段；(iii)包括VH、CH1區(qū)的Fd片段；(iv)包括單臂抗體的VL和VH區(qū)的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546，該片段含有VH區(qū)；(vi)分開的互補決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個區(qū)，VL和VH，由分開的兩個基因所編碼，但用重組技術，通過合成的接頭可將它們連結起來，該接頭可將VL和VH制成單一的蛋白鏈，在該蛋白鏈中，VL和VH區(qū)配對，形成單價分子(為大眾所熟知的單鏈Fv(scFv)；參見Bird(1988)Science242423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體也可考慮包括在術語抗體的”抗原結合部分”內。這些抗體片段可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術得到，并按完整抗體的同樣方式篩選使用。I.含有導向抗原遞呈細胞(APC)的抗原多聚體復合物的多特異性分子本發(fā)明的抗原多聚體復合物包括多個部分或結合特異性，該特異性導向抗原遞呈細胞表面的組分，并與一種或一種以上的抗原連接。上述的多個結合特異性可結合到同一或不同的APC細胞表面組分的抗原表位上。在優(yōu)選的實施方案中，該多聚體復合物包括至少3個與APC細胞表面組分結合的結合特異性。APC上用于導向的合適組分包括以下所述的組分，當其與結合特異性結合時，可介導該特異性的內在化，從而使與結合特異性連接的抗原有效地內在化，并通過APC遞呈。
此處所用的術語“抗原遞呈細胞”或“APC”是指能使抗原內在化并能對其加工的免疫細胞，這樣，抗原決定簇以可被免疫系統(tǒng)(例如II類-MHC局限輔助性T淋巴細胞)識別的方式，以MHC-復合體的形式在該細胞的表面遞呈。使細胞起APC功能的兩種必須的性能是加工胞吞的抗原，和表達II類MHC基因產物的能力。對于輔助性T細胞，最好的APC包括單核吞噬細胞(例如，巨噬細胞)、B淋巴細胞、樹枝狀細胞、皮膚朗氏細胞，以及人的內皮細胞。
在優(yōu)選的實施例中，結合特異性所導向的APC細胞表面組分為Fc受體，通常為FcγR。因此，在本發(fā)明特定的實施方案中，該多聚體復合物包括多個導向FcγR上不同表位的結合特異性(例如，2個或2個以上，優(yōu)選3個或3個以上)。另外，該多聚體可以包括多個導向FcγRI上同一表位的結合特異性。但是，其他合適的APC細胞表面組分也可被導向。這類組分可用以下方法鑒定，例如，用APC對某種動物(例如人FcγR轉基因鼠)免疫接種，然后從該動物取出血清，用標準分析法(例如Western blot)測定與該血清結合的組分。然后可再測定這些APC細胞表面組分使與其結合的化合物內在化的能力。因此，在一個實施例中，該多聚體復合物包括至少一個與Fc受體結合的抗體或其片段(例如，Fab、Fab、F(ab)2、Fv，或單鏈的Fv)，該Fc受體例如是人IgG受體，如Fcγ受體(FcγR)，例如是FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和cγRIII(CD16)。優(yōu)選的Fcγ受體是高親和力的Fcγ受體FcγRI。但是，其他Fc受體，例如人IgA受體(例如FcαRI)也可被導向。Fc受體位于APC，例如單核細胞或巨噬細胞的表面。在特定的實施方案中，多聚體復合物與Fc受體結合的位點遠離該受體的免疫球蛋白(例如，IgG或IgA)結合位點。因此，多聚體復合物的結合不會受到生理水平上的免疫球蛋白的阻斷。優(yōu)選的人源化抗FcγR單克隆抗體在PCT申請WO94/10332和美國專利NO.4,954,617中已有描述，其中的內容在此全部并入作為參考。
如此處的實施例所述，適用于本發(fā)明抗原多聚體復合物的特定人源化和鼠的單克隆抗體和抗體片段包括，但不限于，人源化的抗體H22(ATCC保藏號CRL11177)、鼠源的該抗體，M22(ATCC保藏號12147)，鼠抗體M32.2(ATCC保藏號HB9469)及這些抗體的抗原結合片段。
本發(fā)明的導向APC的多聚體復合物進一步還包括一種或一種以上的抗原。此處所用的術語“抗原”是指能夠被免疫細胞所識別(即引起免疫應答，例如T細胞介導的免疫應答)的任何分子(例如，蛋白、肽、糖類等)?？乖ā白陨砜乖?self antigen)”或“自抗原”(autoantigen)，該抗原正常存在于宿主中，而且在正常情況下不會引起宿主的免疫應答(因為免疫系統(tǒng)識別該抗原為“自身的”，而不是“外源的”)。在某些疾病中，不正常地存在于宿主中的抗原，應該由宿主的免疫系統(tǒng)引起免疫應答，但實際上不是這樣。換句話說，這些抗原“逃離了”宿主免疫系統(tǒng)的識別。這類抗原包括，例如，某些腫瘤的抗原和病原體(例如病毒和細菌)的抗原，在這種場合，要求對抗原進行修飾，以誘導或增強免疫細胞對它的識別，從而清除宿主細胞中的該抗原或產生該抗原的細胞/有機體。換句話說，該抗原經修飾后，使免疫細胞不再將其識別為“自身抗原”。
本發(fā)明的抗原多聚體復合物的制備可按此處所述，采用標準的交聯劑和本領域熟知的接合方法，將一種或一種以上的抗原，通過化學方法，連接到多個(2個或2個以上)APC上組分的結合特異性上。此處還敘述了另一種方法，即通過重組產生單一蛋白的抗原多聚體復合物。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼某種抗原多聚體復合物的核酸。通常，該核酸在表達載體內與啟動子和控制該多聚體復合物表達的其他基因調控序列操縱連接。當某種核酸與另一種核酸序列處于功能的關系時，則該核酸是“操縱連接”的。例如，如果某啟動子或增強子影響了某編碼核酸的轉錄，則該啟動子或增強子與該編碼核酸是操縱連接的。就轉錄調控序列而言，操縱連接意味著所連接的DNA序列是鄰接的，在需要連結兩種蛋白編碼區(qū)時，是按閱讀框的鄰接。對于開關序列，操縱連接表明該序列能影響開關重組。
此處所用的術語“載體”是指能載運與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是“質?！?，質粒是指環(huán)狀雙鏈的DNA環(huán)，外加的DNA片段可連接到其中。載體的另一種類型是病毒載體，其中外加的DNA片段可連接到病毒的基因組中。某些載體能在其引入的宿主細胞中自主復制(例如有細菌復制原點的細菌載體和附加型的哺乳類動物載體)。其他載體(例如非附加型的哺乳類動物載體)可以通過將其引入宿主細胞而整合到該宿主細胞的基因組中，并與宿主基因組一起復制。此外，某些載體能指導與其操縱連接的基因的表達。這類載體在此稱為重組表達載體(或簡稱為表達載體)。一般，重組DNA技術中所用的表達載體常常是質粒的形式。在本發(fā)明的說明書中，“質粒”和“載體”可以通用，因為質粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明還包括其他形式的起同等功能的表達載體，例如病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
此處所用的術語“重組宿主細胞”(或簡稱為宿主細胞)是指其中已導入重組表達載體的細胞。應該懂得這種術語不僅是指特定的對象細胞，而且還指該細胞的子代。因為在連續(xù)傳代的過程中，由于突變或環(huán)境的影響，會發(fā)生某些修飾，這種子代實際上可能與其親本細胞不完全等同，但它仍然包括在此處所用的術語“宿主細胞”的范圍內。
本發(fā)明的抗原多聚體復合物可通過免疫細胞(例如APC)用于誘導或增強抗原的內在化、加工和遞呈。因此，本發(fā)明還提供誘導或增強治療對象抗原的免疫應答的方法，該方法是將有效量的抗原多聚體復合物施予治療對象。例如，可以施予抗原多聚體復合物，以誘導對自身抗原的免疫應答(包括免疫系統(tǒng)不能識別的腫瘤抗原)，或增強對抗原的免疫，例如腫瘤抗原或病原體的組分。這樣，該抗原多聚體復合物也可用作免疫宿主的疫苗。II.導向效應細胞的多特異性分子本發(fā)明的多特異性分子還包括設計成導向效應細胞的分子，以引起效應細胞介導的靶細胞、病原體、等位基因或其他實體的清除。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了多特異性分子，該分子包括至少一個與效應物細胞上的組分結合的部分，該組分通常是Fc受體，以及至少一個(例如，2、3、4或4個以上)與不同的靶，例如腫瘤細胞或病原體上的抗原結合的部分。
此處所用的“效應細胞”是指某種免疫細胞。特定的效應細胞表達特定的Fc受體，并具有特定的免疫功能。例如，表達FcγRI和FcαR的單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞和樹枝狀細胞參與了靶細胞的特異殺傷，并將抗原遞呈到免疫系統(tǒng)的其他組分上。因此，由于RcγRI和FcαR都在這些類別的效應細胞上表達，所以被優(yōu)選用于本發(fā)明中的觸發(fā)靶。此外，特定的FcR在效應細胞上的表達可由體液因子，例如細胞因子調控。例如，已發(fā)現，FcγRI的表達受干擾素γ(IFNγ)的正調控。這種增強的表達增加了FcγRI細胞抗靶的細胞毒性活性。
導向效應細胞的多特異性分子含有一個或一個以上與效應細胞上的組分，例如Fc受體結合的特異性或部分。在一個實施方案中，如前所述，該結合特異性由抗體或抗體片段(例如，Fab 或單鏈Fv)提供。
在特定的實施例中，該抗體或抗體片段是人或“人源化”的(亦即，來源于人的抗體，但含有至少一部分來源于非-人抗體的互補決定區(qū)(CDR)，選用該部分的目的是提供人源化抗體對人Fc受體的特異性)。
上述抗體可以是完整的，即有重鏈和輕鏈或它們的任何片段，例如Fab或(Fab)2片段。該抗體還可以是輕鏈或重鏈雙體，或其任何最小的片段，例如Fv或如按Ladner(美國專利NO.4,946,778，1990年8月7日頌布)所述而的單鏈結構，該專利的內容明確引入作為參考。上述人源化的抗體或片段可以是能夠保留非-人CDR的任何人抗體。對于重鏈可變區(qū)(VH)，優(yōu)選的人抗體來源于已知蛋白NEWM，對于Ig kappa鏈可變區(qū)(VK)優(yōu)選的人抗體來源于已知蛋白KOL。
所選擇的插入人源化抗體的非-人CDR部分要足以能夠使人源化的抗體與Fc受體結合。該部分的選擇方法是將此CDR部分插入人抗體中，然后用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定所產生的人源化抗體的結合能力。
特定人抗體的所有CDR都可被至少一部分份非人抗體的CDR所取代，或者某些CDR可被非人抗體所取代。唯一的要求是代入必需量的CDR，使人源化抗體能與Fc受體結合。來源于鼠單克隆抗體(mab)的非人CDR，mab22，在國際專利申請公布號W/O94/10332中已有描述，該專利的內容在此全部引入作為參考。該mab22抗體是對Fc受體特異的，在1988年9月4日頌布的美國專利NO.4,954,617中對此有進一步的描述，該專利的內容亦明確引入作為參考。人源化的mab22抗體產生的細胞系已于1992年11月4日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱為HA022CL1，登記號為CRL11177。
抗體可用任何方法人源化，該方法可以用來源于非人抗體的CDR取代至少一個部份人抗體的CDR。Winter描述了可用來制備本發(fā)明人源化抗體的方法(英國專利申請GB2188638A，1987年3月26日提出)，該專利已明確引入作為參考。采用寡核苷酸定點突變的方法，可使人的CDR被非人的CDR所取代，該方法如在國際專利申請公布號WO94/10332中所述，其題為，人單核吞噬細胞上免疫球蛋白G的Fc受體的人源化抗體。
除了抗Fc受體部分以外，多特異性分子可包括“抗靶部分，”即某種抗體、功能性抗體片段或配體，它能識別和結合病原體(例如病毒、細菌、真菌)、病原體感染的細胞、癌或瘤細胞(例如乳房、卵巢、前列腺等)或治療對象(例如人或動物)體內其他不希望有的細胞或抗原，或它們的經修飾的形式。此外，該靶部分可含有抗原，或可被導向抗原。優(yōu)選的實施方案中包含可用來刺激免疫系統(tǒng)的抗原，例如慢性感染的情況，以耗竭循環(huán)中的抗原，并治療腫瘤。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗原是連接到含有抗FcR抗體的多價分子上的。
在本發(fā)明特定的實施方案中，該多特異性分子含有配體。該配體可以是與某種分子反應的任何配體。在優(yōu)選的實施方案中，該配體與蛋白，例如在靶細胞，如癌細胞，表面的蛋白結合。優(yōu)選的配體包括受體配體，例如生長因子或分化因子。舉例來說，多價分子可包括表皮生長因子，或至少包括能與受體，如表皮生長因子受體反應的部分或其修飾形式。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，該配體是小的肽鏈，例如鈴蟾肽、胃泌素釋放肽(GRP)、西濱蛙肽、神經調節(jié)肽B，或神經調節(jié)肽C。上述這些肽的序列可以查到，例如在美國專利No.5,217,955中可查到，該專利的內容在此引入作為參考。上述抗體也可以是這些肽的修飾形式。該修飾可以增強對受體的結合，也可減弱或不影響與受體的結合。配體的修飾可將興奮劑轉變?yōu)檗卓箘?，這樣，配體就可抑制而不是刺激細胞的增殖。該抗體的修飾可以是至少加入、缺失或替代一個氨基酸。
在本發(fā)明特定的實施方案中，多價或雙特異的分子含有某種抗原。此處所用的術語“抗原”是指任何天然的或合成的免疫原性物質、免疫原性物質的片段或部分、肽的表位，或半抗原。該術語“抗原”還包括在非復合狀態(tài)時是非免疫原性的，但在復合狀態(tài)時是免疫原性的物質。術語“非復合的”包括不連接成本發(fā)明的分子復合物的物質。術語“復合的”包括連接形成本發(fā)明的分子復合物的物質。
在本發(fā)明的一個實施方案中，采用了雙或多特異的分子，用以將抗原導向細胞，以增強細胞對抗原的內源化和遞呈的加工作用，最終刺激其免疫應答。在特定的實施方案中，該雙特異結合劑與抗原特異結合(直接與抗原表位結合，或間接與抗原連接的表位結合)，并同時與抗原遞呈細胞的表面受體結合，該細胞可使抗原內源化，以便對其進行加工和遞呈。在另一實施例中，抗原連接到多或雙異特分子上，并同時與抗原遞呈細胞的表面受體結合。這些雙或多特異分子的受體結合組分(由此，也是雙或多特異分子本身)與抗原遞呈細胞的受體結合。在某些情況下，該特異分子在其未基本上被該受體的天然配體所封閉的情況下發(fā)生結合反應，結果，將抗原導向受體的過程不會受到生理水平上的配體的阻止，而且經導向后的受體仍保留結合該配體的能力和功能。
抗原的一種類型可以是變應原。“變應原”是指能對敏感對象引起變應或哮喘反應的物質。變應原的名單很龐大，可包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、真菌孢子和藥物(如青毒素)。天然的、動物的和植物的變應原例子包括對以下各屬特異的蛋白犬屬(例如普通犬)；表皮螨屬(例如法嗜皮螨)；貓屬(例如家貓)；豚草屬(例如豚草)；黑麥草屬(例如多年生黑麥草或多花黑麥草)；杉屬(日本杉)；交鏈孢屬(鏈格孢)；赤楊；榿木屬(歐洲榿木)；樺木屬(疣皮樺)；櫟屬(白櫟)；齊墩果屬(歐洲齊墩果)；篙屬(Vulgaris篙)；車前草屬(例如長葉車前)；墻草屬(例如藥用墻草或judaica墻草)；姬蠊屬(例如德國蠊)；蜜蜂屬(例如多花蜜蜂)；柏木屬(例如地中海柏木、緣干柏木、大果柏木)；刺柏屬(例如沙比檜、北美圓柏、歐洲杜松和Juniperus ashei)；崖柏屬(例如側柏)；扁柏屬(例如日本扁柏)；大蠊屬(例如美洲大蠊)；冰草屬(例如偃麥草)；黑麥屬(例如黑麥)；小麥屬(例如小麥)；鴨茅屬(例如鴨茅)；羊茅屬(例如高羊茅)；早熟禾屬(例如草地早熟禾或壓扁早熟禾)；燕麥屬(例如燕麥)；絨毛草屬(例如絨毛草)；黃花茅屬(例如香黃花茅)；燕麥草屬(例如燕麥草)；剪股穎屬(例如小糠草)；梯牧草屬(例如梯木草)；鵑草屬(例如鵑草)；雀稗屬(例如Paspalumnotatum)；高梁屬(例如Sorghum halepensis)；以及雀麥屬(例如無芒雀麥)。
許多變應原可發(fā)現于空氣傳播的豚草花粉、青草、或樹木、或在真菌、動物、房屋塵土、或食物中。從整個類別來看，這些變應原相對比較耐受蛋白酶的消化。優(yōu)選的變應原是與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE結合，由此引起I型過敏性超敏反應的變應原。當多價試劑中至少有一個對高親和力Fc受體的表位的特異性而且該表位在IgG的配體結合區(qū)之外時，這種雙特異結合劑可降低治療對象的超敏性。在變應原與肥大細胞或嗜堿性粒細胞上的IgE結合之前，上述雙特異結合劑競爭形成IgE-結合的變應原，由此可降低I型超敏反應的可能性從而達到上述降低治療對象超敏性的目的。此外，由于將變應原定向到FcΥR上，可能誘導使T細胞處于耐受變應原的狀態(tài)，這樣便可干擾IgE介異的I型反應。上述T細胞的耐受狀態(tài)可由以下方法達到用大致低于當前所用量的變應原，誘導與IgE競爭結合變應原的IgG。
在某些情況下，希望將弱抗原的或非抗原的物質按其原樣(如半抗原)偶聯到載體分子上，例如某種大的免疫原性分子(如細菌毒素)，以便用于給藥。
在這些例子中，在制備雙特異結合試劑時，是與偶聯了上述物質的載體的表位結合，而不是與該物質本身的表位結合。
與本發(fā)明的多或雙特異分子可直接或間接連接的抗原可以是可溶的，或是顆粒；它可以載有B細胞表位，T細胞表位或二者都有。該抗原可以是細菌、病毒或起源于寄生蟲。該抗原常常含有病原體有機體的表面結構的組分。例如，該抗原可含有某種病毒表面結構，例如人免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎病毒表面抗原的包膜糖蛋白。此外，該抗原可以與疾病的細胞結合，例如腫瘤細胞，可產生對該細胞的免疫應答而治療該疾病。該抗原可含有腫瘤特異或腫瘤結合的抗原，例如Her-2/ncu原癌基因產物，該基因在人乳房和卵巢癌細胞中表達(Slamon等(1989)Science 244707)。
