專利名稱：：固相及催化實現(xiàn)的自動同位素稀釋和物種化同位素稀釋質(zhì)譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種促進(jìn)濃縮同位素和標(biāo)記物種與天然同位素物種的平衡的方法，其使用同位素濃縮物種的固相固定(immobilize)以及分析興趣所在的天然物種和標(biāo)記物種的同位素在固相上的平衡和同時萃取、分離和/或選擇，還涉及提高IDMS和SIDMS的便攜性的方法以及其他提高效率及平衡和自動化的方法。相關(guān)技術(shù)的說明IDMS和SIDMS基于濃縮同位素與待測的嚴(yán)格物種分析物的平衡。本文引用了下列描述同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)和物種化同位素稀釋質(zhì)譜法(SIDMS)的專利以及平衡解決方案和這些專利的使用——參見U.S.PatNo.5,414,259和U.S.Pat.No.6,790,673Bl和U.S.Pat.No.6,974,951Bl、以及Pat.No.5，883，349、以及Pat.No.5,830,417和7,005,635B2、以及U.S.Pat.7,220,383B2、Pat.pendingNo.US2002/0198230Al，其公開了為了測量來制備樣品的方法以及測量樣品中存在的化學(xué)物種的方法，不僅測量其整體化學(xué)濃度，而且基于這些方法以提高的靈敏度、精度和效率進(jìn)行在線自動化測量。這些專利的公開以引用的方式明確并入本文。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種用于在使用固相同位素比平衡和測量的質(zhì)譜分析之前催化濃縮同位素物種與天然同位素物種的平衡的方法。本發(fā)明的基礎(chǔ)是用于興趣分析物的最終的定量和定性分析的分子、元素和物種化、以及定量和定性的樣品制備。該方法利用通過同時平衡相較于液相和氣相具有很多優(yōu)勢的固相來促進(jìn)平衡，并實現(xiàn)本領(lǐng)域已知的IDMS和SIDMS分析的自動化。這一創(chuàng)新使用固相和固定的濃縮同位素試劑、同位素濃縮分子制造試劑以及固相與固定相的平衡過程。使用算法來數(shù)學(xué)確定濃度并直接校正物種位移，無需對質(zhì)譜數(shù)據(jù)應(yīng)用校準(zhǔn)曲線。與常規(guī)的液/熱平衡和分離協(xié)議相比，通過固相樣品制備，平衡和分離分析物所需的時間顯著降低。為固相同位素增量(spiking)及平衡所制的試劑和產(chǎn)品在較長時間內(nèi)是穩(wěn)定的，因此可以進(jìn)行現(xiàn)場樣品制備，以及改進(jìn)保存和保存或裝運過程中與試劑和/或樣品的降解關(guān)聯(lián)的一系列保管問題。對于現(xiàn)場工作者和實驗分析人員來說，通過去掉幾個樣品制備及操作步驟，固相同位素增量和平衡使得易反應(yīng)和有毒物質(zhì)的處理以現(xiàn)場增量和平衡形式進(jìn)行比作為整體試劑溶液更加安全。樣品分析物和同位素濃縮和平衡試劑標(biāo)示或者在液相和/或氣相被洗脫(eludeoff)以用于分析，或者被表面電離到質(zhì)譜儀中直接在固相進(jìn)行分析。固相同位素增量和高速平衡提高了設(shè)計包括高度自動化和小型化的子系統(tǒng)的低成本、高吞吐量、可靠的樣品制備及分析系統(tǒng)的能力，從而可以設(shè)計高度便攜、現(xiàn)場實用的、精確、低故障的積極分析及檢測系統(tǒng)。這種現(xiàn)場實用的系統(tǒng)對于環(huán)境法醫(yī)學(xué)、國土安全和國防、工業(yè)合規(guī)、生物科學(xué)和臨床研究和臨床診斷將非常有用。一些國防和國土安全應(yīng)用包括監(jiān)測易揮發(fā)試劑(fugitiveagent)的多點飲用水網(wǎng)絡(luò)和戰(zhàn)場上用于保護(hù)武裝部隊的空氣/水/表面分析。在增長中的環(huán)境衛(wèi)生領(lǐng)域，這些系統(tǒng)對于評估接觸環(huán)境和食品中的工業(yè)毒素引起人類某些疾病的風(fēng)險也將是有用的。最后，這種系統(tǒng)可能成為幫助預(yù)測某些疾病的發(fā)生或減緩這些疾病的發(fā)展的工具，如孤獨癥、某些類型的癌癥、以及免疫退化性疾病，如阿爾茨海默氏癥，帕金森癥和糖尿病。下文將使用上述兩個概念進(jìn)行明確研究。圖1:通過GC-MS描述和分析的SPI-SPE平衡和分離含氧化合物的結(jié)果。圖2:通過GC-MS描述和分析在PAG-5柱上增量指示含氧化合物并在柱上進(jìn)行平衡和分離的結(jié)果。圖3:血清中的嗎啡，采用6ml、0.5g安捷倫Evidex，嗎啡IDMS同位素預(yù)增量C-13，在PSI-SPE柱上與樣品嗎啡平衡。圖4:使用同位素濃縮PSI-SPE并在柱上與天然同位素平衡的l，4-二氧六環(huán)和l，4二氯乙垸。圖5:生物降解對監(jiān)測水井樣品的影響。濃度以ppb表示，所示誤差表示為90%置信區(qū)間，n=3。圖6:校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣對比校準(zhǔn)盒(cartridge)。試劑水增量到2ppm，誤差表示為95%置信區(qū)間，n=4。圖7:校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣對比校準(zhǔn)盒。圖8:RF(響應(yīng)因子)比較。校準(zhǔn)RF對比RF4。圖9:微量滴定板(俯視圖)，8X12(96孔)格式制備的質(zhì)譜(IDMS和/或SIDMS)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，具有兩種不同類型的濃縮同位素修飾結(jié)合抗原的交替行。圖10:微量滴定板或表面修飾固相載體(側(cè)視圖)，具有兩種不同類型的濃縮同位素結(jié)合抗原的交替、分立的行。在用天然同位素樣品執(zhí)行ELISA法之前制備一同位素濃縮抗原作為固體表面的一部分?；蛘撸滔嗌喜淮嬖谕凰仡A(yù)裝抗原，并且在ELISA過程中，當(dāng)結(jié)合到抗體時濃縮和和非濃縮抗原兩者迅速平衡。圖ll:微量滴定板或表面修飾固相載體(側(cè)視圖)，有某一百分比的抗體事先已與同位素濃縮抗原結(jié)合。通過測量樣品中存在的同位素濃縮抗原的結(jié)合水平實現(xiàn)ELISA測量，其中所述結(jié)合水平是這兩組抗原之比的函數(shù)。圖12:微量滴定板或表面修飾固相載體(側(cè)視圖)，使用夾心系統(tǒng)、以及使用同位素濃縮抗原并測量兩種濃縮同位素稀釋劑之比的雙抗體和抗原分析。圖13:具有排列成兩個分立行的天然豐度生物標(biāo)記和同位素濃縮生物標(biāo)記的微量滴定板或表面修飾SELDI(表面增強激光解吸電離)板(側(cè)視圖)。圖14:用于SELDI或ELISA的8孔帶的俯視圖。圖15:固相表面修飾板，其具有16排交替的濃縮和天然的結(jié)合蛋白質(zhì)生物標(biāo)記或核酸探針，設(shè)置成高密度的微陣列格式。通過使用同位素濃縮和天然多元生物標(biāo)記或核苷酸并運用IDMS和/或SIDMS直接比率算法來進(jìn)行定量。圖16:質(zhì)譜讀出表明血液的同位素濃縮特異性物種增量甲基汞，乙基汞，無機汞和金屬汞。圖17:通過正模式ESI-TOF-MS，質(zhì)譜讀出顯示含20ppm的NaN3和20ppm的NaNN15N的水。圖18:通過負(fù)模式ESI-TOF-MS，質(zhì)譜讀出顯示含20ppm的NaN3和20ppm的NaNN15N的水樣。圖19:以正離子模式增量20ppmNaNN15N的20ppmNaN3的疊氮化鈉離子其中之一的質(zhì)譜特寫，所有天然峰在m/z88，所有同位素峰在m/z89。圖20:以負(fù)模式增量20ppmNaNN15N的20ppmNaN3的第一疊氮化鈉離子的質(zhì)譜特寫，所有天然峰在107，混合峰在108，所有同位素峰在109并具有1:2或1:3的用于定量的比率。圖21:質(zhì)譜讀出顯示該組分子物種中的很多同時比率和定量需要用于定量的多個公式和多個比率。這些采集到的圖形是在負(fù)模式下的DIH20中的20ppm的NaN3和20ppm的NaNN15N。每個圖形具有一個或多個疊氮化物峰。圖22:質(zhì)譜讀出顯示天然疊氮化物Na3(N3)4-(最左邊的峰)和疊氮化物Na3(N3)4的三個相應(yīng)的同位素濃縮標(biāo)記類似物-(具有不同數(shù)目的N15同位素和比率)之間的新的比率關(guān)系和多個峰。該圖示是負(fù)模式下增量了20ppm的NaNN15N的20ppm的NaN3的第三疊氮化鈉離子的特寫，所有天然峰在237，混合峰在238、239和240，(2X15N)同位素峰在241。圖23:負(fù)模式下增量20ppm的NaNN15N的20ppm的NaN3的第四疊氮化鈉離子的質(zhì)譜特寫，所有天然峰在302，混合峰在303、304、305和306，所有同位素峰在307。圖24:在正模式下增量了100ppm的K13C15N的100ppm(pg/g)的KCN的第四氰化鉀物種離子的納米ESI-TOF-MS的質(zhì)譜突出增強視圖，所有天然峰在299，同位素濃縮氰化鉀峰是在301、303和305的峰，所有同位素峰在307，每一個都用其同位素和天然碳和氮的混合物注釋。圖25:顯示固相增量和平衡的流程圖。圖26:顯示濃縮同位素增量和平衡方法的流程圖。圖27:甲基汞的同位素理論疊加和測量譜，其采用ESI-TOF-MS位于m/z338(通過ESI-TOF的甲基汞和巰基丙氨酸)。具體實施例方式在本文的使用中，"物種(species)"的使用與包含將被定量分析的物種的樣品有關(guān)，"物種"應(yīng)指任意的化學(xué)物種、離子物種、分子物種、以有機物種、有機金屬物種為例的合成物物種、以包含蛋白質(zhì)的金屬以及異質(zhì)和同質(zhì)碳物種為例的合成物物種、以及適合于本發(fā)明的化學(xué)定性和定量物種化分析的其他物種。問題與方案描述問題與方案討論目前，必須在測量之前進(jìn)行樣品制備。為了使用任意形式的IDMS禾Q/或SIDMS(包括特定物種同位素稀釋質(zhì)譜法-SSIDMS)，首先需要使物種分析物的濃縮同位素物種與天然同位素達(dá)到平衡。如果該步驟需要用幾天或者幾個小時的時間而儀器分析和自動化只需幾秒鐘的時間，則存在一時間差，其妨礙了IDMS和/或SIDMS的自動化應(yīng)用。如果樣品必須進(jìn)行萃取、分離或處理，則需要一種在進(jìn)行萃取和/或分離的同時還加速平衡的自動化方法。尚未具體確定這種通過加速平衡和IDMS/SIDMS自動化實現(xiàn)效率優(yōu)化、可重現(xiàn)性和時間節(jié)省的方法。本發(fā)明在此解決該問題，并實現(xiàn)穩(wěn)定和安全的毒素處理，這對于國防和國土安全領(lǐng)域、環(huán)境和環(huán)境法醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和工業(yè)管控一致性測量方面的應(yīng)用尤為重要。同位素稀釋(ID)和物種化同位素稀釋(SID)的使用需要天然和穩(wěn)定濃縮同位素物種類似物(以及放射性同位素物種類似物)的平衡，以建立通過質(zhì)譜儀測量的同位素比。ID和SID的使用允許直接定性和定量質(zhì)譜法產(chǎn)生對分析興趣所在的物種極其準(zhǔn)確的分析定量分析。因此，在應(yīng)用通過質(zhì)譜儀的ID和SID方法之前，精確和不變的同位素濃縮物種和天然同位素物種的平衡是絕對必要的。目前實現(xiàn)的平衡使用標(biāo)準(zhǔn)樣的熱處理方法，可能需要幾小時或幾天的時間。下文將提供這些老方法的一些示例。可以稀釋濃縮同位素溶液，使其不穩(wěn)定或使溶液中的多個物種可與濃縮同位素在使用前反應(yīng)。穩(wěn)定濃度下濃縮同位素在運輸時不一定是安全的。在本發(fā)明之前，只有具有很高的教育水平、技能和經(jīng)驗的人員才能把SIDMS和IDMS方法當(dāng)成工具來使用。經(jīng)驗不足和缺乏技術(shù)的人員可能不知道如何正確萃取物種，然后增量、平衡以實現(xiàn)定量。運輸、儲存、裝卸、實地使用、實驗室使用、定量轉(zhuǎn)移、樣品的平衡、分析物的萃取、分析物或基體的分離、以及分析物濃度計算對于缺乏經(jīng)驗的分析人員來說都是難以解決的。本發(fā)明描述的方法提高了濃縮同位素稀釋劑的穩(wěn)定性、分析興趣所在的增量物種、易用性、關(guān)鍵步驟的可靠性，其包括平衡和自動化，從而使得IDMS和SIDMS的實現(xiàn)和應(yīng)用為最低技能人員所通用，并解決常需要快速、可靠地分析大量樣品的商業(yè)實驗室的高吞吐量需求。自從現(xiàn)代色譜法在19世紀(jì)中期發(fā)展起來，利用固相吸附劑從基質(zhì)分離出分析物已為人們所熟悉。然而尚未實現(xiàn)如本文所公開的，利用固相吸附劑來平衡濃縮穩(wěn)定同位素物種以及分離基質(zhì)與分析物，從而提高IDMS和SIDMS的適用性和可用性。在本發(fā)明中，利用具有各種不同性質(zhì)的固相物質(zhì)來保存濃縮同位素物種，然后出于樣品制備、樣品儲存或安全目的，將它們提供到實驗室或?qū)嵉噩F(xiàn)場，從而稀釋劑已在固相中而不是在需要處理的試劑溶液中。用于保存濃縮同位素物種的同一固相也可以用來萃取分析物物種。這里采用的固相選自于離子交換、吸附介質(zhì)、固相萃取樹脂、樹脂膠合固相(resinbondedsolidphase)、表面修飾過濾器、固定液體萃取(ILE)中使用的二態(tài)液體、以及纖維的群組，如固相微萃取(SPME)。將同位素濃縮分子或離子物種化學(xué)或物理地穩(wěn)定或捕捉或保持在固相、層析或萃取物質(zhì)上。然后向含有分析興趣所在的物種的樣品中添加天然樣品物質(zhì)興趣物種，其通過能將該物種保持在該介質(zhì)上的該介質(zhì)的適當(dāng)機制保持。該過程可以逆轉(zhuǎn)，可在平衡關(guān)系中洗脫濃縮物種和天然物種。其結(jié)果是，該物種將取得平衡，并且當(dāng)從固定相或固相萃取或?qū)游鼋橘|(zhì)洗脫興趣物種時，樣品混合物是平衡的同位素濃縮物質(zhì)和天然同位素物質(zhì)的組合，已為ID和SID質(zhì)譜法做好準(zhǔn)備。