本發(fā)明屬于骨科植入物材料領域，具體涉及納米級β-磷酸三鈣的制備方法，尤其是一種用高能球磨法制備納米β-磷酸三鈣的方法。

背景技術：

人體骨由無機物、有機物和水共同組成，無機物主要為納米級羥基磷灰石。β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)是最常見的一種生物活性材料，鈣/磷比與羥基磷灰石接近，與骨基質的無機成分相似，且降解速度快于羥基磷灰石，可以與骨組織很好的接合，具有良好的生物相容性，目前已在臨床上廣泛應用。作為生物降解材料，β-TCP既可以單獨制成多孔支架材料應用于各部位骨缺損的修復，也可以與有機材料復合制成高強度可降解骨科植入物材料，如螺釘、鋼板等。

隨著納米科學技術在醫(yī)學的應用，納米級β-TCP材料的研制和應用也引起了國內外學者的廣泛關注。納米級β-TCP顆粒的粒徑、晶粒尺寸和寬度都只限于納米量級的水平，減少了材料的內在缺陷，同時具有納米材料的表面效應、體積效應優(yōu)勢，在力學和生物學方面有很大的優(yōu)越性和應用潛力。納米級β-TCP與人體骨成分的納米羥基磷灰石結構非常相似，十分有利與骨組織的整合，適合骨細胞爬入，且溶解性能較微米級β-TCP也有很大提高。

目前制備納米級β-TCP的方法主要采用化學合成法，存在著工藝復雜、對場地和生產設備要求高和易摻入其他物質等缺點。

因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種工藝簡單、產生雜質少的納米級β-TCP制備方法。

技術實現要素：

為實現上述目的，本發(fā)明提供了一種通過高能球磨法將微米級β-TCP顆粒加工成納米級β-TCP顆粒的方法。

具體地，本發(fā)明提供的納米級β-磷酸三鈣的制備方法包括以下步驟：

1)準備符合外科植入物用β-TCP標準的微米級β-TCP顆粒作為原料；

2)將微米級β-TCP顆粒分散在一縮二乙二醇中，以氧化鋯珠為球磨介質進行高速球磨，直至微米級β-TCP顆粒細化為納米級顆粒；

3)離心，去除一縮二乙二醇；

4)用二氯甲烷漂洗后真空干燥。

其中，所述微米級β-TCP顆粒的粒徑范圍為75-100μm，所述納米級β-TCP顆粒的粒徑范圍為20-160nm。

優(yōu)選地，步驟2)中高速球磨的轉速為1600-2000r/min，最佳為1800r/min。

優(yōu)選地，步驟2)中高速球磨的時間為8-16小時，最佳為12小時。

優(yōu)選地，步驟3)中離心的轉速為1000-1400r/min，最佳為1200r/min，時間為12-18min，最佳為15min。

本發(fā)明制備的納米級β-磷酸三鈣可應用于聚乳酸(PLA)/納米β-磷酸三鈣復合材料的制備，制得的聚乳酸/納米β-磷酸三鈣復合材料自身具備可降解性，同時由于加入了β-TCP，使得復合材料具有良好的骨誘導性和骨傳導性。

其制備方法包括以下步驟：

A)將根據本發(fā)明方法制得的納米級β-TCP顆粒與PLA按一定比例混合，溶于有機溶劑中配制成復合溶液，澆筑并干燥成膜；

B)通過取向模壓法將膜加工為具有一定形狀的PLA/納米β-TCP復合材料。

優(yōu)選地，步驟A)中所述納米級β-TCP顆粒與PLA的質量比為1:1-1:9；最佳地，所述納米級β-TCP顆粒與PLA的質量比為3:7；所述有機溶劑為二氯甲烷。

優(yōu)選地，步驟A)中配制溶液的步驟包括攪拌和超聲混合；所述澆筑的步驟為將復合溶液倒入平底玻璃皿中；所述干燥為真空干燥。

優(yōu)選地，步驟B)中所述模壓法的具體步驟為：取步驟A)獲得的PLA/納米β-TCP膜在100-120℃，250-270MPa下熔融壓制成型；較佳的壓制形狀為圓柱形。

