本發(fā)明涉及一種蟲生真菌顆粒劑及其制備方法，具體用于土壤內(nèi)部防治蠐螬、地老虎、金針蟲等地下害蟲。
背景技術：
：蟲生真菌是指能夠寄生在金龜子、蜘蛛、白蟻、蝗蟲、蠐螬、地老虎、金針蟲等昆蟲體內(nèi)，且能夠使昆蟲致病致死的真菌，蟲生真菌包括蟲霉、子囊菌、擔子菌、半知菌(如白僵菌、綠僵菌)?；谄渲虏√匦裕x生真菌(尤其是白僵菌和綠僵菌)通常被用來開發(fā)成粉劑、油懸浮劑、顆粒劑等生物農(nóng)藥制劑。cn104770397a公開了一種白僵菌粉劑，包括白僵菌孢子粉1-5％、抗紫外線保護劑0.5-2％、填料94-98％，各組分均為質(zhì)量百分比。cn1225985a公開了一種白僵菌油劑，由白僵菌純孢子粉、色拉油、維生素e、三氧化二鐵及乳化劑溴氰菊酯乳油制備而成；cn100348108c公開了一種懸浮劑，由白僵菌純孢子粉、松節(jié)油、乳化劑磺酸鹽陰離子、多元醇、紫外防護劑、化學殺蟲劑制備而成。浙江大學微生物防治所發(fā)表的期刊文章(應華盛，馮明光.球孢白僵菌分生孢子乳懸劑的配方篩選[j]，2001，28(4)：345-351)，公開了一種懸乳劑，它以惰性礦物油、乳化劑蔗糖脂肪酸酯s-1、羧甲基纖維素、抗壞血酸配制而成。述生物農(nóng)藥制劑用于防治地表的害蟲效果較好，但是將其施于土壤內(nèi)部后，其持效期較短。cn105230665a公開了一種蠟紙基緩釋型生物防治劑及其制備方法，其原料包括廢舊蠟紙、蟲生真菌孢子粉和粘連劑。制備方法包括：將廢舊蠟紙粉碎成粒徑為2-4mm的碎片，然后與接種的真菌孢子粉混合均勻得到物料a；然后將所得物料a用粘連劑制備成顆粒狀物料；再將顆粒狀物料表面涂上顏色得到緩釋型生物防治劑。該緩釋型生物防治劑是通過人工拋曬，機械拋灑，禮花彈或航空拋灑的方式均勻植入農(nóng)田或林地，雖然從某種程度上能夠延長蟲生真菌孢子粉的釋放時間，但是卻無法延長其在地下的持效期。除此之外，cn101411338a公開了一種白僵菌顆粒劑,它是由白僵菌孢子粉1-20％、載體70-95％、粘合劑0.05-3％、崩解劑0.5-5％、助崩解劑0-2％、分散劑0.01-1％、抗紫外劑0.5-5％、潤滑劑0-3％、著色劑0-2％組成，各組分均為質(zhì)量百分比。該顆粒劑是先收集蟲生真菌孢子粉，再采用相應配方和工藝制成白僵菌顆粒劑，并通過相關助劑控制顆粒劑的崩解速度和分生孢子的釋放速度來延長持效期，雖具有緩釋作用，但是在防治地下害蟲時，顆粒劑表面容易被雜菌污染。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種蟲生真菌顆粒劑。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種蟲生真菌顆粒劑，包括顆粒載體和蟲生真菌孢子，其特征在于：所述顆粒載體為發(fā)酵過的天然農(nóng)作物顆?；蛉斯ず铣蔂I養(yǎng)顆粒，且需顆粒載體表面完好無損；所述蟲生真菌孢子為活化后的蟲生真菌孢子，所述蟲生真菌孢子包附(包裹附著)于所述顆粒載體表面。上述蟲生真菌顆粒劑由顆粒載體和活化后的蟲生真菌孢子構成，不含有任何粘合劑、潤滑劑等添加劑。將其施于土壤內(nèi)部后，顆粒載體表面不易被雜菌污染，且在土壤內(nèi)部可達2個月的持效期。為進一步防止顆粒劑表面被雜菌污染，所述顆粒載體的單位活孢數(shù)(本發(fā)明所述單位活孢數(shù)是指每克蟲生真菌顆粒劑中存在的活孢數(shù)量)為0.2-3億個孢子/克顆粒劑。進一步地，所述顆粒載體為發(fā)酵過的大米、小米、大麥、小麥、黃豆或西米中的一種或幾種組合；優(yōu)選大米、西米或小麥。進一步地，所述顆粒載體的粒徑為3-20mm。進一步地，所述蟲生真菌孢子為白僵菌分生孢子或綠僵菌分生孢子。本發(fā)明的另一目的在于提供一種蟲生真菌顆粒劑的制備方法。前述蟲生真菌顆粒劑的制備方法，其特征在于步驟如下：先將蟲生真菌菌種活化后接種于真菌液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2.5-3天后得到液體菌種，再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝1:100-1:10混合，攪拌均勻后培養(yǎng)4-15天，干燥后得到蟲生真菌顆粒劑。