在這些情況下，電離方法將專用于溶液或氣相，例如電噴霧電離(ESI)或納米電噴霧(Nano-ESI)、或大氣壓化學(xué)電離(APCI)或電子轟擊(EI)或電感耦合等離子體(ICP)或微波誘導(dǎo)等離子體(MIP)及其他電離方法。本發(fā)明消除可能延長或抑制或阻止平衡的基體，并將其置于固相介質(zhì)上的兩個分析物上，由于兩個物種具有相同的化學(xué)組成和親和力，是同樣的分子，但具有不同的同位素比，因此兩個分析物產(chǎn)生平衡狀態(tài)以同時洗脫，從而加速洗脫過的液體溶液中的平衡。一實施例允許實地或就近使用，甚至另外用于太稀無法裝運或者沒有固相載體物質(zhì)就不穩(wěn)定的小數(shù)量和低濃度。另一實施例能夠?qū)F(xiàn)已在固相上平衡的樣品物種裝運或運輸?shù)椒治龅攸c，作為形成在固相載體物質(zhì)上的濃縮同位素和天然平衡分析物。現(xiàn)已平衡的濃縮和中性分析物將在未來某個時間被洗脫或儲存，以便后續(xù)作為存檔進(jìn)行分析。該實施例產(chǎn)生可被裝運、儲存或存檔的穩(wěn)定存檔平衡的稀釋劑和天然樣品。另一實施例利用具有平衡分析物的固相并通過表面電離感興趣的濃縮分析物和天然分析物來直接誘導(dǎo)電離。用于表面電離的電離方法是下列的一些方法，例如基體輔助激光解吸電離(MALDI)或解吸電噴霧電離(DESI)或激光燒蝕(LA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫化學(xué)分析(ICA)或表面增強激光解吸電離(SELDI)。在固相分離和高吞吐量自動化之前加速溶液中物種的平衡的方法是通過微波增強化學(xué)方法而不是熱傳導(dǎo)和對流方法來進(jìn)行微波平衡加速。選自例如2450MHz微波波段的微波能量產(chǎn)生分子轉(zhuǎn)動和所有離子的離子電導(dǎo)和永久偶極子，其能夠促成更快地從表面解吸，并增強必要的樣品制備步驟(如萃取和分解)中進(jìn)行的天然物種和同位素濃縮物種的類似物的離子和分子平衡。這些結(jié)合的樣品制備過程使得物種同時達(dá)到均勻平衡，并大大縮短了分析周期(樣品制備、操作和分析)。該同時萃取和平衡可與(上文所述的)固相萃取中的平衡步驟結(jié)合，以同時增強這兩個過程。在某些情況下，分析周期可從24小時降至低于600秒。這一結(jié)合的同時萃取和平衡步驟可以實現(xiàn)超快速反應(yīng)，這是醫(yī)院、臨床和商業(yè)實驗室中的高吞吐量自動化應(yīng)用以及國土安全和國防設(shè)置中的近實時應(yīng)用的先決技術(shù)條件。通過這里公開的多個示例實現(xiàn)了這些新的增強。這里公開的主要方法是濃縮同位素標(biāo)記的預(yù)吸附固相固定、快速用于平衡分析興趣所在的物種的同位素濃縮物種類似物和天然豐度物種類似物、以及通過微波增強化學(xué)作用明顯加快的溶液中的同位素物種或氣體形式的同位素物種的平衡。固相分離方法和微波增強化學(xué)方法是眾所周知的，但并未用于提高IDMS和SIDMS的平衡效率、穩(wěn)定性、現(xiàn)場使用、自動化以及平衡物種的儲存和提供。IDMS和SIDMS方法依賴于同位素比的測量，因此不存在與校準(zhǔn)曲線、儀器穩(wěn)定性和探測器信號漂移關(guān)聯(lián)的問題。因此，這兩個同位素稀釋過程中的關(guān)鍵步驟是同位素濃縮稀釋劑與樣品中存在的分析物的平衡。由于只測量同位素比而無須外部校準(zhǔn)，因此當(dāng)達(dá)到平衡時，增量(同位素標(biāo)記或濃縮物種類似物)物質(zhì)作為理想標(biāo)準(zhǔn)樣。這確保了目標(biāo)分析物的始終精確、可重現(xiàn)的測量。增量物質(zhì)作為IDMS和SIDMS的理想標(biāo)準(zhǔn)樣這一角色也消除了與質(zhì)譜檢測過程中的儀器漂移和基質(zhì)效應(yīng)相關(guān)聯(lián)的問題，因為這些效應(yīng)對物種所有同位素的作用相同。參見RuizEncinar，J.;Rodriguez-Gonzalez,P.;Garcia-Alonso，J.I.;Sanz-Medel,A.TrenesinAnalyticalChemistry,2003,22(2),108-114。如果稀釋劑未與樣品完全平衡，則稀釋劑的不同的萃取效率將導(dǎo)致測量中產(chǎn)生誤差。對于液體樣品，通過微微攪拌應(yīng)能達(dá)到充分平衡，而對于固體樣品，平衡則是成問題的，因為分析物既能被吸附到樣品基質(zhì)的表面上，又能被包含到樣品基質(zhì)的晶格內(nèi)。當(dāng)興趣物種存在于固體樣品中并且被添加的稀釋劑是在溶液里時，確保同位素平衡的方式是將原始物種從固體定量萃取到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，原始物種與液體稀釋劑在所述溶劑中的平衡是簡單明了的。參見Rodriguez-Gonzalez,P.;Marchante-Gayon,J.M.;Garcia-Alonso，J.L;Sanz-Medel,A.SpectrochimicaActa,PartB，2005,60,151-207。Clough，R.等人對兩種認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)樣物質(zhì)中的總汞和甲基汞研究了時間對稀釋劑與樣品分析物的平衡的影響。他們在研究過程中觀察到，如果將稀釋劑添加到樣品中，并在室溫(25°C)下與濃硝酸或50:50的水:甲醇(v/v)和0.01%的2-巰基乙醇一起攪拌多達(dá)3000分鐘，平衡過程從未達(dá)到100%。另一方面，將混合物在家用微波爐中以650W加熱2分鐘，即可達(dá)到平衡。但是，在這種情況下，將增量的樣品在室溫下保持24小時，以允許微波消解/萃取前的平衡。參見Clough，R.;Belt,S.T.;Evans,E.H.;Fairman,B.;Catterick，T.Anal.Chim.Acta,2003,500,155-170。Yang,Lu等人發(fā)現(xiàn)鉻物種通過熱對流或傳導(dǎo)平衡要用超過6小時，將分析步驟延遲了一天。作者所采用的95"C堿性條件與EPA(美國環(huán)保署)方法3060A萃取方法化學(xué)相同。精確的同位素稀釋分析需要稀釋劑與興趣分析物之間的同位素平衡。為了使稀釋劑和分析物，有機錫和一甲基汞，更快地溶解和穩(wěn)定并且更快地平衡，對生物樣品應(yīng)用開放聚焦的微波輔助萃取過程。7(TC下在5分鐘之內(nèi)達(dá)到完全溶解和穩(wěn)定。然后在GC-MS毛細(xì)管色譜柱上完成9分鐘分離。參見Monperrus，M.;RodriguezMartin-Doimeadios,R.C.;Scancar,J.;Amouroux，D.;Donard，O.F.X.Anal.Chem.2003,75，4095-4102;Moreno,MJ.;Arjona,J.P.;Rodriguez-Gonzalez，P.;Homme,H.R;Amouroux,D.;Donard,O.RX.J.MassSpectrom.2006,41,1491-1497。Rodriguez-Gonzalez,P.等人研究了不同的萃取方法，例如微波輔助萃取、機械震蕩、用四甲基氫氧化氨(TMAH)堿解、以及對生物物質(zhì)中的丁基錫化合物進(jìn)行酶消化。他們觀察到物種大范圍降解、以及與TMAH平衡不足和酶消化不足。據(jù)稱，使用醋酸-甲醇混合物的微波輔助萃取在低降解和快速同位素平衡以及定量回收方面產(chǎn)生最佳結(jié)果。他們還在研究中提出，只有當(dāng)天然存在的有機錫化合物完全從固態(tài)基質(zhì)釋放到溶液之后方達(dá)到所需要的完全的同位素平衡。參見Rodriguez-Gonzalez,P.;GarciaAlonso，JJ.;Sanz-Medel,A.J.Anal.Atom.Spectrom.2004,19,767-772。結(jié)合三種丁基錫化合物的特定物種同位素稀釋分析執(zhí)行貽貝組織的體外胃腸消化。但為了避免內(nèi)源(endogenous)物種與同位素濃縮稀釋劑物種之間的同位素平衡不足所造成的任何問題，在消化過程完成之后才增量同位素。參見Rodriguez-Gonzalez,P.;Encinar,J.R.;GarciaAlonso，J.L;Sanz-Medel,A.Anal.Bioanal.Chem.2005,381，380-387。Kawano等人在生物樣品中的硒的測定過程中研究了稀釋劑平衡的不同加熱參數(shù)。他們在熱解步驟即將開始時使用原位熔化(insitufosion)，以便平衡稀釋劑與樣品分析物。參見Kawano，T.;Nishide，A.;Okutsu，K.;Minami,H.;Zhang,Q.;Inoue，S.;Atsuya，I.Spectrochim.Acta,2005，60B,327-331。Valkiers等人在比率測量過程中研究了質(zhì)譜儀中的氣相二氧化碳?xì)怏w中的碳同位素和氧同位素的同位素平衡程度。參見Valkiers,S.;Varlam,M.;Rube,K.;Berglund,M.;Taylor,P.;AVang，J.;Milton,M.;DeBievre，P.InternationalJournalofMassSpectrometry,2007,263,195-203。Chen，Z和同事研究了時間和酸濃度對人血清中的轉(zhuǎn)同位素平衡的影響。該科學(xué)論文指出，對于已知樣品，在l小時內(nèi)平衡需要至少0.22mol/HNO3，對于未知樣品，則推薦至少6小時的時間。參見Chen,Z.;Griffin,I丄；Kriseman，Y丄.；Liang,L.K.;Abrams，S.A.ClinicalChemistry,2003，49(12),2050-2055。Hunkeler,D.和Aravena，R.研究了使用直接固相微萃取(dSPME)禾口頂空固相斂萃取(headspacesolid-pasemicroextraction,hSPME)的，甲垸氯化物、乙垸、及含水試樣中的乙烷中的碳同位素比的萃取和平衡，并且論證出dSPME和hSPME使水相中和SMPE纖維上的碳同位素至少偏差0.4。另一方面，對于頂空平衡，在"C中氣相分子較水相分子濃縮達(dá)1.46。參見Hunkeler,D.;Aravena,R.Environ.Sci.Technol.2000,34(13),2839-2844。Crowther,JohnR.將ELISA方法匯編到ELISAGuidebook—書中，其論述了如何通過例如熒光的光學(xué)方法將ELISA固定相用于識別蛋白質(zhì)、抗原和抗體，并與標(biāo)準(zhǔn)樣質(zhì)譜得到的結(jié)果進(jìn)行比較。這本書不包括通過同位素質(zhì)譜測量分析物的ELISA方法。在文獻(xiàn)中未將ELISA的IDMS和SIDMS用于定量，而是其中普遍將ELISA與傳統(tǒng)質(zhì)譜進(jìn)行比較。參見JohnR.Crowther所著的TheELISAGuidebook,由HumanaPressNewJersey于2001年出版
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種用于在使用固相同位素比平衡和測量的質(zhì)譜分析之前的濃縮同位素物種和天然同位素物種的催化平衡的方法。本發(fā)明的基礎(chǔ)是分子、元素和物種化、以及用于興趣分析物的最終定量和定性分析中的定量和定性的樣品制備。該方法利用在同時平衡、以及實現(xiàn)本領(lǐng)域已知的IDMS和SIDMS分析的自動化方面相較于液相和氣相具有很多優(yōu)勢的固相來促進(jìn)平衡。這一創(chuàng)新運用了固相和固定的濃縮同位素試劑、同位素濃縮分子制造試劑(manufacturedreagents)以及固相與固定相的平衡過程。利用算法來數(shù)學(xué)確定濃度并直接校正物種位移(speciesshift),不對質(zhì)譜數(shù)據(jù)運用校準(zhǔn)曲線。與常規(guī)的液/熱平衡和分離協(xié)議(protocol)相比，通過固相樣品制備，平衡和分離分析物所需的時間顯著降低。為固相同位素增量及平衡所制的試劑和產(chǎn)品在較長時間內(nèi)是穩(wěn)定的，因此可以進(jìn)行現(xiàn)場樣品制備，并且改善儲存或裝運過程中與試劑和/或樣品的降解相關(guān)的儲存和保管鏈問題。對于現(xiàn)場工作者和實驗分析人員來說，通過去掉幾個樣品制備及操作步驟，固相同位素增量和平衡將使易反應(yīng)和有毒物質(zhì)的處理以現(xiàn)場增量和平衡形式進(jìn)行，比作為整體試劑溶液更加安全。樣品分析物和同位素濃縮和平衡試劑標(biāo)記要么在液相和/或氣相被洗脫以用于分析，要么被表面電離到質(zhì)譜儀中直接在固相進(jìn)行分析。固相同位素增量和高速平衡提高了設(shè)計包括高度自動化和小型化的子系統(tǒng)的低成本、高吞吐量、可靠的樣品制備及分析系統(tǒng)的能力，從而可以設(shè)計高度便攜、現(xiàn)場使用的、精確、低故障的積極分析及檢測系統(tǒng)。這種現(xiàn)場使用的系統(tǒng)對于環(huán)境法醫(yī)學(xué)、國土安全和國防、工業(yè)合規(guī)、生物科學(xué)和臨床研究和臨床診斷有非常大的用處。一些國防和國土安全應(yīng)用包括監(jiān)測易揮發(fā)試劑(fugitiveagent)的多點飲用水網(wǎng)絡(luò)和戰(zhàn)場上用于保護(hù)武裝部隊的空氣/水/表面分析。在增長中的環(huán)境衛(wèi)生領(lǐng)域，這些系統(tǒng)對于評估接觸環(huán)境和食品中的工業(yè)毒素引起人類某些疾病的風(fēng)險也將是有用的。最后，這種系統(tǒng)可能成為幫助預(yù)測某些疾病的發(fā)生或減緩這些疾病的發(fā)展的工具，如孤獨癥、某些類型的癌癥、以及免疫退化性疾病，如阿爾茨海默氏癥、帕金森癥和糖尿病。下文將描述使用上述兩個概念的明確研究。具體實施例方式該問題近來在Lu等人的論文中得到了說明，文中指出，酵母中的Cr(VI)和Cr(III)的同位素平衡長達(dá)12小時。這一數(shù)據(jù)證明了該問題的直接解決方案。該論文還指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員不理解使用微波方法和標(biāo)準(zhǔn)樣熱方法來平衡同位素和天然物種的不同。