上述高強度復合材料作為骨科內固定材料既可提供力學支撐，在骨折愈合后材料又可自行降解，無需二次手術取出，可通過機器的切削加工工藝，將復合材料棒材制備成骨科內固定植入物，如鋼板、螺釘、融合器等，具有良好的臨床應用前景。

本發(fā)明制備的納米級β-磷酸三鈣還可進一步應用于聚乳酸(PLA)/納米β-磷酸三鈣復合多孔支架的制備，制得的復合多孔支架具有合適的孔徑、孔隙率、力學性能以及成骨活性。

其制備方法包括以下步驟：

a)稱取一定量的PLA溶于二氧六環(huán)中配成PLA溶液，另稱取由本發(fā)明方法制得的納米級β-TCP顆粒加入PLA溶液中，超聲分散并攪拌均勻；

b)將溶液倒入特制聚四氟乙烯模具中后，液氮淬冷；

c)置于-20～-40℃的低溫冰箱中冷凍20～28小時，再置入-60～-50℃冷凍干燥器中干燥；

d)從模具中取出，洗凈，常溫干燥后得到PLA/納米β-TCP復合多孔支架。

優(yōu)選地，步驟a)中所述PLA溶液的濃度為1.2～1.8wt％，超聲分散的時間為30～50分鐘；加入納米級β-TCP顆粒后，溶液中納米級β-TCP顆粒與PLA的質量比為1:1-1:9，最佳地，所述納米級β-TCP顆粒與PLA的質量比為3:7。

優(yōu)選地，步驟c)中在冷凍干燥器中的干燥時間為20～28小時。

優(yōu)選地，步驟d)中洗凈采用蒸餾水洗凈。

本發(fā)明利用球磨機的高速轉動和強烈的撞擊和研磨作用，將外科植入用微米級β-TCP晶粒細化為納米級β-TCP晶粒，所用原料為微米級β-TCP，其本身化學和結晶性質符合外科植入物用β-磷酸三鈣的標準，加工的過程中不涉及化學合成、沉淀反應等，不易混入其他化學物質；且步驟簡單，加工后的顆粒除粒徑改變外，化學和結晶性質未發(fā)生變化，保證了β-TCP的純度和安全性，獲得的納米級β-TCP顆?？勺鳛樯锝到獠牧?，β-TCP既可以單獨制成多孔支架材料應用于各部位骨缺損的修復，也可以與有機材料復合制成高強度可降解骨科植入物材料，如螺釘、鋼板等。

以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是透射電鏡中觀察到的制備的納米級β-TCP顆粒；

圖2是動態(tài)光散射測得的納米級β-TCP粒徑分布；

圖3是圓柱形聚乳酸/納米β-磷酸三鈣復合材料棒材的熱壓加工示意圖；

圖4是不同β-TCP含量材料隨降解時間的壓縮強度變化圖；

圖5是不同β-TCP含量材料隨降解時間的抗彎強度變化圖；

圖6是不同β-TCP含量材料對成纖維細胞細胞活性的影響；

圖7是透射電鏡中觀察到的不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的孔徑；

圖8是不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的孔隙率隨降解變化的統(tǒng)計圖；

圖9是不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的壓縮強度隨降解變化的統(tǒng)計圖；

圖10是不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架載rhBMP-2后植入兔背部肌肉內后分別在2、4、8周觀察到的組織切片圖；

圖11是不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架載rhBMP-2后植入兔背部肌肉內后分別在第4和8周的成骨面積的統(tǒng)計圖。

具體實施方式

實施例1納米級β-磷酸三鈣的制備

1)準備符合外科植入物用β-TCP標準的微米級β-TCP顆粒作為原料；

2)將微米級β-TCP顆粒分散在一縮二乙二醇分散液中，以氧化鋯珠為球磨介質，以1800r/min的轉速連續(xù)球磨12小時；

3)離心，去除一縮二乙二醇分散液；

4)用二氯甲烷漂洗后真空干燥，然后保存。

實施例2透射電鏡和動態(tài)光散射分析驗證

通過H-7000透射電鏡觀察實施例1制得的β-TCP顆粒粒徑，采用的加速電壓為75KV。通過動態(tài)光散射測試所制得的β-TCP顆粒粒徑。Zetasizer Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定聚合物藥物的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數：He-Ne激光(波長635nm)，折光率和粘度分別為n＝1.333和η＝0.933cp，測定溫度25℃。電勢測定參數：He-Ne激光(波長635nm)，散射角θ＝14°，測定溫度25℃。