進一步地，先將蟲生真菌菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于真菌液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.5-3天得到液體菌種；再將大米、西米或小麥置于水中浸泡1-5小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝1:100-3:100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)5-12天，干燥后得到蟲生真菌顆粒劑。進一步地，所述真菌液體培養(yǎng)基為經(jīng)滅菌處理后的1/4sday液體培養(yǎng)基，且其蛋白胨含量0.25％、酵母浸提物含量0.5％、葡萄糖含量1.0％、瓊脂1.8％、其余為水。本發(fā)明蟲生真菌顆粒劑的制備方法是直接將液體菌種按照前述比例接種于所述顆粒載體(顆粒載體為發(fā)酵過的大米、小米、大麥、小麥、黃豆或西米中的一種或幾種組合，且需顆粒載體表面完好無損)上，在特定的條件下培養(yǎng)后得到蟲生真菌顆粒劑。本發(fā)明在不添加粘合劑、潤滑劑等添加劑的條件下制得蟲生真菌顆粒劑，制備過程簡單、實用，對于工業(yè)生產(chǎn)而言，大大降低了生產(chǎn)成本。相比于現(xiàn)有技術中的蟲生真菌顆粒劑，本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑既不含有任何粘合劑、潤滑劑、分散劑等添加劑，也不是由孢子粉混合配置而成，而是由所述顆粒載體和處于待繁殖狀態(tài)的蟲生真菌孢子構成。將本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑施于土壤內(nèi)部后，其表面不易被雜菌污染，且在土壤內(nèi)部具有長達2個月的持效期。相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑在施藥后的前20天內(nèi)具有很好的活性。經(jīng)試驗證明，將其施于土壤中后，蟲生真菌在前20天內(nèi)活孢數(shù)呈大幅上升趨勢。本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑還具有較好的防蟲效果，尤其適用于土壤內(nèi)部防治蠐螬、地老虎、金針蟲等地下害蟲。此外，本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑還能夠有效改善土壤板結，同時還能增強土壤供肥性，是一種集生物防蟲性能和土壤供肥性為一體的產(chǎn)品。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，在此指出以下實施例不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域普通技術人員根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，均在本發(fā)明保護范圍內(nèi)。除特殊說明外，所述百分比均為重量百分比；本發(fā)明中所述原料均是本領域普通技術人員知曉的市售產(chǎn)品，其中，真菌液體培養(yǎng)基為上海冠導生物工程有限公司生產(chǎn)的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基(1/4指的是培養(yǎng)基的強度)，本發(fā)明中所用菌種是由重慶大學基因工程中心提供；所述顆粒載體是指能夠為真菌生長提供營養(yǎng)物質(zhì)的天然農(nóng)作物顆粒(如大米、小米、大麥、小麥、豌豆、黃豆、玉米)或人工合成營養(yǎng)顆粒(如西米)。