該論文討論了EPA方法6800的應(yīng)用和成績，我們在當(dāng)前的工作中正對其深入研究。所述的另一應(yīng)用是可基于更短時幀和快速反應(yīng)將微波實現(xiàn)加入到微流體設(shè)計中，以加速有更快反應(yīng)需求的反應(yīng)。下面顯示了安捷倫芯片立方微流體設(shè)計，其具有例如對該設(shè)備的某部分的同軸微波發(fā)射，以提高例如反應(yīng)速度、萃取和/或平衡。本發(fā)明包含了使用柱上預(yù)吸附增量和微波增強和/或同時使用以上兩者的微流體。在取樣、儲存、校準(zhǔn)和測量過程中，元素和分子物種經(jīng)歷轉(zhuǎn)化并形成其他物種，或是興趣物種降解為其它物種。在許多這樣的情況下，無法進(jìn)行傳統(tǒng)的校準(zhǔn)。此外，定量分析的準(zhǔn)確度和精度取決于使用的校準(zhǔn)協(xié)議的類型，例如內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣化，標(biāo)準(zhǔn)樣加入和同位素稀釋，使用不同的校準(zhǔn)技術(shù)會引入誤差，如固定誤差和隨機誤差。如果以下假設(shè)成立，則得到使用外部校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確結(jié)果校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣和樣品具有相同的基質(zhì)；校準(zhǔn)是線性的；分析人員在限定的誤差范圍內(nèi)準(zhǔn)確制定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣；無論標(biāo)準(zhǔn)樣是如何制定的或是何人制定的，標(biāo)準(zhǔn)樣的穩(wěn)定性都是已知的，并且僅在這些限定的時間、基質(zhì)、濃度、溫度/濕度、容器材料的范圍內(nèi)使用；未知的測量只會比校準(zhǔn)的不確定度差；不存在譜干擾和/或質(zhì)量干擾；為分析制備的樣品不涉及任何正的或負(fù)的污染誤差或取樣誤差；以及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣表現(xiàn)與樣品分析物完全相同。參見Gonzalez-GagoA等人，J.Anal.At.Spectrom.,2007,DOI:10.1039/b705035f;BrownR.J.C.，etal,Anal.ChimicaActa,2007,587(21),158-163。在5%至10%范圍內(nèi)，ICP-MS生成最高精度的結(jié)果(即復(fù)雜基質(zhì))。與外部校準(zhǔn)有關(guān)的主要問題是溶液中的分析物的穩(wěn)定性；樣品制備的準(zhǔn)確性；校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的純度；內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的選擇；不正確的儀器安裝；總的溶解固體；非譜干擾；基質(zhì)匹配；標(biāo)準(zhǔn)樣加入；進(jìn)樣；色譜分離；隨時間的儀器漂移；霧化效率；霧滴尺寸；溶液的物理性質(zhì)；溶液中的酸含量；分析人員欠缺知識/培訓(xùn)；背景校正；質(zhì)量偏歧；死時間；同重多原子干擾。參見Vicki,B.PreparationofCalibrationCurves:Aguidetobestpractice,LGC,2003年9月。為了有效地校正樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣中由于基體效應(yīng)引起的信號強度的時間變化和分析信號的系統(tǒng)變化，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的物理性質(zhì)必須與運用它們的同位素的物理性質(zhì)小心匹配。參見HsiungChiung-Sheng，等人，ClinicalChemistry,1997,43(12)，2303-2311;Entwisle,J.AmericanLaboratory,March2004,11-14;Eickhorst,T.;Seubert,A.J.Chromatogr.A:2004,1050,103-109。當(dāng)基質(zhì)相當(dāng)易變時和/或當(dāng)無法找到校正等離子體相關(guān)影響的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣時，使用標(biāo)準(zhǔn)樣加入(addition)技術(shù)。雖然標(biāo)準(zhǔn)樣加入技術(shù)對通過等離子體相關(guān)影響的基體干擾提供了更好的可能解決辦法，但它要求線性響應(yīng)。因此，在每個分析物的線性范圍內(nèi)工作是非常重要的。參見Bonnefoy,C.等人,Anal.Bianal.Chem.2005,383,167-173;Melaku，S.等人，Can.J.Anal.Sic.Spectres.,2004,49(6),374-384;Panayot,K.等人，Spectrochim.Acta,PartB,2006,61,50-57。蛋白質(zhì)生物標(biāo)記在研究中對人類疾病特別是癌癥的臨床管理產(chǎn)生巨大的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)在蛋白質(zhì)生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用使得單一發(fā)現(xiàn)工作已能識別數(shù)百種生物標(biāo)記。然而，由于缺乏定量和臨床驗證，這些發(fā)現(xiàn)工具的保證尚未達(dá)成?？墒褂眯阅芰己玫母咄掏铝棵嘎?lián)免疫吸附測定(ELISA)以超高靈敏度和特異性對目標(biāo)分析物進(jìn)行定量。目前的ELISA是基于比色法和熒光讀出器來進(jìn)行定量，并與色譜法和質(zhì)譜進(jìn)行比較，但并未迸行結(jié)合。參見Whiteaker,J.R.;Zhao,Lei;Zhang,H.Y.;Feng,LC.;Piening,B.D.;Anderson,L;Paulovich，A.G.AnalyticalBiochemistry,2007,362，44-54。Martens-Lobenhoffer,J.等人對采用液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)的人體血漿和血清樣品中的非對稱二甲基精氨酸(ADMA)的濃度測量進(jìn)行了評價，并將結(jié)果與通過標(biāo)準(zhǔn)樣比色ELISA方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。文中指出ELISA比LC-MS產(chǎn)生的值高，并推斷出ELISA是依賴于基質(zhì)的。他們還認(rèn)為ELISA將血漿中的ADMA濃度高估了2倍。參見Martens-Lobenhoffer,J.;Westphal，S.;Awiszus，F(xiàn).;Bode-Boger,S.M.;Luley,C.ClinicalChemistry,2005,51,2188-2189。Charissou，A.等人還評價了對食物樣品中的羧甲基賴氨酸(CML)進(jìn)行定量的ELISA法，并將結(jié)果與氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)的結(jié)果進(jìn)行比較。在這項研究中，他們采用了常規(guī)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣和同位素稀釋內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣兩者進(jìn)行GC-MS定量，以與標(biāo)準(zhǔn)樣ELISA進(jìn)行比較。他們指出，當(dāng)使用粉末樣品時，與GC-MS相比，ELISA是檢出限較低的快速低成本方法。但對液體和水解嬰兒配方奶粉(hydrolyzedinfantformulas)之類的復(fù)雜基質(zhì)使用兩種檢測方法則會發(fā)現(xiàn)ELISA法受到缺乏特異性和高風(fēng)險的基體干擾的影響。相反，這兩種方法對奶粉樣品產(chǎn)生相似的結(jié)果。他們還指出，ELISA法高估了某些脂肪含量高的樣品中的CML濃度，如肉類產(chǎn)品，以及油炸食品，而通過GC-MS或HPLC(高效液相色譜)法在這些樣品中檢測不到CML或只能檢測到低水平的CML。脂質(zhì)基質(zhì)可能對ELISA存在特異性干擾。參見Charissou,A.;Ait-Ameur,L;Birlouez-Aragon，I.J.Chromatogr.A，2007,1140,189-194。Scholl，RF.等人在通過同位素稀釋質(zhì)譜法和常規(guī)ELISA測定人體中的黃曲霉毒素B1血清白蛋白加合物時也有類似的發(fā)現(xiàn)。他們指出，在2mg白蛋白中通過ELISA測量的黃曲霉毒素-白蛋白加合物的濃度和通過IDMS測量的黃曲霉毒素Bl-賴氨酸的濃度有很好的相關(guān)性；但是，通過ELISA測量的黃曲霉毒素-白蛋白加合物的濃度比黃曲霉毒素Bl-賴氨酸加合物的濃度平均高2.6倍。作者在文中推測，ELISA除測量了黃曲霉毒素Bl-賴氨酸之外，還測量了其他的黃曲霉毒素加合物。參見Scholl,P.F.;Turner,P.C.;Sutcliffe，A.E.;Sylla,A.;Diallo,M.S.;Friesen，M.D.;Groopman,J.D.;Wild,CP.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.2006,15(4)，823-826。Wolthers，B.G.等人評價了測定人體尿液中的變腎上腺素(MA)和去甲變腎上腺素(NMA)的ELISA法，并將結(jié)果與由使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣和校準(zhǔn)曲線但將GC-MS內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣稱為IDMS分析的GC-MS獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。他們得出結(jié)論，ELISA法能夠?qū)δ騇A進(jìn)行定量，從而能夠成功用于確診嗜鉻細(xì)胞瘤，并還建議可在任意臨床實驗室執(zhí)行這個簡單的ELISA法，并希望很快可以取代目前實際上更為復(fù)雜的色譜方法。參見Wolthers，B.G.;Kema，I.P.;Volmer，M.;Wesemann,R.;Westermann，J.;Manz，B.ClinicalChemistry,1997,43(1)，114-120。從示例文獻(xiàn)可以看出，研究人員研究了使用ELISA的不同樣品，并將結(jié)果與包括許多質(zhì)譜形式的其他檢測方法進(jìn)行比較，例如GC-MS、HPLC或IDMS，但將ELISA轉(zhuǎn)化為質(zhì)譜過程尚未得到發(fā)展。在第三部分中描述可用于國防和國土安全和或環(huán)境法醫(yī)學(xué)的完全集成的現(xiàn)場和/或?qū)嶒炇蚁到y(tǒng)的示例，其中第三部分是描述所有這些部件如何結(jié)合的獨立部分。固相平衡、萃取和分離方法結(jié)合到SCF柱上的濃縮物種發(fā)明者之一在EPA方法3200的制備過程中進(jìn)行了研究，其涉及在添加來自國際原子能機構(gòu)(IAEA-085)的人發(fā)中汞物種的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)樣物質(zhì)樣品之前吸附或化學(xué)附著到巰基棉纖維(SCF)固相柱上的甲基汞的同位素濃縮物種。這項研究的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明和新的固相增量及平衡方法的有效性。將結(jié)果與傳統(tǒng)的IDMS和SIDMS方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，傳統(tǒng)的IDMS和SIDMS方法是在不同的汞物種與巰基發(fā)生SCF固相共價結(jié)合之前，在溶液中進(jìn)行平衡。樣品通過微波能量進(jìn)行萃取和增量-平衡，然后與預(yù)吸附固相物種同位素增量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者都提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。這里描述的示例涉及兩組作為相同樣品的IAEA-085參考物質(zhì)人發(fā)的處理。表1數(shù)據(jù)出自常規(guī)EPA方法6800一SIDMS的實施，該方法在用微波能量萃取前對樣品增量同位素濃縮甲基汞。表2是出自相同的標(biāo)準(zhǔn)樣樣品(IAEA-085)，并服從于新方法，該新方法首先不進(jìn)行增量，而是采用EPA微波萃取法(EPA方法3200)萃取甲基汞，然后將甲基汞添加到SCF柱，稀釋劑在SCF柱的固相中平衡，固相被填充作為柱中而不是溶液中的流通介質(zhì)床(bedofflow-throughmedium),如同目前最先進(jìn)的化學(xué)過程所進(jìn)行的。表l:IAEA-085，毛發(fā)分析增量毛發(fā)樣品經(jīng)預(yù)增量，但SCF柱未經(jīng)子樣品復(fù)制品無機汞(昭/g)甲基束([ig/g)總隸(昭/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>不確定度在95%置信區(qū)間，n=4在運用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)進(jìn)行分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)比較之后，可以看出在與IAEA-085標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣值比較的基礎(chǔ)上，兩個過程都產(chǎn)生100%的回收率并達(dá)到相同的準(zhǔn)確度。