通過TEM觀察制備的納米級β-TCP顆粒，顆粒呈不規(guī)則形態(tài)，粒徑范圍為20-160nm(如圖1A，B)。通過動態(tài)光散射觀察發(fā)現制備的納米級β-TCP顆粒在液體中粒徑均勻分布，平均粒徑為125nm(如圖2)。

實施例3聚乳酸/納米β-磷酸三鈣復合材料的制備

1)根據需要按比例稱量納米級β-TCP顆粒與PLA，其中β-TCP的含量分別為10wt％、30wt％、50wt％，用二氯甲烷配制成復合溶液，攪拌并超聲混合均勻后獲得PLA/納米β-TCP復合物溶液，將該溶液倒入平底玻璃皿中，并真空干燥，即得PLA/納米β-TCP復合物膜；

2)取PLA/納米β-TCP復合物膜，在110℃、260MPa下熔融壓制成10×20mm(底面直徑×高)的圓柱形型坯，熱壓成型(熱壓加工示意圖如圖3所示，其中1為復合物膜，其余為加工模具)，快速冷卻，脫模，即可制得不同配比的高強度PLA/納米β-TCP復合材料的棒材。

實施例4不同β-TCP含量材料的力學性能測定

本實施例對實施例3中不同β-TCP含量材料(0wt％、10wt％、30wt％、50wt％)的力學性能進行了測定。

圖4所示為純PLA、β-TCP含量10wt％(P10)、β-TCP含量30wt％(P30)、β-TCP含量50wt％(P50)的各材料在PBS溶液中分別降解15、20、25、30周后的壓縮強度性能變化，從圖中可見含50wt％β-TCP的復合材料初始壓縮強度最好，其次為含30wt％，再次為10wt％，三種復合材料的初始壓縮強度均高于純PLA材料。隨著降解進行，壓縮強度下降，至降解25周后復合材料的壓縮強度才接近或低于純PLA。

圖5所示為上述四組材料在PBS溶液中分別降解15、20、25、30周后的抗彎強度性能變化，從圖中可見β-TCP含量為50wt％的復合材料初始抗彎強度最差，而含30wt％β-TCP的復合材料在第30周時仍有較好的抗彎強度，與純PLA接近。

實施例5不同β-TCP含量材料的生物相容性測定

本實施例對不同β-TCP含量材料(0wt％、10wt％、30wt％、50wt％)的生物相容性進行了測定，用上述各組材料配制的溶液對(L929)成纖維細胞進行了細胞活力的MTT實驗，溶液的孵育時間為5天。

實驗結果如圖6所示，1mg/ml濃度的純PLA對細胞產生的毒性最大，而1mg/ml濃度的三種復合材料的細胞毒性都小于PLA組，而0.1mg/ml與0.01mg/ml各組的毒性都很小與對照組無顯著差異，且復合材料組的毒性也都小于PLA組的毒性，可見PLA/納米β-TCP復合材料的生物相容性非常好。

實施例6聚乳酸/納米β-磷酸三鈣復合多孔支架的制備

1)精密稱取一定量的PLA溶于二氧六環(huán)中，配成1.5wt％的PLA溶液，另分別根據PLA質量稱量1:9、3:7及5:5質量比(PLA：納米級β-TCP)的納米級β-TCP顆粒，同法稱量3：7質量比(PLA：微米級β-TCP)的微米級β-TCP顆粒，分別加入已配比的PLA溶液中，低速攪拌混勻一分鐘，使其混合均勻，超聲分散40分鐘，攪拌均勻；