治療對象的細胞可在體外或體內置于本發(fā)明的多價分子中，該多價分子可用于將抗原導向培養(yǎng)物中的抗原遞呈細胞。從病人血液中分離出免疫活性細胞，然后將此細胞置于含有抗原的多價分子中，或者可將此細胞與多價分子一起置于抗原中，該多價分子具有對該抗原的結合特異性。靶向的抗原遞呈細胞將會加工該抗原，并將其片段在細胞表面上遞呈。經刺激后，可將該細胞送回到病人體內。
本發(fā)明的方法可用來增強或加強對抗原的免疫應答。例如，該方法對治療慢性感染，如肝炎和愛滋病，是很有價值的，因為對于肝炎和愛滋病來說，其無助的免疫系統(tǒng)不能克服感染。該方法也可用于治療感染的急性期，此時增強對侵入有機體的免疫應答可能是必要的。
采用該方法可減少得到保護的或治療的免疫應答所需的抗原劑量，或該方法可用于宿主對抗原無應答或極少應答的例子中。雖然一般來說，都希望減少有效劑量，但當抗原對宿主有毒時，例如變性原的情況下，減少有效劑量是尤為希望的。含有抗原，或含有配體，例如與抗原反應的抗體，的雙或多特異分子的使用方法和用途將進一步在公布的PCT申請PCT/US91/07283中描述。
在本發(fā)明的另一實施方案中，多特異分子含有經修飾的抗原，這樣，通過抗原遞呈細胞將修飾的抗原遞呈到T細胞，可調節(jié)該抗原對T細胞的激活效應。Allan等實際上已表明，對于刺激T細胞的肽鏈，例如刺激T細胞的增殖的肽鏈，替代該肽鏈中的一個或一個以上的氨基酸可以產生不能刺激T細胞的抗原，或在T細胞中誘導無反應性的抗原。這種修飾的肽鏈稱為改變的肽鏈配體(APL)。因此，這種APL可連接到含有至少一個FcγRI結合特異性的雙或多特異分子上。通過抗原遞呈細胞對這些分子的吞噬作用，并遞呈到T細胞，可以抑制T細胞的增殖，或使其無反應性。因此，將下述多特異分子施予治療對象將會誘導該治療對象對抗原的耐受性，該多特異分子含有(a)至少一種改變肽鏈的抗原，該抗原能正常地刺激T細胞，但其經修飾后可誘導T細胞的無反應性；以及(b)至少一種抗-FcγRI抗體。由此，這種多或雙特異分子可以用來使治療對象耐受各種抗原，例如自身抗原。因此，依照所用的抗原，本發(fā)明的方法提供了增加免疫應答的方法，即采用刺激T細胞的抗原；同時本發(fā)明還提供了減少免疫應答的方法，即通過抑制T細胞的刺激，或誘導T細胞的無反應性。
本發(fā)明的多特異、多價分子還可包括“抗—增強因子(抗—EF)部分”。該“抗增強因子部分”可以是抗體、功能性抗體片段，或與抗原結合的配體，并由此增強了抗Fc受體部分或抗靶部分的效應。上述“抗增強因子部分”可結合某種Fc受體或某種靶。對于靶細胞經受抗原調整或抗原性變異(例如已描述過的某些寄生蟲(如錐蟲屬)那樣)的場合，包含與一種靶細胞抗原結合的抗靶部分，以及與不同靶抗原結合的抗增強因子部分的多價分子尤為有用。另一種情況是，該抗增強因子部分可與某種實體結合，此實體與結合抗靶或抗Fc受體部分的實體不同。例如，該抗增強因子部分可結合細胞毒的T細胞(例如通過CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAMI或其它引起增加對靶的免疫應答的免疫細胞)。
制備多特異分子的方法上述的多特異分子可由很多種方法制備。例如，兩種特異性可以在同一載體內編碼，并在同一宿主細胞中表達和裝配。在多特異分子是下面實施例中所述的(配體)×(fab)融合蛋白的場合，上述的方法尤為有用。本發(fā)明的雙特異分子可以是單鏈的雙特異分子，例如單鏈雙特異抗體、包含一種單鏈抗體和配體的單鏈雙特異分子，或包含二種配體的單鏈雙特異分子。多價分子也可以是單鏈分子，或可包含至少二個單鏈分子。制備雙或多價抗體的方法如以下專利中所述美國專利號5,260,203；美國專利號5,132,405；美國專利號4,881,175；美國專利號5.132,405；美國專利號5,091,513；美國專利號5,476,786；美國專利號5,013,653；美國專利號5,258,498；和美國專利號5,482,858。
單鏈分子與其特異靶的結合可通過此處實施例中所述的雙特異ELISA證實。
另一種制備多特異分子的方法是分別產生多特異分子的每種特異性,然后將所生成的蛋白或肽鏈相互結合在一起。例如，兩種人源化的抗體可通過其兩條重鏈C末端鉸鏈區(qū)的巰基結合。在特別優(yōu)選的實施例中，先將區(qū)修飾，使其含有奇數的巰基殘基，優(yōu)選為一個，然后結合在一起。
本發(fā)明的雙特異分子可采用以下實施例中所述的方法，或用本領域熟知的方法，將抗FcR和抗靶部分結合在一起而制成。例如，很多偶聯劑或交聯劑可用于共價結合。交聯劑的例子包括蛋白A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代乙酸鹽(SATA)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸鹽(SPDP)，以及硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(硫代SMCC)(參見例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.med.1601686；Liu，MA等(1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)、Brennan等(Science(1985)22981-83)，以及Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的方法。優(yōu)選的結合劑為SATA和硫代SMCC，二者均可由Pierce ChemicalCo.(RockFcrd，IL)供應。
在采用抗體作為多特異分子的結合特異性時，優(yōu)選的抗體包括人單克隆抗體和人源化的抗體(包括其片段，例如Fab′和單鏈Fv)。制備人源化抗體的方法在本領域是熟知的，并在下面的實施例中詳述。全人單克隆抗體的制備方法在本領域也是熟知的。這些抗體可用各種技術生產，包括傳統(tǒng)的單克隆抗體操作法，例如KoRler和Milsten的標準的體細胞雜交技術，Nature 256495(1975)。雖然原則上是優(yōu)選體細胞雜交方法，但其他生產單克隆抗體的技術也可采用，例如病毒或原癌基因的B淋巴結胞轉化。
優(yōu)選的制備雜交瘤的動物系統(tǒng)為鼠系統(tǒng)。在小鼠中生產雜交瘤是很成熟的方法。將免疫接種的脾細胞分離，并用于融合的免疫接種方案和技術在本領域是熟知的。融合的配對物(例如鼠的骨髓瘤細胞)以及融合的方法也是已知的。
在優(yōu)選的實施例中，人單克隆抗體用攜帶人免疫系統(tǒng)，而不是鼠系統(tǒng)的轉基因小鼠來生產。這些轉基因小鼠，此處稱為“HuMAb”小鼠，含有人的免疫球蛋白基因的小基因座，它可編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和K輕鏈免疫球蛋白序列，以及含有使內源的μ和K鏈失活的基因座(Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，小鼠表現出鼠IgM或K的表達減少，在免疫應答中，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經受類別轉換和體細胞突變，產生高親和力的人IgGk單克隆(Lonberg，N.等(1994)，Supra；Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 11349-101中的綜述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immun01.Vol.1365-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546)。HuMab小鼠的制備在下面II部分以及下列文獻中詳細描述Taylor，L.等(1992)Nucleic AcidsResearch206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBOJ.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 11349-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，所有上述文獻的全部內容在此引入作為參考。進一步參見lonberg和Kay，以及GenpharmInternational的美國專利No.5,545,806和5,625,825；Surani等的美國專利No.5,545,807；國際公布號WO 98/24884,1998年6月11日公布；WO94/25585，1994年11月10日公布；WO 92/03918，1992年3月19日公布；所有這些公開在此全部引入作為參考。另外，實施例2中所述的HCO12轉基因小鼠可用于產生全人單克隆抗體。
如Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1986)Nature Biotechnology14845-851以及WO98/24884中所述，為了生產全人單克隆抗體，用純化的或富含所要求的免疫原的制劑，和/或表達該所要求的免疫原的細胞對小鼠免疫接種。優(yōu)選該小鼠的年齡按首次輸注日算為6-16周。例如，純化的或富含HER2/neu抗原的制劑(5-20μg)可用于小鼠腹膜內免疫接種。在用純化或富含HER2/neu抗原免疫接種后未產生抗體的情況下，也可用表達HER2/neu的細胞，例如腫瘤細胞系，對小鼠免疫接種，以促進其免疫應答。
使用各種抗原的累積經驗表明，用以下方法免疫接種，HuMAb轉基因小鼠的應答最好，即初始先用包含在福氏完全佐劑中的抗原對小鼠腹膜免疫接種(IP)，隨后每隔一周用包含在福氏完全佐劑中的抗原IP免疫接種(直至總數為6次)。該免疫應答可用血漿樣品在免疫接種的全過程進行監(jiān)測，所用血漿樣品由眼眶后血獲得。用ELISA對血漿進行篩選(如下所述)，具有足夠滴度的抗所需免疫原的人免疫球蛋白的小鼠可用作融合體。小鼠可用抗原通過靜脈刺激3天，然后將其處死，取出脾臟。每種抗原要求做2-3個融合體。每種抗原免疫接種六只小鼠。例如，共免疫接種12只HC07和HC012株系的HuMAb小鼠。
隨后將鼠的脾細胞分離出來，用PEG按照標準方案將其與鼠骨髓瘤細胞融合。然后對所得的雜交瘤進行篩選，用于生產抗原特異的抗體。例如，用50％的PEG，將免疫小鼠脾淋巴細胞的單細胞懸浮物與其1/6數量的不分泌P3×63-Ag8.563的鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)融合。將細胞按約2×105的量涂于平底微滴定板上，隨后在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)二星期，該選擇性培養(yǎng)基含有20％的胎克隆血清，18％“653”調節(jié)的培養(yǎng)基，5％origen(IGEN)，4mML-谷氨酸，1mML-谷氨酸，1mM丙酮酸鈉，5mM HEPES，0.055mM2-巰基乙醇，50μ/ml青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和1XHAT(Sigma；該HAT在融合24小時后加入)。2星期后，將細胞在用HT代替HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用ELISA對每個孔進行篩選，選出抗所要求的免疫原的人單克隆IgM和IgG抗體。一旦出現雜交瘤大面積生長的狀況時，通常在10-14天后檢查培養(yǎng)基。替換分泌抗體的雜交瘤，再篩選，如果對抗所要求的免疫原的人IgG單克隆抗體仍為陽性，則可用有限稀釋法至少亞克隆二次。然后將穩(wěn)定的亞克隆在體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)基中產生少量的抗體用作鑒定。
為了鑒定人單克隆抗體的結合，可對免疫小鼠的血清進行測定，例如用ELISA。簡略來說，用所要求的免疫原(純化的)覆蓋微孔滴定板，該免疫原用PBS配制，約0.25μg/ml，然后用5％溶于PBS的牛血清蛋白封閉上述微孔滴定板。將稀釋的小鼠血清加入每個孔內，該小鼠已用所要求的免疫原免疫接種，并在37℃下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌該板，然后用偶聯堿性磷酸酶的羊抗人IgGFc特導的多克隆試劑在37℃下溫育1小時。洗滌后，該板用pNpp底物(1mg/ml)顯色，并在OD405-650分析。優(yōu)選顯示出最高滴度的小鼠用作融合體。
上述ELISA分析也可用于篩選與所要求的免疫原呈陽性反應的雜交瘤。與所要求的免疫原以高的抗體親抗原性結合的雜交瘤可以亞克隆，并進一步鑒定。從每種保留其親本細胞反應性的(用ELISA法)雜交瘤中選出一個克隆，用來制備5-10管細胞庫，貯存于-140℃，用于抗體純化。
抗所要求的免疫原的人單克隆抗體可按下法純化，即將選出的雜交瘤在2升的旋轉燒瓶中生長，以純化單克隆抗體。上清液可經過濾和濃縮后，用蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)親和層析。洗脫的IgG可用凝膠電泳和高效液相層析檢測，以保證其純度。緩沖液可經交換成為PBS，通過OD280的測定，用1.43的消光系數可確定該單克隆抗體的濃度。該單克隆抗體可分成數份并貯存于-80℃下。
為了確定所選擇的人單克隆抗體是否與所要求的免疫原的獨特表位結合，可用市售的試劑(Pierce，RockFcrd，IL)將每種抗體生物素化。用ELISA板進行非標記的單克隆抗體和生物素化抗體的競爭性研究，該板如上所述，覆蓋了所要求的免疫原。生物素化mAb的結合可以用鏈霉親和素-堿性磷酸酶探針檢測。
為了確定純化的抗體的同種型，可進行同種型的ELISA。微滴定板的孔覆蓋以10μg/ml的抗人Ig，在4℃下放置過夜。用5％BSA封閉后，使該板與10μg/ml的單克隆抗體或純化的同種型對照在常溫下反應2小時。然后使該孔與人IgG1或人IgM特導的堿性磷酸酶偶聯探針反應。再如上所述將板顯色并進行分析。
為了證實單克隆抗體與活細胞的結合，該活細胞表達所要求的免疫原，例如腫瘤細胞受體，可以采用流式細胞計量法。簡要來說，將表達所要求的免疫原的細胞系(在標準的生長條件下生長)與不同濃度的單克隆抗體混合，并在37℃下溫育1小時，該單克隆抗體溶于含有0.1％Tween 80和20％鼠血清的PBS中。經洗滌后，將該細胞與熒光素標記的抗人IgG抗體反應，反應條件與第一抗體染色的條件相同。樣品可用利用光及其側向散射性質的FACScan儀器分析。除了用流式細胞計量法分析以外另一種方法是用熒光顯微鏡進行分析。細胞完全按上述方法染色，并用熒光顯微鏡檢查。該方法可看得見單個細胞，但降低了依賴于抗原濃度的靈敏度與所要求的免疫原結合的人IgGs可用Western印跡法進一步測試其與所要求的免疫原的反應性。簡要地說，由表達所要求免疫原的細胞制備細胞提取物，然后進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉移至硝酸纖維素膜上，用20％鼠血清封閉，然后用被測的單克隆抗體探測。采用抗人IgG堿性磷酸酶，并用BCIP/NBT底物片劑顯色，可檢測到人IgG的結合。
多特異分子的治療用途根據多特異分子與FcR的結合能力，該FcR載有免疫細胞和特定的靶細胞，特定的多特異分子可施予治療對象，以治療或預防各種疾病或改善健康狀況，其中包括癌(例如乳癌、卵巢癌、小細胞肺癌)、病原體感染(例如，病毒(如HIV))、原生動物(如鼠弓形體)、真菌(如念珠菌病)、自身免疫性(例如，免疫性血小板減少紫癜和系統(tǒng)性狼瘡)。該多特異分子也可通過接種疫苗施入治療對象體內，以抵抗靶細胞的感染。
對于在治療方面的應用，可以用任何方式將有效量的合適的多特異分子對治療對象給藥，這方式可使該分子實施其預想的治療效果。優(yōu)選的給藥方式包括口服和經皮給藥(例如通過斑點給藥)。其他給藥方式的例子包括注射(皮下、靜脈、非腸道的、腹膜內、鞘內的等)。該注射可以是分次的，也可以連續(xù)輸注。
多特異分子可以與藥用載體一起同時給藥。此處所用的短語(藥用載體)是指包括能與多特異分子一起給藥，并使該分子實施其預期的功能的物質。這類載體的例子包括溶液、溶劑，分散介質、滯留劑、乳化劑等。這種介質用作藥物的活性物質在本領域是眾所周知的。任何其他適合于與該分子一起使用的常規(guī)用載體都在本發(fā)明的范圍內。
術語多特異分子的“有效量”是指必需或足以識別所需的生物效應的量。例如，對于有效量的多特異分子，其中抗靶部分識別病原體細胞，該有效量是消除腫瘤、癌或細菌、病毒或真菌感染所必需的量。對任何特定應用，其有效量可以不同，它取決于以下的因素，例如被治療的疾病或治療對象的健康狀況；用于給藥的特定的多特異分子；治療對象的體重；或疾病的或健康狀況嚴重性。本領域的一種普通技術是從經驗上確定特定多特異分子的有效量，而無需過多的試驗。
以下的實施例對下面的發(fā)明作進一步的闡述，但不會構成更多的限制。本申請所列舉的所有參考文獻、正在申請中的專利和公布的專利的內容，在此特意引入，作為參考。實施例實施例1包含對Fc受體特異的鼠或人源化抗體和抗-her 2 neu抗體的雙特異性抗體的生產單克隆抗體抗FcγRI單克隆抗體(mAb)M22、M32.2和197用離子交換層析和DZ33從雜交瘤血清中提純，人抗HIV-1 IgG1 mAb用蛋白A親和層析法(Pharmacia，Piscataway，NJ)和凝膠過濾從雜交瘤上清中提純。M32.2于1987年7月1日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852，并已被指定ATCC登記號HB9469。
細胞系鼠雜交瘤NSO(ECACC 85110503)為非Ig合成系，并用于重組mAbs的表達。NSO細胞在DMEM加10％牛胎兒血清(FBS，Gibco，Paisley，U.K)中培養(yǎng)。SKBR-3為HER2/neu原癌基因(ATCC，Rockville，MD)高表達的人乳癌細胞系，并在Iscove改良的Dulbecco的培養(yǎng)基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中培養(yǎng)。U937為表達FcγRI的單核細胞系，從ATCC獲得，并在RPM-1640加10％FBS(Gibco，Grand Island，N Y)中生長。