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的優(yōu)點是有助于顯著加快下列關(guān)鍵步驟提供濃縮同位素稀釋劑或濃縮物種類似物，以及將其與興趣物種平衡以用于IDMS和/或SIDMS。汞物種的平衡可以在柱上或在洗脫過程中和/或在萃取步驟中進(jìn)行。通過微波進(jìn)行的平衡產(chǎn)生同樣準(zhǔn)確的結(jié)果。表2:毛發(fā)分析SCF柱預(yù)增量了同位素濃縮汞物種，但樣品未經(jīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>不確定度在95%置信區(qū)間，n=4萃取后，萃取物通過SCF柱(未增量)，以將無機汞與甲基汞分離，這表明本發(fā)明的還涉及用于物種分離的固相物質(zhì)的兩用能力。然后通過HPLC-ICP-MS對兩種洗脫液(用于甲基汞的洗脫液1和用于無機汞的洗脫液2，EPA方法3200協(xié)議)進(jìn)行分析。測定經(jīng)過死時間和質(zhì)量偏置校正的同位素比，并用它來通過傳統(tǒng)的IDMS公式計算無機汞和甲基汞的濃度。從表1和表2的結(jié)果可以觀察到，在采用這兩種對照方法的這些研究中，標(biāo)準(zhǔn)樣值和實測值之間不存在顯著差已.升。從表2的結(jié)果可以觀察到，在該研究中得到在統(tǒng)計上無法區(qū)分的數(shù)據(jù)，該結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣值在表l的95%置信區(qū)間重疊。此外，這兩項研究的結(jié)果彼此之間以及與標(biāo)準(zhǔn)樣值之間在統(tǒng)計上都是無法區(qū)分的。因此可以得出結(jié)論天然豐度的汞物種與同位素濃縮汞物種在柱上的平衡是可實現(xiàn)的，并已付諸實施。這種技術(shù)產(chǎn)生無偏置的和準(zhǔn)確的結(jié)果，等效于科學(xué)文獻(xiàn)所述的傳統(tǒng)IDMS和SIDMS。然而，當(dāng)濃度低于溶液的穩(wěn)定并因為濃度低，物質(zhì)被限制向現(xiàn)場、從現(xiàn)場或向遠(yuǎn)距離實驗室或原處運輸時，將預(yù)增量的固相物質(zhì)或濃縮物種類似物結(jié)合到固相物質(zhì)上是實現(xiàn)IDMS和SIDMS的有效方法。作為執(zhí)行現(xiàn)場IDMS的靶分子的烷基分子在GC-MS中的固相增量和平衡采用GC-MS分析的現(xiàn)場IDMS中的固相穩(wěn)定同位素示例分析過程的某些方面沒有跟上現(xiàn)有的先進(jìn)檢測技術(shù)的發(fā)展。主要的方面是現(xiàn)場取樣(樣品采集)、保管鏈(樣品封裝、運輸和存儲，盡量減少或消除分析物損失)和實驗室分析(樣品制備)。分析化學(xué)研究進(jìn)展導(dǎo)致檢出限低至萬億分之一(onepartpertrillion)的儀器的發(fā)展，萬億分之一這一值遠(yuǎn)低于水標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定度。盡管許多色譜儀器技術(shù)已經(jīng)成熟并已自動化，但樣品制備仍是緩慢、勞動密集型、常要串行執(zhí)行的實驗室過程之一。目前為每個分析取得和處理大量的樣品的做法對于快速運輸和高吞吐量分析來說是費力、費時、昂貴和難以實施的。本發(fā)明在固相濃縮稀釋劑的提供方面的應(yīng)用減少了步驟數(shù)量，改進(jìn)了水、空氣、藥物、食品、農(nóng)業(yè)工業(yè)樣品以及生物和臨床標(biāo)本的現(xiàn)場取樣。固相萃取(SPE)柱體(cartridge)用預(yù)吸附在固相物質(zhì)上的穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物種類似物填充。修飾的SPE柱體是為現(xiàn)場萃取設(shè)計的，并專門為特定分析物組制備的。建立具有適當(dāng)?shù)奈絼?、床深度、?jīng)校準(zhǔn)的貯器容量、同位素標(biāo)記類似物的準(zhǔn)備的萃取柱。現(xiàn)場萃取的實現(xiàn)和簡化要求最低限度的樣品處理。在現(xiàn)場萃取之后，將固相萃取柱體運往實驗室，在實驗室用有機溶劑通過洗脫使同位素標(biāo)準(zhǔn)樣和興趣分析物解吸。通過該方法，將分析物和同位素標(biāo)準(zhǔn)樣固定在固相介質(zhì)上，而運輸和儲存時沒有基質(zhì)，分析物和同位素標(biāo)準(zhǔn)樣不太容易修飾和降解。通過使用常規(guī)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣定量或同位素稀釋定量的GC-MS進(jìn)行分析。取樣和萃取協(xié)議的簡單性使高效的環(huán)境分析方法成為可能，增強了現(xiàn)場取樣和分析的穩(wěn)定性并提高了其精度、準(zhǔn)確度和方法效能。整個過程中的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的水平得到了提高?，F(xiàn)場SPE是一種可由經(jīng)驗較少的人員在現(xiàn)場和在實驗室中執(zhí)行的萃取方法。通過提供具有同位素濃縮物種的萃取和/或固相，可以不進(jìn)行大規(guī)模培訓(xùn)，采用價廉的、相對簡單的、使用預(yù)增量的SPE柱體的手動或自動萃取執(zhí)行該方法。例如，現(xiàn)場人員不是將待分析的水樣置于容器內(nèi)運往分析實驗室，而是將水樣置于經(jīng)校準(zhǔn)的、與固相萃取柱體相連的樣品貯器中，并于現(xiàn)場在固相柱體上進(jìn)行同位素平衡。加入樣品后，通過正壓或真空使樣品通過SPE介質(zhì)。在該萃取過程中，由于吸附劑介質(zhì)與有機分子之間的分子間弓I力相對較強，有機分析物和興趣物種被從水中除去?；久撊ビ袡C分析物和同位素標(biāo)準(zhǔn)樣的水通過SPE柱體。在進(jìn)行SPE之后，分析物和同位素標(biāo)準(zhǔn)樣被固定在沒有水基質(zhì)的固相介質(zhì)上，因此比較不易改變和降解，而這種改變和降解在水樣被運往實驗室期間或存儲過程中是可能發(fā)生的。通過現(xiàn)場SPE大大節(jié)省了時間和資源且適于自動化，現(xiàn)通過若干示例進(jìn)行實證。為了表明固相樹脂上的現(xiàn)場萃取和平衡的樣品保持穩(wěn)定，在進(jìn)行現(xiàn)場萃取并且樣品在柱體中的固相物質(zhì)上平衡之后，郵寄柱體以測試該方法。當(dāng)收到包括柱體和經(jīng)過萃取、柱上平衡與固定的樣品的試劑盒時，分析實驗室可以輕松地從柱體洗脫掉結(jié)合的樣品?？赏ㄟ^任意的質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。在實證中采用GC-MS分析方法。本發(fā)明是一種簡化和高效的樣品制備方法，其去掉了幾個階段的操作，避免了由于分析物的損失、不完整的化學(xué)操作步驟和偏置等操作中可能引入的誤差。此外，本發(fā)明節(jié)省了時間和金錢，并實現(xiàn)了自動化。固相C-18柱體中預(yù)吸附的濃縮同位素上的水萃取示例下面在圖1中給出了在GC-MS之前進(jìn)行的預(yù)增量穩(wěn)定同位素固相萃取(PSI-SPE)，演示了幾種類型的分子物種結(jié)果。對下列化合物類別進(jìn)行PSI-SPE:含氧化合物、PAG-5、以及嗎啡、1，4-二氧六環(huán)和l,2-二氯乙垸這些化合物。這些化合物類別對環(huán)境法醫(yī)學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生和毒理學(xué)測量來說是典型的。使用PSI的所有結(jié)果被發(fā)現(xiàn)與使用常規(guī)實驗室SPE獲得的結(jié)果在在統(tǒng)計上是無法區(qū)分的，一定在EPA方法規(guī)定可接受的范圍內(nèi)。含氧化合物示例含氧化合物是經(jīng)常在汽油中發(fā)現(xiàn)的小極性化合物的列表，作為"抗爆"劑加到餾出物中促進(jìn)燃燒過程。化合物列表包括叔丁醇(TBA)、甲基叔丁醚(MTBE)、乙基叔丁醚(ETBE)、二異丙醚(DIIPE)以及叔戊基甲基醚(TAME)。MTBE已與可能是環(huán)境造成的健康問題聯(lián)系起來。這些化合物特別成問題，因為它們是高度混水的。如果發(fā)生例如成品汽油的油氣泄漏，非極性的石油餾分汽油到達(dá)水體表面，可被去除或者至少被追蹤，大城市中沿江的飲用水抽水站暫時關(guān)閉，直到汽油煙縷經(jīng)過。完全溶于水的含氧化合物的情況并非如此。含氧化合物可以很容易進(jìn)入地下水，無法輕易被去除。此外，由于水樣萃取中涉及的種種困難，確定含氧化合物污染的濃度的水樣分析是成問題的。通過常規(guī)手段不易從水樣中萃取高極性含氧化合物。為了提高萃取效率，往往要加熱樣品。已證實這會將MTBE降解為TBA，導(dǎo)致無SIDMS的不準(zhǔn)確的結(jié)果。此外，已證實MTBE在運送過程中降解為TBA。這會影響含氧化合物萃取過程中的萃取效率和降解。已通過PSI-SPE方法克服了這一問題。如圖2所示，增量含氧化合物的水樣的萃取得到非常好的結(jié)果。分析物的PAG-5列表是許多環(huán)境執(zhí)行機構(gòu)在關(guān)閉或監(jiān)測汽油污染場所時必須分析的一組毒素和污染物。該復(fù)雜列表包含含氧化合物MTBE、揮發(fā)性單環(huán)芳烴苯、乙苯和二甲苯、以及三種半揮發(fā)性分析物萘、芴和菲。當(dāng)采用傳統(tǒng)的方法分析該化合物列表時，必須使用兩種不同的測試方法用于揮發(fā)性成分的EPA方法8260以及用于半揮發(fā)性成分的EPA方法8270。使用PSI-SPE完成分析物的PAG-5列表，用作在單一分析中測量的單一組。這大大減少了測試成本。分析物的PAG-5的PSI-SPE結(jié)果參見圖6(PAG-5使用PSI-SPE。SPESupelco公司的苯乙烯-二乙烯基苯/100mg。試劑水增量20ppb的PAG-5;誤差表示為95%置信區(qū)間，n=5)。嗎啡嗎啡是非常常見的濫用藥物。與前面討論的揮發(fā)性化合物不同，嗎啡測定中的興趣樣品基質(zhì)不單單是水，而是非常復(fù)雜的有機基質(zhì)。用于通過GC-MS測定嗎啡的傳統(tǒng)萃取方法是非常繁瑣的。將PSI-SPE用于同位素標(biāo)記嗎啡，作為加快萃取與分析過程以及提供更為常規(guī)的可重現(xiàn)的萃取方法的一種手段。如圖3所示，SPE結(jié)果非常理想(SPEAgilentEvidex，6ml，0.5g;誤差表示為95%置信區(qū)間，n=4)。成功地從增量過的水和牛血清中萃取了嗎啡。二氧六環(huán)和二氯乙烷小極性分子的另一示例是1，4-二氧六環(huán)。這種化合物常用作消毒劑。雖然其未被證實在萃取或分析過程中降解，但同含氧化合物一樣，也很難用常規(guī)手段從水中萃取。然而，可以使用類似于含氧化合物分析方式的SPE，并取得非常好的結(jié)果。(圖4:1，4-二氧六環(huán)和l，4-二氯乙烷。試劑水增量2ppb的1，4-二氧六環(huán)和20ppb的1,4-二氯乙烷。誤差表示為90%置信區(qū)間，n=3)。多年來，化合物四氯乙烷(TTCE)已成為非常常見的脫脂溶劑。它的用途的一個示例是用于制造不銹鋼管材。在制造過程中用中度碳?xì)浠衔餄櫥懿摹３Ｊ褂肨TCE去除該潤滑劑。TTCE—旦進(jìn)入環(huán)境中，會降解為比TTCE的揮發(fā)性和水溶性高得多的1，2-二氯乙烷(1，2-DCA)。在地下水中發(fā)現(xiàn)的污染物通常是l，2-DCA，而不是母體TTCE。1，2-DCA與非極性芳烴苯系物(BTEX)或高極性含氧化合物和二氧六環(huán)的結(jié)構(gòu)有很大的不同。1,2-DCA具有中間極性，為鹵代化合物(見圖4)。在與上述分析物萃取條件相同的SPE條件下，對l，2-DCA也能獲得良好的結(jié)果。使用傳統(tǒng)的取樣和分析方法時會出現(xiàn)的問題是在運輸過程中微生物或化學(xué)降解導(dǎo)致化合物的損失。很多微生物能夠消耗污染物作為食物來源。如果在樣品運輸過程中存在這種情況，則無法確定分析物的損失，并損害到測量的準(zhǔn)確度。已進(jìn)行研究來評估樣品被萃取并在樹脂上平衡之后SPE柱體上是否會發(fā)生降解。天然水樣取自經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)含有一些污染物的監(jiān)測水井。在第0天通過SPE和PSI-SPE對樣品進(jìn)行萃取和分析(第0天表示在取樣活動和萃取/分析之間經(jīng)過了0天)。允許同一樣品的一部分在密封瓶中室溫下保留14天，以觀察是否有由生物降解造成的損失發(fā)生。該樣品的一部分也在第0天萃取，但直到第14天才從SPE柱體中洗脫，以觀察一旦將分析物和微生物從其水環(huán)境中被去除并隔離在柱體上，是否會在柱體上發(fā)生與密封瓶中發(fā)生的降解相似的降解。圖5顯示了該研究的結(jié)果。(生物降解對監(jiān)測水井樣品的影響。所有濃度以ppb為單位，誤差表示為90%置信區(qū)間，n=3)。如圖5所示，使用SPE或PSI-SPE在第0天萃取和分析的污染物的初始濃度很好的吻合。讓樣品在密封瓶內(nèi)保留14天后所進(jìn)行的分析顯示MTBE以外的所有分析物都完全降解?？闪頜TBE降解的微生物類型相對較少，在該樣品集中未預(yù)計MTBE的降解。在對在第0天萃取但直到第14天才從柱體洗脫的樣品所進(jìn)行的分析中沒有發(fā)現(xiàn)興趣化合物的降解。該研究表明，在樣品基質(zhì)中進(jìn)行取樣并在沒有任何其他步驟的情況下存放時，含有污染物的水樣將會降解，而在SPE柱體上進(jìn)行分離并儲存時，含有污染物的水樣不會降解。這是現(xiàn)場PSI-SPE的功用的另一示例。