專利名稱：一種聚合物基三維生物芯片的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物芯片制備技術領域，具體涉及光引發(fā)聚合物膜表面活性接枝聚合及共價固定基因、蛋白質及其他生物組分來制備生物芯片的方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的順利完成，基因芯片技術得到進一步的完善和發(fā)展。然而，很多研究表明:僅從基因組學的研究并不能完整得到生物功能的信息。盡管基因芯片在生物醫(yī)學研究領域獲得了廣泛的應用，但它只能檢測DNA和RNA，這種以核酸為基礎的芯片檢測只能間接提供蛋白質的信息。因此研究者們將研究聚焦到了蛋白質芯片、糖芯片、細胞芯片上。蛋白質是生命活動體現者，多糖能一定程度地反應生命活動的水平，細胞是生物學機器。深入研究生物芯片，使其更好的運用于醫(yī)學和生物研究，是目前生物芯片技術研究和開發(fā)的重點內容。生物芯片技術利用了特定功能性基團與生物組分化學鍵合的特性，在載體表面通過不同的方式連接上氣基、竣基、醒基、輕基、疏基、環(huán)氧基等基團后，使表面與DNA、抗體、多肽等生物組分發(fā)生化學反應，最終連接上生物組分形成生物芯片。生物芯片技術的優(yōu)點主要體現在:所需的生物組分含量劑量少；能夠快速、高通量定量分析樣品。生物芯片技術本身也面臨著諸多函待解決的問題:(I)生物芯片載體往往親水性不夠好，極易發(fā)生生物組分的吸附，及表面被生物組分提前污染，導致后續(xù)試驗受到影響，同時熒光背景增大，不利醫(yī)學觀察；(2)表面二維結構決定了能結合生物組分的量極為有限，無法形成大容量的生物組分容器，導致熒光強度不高，不利于醫(yī)學觀察；(3)生物芯片制作速度很慢，這取決于傳統(tǒng)的點樣機將微升至納升的樣品加到芯片載體表面的速度，對儀器的依賴性太強；(4)生物芯片在靈敏性、可重復性方面有待進一步提聞；(5)昂貴的精密點樣設備一定程度上限制 了生物芯片的發(fā)展；(6)生物組分樣品來源不足；等等。從醫(yī)學觀察的角度來看，選擇一個理想的芯片載體以降低其背景強度，增加生物組分的連接容量就顯得尤為重要。目前常用的生物芯片載體大多是無機材料，如硅片、玻片和金屬等，這些材料具有表面平整、不易變形、熒光本底低的優(yōu)點。更重要的是，對于傳統(tǒng)的無機和金屬材料，由于表面高活性羥基，氫或配位點的存在，已經有一套成熟的實驗室和工業(yè)表面化學修飾方法，并被廣泛用于生物芯片的表面處理。如用堿液處理過的玻璃片吸附聚賴氨酸以引入胺基；用硅烷偶聯劑在玻璃片表面引入胺基、醛基等官能團。但是，與無機載體相比，合成高分子載體具有低比重、柔性、低成本、易加工成型等優(yōu)良特性，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產及與微流體裝置整合為芯片實驗室，有替代無機基材的趨勢，已逐漸成為發(fā)展/實用生物芯片載體的主體方向。雖然在傳統(tǒng)的Soy thern印跡法中常用的硝酸纖維素薄膜、尼龍膜等也已被用于芯片載體，并且這些膜材料由于多孔性而能大大提高生物分子的吸附量，但是也存在微陣列點易擴散、陣點密度低、背景熒光隨檢測次數增強、雜交速度慢的缺點，制約了其實際應用。因此，目前發(fā)展的聚合物載體都為致密的實性材料，常用的基材為環(huán)烯烴共聚物COC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA和聚碳酸酯PC等。因此，有必要設計合成一種陣點密度高、低背景、高熒光強度的生物芯片載體，合成生物芯片具備更好的醫(yī)學觀察特征。

發(fā)明內容
為克服上述現有技術中的缺陷，本發(fā)明提供了一種聚合物基三維生物芯片，芯片載體以聚合物為基體，由紫外/可見光引發(fā)活性聚合形成的多層聚合物復合膜，結構為三維凝膠微陣列結構，具有抗生物組分污染的特性，同時能夠連接大容量的生物組分，最終得到低背景、高強度的生物芯片。該生物芯片的制備方法簡便，設備要求低，價格低廉；芯片上的生物分子密度高，背景強度低，熒光信號強，利于醫(yī)學觀察和科學研究。為了實現上述發(fā)明任務，本發(fā)明提供的技術方案如下:(1)將光引發(fā)劑的溶液涂覆在聚合物基材表面或將聚合物基材浸潰在光引發(fā)劑溶液中，通過紫外/可見光照射激發(fā)使光引發(fā)劑奪取聚合物基材表面上的氫原子，并在表面引入半頻哪醇休眠基。用大量溶劑洗去表面吸附或殘留的光引發(fā)劑，干燥后低溫儲存。(2)在紫外光/可見光照射下，半頻哪醇休眠基團斷裂，生成表面自由基和半頻哪醇自由基。表面自由基在光照條件下不斷引發(fā)抗生物污染性單體溶液進行可控聚合反應，形成第一層聚合物的接枝層，使表面具備抗核酸、蛋白質、多糖或細胞等生物吸附的性能。用大量溶劑徹底洗去表面吸附或殘留的單體或游離的聚合物后，干燥后低溫儲存。