實施例1：先將金龜子綠僵菌(cqma421)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，于26℃條件下培養(yǎng)2.5天(60小時)得到液體菌種；再將粒徑為3mm的大米置于水中浸泡3小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)5天，干燥后得到0.2億個活孢/克的金龜子綠僵菌顆粒劑。實施例2：先將金龜子綠僵菌(cqma421)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.5天得到液體菌種；再將粒徑為3mm的大米置于水中浸泡3小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)7天，干燥后得到0.5億個活孢/克的金龜子綠僵菌顆粒劑。實施例3：先將金龜子綠僵菌(cqma421)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.5天得到液體菌種；再將大麥置于水中浸泡4小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)11天，干燥后得到1億個活孢/克的金龜子綠僵菌顆粒劑。實施例4：先將金龜子綠僵菌(cqma421)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.5天得到液體菌種；再將小米置于水中浸泡5小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)15天，干燥后得到2億個活孢/克的金龜子綠僵菌顆粒劑。實施例5：先將金龜子綠僵菌(cqma421)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)3天(72小時)得到液體菌種；再將粒徑為20mm的西米置于水中浸泡1小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)8天，干燥后得到1.5億個活孢/克的金龜子綠僵菌顆粒劑。實施例6：先將球孢白僵菌(cqbb007)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.5天(60小時)得到液體菌種；再將粒徑為3mm的小麥置于水中浸泡5小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝1：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)5天，干燥后得到0.5億個活孢/克的球孢白僵菌顆粒劑。實施例7：先將球孢白僵菌(cqbb007)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)3天(72小時)得到液體菌種；再將粒徑為8mm的黃豆與西米按照重量比＝1:1混合后置于水中浸泡2小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝3：100混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)8天，干燥后得到1.5億個活孢/克的球孢白僵菌顆粒劑。實施例8：先將球孢白僵菌(cqbb007)菌種置于1/4sday平板(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、瓊脂1.8％)上活化，然后將其接種于經(jīng)滅菌處理后的1/4sday薩氏液體培養(yǎng)基上，置于26℃條件下培養(yǎng)2.8天(67.2小時)得到液體菌種；再將粒徑為5mm的黃豆置于水中浸泡4小時，瀝干后作滅菌處理，冷卻后得到顆粒載體；再將液體菌種與顆粒載體按照質(zhì)量比＝1：10混合，攪拌均勻后置于26℃條件下培養(yǎng)12天，干燥后得到3億個活孢/克的球孢白僵菌顆粒劑。效果測試金龜子綠僵菌顆粒劑在土壤里繁殖情況測試：取實施例1中制備的金龜子綠僵菌顆粒劑與土壤(土層厚20cm)按重量比＝1：100混合后轉(zhuǎn)入粒徑為10cm塑料缽中，置于25℃恒溫箱中。