鼠免疫球蛋白區(qū)V基因的克隆鼠雜交瘤22胞質RNA按Favaloro等所述的方法制備(Favaloro，J.，R.Treisman和R.Kamen(1982)多瘤特異的RNA轉錄圖譜二向S1凝膠圖譜分析。酶學方法65718)。IgV區(qū)的cDNA由RNA通過反轉錄制備，起始引物為CGlFOR和CK2FOR，制備方法如國際專利申請公布號WO 94/10332中所述，該專利題為人單核吞噬細胞上免疫球蛋白Fc受體的人源化抗體。上述cDNA在標準條件下，用100 U MMLV反轉錄酶(Life Technologies，Paisley，UK)合成。用PCR擴增該VH和VкcDNA，(Orlandi，R.，D.H.Güssow，P.T.Jones和G.Winter(1989)(用聚合物鏈反應克隆用于表達的免疫球蛋白可變域)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833)，所用的cDNA引物與國際專利申請公布號WO 94/10332中所述的SH2BACK和VK7BACK一致。將擴增所得的DNA純化，克隆到M13中，并用T7 DNA聚合酶(Pharmacia，Piscataway，NJ)由雙脫氧法進行序列分析。
嵌合抗體基因的構建為了便于將鼠的V區(qū)DNA克隆到表達載體中，可將限制性位點置于與M22 V區(qū)基因末端最靠近之處。對于VH，可用引物VHlBACK和VHlFOR(Id.)通過PCR，在克隆的鼠VH基因的5′端和3′端分別引入PstI位點和BstEII位點。對于Vκ，可用引物VKlBACK和VKlFOR(Id.)通過PCR，將Pvu II位點和Bg lII位點分別引入克隆的鼠Vκ基因的5′端和3′端。在某些例子中，這些引物與天然存在的基因相比，改變了一個或一個以上的氨基酸。用合適的內切酶將這些V區(qū)基因(ChVH和ChVK)切下，并克隆到含有Ig啟動子、信號肽和剪接位點的M13VHPCR1和M13VKPCR1(Id.)中。從M13中切出HindIII-BamHI DNA片段并克隆到表達載體pSVgpt和pSVhyg中，該表達載體含有人IgGl，(Takahashi，N.等，(1982)，人免疫球蛋白γ基因的結構基因家族進化的意義，Cell，29671)，以及人kappa恒定區(qū)基因組DNA(Hieter，R.A.等，(1980)克隆的人和鼠kappa免疫球蛋白恒定區(qū)和區(qū)基因功能區(qū)的保守同源性，Cell 22197)。
人源化抗體基因的構建按照NEWM(Poljak，R.J等，人雜交瘤免疫球蛋白(IgG New)，Biochemistry，163412)，和KOL(Marquat，M.等，(1980)完整免疫球蛋白分子Kol及其抗原結合片段在3.0A和1.9A分辨率的晶體學精修和原子模型，J.Mol.Biol.141369)的人VHs，構建了二條人源化的重鏈。人源化的輕鏈來源于人的Bence-Jones蛋白REI，(Epp，O.等，(1974)由Bence-Jonce蛋白REI可變部分組成的二聚體的晶體和分子結構，Eur.J.Biochem.45513)，其中某些構架區(qū)(FR)有所改變。該修飾使Vκ功能區(qū)成為更典型的人亞組I，該修飾包括用39位的賴氨酸、104位的纈氨酸、105位的谷氨酸和107位的賴氨酸取代39位的蘇氨酸、104位的亮氨酸、105位的谷氨酰胺和107位的賴氨酸。此外4位的甲硫氨酸改變?yōu)?位的亮氨酸，以適應成為PvuII限制性位點的需要。
將含有NEWM VH和REIVκFR的DNA分別連同無關的CDR克隆到載體M13VHPCR1和M13VKPCR1中(Favaloro等，Supra)。用編碼KOL FR氨基酸的寡脫氧核糖核苷酸和無關的CDR，通過連續(xù)的一系列PCR，構建編碼KOL VH的DNA。然后將此構建物克隆到M13VHPCR1中。
合成用于編碼mAB M22 CDR的寡脫氧核糖核苷酸，其兩側是與人FR相應的核苷酸。對人源化的NEWM VH，該合成引物包括鼠FR氨基酸的27位苯丙氨酸、28位異亮氨酸和71位精氨酸，因為這些氨基酸可能影響抗原的結合，(Chothia，C.和A.M.Lesk(1987)，免疫球蛋白高變區(qū)的規(guī)范結構，J.Mol.Biol.，196901；Tramontano，A.等，(1990)，構架殘基71是免疫球蛋白VH功能區(qū)中第二高變區(qū)的位置和構象的主要決定簇，J.Mol.Biol.，215175)。對人源化的Vκ，同樣包括鼠氨基酸的71位苯氨酸作為能影響親和性的殘基，(Foote，J.和G.Winter，(1992)，影響高變環(huán)的構象的抗體構架殘基，J.Mol.Biol.224487)。KOL VH中不包含鼠FR殘基。將寡脫氧核糖核苷酸的5′端磷酸化，并在含有M13單鏈DNA模板的反應中和M13通用正向引物一起與克隆在M13中的人V區(qū)基因退火，用2.5U T7 DNA聚合酶(United States Biochemicals，Cleveland，OH)和0.5U T4 DNA連接酶(Gibco BRL，Grand Island，NY)使DNA延伸和連接。該突變的鏈優(yōu)選用M13反向測序引物，用1U VentDNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)從延伸/連接混合物中擴增，然后用M13正向和反向引物，通過PCR擴增。用BamH1和HindIII切下產生的DNA，克隆到M13中，并通過DNA序列分析鑒定三種CDR-移植的突變體。對含有人源化V區(qū)的M13克隆進行全面的序列分析，以確定無假的突變體存在。用Hind III和BamH I從符合要求的克隆中切下RF DNA，克隆到pSVgpt或pSVhyg中，并確切按照構建嵌合抗體基因方法所述加入人的IgG1或人的kappa恒定區(qū)。
重組mAbs的表達和純化重鏈(5μg)和輕鏈(10μg)表達載體用PvuI消化、乙醇沉淀并溶于50μl水中。離心收集NSO細胞(1-2×107)，重懸于0.5ml DMEM中，并在0.4cm的電穿孔杯中與上述DNA混合。5分鐘后，將細胞置于冰上，并對其施加170V，960μF的單脈沖(GenePulser，Bio-Rad，Melville，NY)，然后在冰上再保溫15分鐘。讓細胞在DMEM中恢復24-48小時。在培養(yǎng)基中加入霉酚酸(0.8μg/ml)和黃嘌呤(250μg/ml)，使其成為選擇性培養(yǎng)基。將細胞按每份200ul分到96孔板中。再過10-12天后，根據ELISA測定，從上述孔中選出抗體水平最高的細胞，然后用有限稀釋法進行克隆。
用蛋白A親和層析(Boehringer Mannheim，Lewes，U.K.)從生長茂盛的培養(yǎng)物中純化抗體。測定A280nm，確定其濃度，并用ELISA和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步證實。
用ELISA測定抗體的結合用溶于50mM、pH9.6碳酸氫鹽緩沖液中的羊抗-人IgM抗體(Sera-Lab，Crawley Down，U.K.)覆蓋微滴定板的孔，然后用1％BSA將該板封閉，隨后加入可溶的融合蛋白，該融合蛋白含有從短暫轉染的COS細胞(該表達載體由Dr.Brian Seed惠贈，Massachusetts GeneralHospital，Boston，MA)得到的人Fcγ RI和人IgM重鏈(sFcγ RI-μ)的胞外區(qū)。然后在過量的(2.2μg/孔)人IgG1抗體(Sigma，St.Louis，MO)存在下，加入重組的22或對照mAbs，該人IgG1抗體含有λ輕鏈，用來通過其Fc部分封閉被測mAbs的非特異結合。隨后用過氧化物酶標記的羊抗人kappa鏈抗體(SeraLab，Crawley Down，U.K.)和對苯二胺檢測結合的22mAbs。
抗體的熒光化反應加入0.1M Na2CO3將mAb溶液的pH調至9.3。異硫氰酸熒光素(FITC)(Sigma，St.Louis，MO)按2mg/ml的濃度溶于DMSO中。FITC按每μg mAb 40μg的量加入，并在室溫下保溫2小時，然后用G-25層析將熒光化的mAb與游離的FITC分離。
血細胞的制備由肝素化的全靜脈血制備黃色層。全血用含有5％右旋糖酐的RPMI按2.5∶1(v/v)的比例稀釋。在冰上使紅細胞沉降45分鐘，然后將上清細胞轉移至新的管中，并離心沉淀。殘留的紅細胞通過低滲裂解除去。其余的淋巴細胞、單核細胞和嗜中性白細胞置于冰上，備作結合分析之用。對于某些實驗，嗜中性白細胞用Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分離與單核細胞分離。為了正調節(jié)FcγRI，嗜中性白細胞和單核細胞用細胞因子處理。單核細胞的培養(yǎng)物在37℃、5％CO2下保溫48小時，培養(yǎng)物置于特氟隆培養(yǎng)皿內培養(yǎng)，其細胞含量為4×106細胞/ml RPMI，該RPMI含有2.5％AB型正常人血清(Sigma，St.Louis，MO)和500IRU/ml的IFN-γ((R & D Systems，Minneapolis，MN)。嗜中性白細胞在含有50ng/ml的G-CSF(由R.Repp，U.Of Erlanger，Germany惠贈)和500IRU/ml的IFN-γ的AIMV培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)中培養(yǎng)48小時(37℃，5％CO2)。
流式細胞計量細胞結合分析如前所述用96孔微量滴定板進行，(Guyre，P.M.等，結合在FcγR上不同表位的單克隆抗體能夠引發(fā)受體功能。J.Jmmunol.，1431650)。簡而言之，將細胞用pH7.4，含有2mg/ml BSA和0.05％NaN3(PBA)的PBS洗滌，并用PBA調至2.0×107個細胞/ml。用PBA制備FITC標記的、未結合的抗體。將細胞(25μl)、抗體(25μl)和人血清(25μl)，或人IgG(10mg/ml，Sigma，St.Louis，MO)(25μl)，或PBA(25μl)加到微孔滴定板上，并在冰上放置45-60分鐘。用PBA將細胞洗滌3次，除去孔中的未結合抗體。該細胞用1％的低聚甲醛固定。在Becton Dickinson FACScan上分析細胞結合的熒光。
BsAb偶聯步驟BsAb用Glennie等的方法構建，(Glennie，M.J.等，(1987)，含有硫醚鍵合Fab′γ片段的雙特異性F(ab′γ)2抗體的制備和性能，J.Immunol.，1392367)。mAbs 22(人和人源化的)和520C9(抗-HER2/neu)抗體用體外培養(yǎng)各自的雜交瘤細胞的方法生產。該抗體分別用胃蛋白酶消化，產生F(ab′)2，隨后加入10mM巰基乙醇胺，30℃下處理30分鐘后將其還原為Fab′。將此Fab′加到Sephadex G-25柱上(4℃)，該柱已用pH5.3、含0.5mM EDTA的50mM醋酸鈉平衡。在M22×520CP的場合，將溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷卻的鄰苯二馬來酰亞胺(o-PDM，12mM)加(一半體積)到鼠的22 Fab′中；在H22×520C9的場合，將上述同樣的O-PDM加到520C9 Fab′中，然后在冰上保溫30分鐘。然后用在pH5.3，含0.5mM EDTA的50mM醋酸鈉中平衡的Sephadex G-25柱將Fab′-馬來酰亞胺與游離的o-PDM分離(4℃)。對于BsAb的制備，可將M22 Fab′-馬來酰亞胺按摩爾比為1∶1加到520C9Fab′中，或將520C9 Fab′-馬來酰亞胺按摩爾比為1∶1加入H22 Fab′中。將反應物在Amicon chamber中用Diaflo膜在氮氣氛下濃縮至原始體積(在4℃下)。18小時后，用1M Tris-HCl，pH8.0將pH調至8.0。然后用10mM MEA將混合物還原(30分鐘，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用PBS平衡的Superdex 200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱將雙特異性的F(ab′)2與未反應的Fab′分離。
依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)HER2/neu高表達的人乳癌細胞SKBR-3用作靶細胞，被細胞因子激活的嗜中性白細胞所裂解(參見血細胞的制備)。靶細胞用100μCi51Cr標記1小時，然后在U形底的微量滴定板中與嗜中性白細胞和抗體結合。在37℃下保溫5小時后，收集上清并作放射性分析。細胞毒性按以下公式計算裂解％＝(實驗的CPM-靶泄漏的CPM/洗滌劑裂解的CPM-靶泄漏的CPM)×100％。特異裂解＝有抗體的裂解％-無抗體的裂解％。用三份重復樣品進行分析。
過氧化物誘導U937細胞用于測定H22通過FcγRI引發(fā)過氧化物爆發(fā)集落的能力，(Pfefferkorn，L.C.和G.R.Yeaman(1994)，IgA-Fc受體(Fc×R)與FcεRIγ2亞單位在U937細胞中的結合，J.Immunol.1533228；Hallet，H.B.和A.K.Campbell(1983)，多形核白細胞中刺激產生氧自由基的兩種不同機制，Biochem J.216459)。U937細胞在100U/ml的IFN-γ(Genentech，S.San Francisco，CA)存在下，在含10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI-1640(Gibco，Grand Island，NY)中培養(yǎng)5天，以誘導分化并增加FcγRI的表達。實驗結束后，將這些分化的細胞在含10％FBS的新鮮RPMI-1640中37℃下溫育20分鐘。然后將細胞沉淀，并按3×106個細胞/ml的濃度重懸于PBS中，該PBS添加了1mM CaCl2，1mMMgCl2，11mM葡萄糖，和100μg/ml BSA(Sigma，St.Louis，MO)。為了引發(fā)過氧化物的釋放，將100μl的細胞加入含有0.1mM魯米諾(Sigma，St.Louis，MO)、0.5mM釩酸鈉(Sigma，St.Louis，MO)、以及mAb M22、H22或197的反應溶液中，并將其置于22℃下的發(fā)光計中。自細胞加入發(fā)光計中的反應溶液后，立即開始每隔30至40秒測量一次自發(fā)產生的過氧化物。每種mAb所用的濃度均為10μg/ml，以比較FcγRI與M22、H22或197交聯所引發(fā)的過氧化物。對以mV/sec表示的過氧化物的產生監(jiān)測20分鐘，MAb M22、M32.2和197以不同的濃度加入，以確定過氧化物產生的劑量效應性。結果鼠Ig V區(qū)基因由M22雜交瘤RNA，采用對鼠的重鏈和kappa恒定區(qū)特異的引物制備Ig V區(qū)的cDNA，并根據已知的成熟V區(qū)的信號和/或5′端序列，采用另外一系列引物，通過PCR將上述cDNA擴增。組合使用SH2BACK/CG1FOR和VK7BACK/CK2FOR引物，得到預期大小的VH和VγPCR產物。將擴增的DNA用合適的內切酶消化，克隆到M13中，并從至少24個分別的克隆中確定二種不同方向的序列。推導的氨基酸序列示出在SEQ.ID Nos.29和30中。Vγ的4個N末端殘基可由VKBACK引物編碼。
M22 VH和Vκ分別是鼠重鏈亞組IIID和kappa亞組I的成員(Kabat，E.A.等，(1991)，免疫學重要蛋白的序列，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services)。除了在L97的殘基以外，M22 Vκ的氨基酸序列與鼠抗IgG mAb A17的氨基酸序列相同(Shlomchik，M.等，鼠IgM抗IgG單克隆自身抗體(類風濕因子)的可變區(qū)序列。II由脂多糖刺激與由次生蛋白免疫所得hybridonias的比較，J.Exp.Med.165970)。
人源化的mAbs及其結合的起始特性M22 VHFR與KOL(人亞組III)的同源性(79％)大于與NEWM(人亞組II)的同源性(57％)。為了了解該差別對結合可能產生的影響，根據NEWM VH或KOLVH構建了重鏈，NEWM VH包括鼠的27位苯丙氨酸、28位異亮氨酸和71位精氨酸殘基，后者KOL VH不含鼠的FR氨基酸。兩種人源化的VH均與同一種來源于REI的人源化輕鏈配合。
人源化mAb的親和力先通過ELISA測定其與FcγRI/IgM重鏈融合蛋白的結合來確定。該數據表明KOL VH/REI VκmAb與嵌合的mAb的結合力相同，而NEWM VH/REI VκmAb表現出比嵌合的mAb低約5倍的親和力。非特異人IgG1 mAb的低結合力表明，＞95％的人源化mAbs的結合是通過Fv部分實現的，而不是通過Fc區(qū)結合。
對NEWM FR作其他的改變預期會恢復其親和力，但這種改變會產生新的表位，這些新的表位可能會引起不希望有的免疫應答。因此，選擇KOL VH/REI VκmAb，命名為H22，進一步檢驗其結合特性。
mAbH22的功能特性進行了一系列的結合實驗，以確定H22抗體的特異性和同種型。被熒光素結合的M22或H22染色的外周血白細胞證明了與單核細胞的特異結合約為每個細胞104個結合位點。相反，淋巴細胞或未刺激的嗜中性白細胞只有少量或沒有特異結合(表1)表1H22與單核細胞的特異結合
a每個細胞的抗體位點，2個重復試驗的平均值為了證明H22和M22是在同一位點與FcγRI結合，同時還要證明H22也作為配體在Fc結合區(qū)結合，用兩種抗FcγRI鼠mAb(M22和M32.2)和人IgG1 mAb進行競爭性實驗。在過量的人IgG存在下，未結合的H22和M22同等地競爭結合為熒光素化的M22或熒光素化的H22。上述過量的人IgG用來飽和FcγRI上的Fc結合位點。如所預期的一樣，抗FcγRI抗體M32.2，它在FcγRI上的結合位點與M22不同(Guyre，P.M.等，J.Immunol.1431650)，也不能與M22-FITC競爭。此外，H22-FITC受H22的抑制，而不受無關系的人IgG1 mAb所抑制證實了FcγRI通過H22的V區(qū)結合的特異性。