(3)在紫外光/可見光照射下，處于聚合物最外層的半頻哪醇休眠基團再次斷裂，生成表面自由基和半頻哪醇自由基，在光照及光掩模的掩蓋下，引發(fā)帶有氨基、羧基、巰基、醛基、羥基、環(huán)氧基其中一種或多種基團的烯類單體和交聯劑的單體溶液，發(fā)生活性自由基共聚合，形成第二層聚合物接枝層。該接枝層為三維微凝膠陣列，三維凝膠陣列中帶有用于固定生物組分的功能性基團。用大量溶劑徹底洗去表面吸附或殘留的單體或游離的聚合物后，干燥后低溫儲存。形成了三維高密度的生物芯片基材。(4)配置一定濃度的生物組分溶液，將生物芯片基材至于溶液中或者將生物溶液平鋪在基材表層，將在合適的溫度和濕度下，芯片載體上的大量高密度的功能性基團與生物組分溶液結合，形成生物芯片。所述光引發(fā)劑為(氧)硫雜蒽酮、(氧)硫雜蒽酮衍生物、二苯甲酮或二苯甲酮衍生物，用量為0.01 M 0.8 Mo所述紫外光(可見光)光源為可發(fā)射紫外光和可見光的設備，包括低壓、中壓、高壓汞燈，碘鎢燈，氙燈或鹵素燈。光強值為0.l-20mw/cm2。所述具備抗生物污染能力的單體包括:聚乙二醇類單體或兩性離子類單體。所述帶有結合生物組分的功能性基團的烯類單體為含有環(huán)氧基團、氨基、羧基、酸酐基、醛基、巰基中一種或多種基團的單體；交聯劑包括:PEG衍生物類交聯劑及其他含有多個雙鍵的交聯劑單體；交聯劑質量分數為0-60%。所述聚合物基材為聚合物鏈含有碳一氫鍵的能夠進行光引發(fā)劑奪氫反應的有機材料。包括聚合物基材為聚合物鏈含有碳一氫鍵的能夠進行光引發(fā)劑奪氫反應的有機材料。包括聚乙烯PE、聚乙烯PE共聚物、聚丙烯PP、聚丙烯PP共聚物、聚對苯二甲酸乙二醇酯PET、聚對苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA的共聚物、聚醋酸乙烯酯PVAC、聚碳酸酯PC、聚己內酯PCL、纖維素、纖維素酯、環(huán)氧樹脂、環(huán)烯烴共聚物COC、含氟單體共聚物或聚二甲基硅氧烷PDMS。所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:三維微陣列底面形狀可以是正方形、圓形或其他不規(guī)則圖形，三維凝膠微陣列的底面積為1-10000 μ m2，厚度為100_4000nm。所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:生物組分為蛋白質、核酸、多糖或細胞。該發(fā)明的優(yōu)點在于:1)在聚合物表層接枝的第一層為抗生物污染層，使表面有很好的親水性，具有很好的生物相容性，起到抗生物污染作用，使芯片背景強度低；2)接枝聚合的第二層帶有大量具備固定生物分子功能的功能性基團，為三維微凝膠陣列層，厚度可控，功能性基團數量可控，可以通過增加厚度使生物組分的密度增大，從而增大生物芯片的熒光強度；3)連接生物組分的凝膠微陣列層與基材通過共價鍵連接，復合結構提高了交聯網絡的機械強度，克服了凝膠網絡易被破壞的缺點，同時凝膠網絡的吸水性有利于生物組分的活性和穩(wěn)定，提高了生物組分的穩(wěn)定性。
具體實施例方式實施例1:將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于LDPE膜上方，取150 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為0.3Μ)注入雙層聚合物之間，然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結構，移入高壓汞燈照射裝置(功率1000W，光照強度為lOmW/cm2)中室溫下照射180秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小時以去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，于25°C的真空烘箱中干燥2h。

將150 μ L甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液(單體分子量1100，溶液濃度0.3Μ)滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP膜位于三明治結構上方，然后用兩片石英片壓實，移入鹵素燈照射裝置(功率200W，光照強度為3mW/cm2)，照射30min。將完成一層接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小時，去除表面吸附的單體及均聚物，于25°C的真空烘箱中干燥2h。將150μL混合溶液(PEGDA、GMA、丙酮，質量比為1:2:2 ;PEGDA分子量為575)滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP膜位于三明治結構上方，然后用兩片石英片壓實，上層石英片為光掩模。移入鹵素燈照射裝置(功率200W，光照強度為3mW/cm2)，室溫下照射20-90min。形成40 μ m直徑大小的圓形微陣列。