在第5天收取塑料缽內(nèi)的土樣(土樣為取自5個不同點位的混合土樣)，取10克土樣用0.05％的吐溫-80分散過濾制得10kg濾液，所得濾液經(jīng)離心10分鐘后收集金龜子綠僵孢子，再用0.05％的吐溫-80分散金龜子綠僵孢子得到稀釋液。將所得稀釋液涂覆在篩選培養(yǎng)基上(含0.2mg/ml氨芐青霉素、0.1％茶皂素的1/4sday平板)，于26℃條件下培養(yǎng)48小時，統(tǒng)計1/4sday平板上的綠僵菌數(shù)量，并計算土壤的活孢數(shù)，結果見表1；參照前述方法，分別在第0天、第10天、第20天、第30天、第45天、第60天收取塑料缽內(nèi)的土樣，分別統(tǒng)計1/4sday平板上的金龜子綠僵菌數(shù)量，并計算土壤的活孢數(shù)，結果見表1。參照前述方法，分別測試實施例2-5中的金龜子綠僵菌顆粒劑在土壤中的孢子繁殖情況，結果見表1。選用包括硅藻土和金龜子綠僵菌(cqma421)孢子粉制得的含量為2.0億活孢數(shù)/克的粉劑作為對照組1，參照前述方法統(tǒng)計1/4sday平板上的綠僵菌數(shù)量，并計算土壤的活孢數(shù)，重復3次取平均值，結果見表1；表1土壤中金龜子綠僵菌的活孢數(shù)(104活孢子/克土壤)從表1可以看出，在第0-20天，土壤中活孢數(shù)明顯增加，表面金龜子綠僵菌顆粒劑表層的孢子能利用顆粒中營養(yǎng)進行生長繁殖并在顆粒表面長滿新的孢子。第10天孢子數(shù)量增加了5-50倍，其中實施例1中顆粒劑的活孢數(shù)可達到695×104活孢子/克，高于對照組粉劑的活孢數(shù)的(65×104活孢子/克)10倍。而且在第60天，仍然能在土壤中仍檢測到活孢子(4-6×104活孢子/克)，相比于對照組1中的粉劑，其持效期延長了近30天。球孢白僵菌顆粒劑在土壤里繁殖情況測試：參照金龜子綠僵菌顆粒劑在土壤里繁殖情況測試方法，分別統(tǒng)計1/4sday平板上的球孢白僵菌數(shù)量，并計算土壤的活孢數(shù)，結果見表2；選用包括硅藻土和球孢白綠僵菌(cqbb007)孢子粉制得的含量為3億活孢數(shù)/克的粉劑作為對照組1，參照前述方法統(tǒng)計1/4sday平板上的綠僵菌數(shù)量，并計算土壤的活孢數(shù)，重復3次取平均值，結果見表2；表2土壤中金球孢白綠僵菌的活孢數(shù)(104活孢子/克土壤)實施例0天10天20天30天40天50天實施例6中顆粒劑228±391129±62a481±46277±21139±3324±11實施例7中顆粒劑128±271198±49a482±44281±32146±2416±8實施例8中顆粒劑35±111078±54a445±51269±23131±1913±5對照組2中的粉劑269±35155±23b22±13無無無從表2可以看出，在第0-10天，土壤中活孢數(shù)明顯增加，表面球孢白僵菌菌顆粒劑表層的孢子能利用顆粒中營養(yǎng)進行生長繁殖并在顆粒表面長滿新的孢子。第10天孢子數(shù)量增加了5-30倍，其中實施例6中顆粒劑的活孢數(shù)可達到1129×104活孢子/克，高于對照組粉劑的活孢數(shù)(155×104活孢子/克)的7倍。而且在第50天，仍然能在土壤中仍檢測到活孢子(13-24×104活孢子/克)，相比于對照組2中的粉劑，其持效期可達50天。顆粒劑上雜菌生長情況測試：取實施例1中制備的金龜子綠僵菌顆粒劑與土壤(土層厚20cm)按重量比＝1：100混合后轉(zhuǎn)入粒徑為10cm塑料缽中，置于25℃恒溫箱中。分別在第0天、第10天和15天收取塑料缽內(nèi)的土樣(土樣為取自5個不同點位的混合土樣)，取10克土樣用0.05％的吐溫-80分散過濾制得10kg濾液，所得濾液經(jīng)離心10分鐘后收集孢子，再用0.05％的吐溫-80分散孢子稀釋液10倍梯度稀釋后涂覆在篩選培養(yǎng)基上(含0.2mg/ml氨芐青霉素、0.1％茶皂素的1/4sday平板)，于26℃條件下培養(yǎng)48小時，統(tǒng)計1/4sday平板上的雜菌(曲霉、青霉)量，結果見表3。