H22，但不是M22，通過熒光素化的人IgG1，可以競爭Fc介導的與FcγRI的結合。該實驗證明，H22而不是M22的Fc部分，結合到FcγRI的Fc結合區(qū)上。該結果與人IgG1抗體，而不是鼠IgG1，的Fc部分以高親和力與FcγRI結合是一致的。
由于M22的人源化主要是為了增加其用于免疫治療的潛力，因此，在人血清存在下，測定了H22與單核細胞和細胞因子激活的嗜中性白細胞的結合能力。H22-F1TC在人血清存在或不存在的情況下，以類似的親和力結合到單核細胞上的FcγRI。與此相比，Fc介導的無關系的人IgG-FITC的結合則完全被人血清所抑制。同樣，H22-FITC以類似的親和力，在人血清存在和不存在的情況下，結合到IFN-γ-處理的嗜中性白細胞上。歸納起來說，以上數據證明，H22與FcγRI結合的途徑有兩條通過其V區(qū)結合到FcγRI的不同于Fc結合區(qū)的位點上；通過其Fc區(qū)結合到FcγRI的配體結合區(qū)上。前者的結合活性有效地克服了人IgG1的抗體封閉。
H22 BsAb的功能活性抗FcγRI抗體在免疫治療上的最早應用是BsAb的建立，BsAb將攜帶FcγRI的效應細胞連接到腫瘤細胞、病毒、或病毒感染的細胞上。這種BsAb已經用M22建立；因此，對M22抗腫瘤BsAb(520C9×m22)和相應的H22 BsAb(520C9×H22)介導細胞毒性的能力作了比較。這些BsAb含有與抗HER2/neu抗體(520C9)的Fab′化學結合的H22或M22Fab′，因此對效應細胞觸發(fā)分子FcγRI和腫瘤抗原是特異的。
M22來源的BsAb與H22來源的BsAb的比較通過ADCC分析來進行。M22和H22來源的BsAb介導殺傷HER2/neu高表達的SKBR-3細胞。鼠和人源化的BsAb均呈現類似的裂解攜帶抗原的靶細胞的水平。此外，兩種BsAb在人血清存在下能保留ADCC活性，而過量的M22 F(ab′)2會引起殺傷的完全抑制。將這些結果綜合起來考慮，可說明H22 BsAb誘導的裂解是通過M22表位介導的，同時也說明ADCC是FcγRI特異的。
最后，對H22和M22通過類似單核細胞的細胞系U937刺激過氧化物生產的能力進行評價。M22，僅通過其V區(qū)與FcγRI結合，誘導低水平的氧爆發(fā)集落，可能是由于它不能與受體有效地交聯的原因。但是，H22，它可作為配體，通過其Fc區(qū)與FcγRI結合，此外，還可作為抗體，通過其Fv區(qū)與FcγRI結合而與FcγRI交聯，因此誘導更多的過氧化物釋放。實施例2功能性H22表皮生長因子融合蛋白的制備材料和方法表達載體和克隆H22重鏈基因組克隆(pSVgpt)和輕鏈基因組克隆(pSVhyg)的表達載體如國際專利申請公布號WO94/10332中所述，其題為，人單核吞噬細胞上免疫球蛋白G Fc受體的人源化抗體。對于Fab-配體融合結構，輕鏈必須改變。而對于重鏈來說，必須除去CH2和CH3區(qū)，并用編碼該配體的序列替代。重鏈載體含有二個BamHI位點，一個在VH和CH1之間的內含子中，另一個正好在CH3的下游。利用該BamHI限制性位點，編碼恒定區(qū)的DNA可被截短的，僅編碼CH1和大部分鉸鏈區(qū)的序列所取代。為此，采用聚合酶鏈反應(PCR)，用圖1所示的改變，構建重鏈片段新的C末端。
圖1[C]所示的結構中，在克隆的限制性位點XhoI和NotI的下游與BamHI的上游之間含有翻譯終止密碼子，該BamHI位點用來克隆VH下游的由PCR產生的新的CHI片段，而圖1[C]所示的該結構用來產生融合蛋白結構?？寺∥稽c用來插入編碼EGF和其他配體的DNA，這些克隆位點位于大部分鉸鏈區(qū)的下游，以保留Fd和配體區(qū)之間的柔韌性。另外，保留原先結構中單個的半胱氨酸殘基，以便可通過其結合形成雙體分子。
用PCR擴增編碼該配體的DNA，并使該編碼區(qū)的N端含有XhoI位點，而在C端含有NotI位點，然后將其以合適的閱讀框在上述新構建的截短的H22重鏈片段的同樣位點插入。編碼表面生長因子(EGF)的cDNA由ATCC(#59957)獲得。僅編碼成熟EGF的53個氨基酸殘基的DNA的克隆起始于971位的天冬酰胺，終于1023位的精氨酸，該成熟的EGF取自其約1200個氨基酸殘基的前體(Bell，G.I.，Fong，N.M.，Stempien，M.M.，Wormsted，MA.，Caput，D.，Ku.L.，Urdea，M.S.，Rall，L.B.和Sanchez-Pescador，R.人表皮生長因子前體DNA序列，體外表達和基因組構。Nocl.Acids Res.148427-8466，1986)。
表達鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)為非Ig合成系，并用于表達融合蛋白。最終的表達載體pSVgpt，由編碼H22 Fd的DNA按讀碼框融合到EGF(如圖2所示)上而構建成。該表達載體用BioRad Gene Pulser通過電穿孔法轉染到NSO中，該NSO預先用含有編碼H22輕鏈的DNA的pSVhyg轉染過。這些多肽通過載體中的Ig啟動子和Ig增強子表達，并通過位于該結構N端的mAb 22重鏈信號肽分泌。轉染1或2天后，將霉酚酸和黃嘌呤加入培養(yǎng)基中，以選擇吸收了該DNA的細胞。經ELISA證實其結合活性后，分離出單個生長的克隆并再亞克隆。
純化將表達H22-EGF融合蛋白的細胞亞克隆并擴充。將表達融合蛋白的克隆擴充并在旋轉培養(yǎng)物中生長，然后將上清液澄清并濃縮。小規(guī)模的純化采用親和層析法在抗人Kappa鏈親和柱(Sterogene.Carls bad，CA)中進行。純化的蛋白用SDS-PAGE在5-15％的丙烯酰胺梯度凝膠上，在非還原的條件下分析。圖3為制備抗Fc受體-配體融合蛋白的圖示。
雙特異的流式細胞計量法為說明該融合蛋白能夠同時與FcγRI和EGFR結合，建立了流式細胞分析法(圖4)。在該分析中，不同濃度的H22-EGF融合蛋白，或雙特異抗體BsAb H447(H22×H425，鼠單克隆抗體M425的人源化形式，它在配體結合位點與EGFR結合(E.Merck))與A431細胞溫育，該細胞為表達EGF受體(EGFR)的細胞系(ATCC，Rockville，MD)。洗滌后，加入含有融合蛋白的上清液，該融合蛋白包括FcγRI的胞外區(qū)和人IgM的Fc部分。最后，加入藻紅蛋白(PE)標記的mAb(32.2)，mAb(32.2)與FcγRI結合位點和mAb22與FcγRI的結合位點不同。該細胞然后用FACSAN分析。另一種方法是用過量的(100μg/ml)全鼠mAb 425(E.Merck)封閉EGFR的結合，然后用PE標記的抗人IgG檢測BsAb或融合蛋白的結合。
ADCC融合蛋白介導的ADCC用51Cr殺傷分析來測定。EGFR高表達細胞系，A431，用作人單核細胞裂解的靶細胞，該單核細胞在γ-干擾素(IFN-γ)中培養(yǎng)了24小時。靶細胞用100μCi的51Cr標記1小時，然后與效應細胞和抗體在U型底的微量滴定板中混合。在37℃溫育5小時后，收集上清液并分析其放射性活度。細胞毒性按以下公式計算裂解％＝(實驗的CPM-靶泄漏的CPM/洗滌劑裂解的CPM-靶泄漏的CPM)×100％。特異裂解＝有抗體的裂解％/無抗體的裂解％。比較了融合蛋白與其各自的BsAb介導ADCC的能力。該分析還在25％人血清存在下進行，以證明人血清中的IgG或其他因子不會抑制融合蛋白介導的ADCC。結果純化用H22-EGF重鏈結構轉染表達H22 Kappa鏈的NSO細胞，選擇抗霉酚酸和黃嘌呤的克隆并將其擴充，取其上清液在抗人Kappa柱(Sterogene，Carlsbad，CA)上經親和純化得到融合蛋白。用SDS-PAGE分析該純化的蛋白，純化蛋白遷移至表觀分子量為50-55kDa的位置，表明該融合蛋白是以單體的形式表達，而不是二硫鍵結合的雙體。此外，在表觀分子量為25kDa之處可觀察到一條帶，有可能是游離的輕鏈。
結合特異性設計了雙特異FACS分析法，以證明該融合蛋白可同時與FcγRI和EGFR結合。圖5表明，化學連接的全人源化BsAb H447(H22(抗FcγRI)×H425)和H22-EGF融合蛋白均以劑量依賴的方式，與A431細胞上的EGFR和可溶的FcγRI同時結合，其中全人源化BsAb H447按下面實施例3所述制備。
融合蛋白對EGFR的特異性可由鼠mAb，M425的能力來證明，該能力是指鼠mAb，M425在配體結合位點與EGFR結合，從而抑制了融合蛋白或H22×H425的結合。將不同濃度的BsAb H447，或H22-EGF融合蛋白，在過量的M425存在或不存在的條件下，與A431細胞溫育。圖6表明，BsAb以及該融合蛋白與EGFR的結合均被M425所抑制，證明了融合蛋白對EGFR的特異性。
ADCC用A431細胞作為靶細胞，分析融合蛋白介導ADCC的能力。在IFN-γ存在下培養(yǎng)24小時的人單核細胞用作效應分子。圖7證明全抗體、H425、BsAb H447(H22×H425)和融合蛋白介導A431細胞的劑量依賴的裂解。圖8證明，盡管全抗體介導的ADCC被25％人血清(25％HS)所抑制，但人血清并不抑制融合蛋白介導的ADCC，而且，在此特定的實施例中，人血清增強了融合蛋白介導的ADCC。由于證明了融合蛋白能殺傷EGFR高表達的細胞，甚至在會存在于體內的表達FcγRI的效應細胞存在下，亦是如此，因此上述的結果有助于這些分子在臨床上的應用。
H22-EGF融合蛋白的生長抑制性質雖然EGF可刺激表達其受體的正常細胞的生長，但EGF也能抑制高表達EGF-R的腫瘤細胞的生長(Barnes，D.W.(1982)J.Cell Biol.931，MacLeod，C.L.等(1986)J.Cell.Physiol.127175)。EGF和H22-EGF融合蛋白抑制A431細胞生長的能力按以下方法檢測。
將2×104的A431細胞加入六孔板中的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基或含不同濃度的EGF、H22-EGF、H22的Fab片段，或H425的F(ab′)2片段的培養(yǎng)基。7天后用血球計數器計數活細胞。該分析用二個重復樣品進行，結果用平均值+/-標準偏差表示。
結果如圖9所示。這些結果表明EGF和H22-EGF以劑量依賴的方式明顯抑制了細胞的生長。相反，H425的F(ab′)2片段僅在高濃度時有一些抑制活性，而H22的Fab片段沒有生長抑制活性。
由此，H22-EGF能夠同時與FcγRI和EGF結合，說明了該分子已正確地折疊，并保留其同時與兩種受體結合所需的柔韌性。此外，H22-EGF抑制表達EGF-R的瘤細胞系，A431，的增殖，說明與EGF類似，H22-EGF融合蛋白能夠通過EGF-R給出信號。H22-EGF在表達FcγRI效應細胞存在下，也介導A431細胞的有效殺傷。因此，H22-EGF在表達EGF-R的細胞上介導細胞毒性和細胞靜止效應。對有腫瘤的治療對象施用H22-EGF可征集體內的天然細胞毒性效應細胞，從而通過三種可能的不同的模式-細胞毒性、生長抑制和吞噬作用介導腫瘤細胞的殺傷。而且，除了細胞介導的腫瘤細胞的細胞毒性之外，H22-EGF征集的效應細胞也可通過分泌炎癥細胞因子，和/或加工和遞呈腫瘤抗原到腫瘤特異的T細胞，從而進一步增大抗腫瘤的免疫力。實施例3H22-Heregulin(H22-gp30)融合蛋白介導腫瘤細胞的殺傷Heregulin(HRG)是HER3和HER4的配體。這兩種受體均可與HER2形成異源雙體，即一種在某些乳腺癌細胞中表達的分子。當HER3和HER4分子與HER2形成異源雙體時，HRG對HER3和HER4的親和力明顯增加。該實施例證明，在攜帶FcγRI的細胞毒性效應細胞存在下，含有heregulin和FcγRI結合特異性的雙特異分子可抑制腫瘤細胞的生長，并介導這些腫瘤細胞的融合蛋白依賴的細胞毒性。
H22-heregulin融合蛋白的構建方法與實施例2中所述的H22-EGF融合蛋白相同。簡要來說，編碼人抗FcγRI mAb，H22的Fd片段的基因組DNA與編碼β2形式HRG的EGF區(qū)的cDNA融合。H22-HRG融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO4)如圖10所示。此融合蛋白含有heregulin β2的171-239位氨基酸，該氨基酸在專利號為5,367,060的美國專利中示出。heregulin的其他部分，以及其他heregulin分子的部分，例如在專利號為5,367,060的美國專利中公開的部分都可采用。將所產生的H22Fd-HRG表達載體轉染到骨髓瘤細胞系中，然后再用含有編碼H22 kappa輕鏈DNA的載體轉染。所產生的融合蛋白主要以單體的形式表達，盡管該蛋白在H22 Fab組分的鉸鏈區(qū)含有游離的半胱氨酸殘基。流式細胞計量分析表明，這種融合蛋白能與HER2高表達的腫瘤細胞系，SKBR-3，以及FcγRI表達細胞結合。
為測試H22Fd-HRG融合蛋白的生物活性，取表達該融合蛋白的骨髓細胞上清，稀釋3倍或30倍，在IFN-處理的單核細胞存在下，將其加入PC-3細胞或表達HER2、HER3和HER4的SKBR-3腫瘤細胞中，單核細胞與靶腫瘤細胞比為100∶1。按實施例2中所述，單核細胞用IFN-γ處理，靶細胞用51Cr標記。特異裂解％按實施例2中說明的公式計算。結果在圖11中描述。該結果說明，在細胞與稀釋3倍的上清溫育的情況下，約有45％的SKB R3細胞和高達49％的PC-3細胞裂解。
這種融合蛋白在攜帶FcγRI的細胞毒性效應細胞存在下，抑制SKBR-3腫瘤細胞的生長，并介導該細胞的融合蛋白依賴的細胞毒性。因此，本實施例的結果表明，抗FcγRI-heregulin融合蛋白在生理條件下，可介導抗腫瘤細胞毒性的活性，并說明這種融合蛋白在治療各種癌癥中將會有治療的效用。實施例4H22-鈴蟾肽融合蛋白介導的腫瘤細胞殺傷H22-鈴蟾肽融合蛋白的構建方法類似于上述的H22-EGF融合蛋白。但是，因為鈴蟾肽是短的肽鏈(14個氨基酸殘基)，因此，將編碼鈴蟾肽正鏈和反鏈的DNA寡聚物雜交，產生該編碼區(qū)，而不用PCR技術擴增編碼鈴蟾肽的cDNA。融合到H22抗體重鏈羧基端的鈴蟾肽氨基酸序列如下所示-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly(SEQ ID NO5)該序列相當于鈴蟾肽的2-14位氨基酸(Anastasi等(1971)Experientia 27166)，并在該肽鏈的羧基端含有另一個甘氨酸殘基。該寡聚物含有搭接的末端，該末端不雜交，而是產生粘末端，N末端為XhoI位點，在C末端為NotI位點，這樣，該寡聚物就可克隆到上述的H22重鏈表達載體中。
如上述的H22-EGF和H22-heregulin融合蛋白一樣，對H22-鈴蟾肽融合蛋白在腫瘤細胞殺傷的生物活性進行研究。簡要來說，用51Cr標記攜帶鈴蟾肽受體的PC-3腫瘤細胞，并與單核細胞和不同濃度的H22-融合蛋白一起溫育，然后如以上所述，測定融合蛋白依賴的裂解。圖12所示的結果表明了靶細胞的裂解，而且靶細胞裂解水平的增加與分析中融合蛋白的加入量成比例。
另外，還生產了含有H22作為一種結合實體，以及CD4(AIDS貯藏處)或gp120(AIDS貯藏處)作為第二結合實體的融合蛋白。實施例5由修飾的人源化抗體片段生產雙特異抗體材料和方法表達載體和克隆H22重鏈基因組克隆的表達載體(pSVgpt)和輕鏈基因組克隆的表達載體(pSVhyg)如國際專利申請公布號WO94/10332中所述，其題為，人單核吞噬細胞上免疫球蛋白G Fc受體的人源化抗體。對于Fab′結構，必須改變輕鏈。而對重鏈，其CH2和CH3區(qū)必須除去，并用終止密碼子取代。重鏈載體含有二個BamHI位點，一個在VH和CH1之間的內含子中，另一個正好在CH3的下游。利用該BamHI限制性位點，編碼恒定區(qū)的DNA可被截短的、僅編碼CH1和大部分鉸鏈區(qū)的序列所取代。為此，采用聚合酶鏈反應(PCR)，用圖1所示的改變，構建重鏈片段新的C末端。圖1[B]表示為產生截短的單巰基形式所做的改變。
表達鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)為非Ig合成系并用于表達修飾的H22抗體。最終的表達載體，即含有編碼H22 Fd的DNA的pSVgpt結構，與含有編碼H22輕鏈DNA的PSVhyg結構一起用BioRad GenePulser通過電穿孔法共轉染。這些肽鏈通過載體中的Ig啟動子和Ig增強子表達，并通過位于該結構N端的mAb22重鏈信號肽分泌。轉染1或2天后，將霉酚酸和黃嘌呤加入培養(yǎng)基中，以選擇吸收了該DNA的細胞，經證實其具有FcγRI結合活性后，將單個生長的克隆分離出來并亞克隆。
純化單巰基形式的H22抗體和全H425(抗EGFR)抗體的生產方法是，體外培養(yǎng)各自轉染的NSO細胞。H425用蛋白A親和層析純化。單巰基形式的抗體H22用離子交換層析純化，先用Q-Sepharose，隨后用SP-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。單巰基形式的H22抗體的純度用SDS-PAGE確定。
雙特異抗體(BsAb)的制備BsAb用Glennie等的方法構建(Glennie，M.T.等，(1987)，雙特異F(ab′γ)2的制備和性質，含有硫醚鍵連接的Fab′γ片段，J.Jmmunol.，1392367)。H425的F(ab′γ)2在pH3.5，0.1M的檸檬酸緩沖液中，通過有限胃蛋白酶解產生，并用離子交換層析純化。在30℃下，將20mM的巰基乙醇胺加入mAbs中，使其還原30分鐘。將Fab′片段加入SephadexG-25柱，該柱預先在含0.5mM EDTA，pH5.3的50mM醋酸鈉中平衡(40℃)。將溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷卻的鄰苯二馬來酰亞胺(o-PDM，12mM)加入(一半體積)H22 Fab′中，并在冰上保溫30分鐘。然后用Sephadex G-25柱將Fab′-馬來酰亞胺與游離的o-PDM分離(4℃)，該柱預先在含0.5mM EDTA，pH5.3為50mM醋酸鈉中平衡。制備BsAb時，將H22 Fab′-馬來酰亞胺按12∶1的摩爾比加入H425 Fab′中。反應物在氮氣氛下，用Diaflo膜，在Amicon室中濃縮至起始體積(都在4℃)。18小時后，用1M Tris-HCl，pH8.0將其pH調至8.0。然后用10mMMEA使混合物還原(30分鐘，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用在PBS中平衡的Superdex 200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱將雙特異F(ab′γ)2與未反應的Fab′及其他產物分離。