將完成二層接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小時，去除表面吸附的單體及均聚物，于25°C的真空烘箱中干燥2h。將接枝后的復合膜置于700 μ L的500 μ g/mL的羅丹明熒光素標記的IgG蛋白溶液中，置于恒溫振蕩箱中反應。溫度設為30° C，轉速60r/min，反應時間2h。得到蛋白質芯片。水溶液沖洗后，于水溶液中浸泡30min。將蛋白質芯片平鋪在載玻片上，芯片表面保持濕潤。在熒光顯微鏡下觀察，并拍照，測量熒光強度。再將芯片置于原子力顯微鏡下掃描，測量凝膠陣列的形貌及其厚度。該實例設有6組實驗樣本，不同之處在于第二層光掩模再引發(fā)接枝時間分別為20min、30min、40min、50min、60min、90min。請考慮補充其他的實驗結果。例如機械強度，生
物組分的活性和穩(wěn)定，密度增大，生物相容性。其余實施例子修改參照本例子。表I不同時間對應凝膠層厚度及熒光強度差。
權利要求
1.一種聚合物基三維生物芯片的制備方法，包括以下步驟: 第一步，在UV照射下激發(fā)光引發(fā)劑，在聚合物膜表面共價連接光感應的半頻哪醇休眠自由基； 第二步，在UV/可見光的照射下，表面休眠基可逆斷裂/偶合，引發(fā)具備抗生物污染能力的單體發(fā)生表面活性接枝聚合，形成均勻平整的完全抗核酸、蛋白、多糖、細胞吸附的聚合物層； 第三步，在UV/可見光的照射下，光掩模遮蓋下，繼續(xù)利用第二步形成的抗污染層上的休眠基，實施二次區(qū)域選擇性活性表面接枝聚合，將帶有可結合生物組分的功能性基團的烯類單體與交聯劑單體接枝共聚，形成功能性基團密度和接枝層高度可控的三維微陣列構造; 第四步，將膜置于生物組分溶液中反應，得到聚合物基三維生物芯片。
2.如權利要求1所述的聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:光引發(fā)劑為(氧)硫雜蒽酮、(氧)硫雜蒽酮衍生物、二苯甲酮、二苯甲酮衍生物，濃度為0.0l M 0.8 M。
3.如權利要求1所述的聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:所用光源為低壓、中壓、高壓汞燈、碘鎢燈、氙燈或鹵素燈；光強值為0.l-20mW/cm2。
4.如權利要求1中所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:具備抗生物污染能力的單體包括:聚乙二醇類單體或兩性離子類單體。
5.如權利要求1中所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:第三步中，帶有結合生物組分的功能性基團的烯類單體為含有環(huán)氧基團、氨基、羧基、醛基、巰基、酸酐基中一種或多種基團的單體； 交聯劑為PEG衍生物類交聯劑或含有多個雙鍵的交聯劑單體；交聯劑質量分數為0-60%。
6.如權利要求1中所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:聚合物基材為聚合物鏈含有碳一氫鍵的能夠進行光引發(fā)劑奪氫反應的有機材料。包括聚乙烯PE、聚乙烯PE共聚物、聚丙烯PP、聚丙烯PP共聚物、聚對苯二甲酸乙二醇酯PET、聚對苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA的共聚物、聚醋酸乙烯酯PVAC、聚碳酸酯PC、聚己內酯PCL、纖維素、纖維素酯、環(huán)氧樹脂、環(huán)烯烴共聚物COC、含氟單體共聚物或聚二甲基硅氧烷PDMS。
7.如權利要求1中所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:三維微陣列底面形狀是正方形、圓形或不規(guī)則圖形，三維凝膠微陣列的底面積為1-10000 μ m2，厚度為100_4000nm。
8.如權利要求1中所述聚合物基三維生物芯片的制備方法，其特征在于:生物組分包括:蛋白質、核酸、多糖或細胞。
全文摘要
一種聚合物基三維生物芯片的制備方法屬于生物芯片制備技術領域。本發(fā)明公開了一種利用表面活性接枝聚合技術制備生物組分含量可控的三維生物芯片的方法。以聚合物膜為基底，先通過UV照射在膜表面耦合上半頻哪醇休眠基團，再通過可見光/紫外光接枝具有抗生物污染性能的單體，使表面具備抗生物污染性能，最后采用光掩膜在可見光/紫外光下再引發(fā)接枝單體混合溶液，單體混合溶液中含有可固定生物分子的功能性基團，最終得到厚度可控的表面功能性微凝膠陣列。利用該微陣列上的功能性基團與蛋白質、基因等生物組分結合，能形成價格低廉、工藝環(huán)保簡便、陣點密度高，生物分子的密度高，熒光信號強的新型三維生物芯片，具有很好的應用前景。
文檔編號C40B50/00GK103233274SQ20131016310
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權日2013年5月6日
發(fā)明者楊萬泰, 林志峰, 趙長穩(wěn), 馬育紅, 朱興, 閆煦, 陳睿超, 張麗華 申請人:北京化工大學