通過固相預(yù)增量的同位素進(jìn)行校準(zhǔn)和比較在傳統(tǒng)的環(huán)境分析中，對于揮發(fā)性有機分析物(VOA)和半揮發(fā)性有機分析物(SVOA)來說，SVOA分析(EPA方法8260和8270)基于由校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣產(chǎn)生的響應(yīng)因子進(jìn)行定量。該標(biāo)準(zhǔn)樣使用已知濃度的分析物，該濃度是使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣和被測分析物建立的。用于該標(biāo)準(zhǔn)樣的溶劑與洗脫溶劑相同。在使用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的方法中，如果樣品混合物中興趣分析物的萃取效率在100。％以下，并且未用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣校正，則在定量中會出現(xiàn)誤差。由于校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣本身并沒有經(jīng)歷萃取過程，因此相對于未萃取的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣，分析物萃取效率低下將導(dǎo)致信號減弱。在PSI方法中，當(dāng)柱上預(yù)吸附的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣為以下任一種情形時，誤差可以是復(fù)合的1)與萃取介質(zhì)的結(jié)合不如萃取分析物時緊密(穿透)，導(dǎo)致錯誤地升高的濃度，或2)與萃取介質(zhì)的結(jié)合比萃取化合物時緊密(保持)，導(dǎo)致錯誤地降低的濃度。這兩種類型的誤差都可以通過使用校準(zhǔn)柱體來消除。校準(zhǔn)柱體是用與樣品柱體相同的方式制備的SPE柱體，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣預(yù)吸附在固相物質(zhì)上。為了產(chǎn)生校準(zhǔn)柱體，將純凈的試劑水增量一定量的校準(zhǔn)化合物。這由分析人員在樣品萃取時進(jìn)行的，方法是破開校準(zhǔn)溶液的密封玻璃安瓿(ampoule),將校準(zhǔn)溶液添加到純凈的試劑水中?，F(xiàn)已用與樣品同樣的方式，使用PSI-SPE萃取該校準(zhǔn)樣品。當(dāng)洗脫該柱體時，將萃取物作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣。由于這種類型的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣已經(jīng)歷與興趣樣品相同的萃取過程，因此對于小于100%的萃取效率，其產(chǎn)生的響應(yīng)現(xiàn)在已經(jīng)得到校正，從而得到優(yōu)良的數(shù)據(jù)。圖6和圖7顯示了使用常規(guī)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣和校準(zhǔn)柱體進(jìn)行定量的比較結(jié)果。響應(yīng)因子的比較響應(yīng)因子(ResponseFactor)是給定濃度下化合物的面積與同位素標(biāo)記類似物的面積之比。如果這兩種分析物的響應(yīng)是相同的，則在整個萃取與分析過程中，面積計數(shù)應(yīng)該是相同的，因此響應(yīng)因子等于1。然而實際上，化合物與其同位素修飾的類似物的反應(yīng)會略有不同，主要是由于制備標(biāo)準(zhǔn)樣時的不完美的質(zhì)量測量，因此在實際中，響應(yīng)因子非常接近于1.0。如果化合物的響應(yīng)因子是一，或足夠近似可假定為值l.O，則定量乃至于分析都容易得多。事實上，如果總可以假定響應(yīng)因子為1.0，則不再需要制備和操作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣。如果是這種情況，將從根本上改變分析進(jìn)行的方式。在圖8中可以看到，對一半揮發(fā)性化合物萘和一揮發(fā)性化合物苯，比較了使用響應(yīng)因子定量與假定響應(yīng)因子為l.O來定量的經(jīng)增量的水樣的值的接近程度(RF比較。校準(zhǔn)RF對比RF4。SPESupelco公司的苯乙烯-二乙烯基苯/100mg。試劑水增量20ppb的PAG-5;誤差表示為95%置信區(qū)間，n=5。RF萘=1.036，RF菲0.999)。比較的結(jié)果非常好，充分表明應(yīng)進(jìn)行更大量的研究。自動化的潛力將PSI-SPE用作自動化手段的潛力是有吸引力的目標(biāo)，其將影響到未來儀器系統(tǒng)設(shè)計中自動化特性的設(shè)計。下面是一些可通過PSI-SPE來使用這樣或那樣形式的自動化的區(qū)域的取樣。對于環(huán)境法醫(yī)學(xué)和環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測，有許多機會來應(yīng)用該技術(shù)。由于這些固相預(yù)增量物質(zhì)的長期穩(wěn)定性，監(jiān)測被確定為污染地區(qū)的飲用水、淡水或水井，或通過常規(guī)取樣連續(xù)監(jiān)測污染，都是取樣自動化的機會。可在裝有制備的柱體的多功能系統(tǒng)中使用和/或重復(fù)PSI-SPE。通過使用電磁鐵和開關(guān)閥以及標(biāo)準(zhǔn)樣自動化裝置，可在預(yù)定的時間定期進(jìn)行取樣。可使取樣流的流動轉(zhuǎn)向通過柱體達(dá)適當(dāng)?shù)臅r間量，然后用干燥的空氣流替代樣品的流動，以在PSI-SPE取樣組分之后去除殘留的水。萃取完成后，樣品在很長一段時間內(nèi)是穩(wěn)定的，或者可以立即被除去，樣品柱體可被現(xiàn)場分析或運送或甚至郵寄到分析實驗室?？蓪⒅貜?fù)樣品分配給各種MS分析并歸檔用于長期質(zhì)量控制(QA)和驗證。食品、飲料和消費品分析食品與藥物管理局(FDA)和幾個獨立的組織已在一些軟飲料和果汁飲料中鑒定出低水平的苯。研究表明，在低pH值下，用作防腐劑的苯甲酸離子與抗壞血酸(補充的維生素C)S應(yīng)，形成苯。苯是已知的致癌物質(zhì)，并受到EPA的管理。廢水中5ppb以上的任何濃度的苯都被認(rèn)為是危險的。發(fā)明人對現(xiàn)有產(chǎn)品的調(diào)査顯示，一些飲料中的苯濃度超過5ppb。盡管形成機理尚未完全已知，但是熱、光和某些微量金屬以及抗壞血酸似乎有助于苯甲酸離子轉(zhuǎn)化成苯。FDA提出，苯的形成可能是瓶裝飲料到達(dá)商店后的保質(zhì)期和溫度條件的函數(shù)。這是PSI-SPE和額定的(duterated)苯甲酸濃縮同位素標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度過低在液態(tài)標(biāo)準(zhǔn)樣形式下不穩(wěn)定、但被預(yù)吸附到固相上將是穩(wěn)定的情況的示例。FDA或國土安全部需要分析的其他藥物和毒素也可以在濃縮同位素形式下被預(yù)吸附，并且成為定性和定量分析中有價值的新分析工具。因此，重要的是找到一種方法來對水、飲料、食品、藥品和其他樣品流中的污染物和毒素進(jìn)行快速、廉價、常規(guī)的監(jiān)測，類似于這個在生產(chǎn)、質(zhì)量控制和在國土安全和國防情形下適時地使用苯的示例。通過使用作為完全集成的自動分析測量系統(tǒng)的單獨設(shè)備或前端模塊的自動化多功能系統(tǒng)，可以經(jīng)濟(jì)有效地進(jìn)行PSI-SPE。SPI-SPE與標(biāo)準(zhǔn)樣分析方法的對比研究進(jìn)行了時間研究，以提供使用預(yù)增量穩(wěn)定同位素固相萃取(PSI-SPE)可實現(xiàn)的時間節(jié)省的示例。該研究主要針對一組IO個水樣，采用EPA方法8270作為測定方法、EPA方法3510作為萃取方法，對水樣進(jìn)行半揮發(fā)性分析物的分析。結(jié)果列于表3。表3.—組10個水樣的時間研究過程常規(guī)(小時)被測(小時)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>PSI-SPE大大節(jié)省了時間。從現(xiàn)場到完成結(jié)果所用的樣品處理時間是常規(guī)方法的37%。數(shù)據(jù)質(zhì)量明顯優(yōu)于通過常規(guī)協(xié)議取得的數(shù)據(jù)。經(jīng)濟(jì)評價進(jìn)行了成本研究，以獲得對使用PSI-SPE可實現(xiàn)的成本節(jié)省的基本了解。本研究主要針對一組10個水樣，采用EPA方法8270作為測定方法、EPA方法3510作為萃取方法，對水樣進(jìn)行半揮發(fā)性分析物的分析。結(jié)果列于表4。表4.一組10個水樣的成本研究<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>上述QCS利用現(xiàn)場PSI-SPE，大大節(jié)省了成本。從現(xiàn)場到完成結(jié)果所需的處理成本比常規(guī)方法低39%。當(dāng)大批量生產(chǎn)和銷售根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品和設(shè)備時，通過規(guī)模經(jīng)濟(jì)將實現(xiàn)更多的費用節(jié)省。為比較而被分開的樣品的比較獲得一組真實世界的樣品，并在外部實驗室將其分開以比較結(jié)果。4個樣品是從處于被補救汽油污染物的過程中的污染地點取得。樣品被送往商業(yè)實驗室進(jìn)行常規(guī)分析，并使用現(xiàn)場PSI-SPE進(jìn)行處理。結(jié)果列于表5。表5.在商業(yè)環(huán)境實驗室分開的監(jiān)測水井樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在9號監(jiān)測水井(MW-9)、16號監(jiān)測水井(MW-16)、以及19號水(MW-19)中檢測興趣分析物。兩種方法的分析物的鑒定以及測定值都非常一致。預(yù)吸附穩(wěn)定同位素固相實證結(jié)論實踐表明，預(yù)吸附穩(wěn)定同位素-固相萃取是一種有效的樣品萃取和平衡方法。PSI-SPE將消除目前實驗室萃取方法中的很多固有誤差來源，并成為自動化的基礎(chǔ)，從而能夠設(shè)計出新穎、高效、可靠、快速的樣品制備設(shè)備和系統(tǒng)。固相ELISA和SELDI同位素稀釋與物種化同位素稀釋質(zhì)譜ELISA-最普遍的免疫測定法哺乳動物的免疫反應(yīng)開始于特定的特殊細(xì)胞群(B細(xì)胞)對免疫系統(tǒng)無法識別的化合物(抗原)的識別。然后，免疫系統(tǒng)開始產(chǎn)生抗原特異性B細(xì)胞，其能產(chǎn)生具有與抗原結(jié)合的特性的特定的蛋白質(zhì)(抗體)。一旦與抗原結(jié)合，B細(xì)胞就促進(jìn)一系列力求盡快消滅抗原的反應(yīng)。免疫診斷法(免疫測定法)用該宿主防御蛋白質(zhì)(抗體)直接在人的血液中檢測外來物質(zhì)，如病毒抗原。免疫測定法是一組利用抗體的抗原識別特性的高特異性蛋白結(jié)合測定法?，F(xiàn)今采用的最普遍的免疫測定法為ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)法。所有ELISA系統(tǒng)的關(guān)鍵是抗體的使用。動物在抗原的刺激下產(chǎn)生抗體。抗體是特異性生物化學(xué)品，其與抗原結(jié)合，用于檢測特定的抗原，用于生產(chǎn)。因此，如果結(jié)合可被證明，則可將抗體用于檢測特定抗原。相反，可通過使用確定的抗原來測量特異性抗體，這在免疫化學(xué)研究和診斷生物學(xué)領(lǐng)域中構(gòu)成許多測定法的基礎(chǔ)。定量的基礎(chǔ)在于酶產(chǎn)生的信號，其與抗原濃度成正比或成線性關(guān)系。ELISA的優(yōu)點是簡單、易讀(通過肉眼或設(shè)備)、快速、靈敏、商業(yè)供應(yīng)的試劑、試劑盒和儀器、適應(yīng)性強、分析人員和實驗室的安全性、安全處置、相對容易的標(biāo)準(zhǔn)樣化和定量。利用激光電離，將同位素?fù)饺牍滔啾砻嫘揎椢镔|(zhì)，進(jìn)行直接和定量的固相IDMS和SIDMS質(zhì)譜測量，從而當(dāng)基體輔助激光解吸電離(MALDI)或激光燒蝕(LA)將表面和或基體都去除時，進(jìn)行分析物直接濃縮同位素比分析。在這一點，通過另外一個之前不存在的的自由度為定量增加了另一維度。這個最后的自由度允許表面固態(tài)平衡系統(tǒng)用比率代替定量去除，以賦予IDMS和SIDMS數(shù)學(xué)優(yōu)勢。一個關(guān)鍵的優(yōu)點是，不必為了實現(xiàn)定量和可重現(xiàn)性而去除整個修飾固相表面/基質(zhì)(含濃縮同位素標(biāo)記)和分析物。在IDMS和/或SIDMS情況下，修飾固相表面/基質(zhì)(含濃縮同位素標(biāo)記)的任何部分都允許基于同位素比而不是校準(zhǔn)曲線來定量。無需校準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)定量是IDMS和SIDMS所獨有的，其他形式的MALDI或LA需要定量和可重現(xiàn)的表面去除以產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。這里，平衡表面的任何部分都產(chǎn)生準(zhǔn)確定量，并排除通常與質(zhì)譜定量和ELISA定量兩者有關(guān)的誤差。一旦平衡，基質(zhì)吸附和清除效率的變化不再是定量中的因素。消除了IDMS和SIDMS方法的定量中傳送離子通過質(zhì)譜儀的質(zhì)譜儀效率和信號漂移這些方面的誤差來源。固相增量(標(biāo)記)使上述IDMS和SIDMS中不適用于ELISA和或質(zhì)譜領(lǐng)域的直接數(shù)學(xué)定量成為可能。