參照前述方法，測試實施例6中制備的球孢白僵菌顆粒劑表面雜菌生長情況，結對照組3：參照前述方法，測試cn101411338a中公開的白僵菌顆粒劑在土壤中的雜菌生長情況；對照組4：取實施例1中制備的金龜子綠僵菌顆粒劑，采用攪拌機(九陽jyl-c012)攪碎后(綠僵菌顆粒劑攪碎后相當于粉劑)按前述方法測定土壤中雜菌(曲霉、青霉)量，結果見表3；表3雜菌數(shù)量(104個/克土壤)從表3可以看出，在第0天，不同處理土壤中雜菌量差異不大，雜菌量在22-26×104個/克土壤之間；在第10天和15天，實施例1中顆粒劑和實施例6中顆粒劑雜菌數(shù)與對照差異不大，但是對照組3和對照組4中雜菌量大幅增加至178-280×104個/克土壤，表明完整的顆粒劑表層能有效阻礙雜菌的繁殖。此外，經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，對照組3中雜菌大量集中于顆粒劑表面的縫隙處，對照組3中雜菌大量集中于顆粒劑的斷面處，當顆粒劑存在斷面或者有縫隙時，土壤中的雜菌容易侵入顆粒劑的斷面或縫隙處，進而通過吸取營養(yǎng)物質(zhì)快速生長繁殖。金龜子綠僵菌顆粒劑的田間防效：選用本發(fā)明實施例1和實施例2制得的顆粒劑，分別將其按2公斤/畝的用量施于甘蔗種植溝中，覆土種植；選用普通市售金龜子綠僵菌孢子粉與硅藻土混合后配成含量為2.0億孢子活孢數(shù)/克的粉劑，將其按2公斤/畝的用量施于甘蔗種植溝中，覆土種植，作為對照組3。定期隨機抽查5點土樣中的活孢數(shù)的數(shù)量，其平均值見表4；定期隨機抽查甘蔗作物種植溝中以及未施藥土壤中的蠐螬數(shù)量，以10株為一組，計算每組的平均蠐螬數(shù)，并計算金龜子綠僵菌顆粒劑的防效(防效＝100×(未施藥處理組蠐螬數(shù)—處理組蠐螬數(shù))/未施藥處理組蠐螬數(shù))，結果見表5：表4田間土壤中的綠僵菌活孢數(shù)(104活孢子/克土壤)實施例0天10天20天30天50天60天實施例1中顆粒劑23±18408±55715±51337±2381±149±5實施例2中顆粒劑76±31478±55745±51369±2396±1413±5對照組3中的粉劑229±25115±3326±14無無無從表4可以看出，綠僵菌顆粒劑施于田間后，綠僵菌活孢子逐漸上升，第20天達到最高值，之后逐漸下降，在第60天還能檢測到綠僵菌活孢數(shù)，表明綠僵菌在田間土壤中也存在生長和繁殖過程，自第10天后，使用綠僵菌顆粒劑處理后土壤中的活孢數(shù)明顯高于對照組3中的粉劑；而對照組3中的粉劑施于田間后活孢數(shù)逐漸下降，30天之后檢測不到綠僵菌活孢數(shù)；表5綠僵菌顆粒劑的田間防效從表5可以看出，在第20天后，施用本發(fā)明綠僵菌顆粒劑區(qū)域的蠐螬數(shù)顯著低于對照組和未施藥區(qū)域的蠐螬數(shù)；在施藥后第45天至第60天，綠僵菌顆粒劑處理仍有較高的防效，而對照組中粉劑防效迅速下降，表明本發(fā)明綠僵菌顆粒劑對蠐螬的持續(xù)防治時間較長，且持效期可達60天。球孢白僵菌顆粒劑的田間防效選用本發(fā)明實施例5和實施例8制得的顆粒劑，分別將其按3公斤/畝的用量施于小白菜種植溝中，覆土種植。定期隨機抽查小白菜根莖附近以及未施藥土壤中的地老虎數(shù)，統(tǒng)計25株/組中的地老虎數(shù)，并計算球孢白僵菌顆粒劑的防效(防效＝100×(未施藥處理組地老虎數(shù)—處理組地老虎數(shù))/未施藥處理組地老虎數(shù))，結果見表6；表6球孢白僵菌顆粒劑的田間防效從表6可以看出，在10天以內(nèi)，施用本發(fā)明球孢白僵菌顆粒劑區(qū)域的地老虎數(shù)量均少于2只，在施藥后第40天，球孢白僵菌顆粒劑仍有防效，表明其持效期可達40天，且在40天內(nèi)防效下降較慢。此外，本發(fā)明所述蟲生真菌顆粒劑采用營養(yǎng)顆粒作為載體，在助力于蟲生真菌的繁殖過程中還可以作為有機肥料供作物生長，同時達到改良土壤的作用。當前第1頁12