雙特異流式細胞計量分析為了表明用o-PDM方法以及用DTNB方法產生的BsAb能同時結合FcγRI和EGFR，建立了流式細胞計量分析法(圖13)。在此分析中，不同濃度的兩種BsAb與A431細胞溫育，該A431細胞是表達EGF受體(EGFR)的細胞系。洗滌后，此細胞與含融合蛋白的上清液溫育，該融合蛋白含有FcγRI的胞外區(qū)和人IgM的Fc部分。最后，該細胞與FITC標記的抗人IgM-特異抗體溫育，然后用FACSCAN分析該細胞。
ADCC用51Cr殺傷分析測定BsAb介導的ADCC。EGFR高表達的細胞系，A431，用作人單核細胞裂解的靶細胞，該人單核細胞在γ干擾素中培養(yǎng)了24小時。靶用100μCi的51Cr標記1小時，然后與效應細胞和抗體在平底的微量滴定板中混合。在37℃溫育16小時后，收集上清液并分析其放射性活度。細胞毒性用以下公式計算裂解％二(實驗的CPM-靶滲漏的CPM/洗滌劑裂解的CPM-靶滲漏的CPM)×100％。抗體依賴的裂解％＝有抗體的裂解％-無抗體的裂解％。結果純化用截短的H22重鏈結構和完整的kappa鏈結構共轉化NSO細胞。選擇抗霉酚酸和黃嘌呤的克隆并擴充，先用Q-Sepharose，隨后用SP-Sepharose離子交換層析純化上清液中的蛋白。純化后的蛋白用SDS-PAGE分析。該純化的蛋白遷移在表觀分子量為50kDa的位置，表明該蛋白是以單體的形式表達，而不是二硫鍵結合的雙體。
由單巰基H22與H425的Fab′(抗EGFR)結合構成的BsAb的結構與特性由H22的單巰基與H425的Fab′片段，即人源化的抗EGFR mAb，結合，即構建成BsAb。該BsAb用o-PDM作為接頭，按照Glennie等的方法制成(Glennie，M.J.等，(1987)，雙特異F(ab′γ)2的制備和性質，含硫醚鍵連接的Fab′γ片段，J.Immunol.，1392367)。比較了該BsAb與由DTNB法制備的BsAb的活性，后者所用的Fab′片段是由完整的H22經胃蛋白酶消化和還原而得到。為了證明這些BsAb能同時結合FcγRI和EGFR，設計了雙特異FACS分析法。圖14表明o-PDM連接的BsAb和DTNB法制備的BsAb均以劑量依賴的方式，同時結合A431細胞上的EGFR和可溶的FcγRI。
用A431細胞作為靶細胞分析二種BsAbs介導ADCC的能力。在IFN-γ存在下培養(yǎng)24小時的人單核細胞用作效應細胞。圖15證明，二種BsAb以類似的方式介導A431細胞的劑量依賴裂解。這些結果證明，由截短的、單巰基形式的H22所產生的BsAb在表達FcγRI的效應細胞存在下，能殺傷EGFR高表達的細胞。實施例6三價抗體的生產材料和方法細胞系和抗體，M22，520C9，H425，SKB3和A431用離子交換層析(Pharmacia，Piscataway，NJ)從雜交瘤上清中純化M22和520C9，然后520C9用蛋白A親和層析(pharmacia，Piscataway，NJ)進一步純化。H425由雜交瘤上清液用蛋白A親和層析(pharmacia，Piscataway，NJ)純化。生產M22和520C9的雜交瘤在先前已有描述(Guyre等，(1989)結合到FcgRI上不同表位的單克隆體能觸發(fā)受體功能，J.Immunol.1435，1650-1655；Frankel等，(1985)由單克隆抗體確定的結合乳癌的抗原的組織分布，J.Biol.Response Modifiers，4273-286)。鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)是非Ig合成系，并用于表達人源化的mAb，H425(Kettleborough等，(1991)鼠單克隆抗體通過CDR移植的人源化構架區(qū)殘基對嚕噗構象的重要性，Protein Eng.，4773)。SKBR-3，(ATCC，Rockville，MD)高表達HER2/neu原癌細胞的人乳癌細胞系，和A431(ATCC，Rockville，MD)，高表達EGFR(ATCC，Rockville，MD)的人鱗狀癌細胞系，在Iscov′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM，Giboc Grand Island，NY)中培養(yǎng)。
嗜中性白細胞的制備嗜中性白細胞用菲可帕克(pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分離，從單核細胞中分離。為了正調控FcγRI，嗜中性白細胞用細胞因子進行處理。嗜中性白細胞在AIM V培養(yǎng)基中(Gibco，Grand Isand，NY)培養(yǎng)24-48小時(37℃，5％CO2)，AIM V培養(yǎng)基含有2.5％正常人AB型血清(Sigma，St.Louis，MO)，50ng/ml G-CSF(由R.Repp，惠贈，U.of Eolanger，Germany)和100 IRU/ml IFN-γ。
結合方法BsAb用Glennie等的方法(Glennie，M.J.等，(1987)，雙特異F(ab′γ)2，含硫醚鍵連接的Fab′γ片段，的制備和性質，J.Immunol.，1392367)構建。mAbs M22、520C9(抗HER2/neu，33)，和H425(抗EGFR)抗體由體外培養(yǎng)各自的雜交瘤細胞來生產。每種抗體的F(ab′)2通過在pH3.5，0.1M的檸檬酸緩沖液中的限制胃蛋白酶解而產生，該F(ab′γ)2然后通過離子交換層析純化。在M22和H425中加入20mM的巰基乙醇胺(MEA)，在30℃下處理30分鐘，使其還原為Fab′。將該Fab′加到Sephadex G-25柱中，該柱已在含0.5mM EDTA，pH5.3的50mM醋酸鈉中平衡(4℃)。將溶于二甲基甲酰胺，并在甲醇/冰浴中冷卻的鄰-苯二馬來酰亞胺(o-PDM，12mM)加入(一半體積)鼠22 Fab′中，并在冰上溫育30分鐘。然后將此Fab′-馬來酰亞胺與游離的o-PDM在Sephadex G-25柱上分離，該柱已在pH5.3，含0.5mM EDTA的50mM醋酸鈉中平衡(4℃)。BsAb的制備方法如下，將M22 Fab′-馬來酰亞胺按1∶1的摩爾比，加入H425中，反應物在氮氣氛下，用Diaflo膜在Amicon室中濃縮至原來的體積(均在4℃下進行)。18小時后，用pH8.0的1M Tris-HCl將其pH調至8.0。該混合物然后用10mM EMA還原(30分鐘，30℃)，并用25mM的碘乙酰胺烷基化。用磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡的Superdex200(pharmacia，Piscataway，NJ)柱將雙特異F(ab′)2與未反應的Fab′和其他產物分離。BsAb M22×520C9用類似的方法制備，但是要用520C9，而不是用H425。
由M22×H425×520C9組成的三特異抗體的制備分為2個階段(圖16)。在第一階段，如以上所述，M22與H425連接，產生M22×H425BsAb，但不進行最后的還原反應和烷基化反應，然后用DTNB處理該反應物，以封閉剩余的游離巰基基團，將此二價的BsAb用Superdex 200柱通過凝膠過濾純化，還原為F(ab′)2(SH)，并按1∶1的摩爾比與o-PDM處理的520C9混合。所生成的三特異F(ab)3用Superdex 200柱純化。采用TSK 3000柱(ToJo Haas，Japan)，通過HPLC大小排阻層析對該TsAb進行分析。用上述同樣的方法，可構建另一種含有m22 Fab′×32.2 Fab′×m22 Fab′的TsAb。
雙特異流式細胞計量法TsAb可同時結合EGFR和FcγRI，或同時結合HER2/neu和FcγRI。A431細胞(EGFR高表達細胞)或SKBR-3細胞(HER2/neu高表達細胞)與BsAb(M22×520C9或M22×H425)或與TsAb，M22×H425×520C9溫育。將細胞洗滌，然后與可溶的FcγRI溫育。用mAb32.2-FITC檢測可溶FcγRI的結合，mAb32.2-FITC與FcγRI的結合位點與22的結合位點不同。該細胞然后用FACSCAN分析。
ADCC用SKBR-3細胞或A431細胞作為被細胞因子激活的嗜中性白細胞裂解的靶細胞。靶用100μCi的51Cr標記1小時，然后在U形底的微量滴定板中與嗜中性白細胞和抗體混合。在37℃下溫育16小時后，收集上清，并分析其放射性活度。細胞毒性按以下公式計算裂解％＝(實驗的CPM-靶滲漏的CPM/洗滌劑裂解的CPM-靶滲漏的CPM)×100％。特異裂解＝有抗體的裂解％-無抗體的裂解％。用三個重復樣品進行分析。
FcγRI調節(jié)分析M22×32.2×M22 BsAb用作調節(jié)全血中單核細胞上的FcγRI。該分析步驟如附件的流程圖所示(參見圖23A)。圖23B表明用10μg/ml的上述BsAb處理后，FcγRI在單核細胞上的表達降低至約為BsAb處理前水平的50％。結果TsAb的構建和生化特性TsAb按圖16所描述的流程圖制備。在該方法的第一階段，M22與H425偶聯，用DTNB處理，然后用凝膠過濾純化所產生的雙特異F(ab′)2。在第二階段，將此雙特異F(ab′)2還原，并與o-PDM處理的520C9Fab′混合，產生TsAb，M22×H425×520C9。在圖17中，用圖式對此TsAb作了描述。在該圖中，Fab′-A代表M22，Fab′-B代表H425，以及Fab′-C代表520C9。
結合(BsFACS)為了證明該TsAb，M22×H425×520C9能同時結合FcγRI和HER2/neu，設計了雙特異FACS分析。該分析在圖18A中用圖式作了描述。圖19表明TsAb以劑量依賴的方式同時與SKBR-3細胞上的HER2/neu和可溶的FcγRI結合。在該分析中，BsAb，M22×H425，在寬的濃度范圍內產生可忽略的信號。為了證明該TsAb，M22×H425×520C9，可同時結合FcγRI和EGFR，設計了類似的分析方法，在此情況下，采用EGFR高表達的細胞系，A431。在圖18B中對該分析用圖式作了描述。圖20表明TsAb和BsAb，M22×H425，均以劑量依賴的方式，分別同時結合A431細胞上的EGFR和可溶的FcγRI。在該分析中，BsAb，M22×520C9，在寬的濃度范圍內產生可忽略的信號。
ADCC用SKBR-3或A431細胞作為靶細胞，分析上述TsAb介導ADCC的能力。人嗜中性白細胞在IFN-γ存在下培養(yǎng)24-28小時，G-SF用作效應細胞。圖21證明，BsAb，M22×520C9，和TsAb，M22×H425×520C9，兩者均介導SKBR-3細胞的裂解，而BsAb，M22×H425，不介導。另一方面，圖22證明，BsAb，M22×H425，介導SKBR-3細胞的裂解，而BsAb，M22×520C9不介導。這些結果證明，TsAb在表達FcγRI的效應細胞存在下，能殺傷HER2/neu和EGFR高表達的細胞。
上述三特異抗體包含M22，鼠形式的抗-FcγRI mAb。這種三特異抗體可用單巰基形式的人抗FcγRI mAb，H22構建。其唯一的區(qū)別是所分泌的單巰基形式是該抗體H22的F(ab′)2的片段。采用離子交換層析法，先用Q-Sepharose，隨后用SP-Sepharose(Parmacia，Piscataway，NJ)，從培養(yǎng)物上清液中提純出單巰基形式。只要H22的單巰基形式純化后，周此試劑產生三特異抗體的方法即與上述用M22的F(ab′)2片段的相同。
實施例7用H22-抗原融合蛋白增強的抗原遞呈本實施例證明(a)基因移植到抗FcγRI抗體恒定區(qū)上的抗原肽鏈與單獨的抗原相比，在抗原的抗原遞呈和T細胞刺激中，前者明顯更為有效，以及(b)基因移植到抗-FcγRI恒定區(qū)上的拮抗肽與單獨的拮抗肽相比，在抑制T細胞的刺激中，前者明顯更為有效。因此，這種融合蛋白會有效地增進體內肽鏈向抗原遞呈細胞(APC)的遞送，因而在各種治療方法中將會是有用的。材料和方法試劑AIMV(GIBCO，Grand Island，NY)用作培養(yǎng)基。破傷風毒素(TT)購自ACCURACTE CHEMICAL CO.(Westbury，NY)。無菌低內毒素的鼠抗FcγRI mAb 22 F(ab′)2片段，和雙特異Ab，MD×H210(由人源化的Ab22的Fab′與抗Her2/neu腫瘤Ag mAb 520C9的Fab′化學連接構成)由MEDAREX，INC供應(Annandale，NY)。TT的通用Th表位，TT830-844(QYIKANSKFIGITEL(SEQIDNO6)，以下稱為TT830)(Valmori D.等(1994)J.Immunol.1522921-29)，以及該表位的突變形式，TT833S(QYIKANSKFIGITEL(SEQID NO9)，833位的賴氨酸變?yōu)榻z氨酸)由PEPTIDOGENIC CO(Livermore，CA)合成并提純至＞95％。另一種TT的通用表位，TT947-967(FNNFTVSF WLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO12)，以下稱為TT947)，(＞80％純度)(Valmori D.同上)用作本研究中的對照肽鏈，用于靜脈注射(IVI)的市售IgG用于封閉試驗中。
細胞表達FcγRI的單核細胞系，U937，由ATCC獲得。產生CD4+，即肽TT830特異的T細胞，的方法是經改進的前述用于TT特異的T細胞系的方法(Gosselin E.J.(1992)J.Immunol.1493477-81)。簡要地說，用Ficoll Hypaque從外周血中分離出單核細胞。用10μM TT830刺激在50ml AIM V培養(yǎng)基中的150×106個單核細胞。在含5％CO2的培養(yǎng)箱中，37℃下溫育3天后，用10ml HEPES緩沖的RPMI 1640洗滌一次，以除去非連接的(大部分是非特異的)細胞；特異的T細胞集落連同粘附的單核細胞留在燒瓶內。將50ml添加了20U/ml人IL-2(IMMUNEX，Seattle WA)的AIMV，和1ml(終濃度為2％)收集的人血清加回到燒瓶內。在總培養(yǎng)時間為10-14天后，收集T細胞，并通過Ficol Hypaque沉淀死細胞，產生高度富含活細胞CD4+的群體(95-98％)，即Ag特異的T細胞。如圖3所示，該T細胞被證實是對TT830肽鏈特異的。用冷聚集法(Mentzer S.J.等(1986)Cell.Immunol，101132)從白細胞電泳包裝中純化大量的單核細胞。該方法可獲得純度為80-90％的產品。將單核細胞和T細胞分成份冷凍備用，而且已表明該冷凍細胞在融化后仍保留其正常的功能。
抗原遞呈分析在增殖分析中，將T細胞(5×104)、照射的單核細胞(3000rad，105/孔)，和不同濃度的肽TT838融合蛋白Fab22-TT830，按最終體積200μl/孔，在平底的96孔組織培養(yǎng)板中，一起保溫2天。然后每孔加入10μl(1μCi/孔)3H-胸苷。培養(yǎng)過夜后，收集培養(yǎng)板并在液閃計數器中計數。T細胞增殖表示為3個重復樣品的平均計數/min(CPM)±SD。背景CPM(不含抗原的T細胞和單核細胞)從所有數據點中減去。APL實驗按類似于Sette等報道的方案進行(De Magistris(1992)Cell 68625)。簡要地說，對于抑制分析，照射的單核細胞用不同濃度的TT 833S或Fab22-TT833S處理過夜，然后加入20nm的TT830和T細胞。再溫育2天后，按以上所述測定T細胞的增殖。在“預脈沖”實驗中，照射過的單核細胞用20nM的TT830脈沖，4小時后，加入10μM TT833S或0.1μM Fab22-TT833S。溫育過夜后，再加入T細胞。再溫育2天后，T細胞用照射過的單核細胞和TT833S或Fab22-TT833S刺激1天，在Ficoll Hypaque上離心后回收，并用單核細胞和不同濃度的TT830再刺激2天。然后加入3H-胸苷測定T細胞的增殖，用3個重復樣品的CPM作圖。有時，抑制百分率可用以下公式計算抑制％＝(CPM無抑制劑-CPM抑制劑)/CPM無抑制劑×100。所有實驗至少重復三次。
染色和流式細胞計量法染色步驟由先前描述的步驟改編(Gosselin E.J.等(1990)J.Immunol.144-1817-22)。簡要地說，將30μl的RPMI+1 mg/ml BSA加入4℃下的96孔板的每個孔中，該RPMI中含有不同濃度的蛋白Fab22-TT830、Fab22-TT833S，或BsAb MDXH210中的一種。在4℃下溫育1小時后，將該板離心，棄去上清，細胞用PBS/BSA在4℃下洗滌3次。細胞然后與40μl/孔FITC標記的F(ab′)2羊抗人IgG(JACKSONIMMUNORESEARCH LABORATORIES，INC.West Grove，PA)溫育1小時，隨后用PBS/BSA洗滌3次并重懸于含1％低聚甲醛(KODAK，Rochester，NY)的PBS/BSA中。然后用FACScan(BECTONDICKINSON & CO.，Mountain View，CA)檢查細胞，并測定平均熒光強度(MFI)。
細胞因子測定在抗原遞呈分析中，經2天刺激后，收集96孔板中的上清液并冷凍備用。用特異的ELISA測定這些樣品中的IFN-γ和IL-4的含量。與IFN-γ配對的抗體以及IL-4特異的ELISA購自PHARMINGEN(CanDiego，CA)。ELISA分析按照生產商提供的方案進行。
H22-TT肽融合蛋白的制備為了制備融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S，按照以下所述的方法，將編碼每種肽鏈的寡核苷酸通過基因工程技術，分別連接到人抗FcγRI mAb22(H22)重鏈的鉸鏈區(qū)。