采用熒光定量的ELISA近來開始應(yīng)用于環(huán)境衛(wèi)生和環(huán)境法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。ELISA已應(yīng)用于三嗪、磺脲類藥物、有機磷酸酯、多氯聯(lián)苯(PCB)、環(huán)戊二烯類殺蟲劑(cydodienes)、和BTX(苯，甲苯，二甲苯)及其他毒素的化學(xué)分析，用于由美國EPA和環(huán)境訂約人所作的廢棄場所的生物分析和鑒定。限制ELISA在環(huán)境領(lǐng)域廣泛使用的難點在于檢出限、校準(zhǔn)曲線誤差和基質(zhì)干擾。這些問題和多種誤差來源削弱了ELISA生成的數(shù)據(jù)在環(huán)境衛(wèi)生和法醫(yī)領(lǐng)域中的法律辯護(hù)性，在這些領(lǐng)域中，專家常在法律程序中評估分析數(shù)據(jù)。由于使用固相平衡質(zhì)譜和最終直接算法定量的最終的定量方法，通過IDMS禾卩/或SIDMS的固相平衡和不采用校準(zhǔn)曲線的直接定量在法律辯護(hù)性方面得到明顯改善。由于采用了平衡同位素比，不完全和部分回收的基質(zhì)和分析物、電離中的波動、儀器效率低下、性能下降和其他樣品操作或儀器導(dǎo)向偏差對準(zhǔn)確性而言是無關(guān)緊要的。因此，這些常見偏差都同時減少或消除，從而使數(shù)據(jù)辯護(hù)在法庭上處于更有利的地位。ELISA可在各種不同的形狀和包裝的固體載體物質(zhì)上以幾種不同的格式進(jìn)行。到目前為止，最普遍的ELISA使用8X12孔格式的塑料微量滴定板作為固相。因此，可在微孔板的92個個體孔的每一個中進(jìn)行ELISA測試(見圖9)。為了創(chuàng)建有效的ELISA，必須滿足三個條件稀釋線性這與下一個步驟一回收率密切相關(guān)。當(dāng)在x-y圖上繪制信號(表示為峰面積、峰面積或強度)-稀釋因子曲線時，其必須生成直線?；厥章蔬@是當(dāng)已知數(shù)量的有關(guān)物質(zhì)被加入測定反應(yīng)時，在測定之后觀察到的有關(guān)物質(zhì)的百分比。臨床日常工作中的回收率應(yīng)在10%以內(nèi)。百分比回收率={(估計值)-(凈增值)}/(凈增值)X100批內(nèi)和批間變異通常是在不同的日期進(jìn)行的，在一塊ELISA板中的批內(nèi)平均值，以及不同板間的批間平均值。ELISA類型和系統(tǒng)從根本上講，有兩種類型的ELISA:競爭(C-ELISA)或抑制(I-ELISA)。術(shù)語"競爭"和"抑制"描述測定，所述測定中的測量涉及通過對建立的預(yù)滴定系統(tǒng)的干擾能力來定量物質(zhì)。該系統(tǒng)也可用于抗體或抗原的測量。從方法論的角度，有三種基本的ELISA系統(tǒng)，是所有的ELISA測試(包括C型和I型；直接或間接)的基礎(chǔ)直接ELISA?？乖ㄟ^被動吸附附著在固相上。清洗之后，加入酶標(biāo)記抗體。經(jīng)過潛伏期和清洗之后加入底物系統(tǒng)，允許顏色逐漸顯示。間接ELISA。來自特定生物物種的抗體與附著在固相上的抗原反應(yīng)。通過添加異種(antispecies)酶標(biāo)記抗血清來檢測任何結(jié)合抗體。這廣泛應(yīng)用于臨床診斷。夾心ELISA。該系統(tǒng)涉及抗體或附著在固相物質(zhì)上的捕捉抗原。直接夾心ELISA。如果系統(tǒng)是直接夾心測定，則用酶標(biāo)記檢測抗體。利用抗原的血清特異性來檢測抗原。用酶標(biāo)記檢測抗體。捕捉抗體和檢測抗體可以是相同的血清，或者是來自同種的不同動物的血清，或是來自不同種動物的血清。用于直接夾心測定的抗原必須具有至少兩個抗原基。間接夾心ELISA。如果系統(tǒng)是間接夾心測定，則通過固相結(jié)合抗體來捕捉抗原。然后使用來自其他物種的抗體來檢測抗原。其依次被異種結(jié)合物(antispeciesconjugate)結(jié)合。因此，用于涂層和檢測抗體的血清物種必須不同；異種結(jié)合物不能與涂層抗體反應(yīng)。最常用的酶是辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。也使用其他酶，例如(3-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶和過氧化氫酶，但這些酶限制了底物選擇，還限制其廣泛應(yīng)用。檢測酶可直接與第一抗體聯(lián)結(jié)，或通過識別第一抗體的第二抗體引入檢測酶。如果第一抗體是生物素標(biāo)記的，其也可以與例如抗生蛋白鏈菌素等蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)。底物的選擇取決于檢測的必要靈敏度水平和檢測可用的儀表(分光光度計、熒光計或照度計)。在所有的蛋白標(biāo)記和可視化技術(shù)中，由于標(biāo)記和譜測量的簡單性以及抗生物素蛋白(在蛋清和鳥類、爬行動物和兩棲綱的組織中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白)的高特異性和對生物素這種小維生素的選擇性，人們所透徹了解的生物素化是最流行的。在用于檢測和目標(biāo)生物分析物的測定系統(tǒng)中，抗生物素蛋白-生物素反應(yīng)是最有用的工具?？股锼氐鞍讓ι锼靥貏e的親和力允許復(fù)雜混合物中的含生物素的分子與抗生物素蛋白結(jié)合物離散地結(jié)合。使用IDMS和/或SIDMS的質(zhì)譜ELISA微陣列芯片由于固有的高靈敏度和明顯較低的干擾，質(zhì)譜儀和同位素測量技術(shù)作為潛在的免疫檢測系統(tǒng)是非?？扇〉?，但是由于一些阻礙，它們沒有成功地用作ELISA的最終定量探測器。主要原因是質(zhì)譜儀的高成本、質(zhì)譜探測器信號的不穩(wěn)定、生物科學(xué)家缺乏同位素分析方面的專業(yè)知識以及質(zhì)譜儀在生物分析測量領(lǐng)域相對新近的普及。對于ELISA型測定，當(dāng)肽位于被設(shè)置成微陣列板中的結(jié)合抗原或固定抗體行的離散取樣點上時，使用濃縮同位素標(biāo)記或同位素濃縮合成肽來模仿抗原基或抗體是可行的。然后對微陣列板進(jìn)行處理，并將其引入質(zhì)譜儀進(jìn)行液體/或氣體電離和最后的定量質(zhì)譜分析。當(dāng)可固定在固相基質(zhì)上的細(xì)胞被固定并作為抗原晶格時，在發(fā)酵過程中通過介質(zhì)中的養(yǎng)分或通過化學(xué)同位素標(biāo)記過程摻入同位素標(biāo)記的所有細(xì)胞都可被使用，不管是活的還是減弱的。這些細(xì)胞包含在專門設(shè)計的多陣列芯片中，離散取樣進(jìn)行地點有能力保持細(xì)胞的結(jié)合在質(zhì)譜儀的分析周期時長內(nèi)保持存活。將利用IDMS和/或SIDMS原理的同位素分析方法和本文所述的發(fā)明用于通過固定配體對其他生物分子的親和力捕捉和分析生物分子，固定配體例如是凝集素、多糖、核苷酸、生物分子和/或可以脫離天然源或合成為功能類似物的化學(xué)毒素。濃縮同位素可用于固定在基因芯片微陣列上的數(shù)以千計的核苷酸探針中的每一個探針的可視化。圖10、11、12顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例的表面修飾固相物質(zhì)上的濃縮同位素標(biāo)記抗原。采用IDMS禾口/或SIDMS的質(zhì)譜SELDI分析質(zhì)譜技術(shù)在臨床診斷中的新近的一個應(yīng)用涉及SELDI(表面增強激光解吸電離)芯片，其具有用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜(profiling)的蛋白質(zhì)和多肽固定的各種不同的功能表面。這些芯片利用來自細(xì)胞樣品源的固定生物標(biāo)記，這些生物標(biāo)記在細(xì)胞樣品源中根據(jù)病情具有獨特的響應(yīng)表達(dá)。由于迄今為止的工作都采用直接蛋白組學(xué)分析，其到目前為止不涉及任何以最終的定量為目的的分子標(biāo)記，這是由于整個生物標(biāo)記分析和蛋白質(zhì)表達(dá)譜領(lǐng)域被缺乏最終直接定量和可重現(xiàn)性所累。濃縮同位素標(biāo)記通過提供在SELDI蛋白質(zhì)芯片上測量同位素標(biāo)記生物標(biāo)記比的手段，克服了這些局限性，通過IDMS和/或SIDMS定量大大改善了定量和可重現(xiàn)性。見圖13、14和15。使用IDMS和/或SIDMS的直接組織譜新的分子表達(dá)譜技術(shù)有助于通過微創(chuàng)活檢獲得的小病理樣品的分析，涉及預(yù)后、治療反應(yīng)、以及創(chuàng)新的靶標(biāo)確認(rèn)相關(guān)的病理解剖分析可以發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的生物標(biāo)記。因此健康和病理設(shè)置中的組織學(xué)水平的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的重要問題。直接組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析(DTPA)是SELDI-MS技術(shù)的最初應(yīng)用，可作為對病理解剖診斷的補充來擴(kuò)展臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用。DPTA方法提供了獨特的高吞吐量特點，這可用于發(fā)現(xiàn)大量患者組中的生物標(biāo)記。DPTA方法已用于肺癌和腦腫瘤等疾病的分類，從而改進(jìn)病理解剖診斷技術(shù)。DPTA是最近開發(fā)的快速、靈敏的技術(shù)，開啟了通向臨床蛋白質(zhì)組學(xué)新觀點的大門。通過使用濃縮同位素標(biāo)記及應(yīng)用引入作為固相表面修飾或非修飾介質(zhì)的IDMS和/或SIDMS原理，獲得了該領(lǐng)域目前需要的明確定量、重現(xiàn)性和靈敏度的發(fā)展。直接數(shù)學(xué)反巻積是必要的，因為在環(huán)境法醫(yī)學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生和國土安全測量的實踐中只有直接數(shù)學(xué)求解才允許分析物的定量-實例如剛剛通過人體組織中的汞物種所例證的，由于校準(zhǔn)曲線導(dǎo)致80%以上的誤差，因此不能用于定量。只有SIDMS直接濃縮同位素計算才既能進(jìn)行定量又能校正物種轉(zhuǎn)化中的物種轉(zhuǎn)變。已發(fā)現(xiàn)，IDMS和SIDMS都必須通過數(shù)學(xué)算法直接計算而不應(yīng)使用校準(zhǔn)曲線來避免分析實驗室中常見的誤差，在國土安全，環(huán)境衛(wèi)生和工業(yè)測量等關(guān)鍵測量中，這些誤差是關(guān)鍵的、費時的、且不可接受的。興趣分析物的濃縮同位素類似物是從原始的濃縮同位素生成的，或是購買的或在實驗室中合成的。本發(fā)明包含將IDMS和SIDMS與各種電離方法聯(lián)用，如ESI、納升電噴霧(nanoESI)、納米芯片電噴霧(nanochipESI)、DESI、MALDI、LA、SELDI、APCI、ICP、GC-ICP、GC-MS。為實證目的，顯示了GC-ICP-MS和納升電噴霧飛行時間質(zhì)譜。用GC-ICP-MS和通過nanochipESI與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用的電離(nanochipESI飛行時間質(zhì)譜)平臺的示例來例證適合國土安全、環(huán)境法醫(yī)學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生、工業(yè)抽樣測量情形的示例。附上汞物種、疊氮化鈉和氰化鉀的毒素數(shù)據(jù)的例證。利用IDMS(同位素稀釋質(zhì)譜)和SIDMS(物種化的同位素稀釋質(zhì)譜)的增量對目標(biāo)分析物物種進(jìn)行定量測定需要的數(shù)學(xué)算法與傳統(tǒng)的方法(和數(shù)學(xué)方法的新應(yīng)用)不同，因為它們只需通過直接數(shù)學(xué)求解來完成。由純標(biāo)準(zhǔn)樣獲得的校準(zhǔn)曲線在單一測量中是不可能的或者可能根本無法采用。發(fā)展了這些相對實際情況的簡化，并將其應(yīng)用于多種類型的濃縮同位素樣品制備，例如直接溶液電離和表面吸附、結(jié)合、離子交換、固相萃取測量及諸多其他方法。不能通過標(biāo)準(zhǔn)樣曲線定量且必須通過SIDMS測量完成的測量的第一示例是具有甲基汞和無機汞并增量了乙基汞的血液樣品。樣品在與獨立的同位素類似物無機汞、乙基汞和甲基汞平衡后被分離和電離。在該示例中，無機汞Hg^增量了98X的濃縮無機汞Hg+、199，甲基汞(CH3Hg+)增量了甲基滎(31131^+-202，乙基汞(C2H5Hg+)增量了(^21151^+-201，金屬汞物種(HgQ)未存在于原樣品中，是在用于分離三個汞物種的GC柱中通過熱分解產(chǎn)生的。下圖16表明，使用校準(zhǔn)曲線即使不是不可能，也是非常困難的，因為人體血液或尿液中的不同數(shù)量的無機汞、甲基汞和/或乙基汞會以不同的比例產(chǎn)生不同數(shù)量的四種物種(無機汞，甲基汞，乙基汞和金屬汞)，而對未知的個體樣品是無法建立校準(zhǔn)曲線的。只有通過SIDMS法的數(shù)學(xué)反巻積才能在這種情況下進(jìn)行定量。與上文所述的人發(fā)和6種分離轉(zhuǎn)化的示例相同，在該示例中，須進(jìn)行定值和校正的至少有4種以上，因為這里不僅形成了第四物種金屬汞，而且無機汞、甲基汞和乙基汞也促使了該第四物種的轉(zhuǎn)化。這些情況比過去更加普遍，且常見于多種類型的反應(yīng)物種分析，如芥子氣、農(nóng)藥和農(nóng)藥代謝物、可卡因及其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物嗎啡。