2)將溶液倒入特制聚四氟乙烯模具(底面直徑11mm，高度22mm)后液氮淬冷；

3)將步驟2)淬冷后的聚四氟乙烯模具置于-30℃的低溫冰箱中冷凍24小時，再置入-55℃冷凍干燥器中干燥1天；

4)從模具中取出放入燒杯中，用蒸餾水洗凈后，常溫干燥得到PLA多孔支架，納米β-TCP含量分別為10wt％、30wt％、50wt％的PLA/納米β-TCP復合多孔支架，及含30wt％微米級β-TCP顆粒的PLA復合多孔支架。

實施例7不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的孔徑，以及在PBS溶液中降解8周、26周的電鏡觀察測定

觀察結果如圖7所示，圖中PLA表示純PLA組，PLA/10nmβ-TCP表示納米β-TCP含量為10wt％組，PLA/30μmβ-TCP表示微米β-TCP含量為30wt％組，以此類推，圖中的標尺為300μm。從圖中可知降解前各組支架孔徑形態(tài)均一，純PLA多孔支架孔壁光滑，而復合材料組孔壁則有β-TCP附著。降解前8周各組多孔支架孔形態(tài)均無明顯變化，而在26周時部分支架孔壁降解，小孔徑孔壁融合形成大孔。PLA/50nmβ-TCP組多孔支架降解最為明顯，其次為PLA/30nmβ-TCP組和PLA/10nmβ-TCP組。此外PLA/30nmβ-TCP多孔支架降解快于PLA/10μmβ-TCP組。

實施例8不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架在PBS溶液中降解26周的孔隙率變化測定

測定結果如圖8所示，降解前所有組的多孔支架的孔隙率無明顯差異，均在73～74％，β-TCP含量不影響支架的孔隙率。降解過程中各組支架孔隙率都呈增加趨勢，而7周后PLA/50nmβ-TCP組孔隙率增加最為顯著，明顯快于PLA/10nmβ-TCP組多孔支架和PLA/30nmβ-TCP組多孔支架。在26周降解過程中PLA/30nmβ-TCP組和PLA/30μmβ-TCP組多孔支架孔隙率無明顯差異。

實施例9不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的壓縮強度隨降解時間的變化測定

測定結果如圖9所示，在26周降解過程中，各組支架的壓縮強度均呈下降趨勢，納米級β-TCP含量直接影響支架的初始力學性能。其中PLA/30nmβ-TCP組多孔支架在降解16周后壓縮強度仍接近1.0MPa，而降解過程中PLA/30nmβ-TCP組多孔支架和PLA/30μmβ-TCP多孔支架的壓縮強度并無顯著差異。

實施例10不同粒徑β-TCP顆粒和不同納米β-TCP含量復合多孔支架的成骨活性測定

分別將以上5種多孔支架載rhBMP-2后植入兔背部肌肉內，分別于術后2、4、8周取出植入的多孔支架用于組織學觀察(HE染色、骨鈣素免疫組化)，結果如圖10所示，30wt％和50wt％納米β-TCP組的成骨效率最高。

然后還統(tǒng)計分析了成骨面積，結果如圖11所示(a、b、c、d分別表示成骨面積大小與PLA組、PLA/10nmβ-TCP組、PLA/30μmβ-TCP組、PLA/30nmβ-TCP組多孔材料差異有統(tǒng)計學意義)，第4周取出的各組支架均可觀察到一定數量新骨生成，其中PLA/30μmβ-TCP組、PLA/30nmβ-TCP組和PLA/50nmβ-TCP組新生骨量顯著多于純PLA支架組和PLA/10nmβ-TCP支架組。第8周時，PLA/30nmβ-TCP支架成骨面積約為32.4±1.6％，顯著高于PLA/30μmβ-TCP多孔支架組(24.3±0.5％)、PLA/10nmβ-TCP多孔支架組(21.3±1.2％)和純PLA支架組(9.2±1.1％)(p<0.05)，而PLA/30nmβ-TCP多孔支架組與PLA/50nmβ-TCP(33.2±1.5)多孔支架組成骨面積差異無統(tǒng)計學意義。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。