表達和克隆的載體通過將mAb22的CDR區(qū)移植到人IgG1的構架，使mAb22人源化(參見以上所述及R.F.等(1995)J.Immunol.1554996-5002)。對H22重鏈基因組克隆的表達載體(pSVgpt)進行改造，加入其他分子的編碼序列，在本實施例中為TT肽。將該載體含有CH1、鏈鏈區(qū)以及新改造的XhoI和NotI克隆位點(參見圖2)的BamHI片段插入pUC 19的BamHI位點，以產生pUC19/H22CH1(X+N)載體。如以下所述，此載體用來克隆編碼TT肽鏈的寡核苷酸序列。
將編碼破傷風毒素(TT)肽鏈的寡核苷酸序列設計成在該編碼區(qū)的N末端含有XhoI位點，在C末端含有NotI位點(圖24A)。這些寡核苷酸由GENOSYS Biotechnologies(The Woodlands，TX)合成并純化。然后將此合成的寡核苷酸退火，并連接到克隆載體pUC19/H22CH1(X+N)中。通過限制酶切圖譜，篩選已摻入TT肽鏈編碼序列的克隆。然后從pUC19中切出含有CH1、鉸鏈區(qū)，和TT830或TT833 S的BamHI片段，并插入已含有VH的表達載體中。H22重鏈與TT肽鏈融合的最終表達載體如圖24B所示。
H22-TT融合蛋白的表達鼠骨髓瘤NSO(ECACC 85110503)是非合成的系并用作表達H22-TT融合蛋白。首先，NSO細胞用含有H22輕鏈編碼序列的pSVhyg載體轉柒。然后該表達H22輕鏈的NSO細胞再用含有H22H鏈Fd序列的載體結構轉染，該H22H鏈Fd序列已按讀碼框與TT編碼序列融合(圖24B)。BioRad Gene Pulser電穿孔儀用來進行電穿孔，所用電壓為200V，電容為960μFarad。轉染后1天或2天，培養(yǎng)基中加入霉酚酸(0.8μg/ml；SIGMA)和黃嘌呤(2.5μg/ml；SIGMA)，以選擇已成功吸取表達載體的轉染子。按照流式細胞計量分析結果，根據培養(yǎng)上清與U937細胞上的RcγRI的結合能力，分離出單個的克隆。陽性克隆用限制稀釋法進行亞克隆。
Fab22-TT融合蛋白的純化表達Fab22-TT830融合蛋白的克隆pW5和表達Fab22-TT833S的克隆pM4用旋轉瓶培養(yǎng)擴充。將上清液澄清并濃縮。小規(guī)模的純化采用親和層析在抗H22親和柱上進行。用5-10％的丙烯酰胺梯度凝膠在非還原的條件下進行SDS-PAGE分析，結果表明，融合蛋白的純度＞90％，其分子量為50kDa，與預期的一致。蛋白濃度通過測定其在280nm的吸收，并由IgGFab′的消光系數為1.53來確定。結果與U937細胞結合的H22Fd-TT融合蛋白首先，檢驗了H22融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S與FcγRI結合的能力。先前描述過的雙特異Ab，MDXH120，用作陽性對照，MDXH210含有同樣的FcγRI結合組分(人源化mAb22的Fab′)(Valone F.H.等(1995)J.Clin，Oncol.132281-92)。融合蛋白和MDXH210與U937細胞的結合可通過用FITC標記的對人IgG特異的羊抗體染色，并用流式細胞計量法測定，該U937細胞基本上表達FcγRI。如圖24A和24B所示，融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S以類似于MDXH210的劑量依賴方式，結合到U937細胞上。融合蛋白的結合被鼠抗-人FcγRI mAb 22 F(ab′)2完全封閉，證明了融合蛋白對FcγRI的特異性。
H22Fd-TT融合蛋白增強TT肽鏈的遞呈100-1000倍融合蛋白Fab22-TT830用于抗原遞呈分析中，以確定Th表位，TT830，在H22的恒定區(qū)表達時，是否能夠被單核細胞有效地遞呈到自身的T細胞。如圖26所示，要達到同樣水平的T細胞增殖，所需的Fab22-TT830量比單獨用TT830肽的量少1000倍。此外，圖26表明，Fab22-TT830的遞呈的比完整TT的遞呈更有效10,000倍，由此可以認為，與TT830肽鏈相比，Fab22-TT830所增強的遞呈不僅是由于其分子量高，也由于Fab22-TT830穩(wěn)定性的增加。另一種抗原TT表位，TT947，不能刺激T細胞，證實了T細胞對TT830肽鏈是特異的。因此，這些結果提供了明確的證據，即在H22恒定區(qū)表達的Th表位可以被有效且特異地遞呈。
封閉單核細胞上的FcγRI消除了H22 Fd-TT融合蛋白增強的抗原遞呈作用為了直接確定通過使用融合蛋白而增強的肽鏈遞呈是否是由FcγRI介導的，用mAb22F(ab′)2處理單核細胞1小時，然后加入Fab22-TT830或TT830肽鏈，以封閉Fab22-TT830與抗原遞呈單核細胞上的FcγRI結合。mAb22F(ab′)2消除了融合蛋白所增強的肽鏈遞呈作用，而對TT830的遞呈無影響(圖27)。mAb22F(ab′)2與FcγRI結合未引起游離肽鏈遞呈的增強，這一事實暗示了mAb22單獨與FcγRI結合不會改變單核細胞的功能狀態(tài)而使其增強抗原遞呈作用，因此，假設遞呈作用的增強有可能是由于通過FcγRI有效地捕捉抗原的結果，那么，為了增強抗原呈遞的效果，將肽鏈連接到抗FcγRI Ab22上看來是必要的。
人TgG的存在不影響H22對肽鏈遞呈的增強在生理條件下，FcγRI的配體結合區(qū)被IgG所飽和，IgG阻斷了抗原抗體導向該受體。用mAb22的衍生物來觸發(fā)FcγRI功能有以下的獨特優(yōu)點。即Ab22結合到配體結合區(qū)以外的表位上。因此，被mAb22觸發(fā)的功能，例如ADCC、吞噬作用和抗原遞呈不會被生理水平的IgG所抑制(Gosselin E J.，同上，Guyre P.M.(1989)J.Immunol.143-1650-55)。同樣，用融合蛋白Fab22-TT830增強的TT830的肽鏈遞呈不受Ig(G)的抑制(圖28)，可以假定，基于H22的融合蛋白也是在體內將抗原肽導向FcγRI的有效方式。
IFN-γ和IL-4的產生隨著H22Fd-TT融合蛋白增強的抗原遞呈作用而增加由于激活的作用，T細胞不僅通過增殖而克隆擴充，而且還產生細胞因子，例如IFN-γ和IL-4，從而發(fā)揮其B細胞分化和單核細胞激活的效應功能(Paul W.E.和Seder，R.A.(1994)Cell 76241-251)。因此，檢驗了IFN-γ和IL-4隨著H22融合蛋白增強的抗原遞呈作用而產生的情況。如圖28A和28B所示，Fab22-TT830提高了IFN-γ和IL-4的生產水平，尤其是抗原濃度在最適濃度以下時。但是，在這些實驗中，細胞因子產量的增加(約20倍)少于T細胞增殖的增加(約600倍)。
因此，在抗FcγRI mAb H22恒定區(qū)表達的Th表位可以被人單核細胞有效地加工和遞呈，導致增強T細胞的激活和細胞因子的產生。
APL遞呈，TT833S和Fab22-TT833S不能刺激T細胞的增殖天然T細胞表位中，改變了一個或兩個氨基酸的肽鏈被Allen及其同事們稱為改變的肽鏈受體(APL)，現已表明，APL是T細胞激活的興奮劑，部分興奮劑或拮抗劑(Sette等(1994)Ann.Rev.Immunol.12413和Evavold等(1993)Immunol.Today 14602)。在某些情況下，APL通過TCR被特異的T細胞識別，觸發(fā)了部分信號的轉導，從而導致(i)T細胞的刺激被超抗原抑制(Evavlold等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.V.S.A.912300)，T細胞無反應性(Sloan-Lancaster等(1993)Nature363156以及Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.1851195)，或(iii)Th1/Th2分化的調節(jié)(Nicholson等(1995)Immunity 3397；Pfeiffer等(1995)J.Exp.Med.1811569；以及Windhagen等(1995)Immunity2373)。已表明，部分興奮劑刺激T細胞的某些功能，例如T細胞產生IL-4的功能，但不能刺激其他功能，例如T細胞增殖(Evabold等(1991)Science 2521308)。部分興奮劑也會誘導無反應性。某些APL與TCR反應不能觸發(fā)任何可檢測到的信號發(fā)出，但是能起TCR拮抗劑的功能，而抑制T細胞對野生肽抗原應答的增殖，因而稱為TCR拮抗劑(De Magistric等(1992)Cell 68625以及Ruppert等(1993)Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A 902671)。
該實施例證明，肽鏈TT833S，即破傷風毒素T細胞表位TT830的拮抗劑肽鏈，和Fab22-TT833S不能刺激T細胞的增殖。如圖30所示，即使TT833S和Fab22-TT833S的劑量分別高達100μM和1μM，也未能觀察到TT830特異的T細胞的明顯增殖。此結果說明，TT830肽鏈的833位賴氨酸改變?yōu)榻z氨酸后，消除了該T細胞表位的T細胞反應性。此外，當肽鏈TT830和TT833S同時遞呈到TT830特異的T細胞上時，相應于TT830的T細胞增加被TT833S以劑量依賴的方式所抑制，這表明TT833S可起TT830特異的T細胞的拮抗劑的作用。
Fab22-TT833S抑制T細胞激活至少比TT833S更有效100倍本實施例比較了TT833S和Fab22-TT833S在抑制T細胞相應于TT830的增殖的相對效率。如圖32所示，在抑制TT830刺激的T細胞增殖上，Fab22-TT833S比TT833S更有效100倍?？梢哉J為，APL、TT833S在mAb H22的恒定區(qū)上表達時，可被APC有效地弟呈。融合蛋白Fab22-TT833S增加了對T細胞增殖的拮抗效力，這可能是FcγRI介導的捕捉抗原比游離的肽鏈更為有效的反映。
T細胞激活的抑制是由競爭T細胞受體結合所介導，而不是由競爭MHC II類抗原結合所介導APL TT833S和融合蛋白Fab22-TT833S的拮抗效應可能是通過MHC結合水平上的競爭，或TCR結合水平上的競爭，或是兩者。為了了解有關的機制，進行了首先由Sette及其同事所描述的“預脈沖”實驗(DeMagistris，M.T.等(1992)Cell 68625-634)。該實驗設定使興奮劑(TT830)在不存在來源于抑制劑(TT833S)的競爭的條件下，與MHC II類抗原結合，這樣，只有TCR拮抗劑，而不是純的MHC封閉劑，能有效地抑制興奮劑刺激T細胞的增殖?？乖f呈的單核細胞用低于最佳濃度(20mM)的TT830脈沖4小時，使TT830在不存在來自TT833S的競爭的條件下與MHC II類結合。然后將APL、TT833S或Fab22-TT833S與預脈沖的單核細胞再溫育16小時。加入相應的T細胞，并按上述方法測定其增殖。即使在MHC的封閉起很小作用的情況下，T細胞的增殖仍然受到抑制(圖33)。因此，該抑制看來是競爭與T細胞受體結合的結果，而不是競爭MHC II類結合的結果。
TT833S和Fab22-TT833S的遞呈不能刺激T細胞產生IL-4和IFN-γ在某些情況下，APL能刺激T細胞產生細胞因子，但不能增殖(Evavold B.D.和Allen P.M.(1991)Science 2521308-1310)。為了確定是否TT833S的遞呈刺激了細胞因子的產生，因此，測定了抗原遞呈分析所得上清中IL-4和IFN-γ的含量。如圖34所示，TT833S和Fab22-TT833S對刺激T細胞產生IFN-γ和IL-4是無效的。
TT833S和Fab22-TT833S的遞呈不會導致T細胞無反應性Allen及其同事報道TCR與某些APL-MHC II類復合物反應會導致T細胞的無反應性(Sloan-Lancaster J.等(1993)Nature 363156-159，Sloan-Lancaster J.等(1994)J.Exp.Med.1801195-1205)。類似于上述Allen等的實驗方案用來確定TT833S的遞呈是否也能引起T細胞的無反應性。如圖3 5所示，T細胞與APC和TT833S或Fab22-TT833S溫育1天、2天或4天后，回收T細胞，該細胞對隨后的抗原攻擊的應答與T細胞單獨與APC溫育的一樣。因此，拮抗劑通過單獨用肽鏈，或用Fab22-TT833S遞呈，都不會引起T細胞無反應性。而且，其活T細胞的百分率與無肽鏈、TT833S或Fab22-TT833S的培養(yǎng)物中回收的T細胞相同(約為50％)，可以認為TT833S的遞呈不會增加T細胞的死亡。
用基于抗FcγRI mAb22的融合蛋白將抗原肽鏈導向FcγRI，其免疫原性可增加約1000倍，所觀察到的此現象表明，這類融合蛋白對用于慢性疾病和癌癥的基于肽鏈的疫苗是有用的。通過基因工程技術，將肽鏈引入對特定APC表面分子特異的人mAb恒定區(qū)，這種方法代表了增加基于肽鏈的疫苗抗原效價的普遍采用途徑。
此外，FcγRI導向的拮抗肽鏈抑制了TT830特異的T細胞的增殖，甚至在APC首先用天然的肽鏈脈沖時亦是如此，這種狀況與在體內想減輕自身免疫應答時所遇到的狀況類似。所觀察到的這種現象表明拮抗肽鏈的導向遞呈可以用作抗原特異治療法，用于治療例如，T細胞介導的自身免疫疾病。基于APL的治療將會提供抗原特異的免疫療法，用于治療T細胞介導的自身免疫疾病，例如風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性硬化。此外，對于以過量免疫應答為特征的某種免疫疾病來說，采用某種融合蛋白，通過誘導與該免疫疾病有關的抗原的抗原特異無反應性，可以治療這種免疫疾病，上述的融合蛋白包含一個對FcγRI的結合特異性，以及是上述抗原的部分興奮劑的肽鏈。由此，通過提供增加抗原的抗原遞呈作用的方法，本發(fā)明提供了治療各種免疫疾病的方法，該抗原遞呈作用的增加刺激了T細胞，阻止了T細胞的增殖和/或細胞因子的分泌，或誘導了T細胞的無反應性。實施例8功能性單鏈抗FcγRI抗CEA雙特異分子本實施例證明重組的雙特異單鏈分子可以結合FcγRI和CEA，該重組的雙特異單鏈分子包含與抗癌胚抗原(抗CEA)抗體融合的人源化抗FcγRI抗體。
圖37是編碼雙特異單鏈分子的哺乳動物表達結構(結構321和323)的簡要圖示，該雙特異單鏈分子含有一個結合FcγRI的特異性和一個結合癌胚抗原(CEA)的特異性。由結構321編碼的雙特異單鏈分子H22抗CEA的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，和編碼該融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO15)如圖40所示。結構323編碼的雙特異單鏈分子H22抗CEA與結構321編碼的融合蛋白的不同只是H22的VH和VL鏈的轉換。
還制備了編碼含有一個FcγRI結合特異性的單鏈抗體的哺乳動物表達結構(結構225)。結構225編碼的單鏈抗體H22的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，以及編碼該單鏈抗體的核苷酸序列(SEQ IDNO13)如圖39所示。
將上述每種結構克隆到pcDNA3的HindIII和XbaI位點(體外基因)，由CMV啟動子驅動表達。這些結構的每一種還含有編碼c-myc肽鏈和6個組氨酸的肽鏈的核苷酸，用于從細胞培養(yǎng)物中純化重組蛋白。該c-myc尾端相應于人c-myc的410-420位氨基酸(Evan等(1985)Mol.Cell.Biol.53610)。上述抗CEA單鏈抗體，稱為MFE-23，在Casey等(1994)J.Immunol.Methods 179105和Chester等(1994)Lancet 343455中進一步描述。
該單鏈雙特異分子H22抗CEA和單鏈H22抗體用于結合分析，按以下方法進行。ELISA板用CEA覆蓋，并用5％PBA封閉。用編碼該單鏈分子的結構(轉染瘤)轉染的細胞上清加入板中，并加入FcγRI/IgM-μ(COS轉染的細胞上清，以上所述)，然后將此板與偶聯堿性磷酸酶的羊抗人IgM一起溫育，用PN PP顯色，并測定該板在405-650nm的讀數，以檢測其結合。
分析結果在圖8中表示。該結果說明結構321和323編碼的單鏈雙特異H22抗CEA分子與FcγRI和CEA兩者結合。另一方面，與預期的一致，單鏈H22抗體(由結構225編碼)與FcγRI和CEA兩者均不結合。
實施例9導向CD64(FcγRI)以誘導和/或增強抗原加工和遞呈為了確定是否將正常非免疫原性的抗原(例如，自交抗原)導向人CD64(FcγRI)可克服體內的免疫無應答性，制備了幾種多聚體復合物，并按以下所述進行測試，該復合物含有與F(ab′)2抗體片段連接的上述抗原，而此抗體片段是定向抗原遞呈分子上Fc受體的。詳細地說，人CD64轉基因小鼠及其同窩的非轉基因小鼠都用鼠抗人CD64mAbM22(用ATCC保藏號為HB-12147的雜交瘤生產)的F(ab′)2片段免疫接種。在小鼠接受第四次的兩周一次的免疫接種后，取其血。根據ELISA分析，6只轉基因鼠中的3只小鼠呈現出明顯的抗M22 Id特異抗體滴度，但6只非轉基因同窩小鼠中都沒有呈現此滴度。這些抗血清是M22特異的，且與其他鼠抗體不反應。
為了確定是否M22Fab′的多聚體復合物會誘導更有效的抗原內在化，并由此增強抗原遞呈，和產生更強的免疫應答，用化學法和基因工程法合成了M22Fab′的多聚體分子。這些多聚體含有可與22F(ab′)2(或其他Fc受體結合的抗原)和另外的22Fab′分子化學連接的抗原。最終的多聚體包括幾種不同種類的分子，含有，例如，多個22Fab′臂(例如，2或2個以上)以及1個或1個以上抗原分子。需要時這些不同種類的分子可通過大小排阻層析，或親和析層來純化。圖41是產生這種化學連接的多聚體靶抗原的簡要圖示。
化學合成的多聚體可按以下方法制備，將M22的F(ab′)2與20摩爾過量的琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)在室溫下溫育2小時。用G25層析除去生成的復合物F(ab′)2-SMCC中的游離SMCC。按1∶1的摩爾比加入含有游離巰基(SH)基團的抗原。所得的混合物在室溫下溫育過夜。加入過量的碘乙酰胺終止反應，然后用大小排阻層析純化所得的結合物。