這些分子位移很多都需要定量，但是如果用于定量的方法是校準(zhǔn)曲線，則不服從于準(zhǔn)確或快速的定量。IDMS、SIDMS和直接物種算法取決于產(chǎn)生的物種，只有為了IDMS和SIDMS分析而新產(chǎn)生的直接數(shù)學(xué)算法才能用于動態(tài)系統(tǒng)的定量。濃縮穩(wěn)定同位素稀釋劑("稀釋劑"，spike)與樣品之間必須具有不同的同位素組成，但具有相同的興趣分析物的化學(xué)形態(tài)和化學(xué)性質(zhì)。實際樣品的基質(zhì)組成與正常標(biāo)準(zhǔn)樣很少相同，與其他元素成分的任何差異導(dǎo)致在ESI、nanoESI、nanochipESL、MALDI、SELDI和APCI等軟電離方法中表達(dá)不同的同位素類似物。因此，沒有任何校準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確代表樣品。在此給出疊氮化鈉和氰化鉀的示例。稀釋劑是在水和/或酸中和/或有機溶劑溶液中制備的，或者通過吸附、離子交換或結(jié)合固定在表面。在軟電離方法中，如噴霧(ESI)、謹(jǐn)oESI、DESI、MALDI禾卩SELDI，或者在硬電離方法中，如上述汞物種示例中的ICP-MS，不能通過建立校準(zhǔn)曲線的完成校準(zhǔn)。在軟電離方法中，被測量和定量的離子依賴于實際樣品中的基質(zhì)與分析物，無法通過標(biāo)準(zhǔn)樣或者甚至于通過試圖與基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)樣來模擬。離子同時是基質(zhì)相互作用的產(chǎn)物。分析物可以有許多質(zhì)譜儀中代表的代表性的分子離子和離子物種。將以疊氮為例顯示幾個基于基質(zhì)和樣品條件的表示法。每個表示法需要直接使用IDMS和SIDMS的不同數(shù)學(xué)定量。軟電離不會獨立于基質(zhì)產(chǎn)生分子離子，但是把基質(zhì)與環(huán)境結(jié)合以改變表示分子離子和同位素濃度類似物離子的濃度。舉例如下。校準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)樣IDMS和SIDMS公式的使用不能用于定量，而只有對來自軟電離的這些同位素物種采用新的數(shù)學(xué)算法協(xié)議，定量才是可能的?？梢钥闯觯瑯?biāo)準(zhǔn)樣IDMS公式不能說明用于定量的多種表達(dá)和同時和不同的同位素比。將IDMS中用于同位素比定量測定的通用數(shù)學(xué)公式表示為式1，用于確定未知樣品濃度的數(shù)學(xué)求解的直接算法是該公式的重排，顯示為式2。該直接數(shù)學(xué)求解的各個組成部分在下面的式2中表示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>其中，W^同位素稀釋劑的重量c^稀釋劑中的物種濃度(濃縮)Q^樣品中的物種濃度(未知)As=稀釋劑中的改變的同位素A的原子分?jǐn)?shù)(濃縮)Ax=樣品中的同位素A的原子分?jǐn)?shù)(天然)Bs=稀釋劑中的改變的同位素B的原子分?jǐn)?shù)(濃縮)Bx=樣品中的同位素B的原子分?jǐn)?shù)(天然)M^樣品中的物種的平均原子質(zhì)量Mf稀釋劑中的物種的平均原子質(zhì)量Rn^同位素A與同位素B的測量同位素比(濃縮/天然)校準(zhǔn)曲線的使用也受到過篩物種濃度的限制，其中過篩(sifting)物種濃度取決于動態(tài)物種濃度和無法通過分別進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)樣校準(zhǔn)方案來重復(fù)的樣品的基質(zhì)。例如ESI、nanoESI、MALDI、APCI和EI等軟電離方法是這些分子軟電離源中的一些示例，這些軟電離源最容易受到無法在不用基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣溶液中復(fù)制的復(fù)雜分子離子的影響。動態(tài)物種和使用軟電離方法通過樣品基質(zhì)本身確定的物種需要與硬電離方法十分不同的數(shù)學(xué)處理，例如ICP-MS的硬電離方法使所有物種變?yōu)樵仉x子，并且可以使用校準(zhǔn)曲線，因為嚴(yán)格的(harsh)電離消除了基質(zhì)效應(yīng)和分子信息。該應(yīng)用不足以定量軟電離和復(fù)雜電離的分子離子的各種表達(dá)。在該示例中，疊氮化物以正離子模式和負(fù)離子模式使用。該純?nèi)芤褐泻锈c(Na)離子，Na是作為正離子影響添加的，正離子模式下物種之一的1:1的比率和負(fù)離子模式下的l:2或1:3的比率同時表達(dá)。任何可用和主要(dominant)的離子例如K都可以用只存在于具有上述樣品的基質(zhì)條件的實際樣品中的分子離子代表。校準(zhǔn)溶液的基質(zhì)匹配不能準(zhǔn)確或完全解釋真實樣品中的基質(zhì)離子的濃度和實際條件的復(fù)雜性。還存在其他離子模式，如圖17至24所示。在所述第一組示例中，只有多算法才能考慮到定量疊氮化物所必須的多種離子表達(dá)。在正離子模式中，發(fā)現(xiàn)一組物種離子，在負(fù)離子模式中，觀察到明顯不同比值的另一組物種離子(見圖17至20)。當(dāng)物種是源自相同的母體物種的不同子物種時，在通過質(zhì)譜儀根據(jù)質(zhì)量分離的同位素濃縮和天然毒素的多種物種的準(zhǔn)確定量中，沒有偏置的直接校準(zhǔn)是IDMS和SIDMS的擴(kuò)展。這些情況下的反巻積不是正在轉(zhuǎn)變的多種物種的反巻積，而是從溶液或固相的相同的物種產(chǎn)生并以獨特的比率和圖式表達(dá)的多種物種的反巻積。數(shù)學(xué)上，定量必須準(zhǔn)確地考慮到幾個物種和他們的不同比來定量毒素。圖21表示荷質(zhì)比(m/z)質(zhì)譜的多個部分，該質(zhì)譜在通過具有Na的該基質(zhì)產(chǎn)生的不同物種中提供超過一打的確認(rèn)比值，并且都在K和其他離子之間分裂，如果樣品中含有K，將產(chǎn)生Na和K離子。在這種情況下，Na4(N3)5-離子也將具有Na3K、Na2K2和NaK3和K4類似物。這些中的每一個都是獨特的，且與基于純標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行的校準(zhǔn)不同。只有通過對現(xiàn)場產(chǎn)生的實際同位素標(biāo)記的真實物種應(yīng)用直接數(shù)學(xué)求解才是定量的真實的樣品。只能使用直接數(shù)學(xué)同位素比，因為沒有基質(zhì)和實際存在的樣品，無法表達(dá)通過樣品表達(dá)的實際分析物物種及其同位素類似物的準(zhǔn)確表現(xiàn)。使用同位素比時準(zhǔn)確濃度可達(dá)2和3位有效數(shù)字，但多數(shù)情況下在復(fù)雜基質(zhì)中由模擬校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣能產(chǎn)生小于1位有效數(shù)字，這些這些不能作為工作的基礎(chǔ)。這些從天然和濃縮同位素物種產(chǎn)生的多個相關(guān)物種普遍存在于例如nanoESI和MALDI的軟電離中，而由于離子的穩(wěn)定性，這些物種在較硬的電離中消失。另一示例是氰化鉀毒素，例如圖24中所不o在任何其他劑量的基質(zhì)或混合物或陰離子螯合物將表達(dá)的金屬離子成分(例如K或任何會被CN—螯合物螯合的金屬離子)的基質(zhì)中，譜中的Fe、Cu、Ni、Cd、Hg將被修飾，并會完全不同，在目前無法理論預(yù)測。例如，實際樣品將具有例如對于Hg2+、Cd2+具有倍增的數(shù)學(xué)穩(wěn)定性的形成常數(shù)和分階形成常數(shù)，對于Kl、K1K2、K1K2K3、K1K2K3K4為5.5、5.1、4.6、3.6，對于Hg和Cd離子分別與氰化物負(fù)離子的Ks(底物常數(shù))的對數(shù)，為10.0、16.7、3.8禾口3.0。這些全部在競爭，無法計算，必須進(jìn)行測量，并且建立校準(zhǔn)曲線來定量無法預(yù)測的真實樣品。在這些復(fù)雜軟離子分子定量中，只有不校準(zhǔn)的直接數(shù)學(xué)求解是可能的。在水溶液中可能表達(dá)超過80階乘的離子可能組合。術(shù)語的正常上下文中的傳統(tǒng)的校準(zhǔn)曲線的使用是不適用的。校準(zhǔn)曲線的使用、采用校準(zhǔn)曲線的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣的使用或者基于這些離子的校準(zhǔn)曲線是適當(dāng)?shù)模⒛軌蛴杉冃?zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣以定量真實樣品的未知基質(zhì)的濃度的方式建立。如果存在鉀和鈉和其他離子，則表達(dá)鉀和鈉和其他金屬加合離子，以及產(chǎn)生與母體毒素相關(guān)但在基于樣品基質(zhì)的質(zhì)譜中卻表達(dá)為新的物種的復(fù)雜物種，樣品制備和離子環(huán)境將是獨特的。如果同位素類似物的存在允許己知的一對物種也被定性識別為M+l和M+2類似物，識別也將更加確定。在萃取之前和/或過程中添加到樣品中的和/或在固相中平衡以進(jìn)行所需的必要校準(zhǔn)步驟的已知劑量的同位素濃縮物種，在這里通過樣品中的非定量分析物表達(dá)。當(dāng)傳統(tǒng)意義上的校準(zhǔn)不適用時，直接數(shù)學(xué)計算是既能識別又能定量分析物的唯一的可靠方式。當(dāng)由添加到樣品中的母體物種產(chǎn)生新的物種并且需要新的算法來直接定性和定量處理分析物時，這是SIDMS和IDMS的擴(kuò)展。微波增強平衡使用IDMS和SIDMS方法時平衡時間對物種的影響傳統(tǒng)加熱、超聲萃取和微波增強平衡的比較在該說明中，在通過SIDMS和IDMS技術(shù)的汞物種形成中使用NIST標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(河流泥沙標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(SRM)2704和土壤標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(SRM)2711)和歐洲IAEA認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)樣物質(zhì)(CRM)(人發(fā)IAEA-085)。兩種標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(2704和2711)增量已知量的同位素濃縮無機汞(199Hg2+)。該研究中評價的樣品制備方法是EPA方法3052、EPA草擬方法3200(微波輔助萃取，MAE)和EPA方法3200(超聲輔助萃取，UAE)。為實施EPA方法3052和方法3200(MAE)，對樣品進(jìn)行增量，并立刻根據(jù)該方法萃取或消解。但是對于方法3200(UAE)這一選擇，對樣品進(jìn)行增量，并用不同時間量(l小時、3小時、6小時、12小時、24小時和48小時)進(jìn)行平衡，然后根據(jù)該方法萃取。表6:平衡時間對總汞的IDMS分析的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>不確定度在95%置信區(qū)間，n=4。N/A—不適用，對樣品進(jìn)行增量并立刻消解/萃取。由于EPA方法3052和3200(MAE)是非常高效的，因此實現(xiàn)從兩個被研究標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)總滎的100%回收(表6)。在這種情況下，增量的同位素與樣品同位素在萃取過程/消解中在小于10分鐘之內(nèi)平衡。由于EPA方法3200(UAE)在無機汞的萃取和平衡中效率較低，因此回收百分比隨著不同的研究標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)和時間而不同。標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)2704的回收百分比在24小時內(nèi)上升到大約100%,而標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)2711即使在48小時之后也未獲得定量回收。從方法3200(UAE)的回收百分比數(shù)據(jù)顯示，無論稀釋劑與樣品的平衡花費1小時還是48小時，當(dāng)使用UAE時，回收都取決于樣品基質(zhì)。該實踐研究最后顯示，用于水樣IDMS分析的"稀釋劑同位素與樣品同位素的平衡"不是對所有類型的萃取協(xié)議下的復(fù)雜或固態(tài)樣品都適用的。在前面提到的(LuYang等人)酵母的鉻物種分析中，同一時間依賴萃取經(jīng)歷12小時來進(jìn)行組織樣品的熱對流和熱傳導(dǎo)。對于固態(tài)樣品，在質(zhì)譜之前，高效萃取和平衡方法對于興趣物種是必要的。低效的固相樣品萃取和/或消解和平衡方法會導(dǎo)致不準(zhǔn)確的IDMS或SIDMS分析。SIDMS需要多種物種同時平衡并鑒別物種轉(zhuǎn)變，以便校正每個物種的最終濃度。使用人發(fā)中的汞物種作為只包含甲基汞和無機汞物種的良好模型的示例，比較EPA方法3200中的兩種可選方法，用MAE和UAE萃取這些物種。從表7的比較可以看出，UAE未獲得正確的標(biāo)準(zhǔn)樣結(jié)果，因為該步驟中結(jié)合的天然和濃縮同位素物種的萃取和平衡不發(fā)生，或者不夠完全因此無法獲得正確的答案。MAE與之形成對比，MAE采用微波來同時萃取兩個物種和平衡濃縮的同位素物種。MAE在比UAE示例的一半時間更少的時間內(nèi)獲得統(tǒng)計學(xué)有效度內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)樣值。表7.通過EPA方法6800的毛發(fā)樣品(IAEA-085)中滎物種的濃度和百分比變化的反巻積，SIDMS使用濃縮的同位素試劑和反巻積算<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>不確定度在95%置信區(qū)間，n=4MAE—微波輔助萃取，共10分鐘UAE—超聲輔助萃取，共28分鐘*括號中的值代表回收百分比多物種轉(zhuǎn)變和直接數(shù)學(xué)確定是必要的，優(yōu)于校準(zhǔn)曲線有必要評價多物種轉(zhuǎn)變和多物種的轉(zhuǎn)化，以證明本發(fā)明所述的萃取和平衡方法的耐用性。目前沒有三種汞物種的認(rèn)證組織樣品，因此將之前的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(CRM)(人發(fā)認(rèn)證參考標(biāo)準(zhǔn)樣物質(zhì)，IAEA-085)增量第三汞物種乙基汞。這是一種合理的選擇，因為文獻(xiàn)表明乙基汞是人體從疫苗中的汞防腐劑硫柳汞代謝的汞物種。由于這三種物種的存在，必須計算六種物種轉(zhuǎn)化。為這一特殊目的發(fā)展了數(shù)學(xué)算法，用于樣品制備過程中的三種物種和它們之間的轉(zhuǎn)化的SIDMS測量。表8中揭示了80%以上的乙基汞轉(zhuǎn)化，該乙基汞轉(zhuǎn)化主要是由于乙基汞轉(zhuǎn)化為無機汞以及乙基汞轉(zhuǎn)化為甲基汞。甲基汞的轉(zhuǎn)化也值得注意，并特定的從乙基汞轉(zhuǎn)化得到的甲基汞單獨測量。如果沒有統(tǒng)一地同時萃取和平衡所有汞物種，該測量無法進(jìn)行。表8:對總汞和甲基汞認(rèn)證的人發(fā)認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)樣參考物質(zhì)(IAEA-085)，增量濃度22嗎/g的天然乙基汞。使用微波萃取和HPLC-ICP-MS分析，對三種物種應(yīng)用EPA方法6800，對物種的全部六種轉(zhuǎn)化應(yīng)用校正。顯示了該實踐研究中得到的多個復(fù)制品及分析空白試驗值樣品識別毛發(fā)-10嗎/gHg/g嗎/g1AEA-085反巻積濃度分析物復(fù)Hg2+MeHg+EtHg+制品互變(％)Hg2+MeHg十MeHg十EtHg+EtHg+Hg2+至至至至至至MeHg+Hg2+EtHg+MeHg十Hg2+EtHg+<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>根據(jù)物種和同位素濃縮物種的表達(dá)，IDMS和SIDMS中的算法容易手動或動態(tài)可調(diào)。然而，校準(zhǔn)曲線是不可調(diào)的。必須每次產(chǎn)生它們，例行公事并且相對頻繁。校準(zhǔn)曲線不是對多物種分析的數(shù)學(xué)可行的替代，因為即使當(dāng)發(fā)生最微小的基質(zhì)樣品變化時，誤差和位移也會妨礙其使用。因此，進(jìn)行用于定量的同位素濃縮類似物的IDMS和SIDMS測量的唯一的數(shù)學(xué)準(zhǔn)確的方法。這對于國土安全和國防應(yīng)用以及必須得到和確保最低的第一類誤差(falsepositive)和第二類誤差(falsenegative)的質(zhì)量保證測量而言是關(guān)鍵的。本文通過實例進(jìn)一步描述了IDMS和SIDMS的這些方面。第三部分一描述了現(xiàn)場應(yīng)用的完全自動化系統(tǒng)中的集成例如用于國防和國土安全，說明如下隨著恐怖主義的威脅和食物、空氣和飲用水的針對性污染的潛在可能，產(chǎn)生了以最準(zhǔn)確的可能方式(第一類誤差最低或不存在)對易揮發(fā)試劑快速檢測大量的相對少見但高毒性的化合物的需要。由于最危險的試劑是非常有效的，因此強烈要求毒素探測器能夠準(zhǔn)確可靠地檢測到最低濃度水平。鑒于工作的任務(wù)的關(guān)鍵性和時間緊迫性，依賴性地在不同的情況和環(huán)境下能夠保持其準(zhǔn)確度和靈敏度的耐用的現(xiàn)場使用系統(tǒng)中，周期(取樣、樣品制備/樣品操作和分析)必須快速結(jié)束。如果使用標(biāo)準(zhǔn)樣，優(yōu)選的是不處理標(biāo)準(zhǔn)樣(典型為高毒性物質(zhì)的化學(xué)類似物)，以便這些標(biāo)準(zhǔn)樣固定在固相過濾器、充滿珠子的柱、柱體和其他相對安全的小型固相設(shè)備中，這些固相設(shè)備的運輸遠(yuǎn)比液體更為安全，并且可在對液體而言會不穩(wěn)定且需要頻繁更換的濃度下來運輸。如果需要將在現(xiàn)場或遠(yuǎn)處取得的樣品運輸?shù)綄嶒炇?，將樣品放入固相容器?nèi)的能力，可能以在整個保管鏈(從源中去除樣品與運往通常是專門的實驗室的分析地之間的步驟)中穩(wěn)定(將保持其化學(xué)形式)和安全地處理的形式固定?，F(xiàn)今可用的大多數(shù)靈敏和有用的檢測系統(tǒng)在分析樣品時都使用標(biāo)準(zhǔn)樣校準(zhǔn)方法來建立有用的探測器信號范圍，并依賴于校準(zhǔn)范圍作為計算探測器產(chǎn)生的探測器信號的參考。任何在實驗室工作的化學(xué)家將非常熟悉校準(zhǔn)曲線的使用。不幸的是，校準(zhǔn)曲線受到許多的42潛在誤差源的影響，并且需要頻繁中斷樣品分析周期來重新校準(zhǔn)?；|(zhì)(在其中發(fā)現(xiàn)興趣分析物的物質(zhì))變化、分析物萃取過程中的變化都在基于校準(zhǔn)曲線的測量中引入誤差。此外，質(zhì)譜儀是能夠檢測到"萬億(trillion)分之一"水平的分子的最靈敏的探測器，其產(chǎn)生使最終建立的校準(zhǔn)曲線無效的信號漂移。為質(zhì)譜儀建立新的校準(zhǔn)曲線意味著分析人員要進(jìn)行大量的手動、繁重、耗時的樣品制備和分析步驟。所有這些與校準(zhǔn)曲線有關(guān)的潛在誤差源排除了現(xiàn)有的質(zhì)譜儀為了國土安全和國防目的自動化的可能性。本文前面所引用的關(guān)于IDMS和SIDMS的現(xiàn)有發(fā)明和專利以及本文所描述的發(fā)明解決了這些問題。濃縮同位素標(biāo)記和濃縮標(biāo)準(zhǔn)樣類似物的使用提供了在核子范圍而不是化學(xué)范圍進(jìn)行測量的能力，該技術(shù)基于所有流行的發(fā)色、熒光、化學(xué)發(fā)光和其他可視化技術(shù)。其依次消除了許多干擾和穩(wěn)定性問題。IDMS和SIDMS利用數(shù)學(xué)求解來產(chǎn)生最終數(shù)據(jù)，這消除了校準(zhǔn)曲線的需要，消除或最小化了與基質(zhì)變化和萃取步驟之后的分析物回收有關(guān)的問題。通過IDMS和/或SIDMS協(xié)議下的質(zhì)譜法產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)是校準(zhǔn)的和高度準(zhǔn)確的結(jié)果。在應(yīng)用該專利的時候，IDMS和SIDMS協(xié)議已被美國環(huán)保署(EPA)所接受，作為國家方法，指定為"方法6800"，該方法已被EPA和英國標(biāo)準(zhǔn)樣協(xié)會(BSI)在發(fā)表的意見和文件中認(rèn)可，作為能夠產(chǎn)生用于物種化的元素分析的法律辯護(hù)數(shù)據(jù)的唯一方法。目前，分析前(前期過程)的樣品制備要求從現(xiàn)場去除樣品、興趣分析物萃取、分析物分離、用濃縮同位素進(jìn)行增量(或標(biāo)記)，其包括高度熟練的分析人員進(jìn)行的一系列的手動步驟。該過程將花費幾小時到數(shù)天均有可能。前期的時間的顯著縮短和手動步驟的消除是在IDMS和SIDMS能夠自動化之前勢在必行的。本發(fā)明精確實現(xiàn)了這些前期性能改進(jìn)來實現(xiàn)完全的、交付使用的自動化。在應(yīng)用本發(fā)明的時候，發(fā)明人正處于代表美國政府開發(fā)被稱為"集成工業(yè)方法系統(tǒng)(IIMS)"的五階段程序，目標(biāo)是創(chuàng)建武裝部隊和緊急出動人員能夠?qū)嵉厥褂玫幕瘜W(xué)和生物測量系統(tǒng)。將自校準(zhǔn)、實地使用構(gòu)思為包括本發(fā)明所述的所有自動化特征的質(zhì)量分析器。無論是通過恐怖分子還是工業(yè)過程引入到環(huán)境中，毒劑都以物種化和復(fù)雜的化學(xué)形式存在，這常常使得可以通過現(xiàn)有的實驗室分析自動檢測和測量它們。通常，必須使用長期、繁瑣的樣品制備和校準(zhǔn)步驟和多種檢測方法。這些方法完全不適合IIMS類型的應(yīng)用。自動化需要和安全和檢測性能問題的大多數(shù)或所有方面己付諸實施。例如，應(yīng)用同位素技術(shù)(AIT)公司發(fā)售的IDMS和SIDMS產(chǎn)品已向環(huán)境實驗室、研究實驗室、工業(yè)實驗室和疾病控制中心出售，用于測量水、土壤、毛發(fā)、組織、血液和尿液，以及天然和工業(yè)來源的有毒化學(xué)制品的分析。AIT產(chǎn)品已作為IDMS和SIDMS試劑盒出售，包括同位素稀釋劑、濃縮標(biāo)準(zhǔn)樣類似物和用于最終的數(shù)學(xué)反巻積和計算的軟件。AIT的產(chǎn)品已用于不同類型的質(zhì)譜儀，例如飛行時間(TOF)和電感耦合等離子體(ICP)、與高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)聯(lián)用，采用電噴射電離(液體到液體噴霧)和氣體電離(液體到氣體)的形式。其他發(fā)明，如用于快速增量和平衡、同時萃取、增量和平衡的固相介質(zhì)保持同位素標(biāo)記或濃縮標(biāo)準(zhǔn)樣類似物，已付諸實施。權(quán)利要求1、一種用于平衡同位素稀釋質(zhì)譜樣品的方法，包括以下步驟a)向介質(zhì)中添加一定量或濃度的同位素標(biāo)記分析物類似物，所述介質(zhì)選自包括固相載體和可微波溶液的組；b)再向所述介質(zhì)中添加包含或被懷疑包含與所述同位素標(biāo)記分析物類似物對應(yīng)的興趣分析物的樣品；c)對所述介質(zhì)執(zhí)行平衡步驟，選自包括(a)將固相載體和所述樣品培養(yǎng)1秒至24小時以及(b)將可微波溶液微波1秒至1小時的組，以制備包含同位素標(biāo)記分析物類似物的平衡樣品；以及d)對包含所述同位素標(biāo)記分析物類似物的所述平衡樣品進(jìn)行直接電離，并送入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固相載體還選自包括表面修飾和/或功能化的離子交換介質(zhì)、吸附介質(zhì)、固相萃取樹脂、樹脂膠合固相、吸附劑、固體和/或多孔珠體、特殊的和表面活化的珠體、混合床介質(zhì)、過濾器、用于固定液體萃取的二態(tài)液體、裝在填充柱中的纖維、微量滴定板、板、微陣列、瓶子、管、蓋子、ELISA、SELDI中的隔片和吸量管尖端、微陣列和可溶解的固相凝膠以及免疫測定固相介質(zhì)載體的組。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述同位素稀釋質(zhì)譜樣品是物種化的同位素稀釋質(zhì)譜樣品。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述同位素稀釋質(zhì)譜樣品是特定物種同位素稀釋質(zhì)譜樣品。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中微波所述可微波溶液的所述步驟在1至600秒的時間內(nèi)完成平衡。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)固相載體和所述樣品的所述歩驟在1至600秒的時間內(nèi)完成平衡。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分析物選自包括含有任意天然存在同位素變化的元素的化合物或成分的組。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中微波所述微波溶液的步驟在101()至1013赫茲范圍內(nèi)進(jìn)行。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中微波所述微波溶液的步驟在約2450兆赫茲處進(jìn)行。10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中分析物選自包括用于國土安全、國防、環(huán)境優(yōu)先毒素、環(huán)境法醫(yī)學(xué)物種、以及環(huán)境衛(wèi)生和工業(yè)化學(xué)的化合物或成分的組。11、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中分析物選自包括含有汞、叔丁醇、甲基叔丁醚、乙基叔丁醚、二異丙醚、叔戊基甲基醚、嗎啡、二氧六環(huán)、二氯乙垸、四氯乙烷、萘和菲的化合物或成分的組。12、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中基于存在的全體分析物與同位素標(biāo)記分析物類似物之比來計算樣品中的分析物的濃度，其中所述全體分析物是通過質(zhì)譜測定的。13、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中基于物種的同位素比使用濃度和/或降解調(diào)整的數(shù)學(xué)計算來直接計算分析物的濃度，而不使用校準(zhǔn)曲線。14、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中固相和/或微波平衡用于自動化的IDMS禾口/或SIDMS質(zhì)譜。全文摘要一種用于在質(zhì)譜分析之前使用固相和/或微波同位素比平衡和測量來平衡濃縮同位素物種與天然同位素物種的方法。文檔編號H01J49/04GK101600954SQ200780050971公開日2009年12月9日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日發(fā)明者D·利內(nèi)曼,H·M·金斯頓,M·帕穆克丘,M·拉赫曼申請人:應(yīng)用同位素技術(shù)公司