M22F(ab′)2+-抗原多聚體增強/誘導免疫應答圖42A所示的是含有純化的M22F(ab′)2(泳道1)和化學連接的M22Fab′多聚體(泳道2)的非還原SDS-PAGE凝膠。該多聚體包括幾種分子F(ab′)3、F(ab′)4、F(ab′)5、F(ab′)6，和分子量更高的分子。
為了比較M22F(ab′)2和多聚體M22F(ab′)3+介導人CD64內在化的能力，將不同濃度的M22F(ab′)2或M22F(ab′)3+與從人CD64轉基因鼠分離出的巨噬細胞溫育2小時。用FITC標記的抗人CD64 mAbM32.2(由ATCC貯藏號為9469的雜交瘤生產)檢測人CD64的表面表達，該FITC標記的抗人CD64mAbM32.2與人CD64結合，其結合位點與M22表位的不同。如圖42B所示，與M22F(ab′)2溫育沒有明顯減少巨噬細胞表面的CD64。但是，與F(ab′)3+在37℃下溫育，導致人CD64的表達以劑量依賴的方式減少，減少量達50％。與F(ab′)3+在4℃下溫育未引起人CD64表達的減少，證明該現象是溫度依賴的。
進一步進行實驗，以確定是否在體內存在調節(jié)。將M22F(ab′)2或M22F(ab′)3+注射入人CD64轉基因小鼠體內，1小時后取血。在M22F(ab′)3+免疫的動物的循環(huán)單核細胞上，人CD64的表面表達明顯減少，但M22F(ab′)2免疫的沒有減少。可以推測，表面人CD64表達的減少表示該受體連同F(ab′)3+多聚體一起的內在化。
隨后，研究了人CD64轉基因小鼠和未轉基因的同窩小鼠用M22F(ab′)3+多聚體免疫三次后，產生抗M22獨特型(“Id”)應答的能力。圖43A所示的數據證明，所有用多聚體免疫三次(25μg/免疫接種)的人CD64轉基因小鼠(n＝12)均產生高滴度的M22特異的抗體。但經同樣免疫的未轉基因同窩小鼠(n＝10)均無特異抗體產生。人CD64轉基因小鼠中，M22F(ab′)3+多聚體誘導出的免疫應答明顯好于MF(ab′)2所誘導的。與F(ab′)2相比，所有用多聚體免疫的多聚體免疫小鼠都產生應答，而且產生免疫應答所需要的免疫次數較少(3次對4次)。這些結果證明，Fab′多聚體復合物使抗原通過人CD64更好地內在化，并增強了抗原特異的免疫應答。實際上，圖43B所示的數據表明，用少至0.25μg的多聚體免疫接種人CD64轉基因小鼠，多數小鼠仍能產生可檢測到的免疫應答。
要觀察到對許多腫瘤結合的抗原的有效免疫應答是困難的，因為免疫系統(tǒng)往往能耐受這些抗原。為了測定將這種正常非免疫原性的抗原導向人CD64能否引起對抗原的免疫應答，將某種模型抗原，鼠單克隆抗體的Fab′片段520C9偶聯到M22多聚體上。
對人CD64轉基因小鼠或其未轉基因的同窩小鼠免疫接種后，確定其抗520C9 Id的滴度和抗M22Id的滴度。如圖44A所示，8只人CD64轉基因小鼠中的7只顯示出強的抗520C9和抗M22的滴度。7只免疫的未轉基因小鼠都未顯示出可檢測到的對520C9或對M22的滴度。這些數據證明，將正常非免疫原性的蛋白偶聯到人CD64上，使其通過人CD64+抗原遞呈細胞內在化而產生對該抗原的有效免疫應答。幾個研究小組已表明，誘導出來的，對B細胞淋巴細胞上表面Ig表達的獨特型特異的免疫力可產生有效的對腫瘤細胞特異的免疫力。該實施例證明，通過將520C9獨特型導向人CD64，很容易誘導出特異的抗520C9Id應答。對特定抗原免疫應答的性質，特別是結合腫瘤的抗原或病毒抗原，與其應答的量同樣重要。T輔助細胞，根據其分泌的細胞因子類型，以及在刺激時對B細胞提供的輔助類型，可分為Th1和Th2。Th1細胞受到刺激時分泌IL-2和IFN-γ，并通常刺激B細胞分泌IgG2a同種型的抗體。Th2細胞刺激時分泌IL-4和IL-5，并通常刺激B細胞分泌IgG1或IgE同種型的抗體。一般，認為Th1細胞刺激免疫應答的細胞臂，而Th2細胞刺激體液的臂。用偶聯520C9的M22多聚體免疫接種人CD64轉基因小鼠后，用同種型特異的誘導試劑檢驗IgG1或IgG2a同種型的520C9特異的抗體的滴度。圖44B所示的數據證明，已誘導出強的IgG1以及IgG2a Id特異的滴度，證實了這種通過免疫接種激活Th1和Th2應答的方法的能力。
H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原多聚體誘導免疫應答圖45(a)所示的是編碼基因連接的多聚體靶抗原的載體圖譜。該載體編碼某種蛋白，該蛋白包括二個來源于人源化的抗FcγRI抗體H22(由ATCC保藏號為CRL 11177的雜交瘤產生)的sFv區(qū)，以及一個來源于抗體M32.2的sFv區(qū)，這些抗體片段都與抗原連接在一起。所產生的融合蛋白H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原(如圖45(b)所示)，可在多個位點與FcγRI結合，并由此通過受體的聚集而誘導內在化。
用鼠gp75(色氨酸1黑素瘤抗原)作為抗原，制備H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原多聚體，用于轉基因小鼠的模型研究。已發(fā)現，該融合蛋白與FcγRI有效地結合，并誘導受體的內在化。如圖46所示，化學連接的M22Fab×M22Fab×M32Fab-抗原和基因連接的H22sFv-H22sFv-32.2sFv-抗原都誘導FcγRI的內在化。該研究按下述方法進行，將樣品加入經IFN-γ處理的U937細胞中，37℃下溫育2小時。樣品用人IgG1-F1TC在4℃下染色1小時，然后用FACscan分析樣品，測定其FcγRI表達。調節(jié)百分數(％)用以下公式計算〔1-(樣品的MFI/對照的MFI)〕×100％，其中MFI為平均熒光強度。
H22sFv2-抗原與FcγRI結合的親和力與H22Fb2抗原的大約相等圖47(a)所示的是編碼某種融合蛋白的載體圖譜，該融合蛋白由兩個H22sFv區(qū)與抗原用基因連接法連接在一起而構成。產生的融合蛋白H22sFv-H22sFv-抗原(如圖47(b)所示)可與兩個FcγRI分子結合。這種融合蛋白對FcγRI的親和力應該比僅含有一個H22sFv的融合蛋白更大。這種多聚體結合兩FcγRI分子的能力也可能誘導受體更好的內在化。
為了檢驗上述的假定(即H22sFv-H22-抗原融合蛋白與FcγRI結合的親和力是否比單個H22sFv-抗原融合蛋白的更大)，進行了競爭實驗。U937細胞先用IFN-γ處理，以增強FcγRI的表達，然后用抗體H22和藻紅蛋白的偶聯物染色。如圖48所示，該偶聯物被不同濃度的H22Fab、H22sFv2-EGF融合蛋白或H22Fab2所抑制。仍然如圖48所示，H22sFv2-EGF與FcγRI結合的親和力與H22Fab2的大約相等。以前已表明，H22Fab′與H22sFv對FcγRI的親和力相同(Goldstein等，(1997)J.Immunol.)。
H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA誘導FcγRI的內在化圖49(a)所示的是編碼某種多聚體融合蛋白的載體圖譜，該融合蛋白含有3個與抗原連接的H22sFv片段。此融合蛋白，H22sFv-H22sFv-H22sFv-CEA(如圖49(b)所示)，含有與3個H22sFv連接的腫瘤抗原CEA。該融合蛋白應以高的親和力結合FcγRI(由于3個sFV分子的三價結合)，而且也應由于3個FcγRI分子的聚集而導至FcγRI的內在化。
基因法連接的H22sFv-H22sFv-CEA融合蛋白誘導FcγRI內在化的能力用先前所述的方法測試，其結果如圖50所示。很明顯，在同樣的濃度下，H22Fab-CEA不介導內在化，可能是由于它與FcγRI單價結合。該實施例的操作方法是將樣品加入IFN-γ處理過的U937細胞中，并在37℃下溫育1小時或過夜。然后用M32.2-FITC在4℃下將細胞染色1小時，樣品用FACscan分析，以測定其FcγRI的表達。實施例10導向CD89(FcαR)和腫瘤抗原(例如，EGF受體)的人抗體融合蛋白促進腫瘤細胞的細胞介導的細胞毒素以下的研究涉及雙特異融合結構的生產和特性，該融合結構誘導表達EGF受體(EGFR)的腫瘤分子的效應細胞介導的殺傷。該結構包括與抗CD89(抗FcαR)抗體(ScFv或Fab′)連接的EGF。因此，該結構激活已導向腫瘤細胞的CD89表達細胞的效應功能。
CD89(FcαR)是一種受體，它結合IgA的Fc部分，IgA是人體最豐富的Ig。CD89基本上主要在細胞毒性免疫分子上表達，這些分子包括多形核白細胞(PMN)、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白細胞和嗜伊紅性粒細胞，抗原復合的IgA1和IgA2以及單體的IgA1和IgA2均結合CD89，可假定，該受體在體內可能被單體的IgA所飽和。用對配體結合位點內部或外的表位特異的mAb交聯髓樣效應細胞上的CD89，可刺激脫粒作用、過氧化物的釋放、炎癥細胞因子的分泌、胞吞作用和吞噬作用。因此，CD89可能是與臨床上有關的細胞毒素免疫效應細胞上的觸發(fā)受體。
酪氨酸激酶連接的受體是I型生長因子受體家庭的成員，已有報道，這些受體在各種癌癥的誘發(fā)過程期間是高表達的。該家庭的成員之一是表皮生長因子受體(EGF-R，c-erbB-1基因的產物)。EGF-R在幾乎所有的頭部和頸部的腫瘤中都是高表達的，約在1/3的乳房和卵巢腫瘤中高表達，以及可在前列腺，腎、膀胱、肺、腦、胰腺和胃腸系統(tǒng)的腫瘤中高表達。盡管該受體存在于某些正常細胞中，例如角質形成細胞和肝細胞，但EGF-R在腫瘤細胞上的高表達對于腫瘤的定向特異治療是有用的。定向治療可包括對EGF-R特異的mAb，或該受體的配體之一，如EGF。EGF是各種類型表達EGF-R的細胞的細胞分裂和分化功能的調節(jié)劑。EGF是53個氨基酸的非糖基化的多肽，該肽含有3對二硫鍵，并由1207個氨基酸的前體經蛋白加工而產生。融合結構的制備雙特異融合蛋白的制備方法如下所述。采用此處先前所述的HuMAb-Mouse技術，產生完全人CD89 mAb。將此mAb，14A8(亦稱為14.1)，結合到某一表位上，該表位與保留觸發(fā)效應功能的能力時的Fc結合位點不同。由此，該抗體克服了因飽和的單體IgA引起的配體結合位點可能被封閉的問題。在此是將mAb 14A8的fab′和sFv片段與EGF融合。簡要地說，由用可溶CD89免疫接種的HuMAb小鼠獲得14A8雜交瘤細胞系。用RT-PCR由該細胞系分離的RNA克隆到V區(qū)。DNA序列分析表明，該抗體包括含有DN1D區(qū)段和JH4J區(qū)段的30.3VH，以及含JK3 J區(qū)段的L18 Vk。
采用編碼由HuMAb-Mouse產生的全人抗CD89 mAb的可變區(qū)的DNA，即可構建并表達具有雙特異分子(BMS)功能的抗體融合蛋白。如圖51所示，這些分子包括與人IgA(FcαRI，CD89)Fc部分的受體在某表位結合的抗體片段，該表位與Fc結合位點不同，但仍可觸發(fā)效應細胞功能，還包括與表皮生長因子受體(EGF-R)結合的臂，該表皮生長因子在各種腫瘤細胞系中是高表達的。制備上述BMS的方法是將mAb 14A8(抗CD89)的Fab或sc-Fv片段，通過易彎曲的肽鏈接頭，融合到EGF-R的配體EGF上。用RT-PCR的DNA序列分析克隆mAb 14A8的可變區(qū)并分析其特性。
Fab融合結構的制備方法是將14A8VH DNA插入表達載體，該表達載體含有與EGF融合的人IgG1 CH1和鉸鏈區(qū)的cDNA。同樣，將14A8VL DNA插入含有人CL區(qū)cDNA的表達載體。sc-Fv融合蛋白以單鏈形式由一種載體表達。如圖51中的圖式所示，用電穿孔法，將PJZ906(14Afd-EGF)和PJZ907(14A8L鏈)共轉染到NSO細胞中，并在含G418和潮霉素的培養(yǎng)基中選擇。PJZ909(14A8sFv-EGF)同樣地轉染，并在含G418的培養(yǎng)基中選擇。表達融合蛋白的細胞系用限制稀釋克隆法進行亞克隆。該融合蛋白的提純方法是將表達融合蛋白的細胞系的上清通過蛋白L柱，然后將大約2μg的純化蛋白在還原和非還原的條件下加到4-15％tris-甘氨酸凝膠中。融合蛋白結合腫瘤細胞的特性如圖52(A和B)以及圖53所示，流式細胞計量實驗證實，這些BSM中的抗體片段和EGF部分與其各自的細胞表面受體特異結合。圖52(A)表明14A8fab′-EGF融合蛋白結合到A431細胞上的EGF-R上。圖52(B)表明14A8sFv-EGF與A431細胞(用偶聯藻紅蛋白的羊抗人IgG Fab-2染色)的結合。不含EGF的14A8的fab-2片段用作對照。圖52(C)表明，14A8融合蛋白和市售的EGF以EGF-FITC結合物(7nM)的方式競爭與A431細胞的結合。圖53(A)表明14A8fab′-EGF融合蛋白與表達CD89的U937細胞(用偶聯藻紅蛋白的羊抗人IgG Fab-22染色)的結合。對EGF-R特異的人源化mAb H415的fab-2片段用作對照。圖53(B)表明14A8sFv-EGF融合蛋白也與表達CD89的U937細胞結合。除了要確定14A8sFv-EGF的不同濃度，以測定其抑制14A8fab′-EGF融合蛋白結合的能力(23nM)之外，該實驗按圖53(A)同樣的方式進行。H22sFv-EGF融合蛋白再用作對照。mAbH22與U937細胞上的另一Fc受體CD64(FcγRI)結合。效應細胞介導的表達EGF-R的腫瘤細胞裂解鉻釋放(細胞裂解)分析證實14A8fab′-EGF和14A8sFv-EGF融合蛋白均以劑量依賴的方式，用純化的表達CD89的多形核(PMN)白細胞、單核細胞或全血效應細胞，介導對表達EGF-R腫瘤細胞的特異裂解。
如圖54(A)、54(B)和54(C)，以及圖55所示，14A8融合蛋白用單核細胞(54A)、PMN(54B)，和全血(54C)介導A431細胞的細胞毒性。鉻釋放分析所用的溫育周期為16-18小時，效應物-靶比值(對單核細胞和PMN)為100∶1。14A8的fab-2片段用作對照。如圖56所示，14A8fab′-EGF融合蛋白(1μg/ml)(56A)和14A8sFv-EGF融合蛋白(1μg/ml)介導，A431細胞的細胞毒素被14A8的fab-2片段(40μg/ml)所抑制。該結果證明，細胞通過融合蛋白的裂解是由與CD89結合而特異介導的。
總的說來，前面的研究描述了用基因法將14A8的Fab′或sFv片段與EGF連接而產生融合蛋白；在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表達該融合結構；以及用蛋白L層析將該結構純化至接近均一性。這些融合蛋白在人體內是最小免疫原性的，因為14A8是全人的，EGF是起源于人的，這些融合蛋白可能會增強融合蛋白的治療功效。前面的研究也證明了這些融合蛋白，14A8fab′-EGF和14A8 sFv-EGF，能夠結合表達CD89和EGF-R的細胞。雖然，該研究進一步證明，在表達CD89的免疫效應細胞存在下，這些融合蛋白以劑量依賴的方式介導EGF-R高表達細胞的殺傷。也證明了全血存在下腫瘤細胞的裂解。
實施例11含有導向CD89(FcαR)和腫瘤抗原(例如，EGF受體和/或HER2)的雙特異和三特異分子促進細胞介導的腫瘤細胞的細胞毒性以下的研究涉及雙特導和三特導分子的生產和特性，這些分子誘導效應細胞介導的表達EGF受體(EGF-R)和/或HER2/neu(亦稱為HER2)的腫瘤細胞的殺傷，雙特異結構包括與人單克隆抗HER2抗體(ScFv或Fab′)，稱為3.F2，連接的人單克隆抗CD89(抗FcαR)抗體(ScFv或Fab′)，稱為14.1。三特異結構包括與EGF融合的雙特異抗CD89(ScFv)X抗HER2(ScFv)結構。這些結構激活已導向腫瘤細胞的CD89表達細胞的效應功能。這些結構也具有全人結構的優(yōu)點。
雙特異和三特異融合結構的制備圖57和58所示的是本發(fā)明選擇的雙和三特異的分子及其親本人抗體(HμMab)。圖57所示的是單鏈(ScFv)雙特異融合分子，931和934，除了934包括EGF，而931不包括以外，其余均相同。14.1(抗CD89)和3F2(抗HER2)的可變輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)用于產生該結構。圖58所示的是化學結合的Fab′抗CD89×抗HER2雙特異結構。14.1和3F2的fab′片段用標準的化學交聯方法通過二硫鍵的連接產生該雙特異分子。
單鏈雙和三特異分子(931和934)用下述方法生產。用質粒(例如pJZ934)轉染NSO細胞(如圖51中所示的抗CD89×EGF融合結構)，并在含G418的培養(yǎng)基中選擇。從細胞系中篩選出表達融合蛋白的細胞，然后用有限稀釋克隆法亞克隆。最后，將表達融合蛋白的細胞系的上清液通過蛋白L柱，純化融合蛋白，然后在非還原或還原的條件下，將大約2μg的純化蛋白樣加到4-15％tris-甘氨酸中的膠上。純化的934結構主要是三聚體，該三聚體在還原條件下解離為單體。雙和三特異分子結合腫瘤細胞的特性流式細胞計量法用于測定雙和三特異分子的特性。圖59(A)所示的是轉染上清液中融合蛋白與腫瘤細胞的結合。轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清與SKBR-3或A431腫瘤細胞系溫育，然后用藻紅蛋白偶聯的羊抗人IgGfab-2染色，檢測融合蛋白的結合。如圖59(B)中所示，轉染的細胞(931和934)上清也介導細胞裂解(ADCC)。在這些研究中，鉻釋放分析所用的保溫周期為16-18小時，效應物(單核細胞，PMN)-靶(SKBR-3，A431)比值為100∶1。用轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清液介導特異裂解，檢測腫瘤細胞的殺傷。
圖60(A)所示的是純化的雙和三特異分子(931和934)與U937細胞的結合(通過CD89受體)活性。抗體425(抗EGF-RmAb)的fab-2片段用作陰性對照，該片段與U937細胞不結合?？笴D89(Fab′)×抗HER2(Fab′)化學偶聯的雙特異分子(如圖58所示)用作陽性對照。除了是測定與SKBR-3細胞的結合(通過HER2受體)以外，圖60(B)與圖60(A)相同。抗CD89抗體的fab-2片段，14.1用作陰性對照。圖61所示的是934三特異結構與A431細胞的結合。除了采用EGF-R高表達的A431腫瘤細胞以外，圖61所示的實驗與圖60的相同。含有與EGF融合的sFv片段的融合蛋白用作陽性對照，抗CD89抗體14.1的fab-2片段用作陰性對照。效應細胞介導的表達EGF-R和HER2/neu腫瘤細胞的裂解測定了單鏈雙和三特異的分子(931和934)在效應細胞存在下，介導表達EGF-R和HER2/neu腫瘤細胞的細胞裂解(ADCC)能力。鉻釋放分析所用的溫育周期為16-18小時，效應物(單核細胞，PMN)-靶(SKBR-3)比值為100∶1。用轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清介導特異的裂解，檢測腫瘤細胞的殺傷。如圖59(B)所示，轉染的上清介導單核細胞、PMN和全血的細胞裂解(ADCC)。在這些研究中，鉻釋放分析所用的溫育周期為16-18小時，效應物(單核細胞、PMN)-靶(SKBR-3、A431)比值為100∶1。用轉染的(931和934)和未轉染的(NSO)上清介導特異的裂解，檢測腫瘤細胞的殺傷。
圖62和圖63所示的是用純化的單鏈雙特異結構931，分別在PMN和單核細胞存在下的效應細胞介導的SKBR-3細胞的裂解(圖62(A)和圖63(A))，和BT474細胞的裂解(圖62(B)和圖63(B))。鉻釋放分析所用的溫育周期為16-18小時，效應物-靶比值為100∶1?？笴D89抗體，14.1，的fab-2片段用作每個實驗的陰性對照。
此外，用多形核(PMN)細胞、單核細胞和全血，測試純化的化學結合雙特異分子14.1×3.F2(圖58)對51Cr標記的SKBR-3或BT-474人腫瘤細胞的ADCC殺傷，該雙特異分子含有二個交聯的Fab′抗體片段(與931和934結構的單鏈抗體相應)。特異裂解的計算方法為在雙特異分子存在下腫瘤細胞的裂解量-單獨用多形核細胞的腫瘤細胞裂解量。如圖64所示，雙特異分子14.1×3.F2通過PMN以劑量依賴的方式介導SKBR-3和表達HER2/neu的BT474腫瘤細胞的殺傷。此外，如圖65中所述，雙特異分子14.1×3.F2通過單核細胞以劑量依賴的方式介導SKBR-3和表達HER2/neu腫瘤細胞的細胞殺傷。在兩種情況下，加入10μg/ml的14.1 Fab′2，其腫瘤細胞的ADCC完全被1μg/ml的雙特異分子14.1×3.F2所抑制，證明靶細胞的殺傷就是通過CD89與效應細胞結合而介導的。圖66表明雙特異分子14.1×3.F2通過全血也以劑量依賴的方式介導表達HER2/neu的BT474腫瘤細胞的細胞殺傷。
總的來說，前面的研究描述了含有人單克隆抗體(包括單鏈和Fab′片段)的雙或三特異分子的制備。此外，這些實施例證明了這些雙和三特異分子在效應分子存在下，有效地介導了表達HER2/neu和EGF-R的腫瘤細胞的殺傷。等同的實施方案本領域的技術人員可以識別出，或僅用常規(guī)的實驗，即能查明許多與此處所述的本發(fā)明特有的實施方案等同的實施方案，可以認為這樣的實施方案可包括在以下的權利要求之中。
序列表<110>米德列斯公司等(Medarex，Inc.et al.)<120>含有抗Fc受體結合劑的治療化合物<130>MXI-043CP3PC<140>09/523,279<141>2000-03-10<150>09/364,088<151>1999-07-30<160>19<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(24)<400>1act cac aca tgc cca ccg tgc cca 24Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5<210>2<211>27<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(18)<400>2act cac aca tgc cca ccg tgaggatcc 27Thr His Thr Cys Pro Pro1 5<210>3<211>42<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>3act cac aca tgc tcg agc ctt cac ggc ggc cgc tgaggatcc 42Thr His Thr Cys Ser Ser Leu His Gly Gly Arg1 5 10<210>4<211>300<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Asn20 25 30Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 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權利要求
1.一種雙特異性分子，它包含對Fcα受體的第一結合特異性和對EGF受體的第二結合特異性。
2.權利要求1所述的雙特異性分子，其中的第一和第二結合特異性是基因融合的。
3.權利要求1所述的雙特異性分子，其中的第一結合特異性是抗體或抗體片段。
4.權利要求3所述的雙特異性分子，其中的抗體或抗體片段是人抗體或抗體片段。
5.權利要求4所述的雙特異性分子，其中的抗體是單鏈抗體。
6.權利要求4所述的雙特異性分子，其中的抗體片段是Fab′抗體片段。
7.權利要求1所述的雙特異性分子，其中的第二結合特異性包含EGF。
8.一種雙特異性分子，它包含與Fcα受體結合，并與EGF連接的人抗體或其片段。
9.一種雙特異性分子，它包含與Fcα受體結合，并與EGF連接的單鏈人抗體或其片段。
10.一種雙特異性分子，它包含對Fcα受體的第一結合特異性和對HER2受體的第二結合特異性。
11.權利要求10所述的雙特異性分子，其中的第一和第二特結合異性是基因融合的。
12.權利要求10所述的雙特異性分子，其中的第一結合特異性是人抗體或其片段。
13.權利要求12所述的雙特異性分子，其中的抗體是單鏈抗體。
14.權利要求13所述的雙特異性分子，其中的抗體片段是Fab′抗體片段。
15.權利要求10所述的雙特異性分子，其中的第二抗體或抗體片段是人抗體或抗體片段。
16.權利要求15所述的雙特異性分子，其中的抗體是單鏈抗體。
17.權利要求15所述的雙特異性分子，其中的抗體片段是Fab′抗體片段。
18.一種多特異性分子，它包含對Fcα受體的第一結合特異性；對HER2受體的第二結合特異性；以及對EGF受體的第三結合特異性。
19.權利要求18所述的多特異性分子，其中的第一、第二和第三結合特異性是基因融合的。
20.權利要求18所述的多特異性分子，其中的第一特異性是抗體或抗體片段。
21.權利要求20所述的多特異性分子，其中的抗體或抗體片段是人抗體或抗體片段。
22.權利要求21所述的多特異性分子，其中的抗體是單鏈抗體。
23.權利要求21所述的多特異性分子，其中的抗體片段是Fab′抗體片段。
24.權利要求18所述的多特異性分子，其中的第二結合特異性是抗體或抗體片段。
25.權利要求24所述的多特異性分子，其中的抗體或抗體片段是人抗體或抗體片段。
26.權利要求25所述的多特異性分子，其中的抗體是單鏈抗體。
27.權利要求25所述的多特異性分子，其中的抗體片段是Fab′抗體片段。
28.權利要求18所述的多特異性分子，其中的第三結合特異性包含EGF。
29.一種多特異性分子，它包含與Fcα受體結合的人抗體或其片段；與HER2受體結合的人抗體或其片段；以及EGF
30.權利要求29所述的多特異性分子，其中的第一、第二和第三結合特異性是基因融合的。
31.權利要求29所述的多特異性分子，其中的第一和第二結合特異性是單鏈抗體或抗體片段。
32.一種誘導效應細胞介導的腫瘤細胞的細胞殺傷的方法，該腫瘤細胞以高表達EGF受體為其特征，該方法包括使該腫瘤細胞與含有對Fcα的第一結合特異性和對EGF的第二結合特異性的雙特異性分子結合。
33.權利要求32所述的方法，其中雙特異分子的第一和第二結合特異性是基因融合的。
34.權利要求32所述的方法，其中雙特異分子的第一結合特異性是人抗體或抗體片段。
35.權利要求34所述的方法，其中的抗體是單鏈抗體或Fab′抗體片段。
36權利要求32所述的方法，其中雙特異分子的第二結合特性包含EGF。
37.一種誘導效應細胞介導的腫瘤細胞的細胞殺傷的方法，該腫瘤細胞以高表達EGF受體或HER2受體為其特征，該方法包括使該腫瘤細胞與含有與Fcα受體結合，并與EGF連接的人抗體或其片段的雙特異性分子接觸。
38.一種誘導效應細胞介導的腫瘤細胞的細胞殺傷的方法，該腫瘤細胞以高表達HER2受體為其特征，該方法包括使該腫瘤細胞與含有對Fcα受體的第一結合特異性和對HER2受體的第二結合特異性的雙特異性分子接觸。
39.權利要求38所述的方法，其中的第一或第二結合特異性是人抗體或其片段。
40.權利要求39所述的方法，其中的抗體為單鏈抗體或Fab′抗體片段。
41.一種誘導效應細胞介導的腫瘤細胞的細胞殺傷的方法，該腫瘤細胞以高表達EGF受體或HER2受體為其特征，該方法包括使該腫瘤細胞與多特異性分子接觸，該分子包含對Fcα受體的第一結合特異性；對HER2受體的第二結合特異性；以及對EGF受體的第三結合特異性。
42.權利要求41所述的方法，其中第一、第二和第三結合特異性是基因融合的。
43.權利要求41所述的方法，其中第一或第二結合特異性是人抗體或抗體片段。
44.權利要求43所述的方法，其中的抗體是單鏈抗體或抗體片段。
45.權利要求43所述的方法，其中的第三結合特異性包含EGF。
46.一種誘導效應細胞介導的腫瘤細胞的細胞殺傷的方法，該腫瘤細胞以高表達EGF受體或HER2受體為其特征，該方法包括使所述的腫瘤細胞與多特異性分子接觸，該分子包含與Fcα受體結合的人抗體或其片段；與HER2受體結合的人抗體或其片段；以及EGF。
47.一種分子復合物，它包含a)兩個或兩個以上對抗原遞呈細胞表面上組分的結合特異性；以及b)至少一種與所說的結合特異性連接的抗原，其中所說的組分被該結合特異性結合時，介導該分子復合物的內在化。
48.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的復合物包含三個或三個以上結合特異性。
49.權利要求47所述的分子復合物，其中至少結合特異性中的一個與抗原遞呈細胞上的Fc受體(FcR)結合。
50.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的結合特異性包括抗體或其抗原結合片段。
51.權利要求50所述的分子復合物，其中所說的抗體與Fc受體(FcR)結合。
52.權利要求51所述的分子復合物，其中所說的FcR是Fcγ受體。
53.權利要求52所述的分子復合物，其中所說的Fcγ受體是FcγRI。
54.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的結合特異性中的一個或一個以上含有選自H22(ATCC保藏號CRL11177)、M22(ATCC保藏號HB12147)、M32.2(ATCC保藏號HB9469)，以及其抗原結合片段的抗體。
55.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的同一表位結合。
56.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的不同表位結合。
57.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的結合特異性與不同的細胞表面組分結合。
58.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的抗原與所說的結合特異性化學連接。
59.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的抗原與所說的結合特異性重組融合。
60.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的抗原是腫瘤抗原。
61.權利要求59所述的分子復合物，其中所說的腫瘤抗原來源于選自乳癌、肉瘤、癌和卵巢癌的癌癥。
62.權利要求47所述的分子復合物，其中所述的抗原是自抗原。
63.權利要求47所述的分子復合物，其中所述的抗原是自身抗原。
64.權利要求47所述的分子復合物，其中所述的抗原與FcγRI結合。
65.權利要求47所述的分子復合物，其中所述的抗原包含的抗體選自H22(ATCC保藏號CRL11177)、M22(ATCC保藏號HB12147)、M32.2(ATCC保藏號HB9469)，以及其抗原結合片段。
66.權利要求47所述的分子復合物，其中所說的抗原包含抗體520C9(ATCC保藏號HB8696)或其抗原結合片段。
67.一種誘導或增強治療對象體內的抗原免疫應答的方法，包括對該治療對象施予分子復合物，以增強或誘導該治療對象體內對該抗原的免疫應答，其中該分子復合物含有二個或二個以上對抗原遞呈細胞表面上的組分的結合特異性；以及至少一種與所說的結合特異性連接的抗原，其中所說的組分被該結合特異性結合時，可介導該分子復合物的內在化。
68.權利要求67所述的方法，其中所說的分子復合物包含三個或三個以上的結合特異性。
69.權利要求67所述的方法，其中所說的結合特異性中，至少一個與抗原遞呈細細胞上的Fc受體(FcR)結合。
70.權利要求67所述的方法，其中所說的結合特異性中，至少一個包含抗體或其抗原結合片段。
71.權利要求70所述的方法，其中所說的抗體與Fc受體(FcR)結合。
72.權利要求70所述的方法，其中所說的Fc受體是FcγRI受體。
73.權利要求67所述的方法，其中一個或一個以上所說的結合特異性含有選自H22(ATCC保藏號CRL11177)、M22(ATCC保藏號HB12147)、M32.2(ATCC保藏號HB9469)，以及其抗原結合片段的抗體。
74.權利要求67所述的方法，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的同一表位結合。
75.權利要求67所述的方法，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的不同表位結合。
76.權利要求67所述的方法，其中所說的抗原與所說的結合特異性化學結合。
77.權利要求67所述的方法，其中所說的抗原與所說的結合特異性重組融合。
78.權利要求67所述的方法，其中所說的抗原是腫瘤抗原。
79.權利要求67所述的方法，其中所說的抗原是自抗原。
80.權利要求67所述的方法，其中所說的抗原是自身抗原。
81.一種免疫接種治療對象的方法，包括對治療對象施予有效量的分子復合物，該復合物包含a)二個或二個以上對抗原遞呈細胞表面上組分的結合特異性；以及b)至少一種與所說的結合特異性連接的抗原，其中所說的組分被該結合特異性結合時，可介導該分子復合物的內在化。
82.權利要求81所述的方法，其中所說的分子復合物包含三個或三個以上結合特異性。
83.權利要求81所述的方法，其中至少一個所說的結合特異性包含抗體或其抗原結合片段。
84.權利要求83所述的方法，其中所說的抗體與Fc受體(FcR)結合。
85.權利要求84所述的方法，其中所說的Fc受體是FcγRI受體。
86.權利要求81所述的方法，其中一個或一個以上所說的結合特異性包含的抗體選自H22(ATCC保藏號CRL11177)、M22(ATCC保藏號HB12147)、M32.2(ATCC保藏號HB9469)，以及其抗原結合片段。
87.權利要求81所述的方法，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的同一表位結合。
88.權利要求81所述的方法，其中所說的結合特異性與所說的細胞表面組分的不同表位結合。
89.權利要求81所述的方法，其中所說的抗原與所說的結合特異性化學連接。
90.權利要求81所述的方法，其中所說的抗原與所說的結合特異性重組融合。
91.權利要求81所述的方法，其中所說的抗原是腫瘤抗原。
92.權利要求81所述的方法，其中所說的抗原是自抗原。
93.權利要求81所述的方法，其中所說的抗原是自身抗原。
94.一種通過抗原遞呈細胞誘導或增強抗原遞呈的方法，包括使抗原與抗原遞呈細胞接觸，其中抗原與兩個或兩個以上抗原遞呈細胞表面上組分的結合特異性連接，該抗原遞呈細胞被結合特異性結合時，可介導該抗原的內在化。
95.權利要求94所述的方法，其中的抗原與三個或三個以上的結合特異性連接。
96.權利要求94所述的方法，其中所說的結合特異性包含抗體或其抗原結合片段。
97.權利要求96所述的方法，其中所說的抗體片段包含Fab′片段或sFv片段。
98.權利要求96所述的方法，其中所說的抗體與Fc受體(FcR)結合。
99.權利要求96所述的方法，其中所說的抗原是腫瘤抗原。
100.權利要求96所述的方法，其中所說的抗原是自身抗原。
全文摘要
公開了誘導效應細胞介導的靶細胞殺傷的多特異性分子。該分子是“多特異性的”,因為這些分子與多個(兩個或兩個以上)不同的靶結合,其中一個靶是免疫細胞表面上的Fc受體。本發(fā)明的多特異性分子包括下述的分子,這些分子包含至少一個與Fc受體,例如Fcγ受體(例如,Fc γ RI),結合的部分,以及至少另一個與不同的靶,例如腫瘤細胞或病原體上的抗原,結合的部分。本發(fā)明的多特異性分子還包括抗原“多聚體復合物”,它包含多個(即2個或2個以上)與抗原遞呈細胞(APC)上的分子,例如Fc受體,結合、并與一個或一個以上抗原連接的部分。這些多聚體復合物將抗原,例如自身抗原,導向APC,以誘導和/或增強APC對該抗原的內在化(胞吞作用)、加工和/或遞呈。因此,這些分子可以用于在體內或在體外誘導或增強對正常非免疫原性的蛋白,例如自身抗原,的免疫應答。在特定的實施方案中,至少該多特異性分子的一個部分包含人源化的或人的抗體或抗體片段(例如,ScFv或Fab′),該抗體或抗體片段與Fc受體或靶細胞上的受體(例如EGF－R或HER2)結合。
文檔編號C07K19/00GK1382157SQ00813684
公開日2002年11月27日 申請日期2000年7月25日 優(yōu)先權日1999年7月30日
發(fā)明者Y·M·德奧, J·戈德斯坦, R·戈拉齊爾諾, T·凱勒 申請人:米德列斯公司